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ORQUÍDEAS
RESCATE POR GERMINACION IN
VITRO
Carmen Ruíz Bello
José Luis Moreno Martínez
Marisela Guadalupe Salgado Mora
Aída Olivera de los Santos
ORQUÍDEAS
RESCATE POR GERMINACION
IN VITRO
Carmen Ruíz Bello
José Luis Moreno Martínez
Marisela Guadalupe Salgado Mora
Aída Olivera de los Santos
UNIVERSIDAD AUTONOMA DE CHIAPAS
DIRECTORIO
Mtro. Carlos Eugenio Ruíz Hernández
Rector
Mtro. Hugo Armando Aguilar Aguilar
Secretario General
Mtro. Roberto Sosa Rincón
Secretario Académico
C.P. José Hugo Ruíz Santiago
Encargado de la Secretaría Administrativa
Mtro. Luis Iván Camacho Morales
Secretario Auxiliar de Relaciones Interinstitucionales
Dr. Lisandro Montesinos Salazar
Director General de Planeación
Dr. Lorenzo Franco Escamirosa Montalvo
Director General de Investigación y Posgrado
Lic. Víctor Fabián Rumaya Farrera
Director General de Extensión Universitaria
Mtra. Rocío Aguilar Sánchez
Jefa de la Unidad de Divulgación Científica de la Dirección General Investigación y Posgrado
FACULTAD DE CIENCIAS AGRICOLAS
M. C. Carlos Gumaro García Castillo
Director
M. C. Miguel Antonio Ramón Castro
Secretario académico
Dr. Ricardo Magallanes Cedeño
investigación y Posgrado
ORQUÍDEAS. RESCATE POR GERMINACIÓN IN VITRO.
D.R. © 2016. UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIAPAS
Boulevard Belisario Domínguez Km. 1081 sin número, Colina Universitaria, Terán,
C.P. 29050, Tuxtla Gutiérrez, Chiapas, México.
D.R. © 2016. Carmen Ruíz Bello, José Luis Moreno Martínez, Marisela Guadalupe
Salgado Mora y Aída Olivera de los Santos.
ISBN: 978-607-8459-06-3
Edición:
Dirección General de Investigación y Posgrado - Unidad de Divulgación Científica.
Diseño y composición:
Bernardo Olivio Reyes de León y Ernesto de Jesús Pérez Álvarez.
Diseño de forros:
Bernardo O. Reyes de León.
Formación editorial:
María Beatriz Arévalo Dorry.
Imagen de portada:
Carmen Ruíz Bello y José Luis Moreno Martínez.
Primera edición en español, Enero 2016.
200 ejemplares.
Impreso y hecho en México.
Título: Orquídeas. Rescate por germinación in vitro
La presente publicación ha sido evaluada y aprobada por un comité editorial
constituido por integrantes de cuerpos académicos consolidados y externos a la
institución. Es producto programado del proyecto aprobado a la Dra. Carmen Ruíz
Bello con financiamiento UNACH-EXB-149 PROMEP/103.5/11/3666. Otorgado
por la Secretaría de Educación Pública.
INDICE
Página
Presentación
i
1. Introducción
1
2. Importancia
2.1. Importancia económica en México
2.2. Importancia ecológica
3
5
5
3. Usos potenciales
3.1. Plantas de ornato
3.2. Usos en la industria
3.3. Otros usos
7
8
8
10
4. Recursos forestales no maderables
12
5. Clasificación taxonómica
16
6. Descripción botánica
6.1. Hábitat de desarrollo
6.1.1. Epífitas
6.1.2. Terrestres
6.1.3. Litófitas
6.2. Tipos de crecimiento
6.2.1. Simpodial
6.2.2. Monopodial
6.2.3. Trepadoras
6.2.4. Rastrero
18
20
20
21
23
23
23
23
24
25
7. Pérdida de la biodiversidad
26
8. Propagación de orquídeas
8.1. Propagación asexual ó vegetativa
8.1.1. División de plantas
8.1.2. Tipos de sustratos
8.2. Propagación sexual o por semillas
28
29
30
31
34
9. Propagación in vitro
37
10. Propagación in vitro de orquídeas
10.1. Propagación asexual ó vegetativa
10.2. Propagación sexual ó por semilla
10.2.1. Germinación de las semillas in vitro
10.2.1.1. Germinación simbiótica
10.2.1.2. Germinación asimbiótica
40
41
42
43
43
43
11. Cápsulas o frutos de las orquídeas
46
12. Preparación del medio de cultivo in vitro
12.1. Preparación de soluciones madre
12.2. Condiciones ambientales de los cultivos in vitro
12.3. Características del cuarto de crecimiento
51
55
57
57
13. Procedimiento para establecer el cultivo in vitro
13.1. Preparación del medio nutritivo
13.2. Siembra de las semillas y germinación de las mismas
13.3. Formación de protocormos y de hojas
13.4. Formación de raíces y crecimiento de las plántulas
13.5. Trasvase y separación de plántulas
13.6. Adaptación al medio ambiente
13.7. Establecimiento de plantas en maceta
58
59
61
62
63
65
66
69
14. Polinización manual para obtener cápsulas con semillas
70
15. Conservación de orquídeas
15.1. Estrategias de conservación in situ y ex situ
15.1.1. Conservación in situ
15.1.2. Conservación ex situ
15.2. Conservación in vitro de tejidos vegetales
73
75
76
76
79
16. Referencias Bibliográficas
81
INDICE DE FIGURAS
Página
Figura
Título
1
Planta y fruto de vainilla
9
2
Orquídea epífita
13
3
Dos plantas de Encyclia adenocaula en un mismo
Hospedero
14
4
“Flor de la Candelaria” (Guarianthe skinneri) Orquídea
Epífita
15
5
Partes que componen a una planta de orquídea
19
6
Orquídeas epifitas
21
7
Orquídeas terrestres
22
8
a) crecimiento simpodial, b)crecimiento monopodial
23
9
Vainilla (Vanilla planifolia Andrews)
24
10
Mujeres dividiendo plantas de orquídeas y
estableciéndolas en diferentes sustratos
31
11
Diferentes tipos de sustratos que se pueden utilizar para
establecer los fragmentos de las plantas
32
12
Orquídea en tronco de Yaite (Gliricidia sepium)
33
13
a) Fruto de orquídea, b) Semillas de orquídea
34
14
Cápsulas (frutos) con semillas de Encyclia
adenocaula. Planta en su hospedero principal
(Quercus sp) en condiciones naturales
35
15
Meristemo de la planta. (Se señala con el bisturí un
meristemo de la planta)
41
16
Meristemo de orquídea propagado in vitro
42
17
Semillas de orquídeas vistas con microscopio
44
18
Cápsulas (frutos) de orquídeas
47
19
Cápsulas de orquídeas
48
20
Cápsulas de Encyclia adenocaula
50
21A
Selección y Preparación de los medios de
cultivo in vitro
59
21B
Selección y Preparación de los medios de
cultivo in vitro
60
22
Secuenciación de la disección de la cápsula, siembra y
germinación de las semillas (in vitro)
61
23
Formación de protocormos, desarrollo de las hojas
63
24
Formación de raíces, crecimiento de plántulas
64
25
Plántulas de orquídeas, provenientes de semillas
germinadas in vitro
65
26
Trasvase de plántulas
66
27
Plántulas en proceso de adaptación en el invernadero
67
28
Plantas sembradas en macetas adaptadas al medio
ambiente (Encyclia adenocaula)
69
29
A) Ubicación del polen; B) Ubicación del gineceo
71
30
Fruto ó cápsula producto de la fecundación
72
31
Conservación in situ
78
32
Conservación ex situ
78
INDICE DE CUADRO
Cuadro
Título
Página
1
Medio Murashige y Skoog (1962) (MS)
54
PRESENTACIÓN
La presente publicación, es con la finalidad de informar acerca de las orquídeas:
esta preciada familia de plantas monocotiledóneas. Asimismo, dar a conocer; que
las semillas de las orquídeas carecen de endospermo (sustancia de reserva
alimenticia para que el embrión de la semilla, continúe su división celular y origine
una nueva plántula). Esto complica su germinación en la naturaleza. Las semillas
deberán encontrar la asociación con un hongo micorrízico que las nutra para
llevar a cabo su germinación; por este motivo miles de semillas mueren.
Las orquídeas tienen una gran importancia dentro de las plantas ornamentales,
muchas de ellas se encuentran en la NOM-059-SEMARNAT en alguna categoría
de riesgo, algunas ya en peligro de extinción. Por este motivo es necesario
buscar estrategias para propagarlas y con ello estamos hablando de rescatarlas;
conociendo las diferentes formas de propagación Asexual y Sexual podremos
lograrlo. En el presente libro se notifica al respecto.
Las orquídeas pueden ser epífitas (viven sobre cortezas de los árboles), terrestres
(viven sobre el suelo) y litófitas (viven sobre rocas).
Las orquídeas son más abundantes en los trópicos, pero también se les
encuentra en climas templados. Su zona preferida es la franja entre los trópicos
que es donde viven las orquídeas epífitas. Algunos países poseen más orquídeas
que otros. En México se reportan alrededor de 1.200 especies, de las cuales el
Estado de Chiapas posee alrededor de 600.
Por la belleza de sus flores, cada año cientos de orquídeas son extraídas de su
hábitat natural y son vendidas de manera ilegal. Los bosques donde crecen están
siendo altamente deforestados, aunado a los fenómenos naturales y a los
incendios provocados. Por lo anteriormente citado; las poblaciones de orquídeas
tienden a reducir su variabilidad genética con riesgos de llegar a extinguirse.
Es necesario ayudar a rescatar y conservar estas maravillosas plantas.
Dra. Carmen Ruíz Bello.
Orquídeas, rescate por germinación in vitro
Por la belleza de sus flores, las orquídeas son muy preciadas en el mundo
entero. Su principal uso es como plantas de ornato aunque las hay
industriales. En México se reporta el empleo de varias especies en usos tan
diversos como medicinales, aromatizantes de alimentos, para extracción de
gomas y mucílagos utilizados como adhesivos o aglutinantes y como
plantas ornamentales.
Existe un verdadero interés por las orquídeas silvestres; esto se debe
primordialmente a fines comerciales y religiosos. Año con año muchos
ejemplares se concentran en los mercados regionales para su venta. Por el
constante saqueo de orquídeas hay especies que se encuentran
amenazadas, con poblaciones reducidas o en peligro de extinción. Esto
puede ocasionar la pérdida de materiales muy valiosos que aportarían
germoplasma en programas de mejoramiento y propagación masiva; por lo
que debe considerarse su rescate.
La propagación natural de las orquídeas se dificulta porque sus semillas son
diminutas y carecen de endospermo por lo que requieren de la simbiosis con
hongos micorrízicos para llevar a efecto la germinación. Por este motivo; es
necesario buscar metodologías que ayuden a germinar las semillas como es
el caso de la germinación in vitro y con ello contribuir al rescate y
conservación de la variabilidad genética de las especies.
1. INTRODUCCION
1 1. Introducción
La familia Orchidaceae es la más evolucionada y compleja que existe,
constituyendo el grupo con mayor diversidad de las plantas vasculares (Banks,
2006).
La sofisticada estructura de sus flores y la alta especificidad para su
polinización son características propias de este grupo. Todas las orquídeas son
herbáceas y pueden ser: epífitas, terrestres y litófitas. La estructura de las plantas
y en especial de las flores varía de acuerdo al grupo o género al que pertenezcan,
hay la presencia o ausencia de pseudobulbos, diferentes tipos de tallos, raíces y
hojas y la enorme variedad de formas de las flores siempre conservando una
configuración definida: tres sépalos, son coloreados y en ocasiones similares a los
pétalos, uno de los cuales recibe el nombre de labelo, que se modifica para
adquirir las más extrañas formas (Cabrera, 1999). De acuerdo a Hagsáter et al.,
(2005) existen entre 20,000 a 30,000 especies de orquídeas y se han descubierto
nuevas. En México se calcula que existen alrededor de 1,200 especies (Cabrera,
1999).
La belleza de las orquídeas y la gran diversidad de formas y colores, atraen la
atención de coleccionistas alrededor del mundo, los cuales en su mayoría
manifiestan una obsesión por estas plantas. Vendrame y Pinares (2009), reportan
que en el Sur de la Florida hay muchos productores de orquídeas, desde los más
especializados que han obtenido híbridos merecedores de premios en
exhibiciones mundiales, hasta los dedicados a la producción a gran escala de
millones de orquídeas de los géneros más comunes domo Phalaenopsis y
Dendrobium; que el número de sociedades locales dedicadas a las orquídeas es
impresionante e ilustra la pasión por estas plantas.
2 2. IMPORTANCIA
3 2. Importancia
Las orquídeas son sin duda, algunas de las flores más apreciadas en el mundo
entero. Esto se debe a que sus flores poseen las más diversas y exóticas formas.
Desde hace siglos han apasionado a reyes y nobles, así como a gente común y
siguen apasionando a la humanidad.
Son plantas que cuentan con un gran
número de coleccionistas en el mundo, reunidos en sociedades, clubes y grupos
de estudio (Bastida, 2007).
En la época de la Colonia el médico de Felipe II, Francisco Hernández vino a la
Nueva España a realizar una investigación acerca de las plantas medicinales de
las tierras del Nuevo Continente y junto con los sabios indígenas describió e hizo
dibujar un gran conjunto de plantas desconocidas hasta entonces en Europa.
Posteriormente publicó los primeros dibujos de cinco orquídeas mexicanas que
fueron: una Stanhopea, una Laelia, una Encyclia, una Bletia y Vanilla planifolia.
En particular, la vainilla aparece ilustrada desde 1552 con el nombre de tlixochitl
en el códice de la Cruz-Badiano (Hágsater et al., 2005).
En México, como en otras partes del mundo el cultivo de las orquídeas para fines
culturales constituyó la base de una creciente afición. Esto se reflejó en 1938 con
la constitución de la primera asociación cívica, formada por destacados y
prominentes personajes que se denominó “Amigos de las Orquídeas”. Hoy en día
se le conoce como “Asociación Mexicana de Orquideología”.
Esta nueva
generación de orquideófilos, con verdadero espíritu de conservar nuestras joyas
vegetales, aumentó en los últimos años sus actividades e investigaciones en
bosques y selvas de México. Destacan los estudios realizados con fines
taxonómicos de los cuales se dispone de una larga lista de especies
desconocidas. Asimismo estos estudios ayudaron a resolver la problemática de
su nomenclatura y el enigma existente en la clasificación de varios de sus
géneros y múltiples híbridos naturales (Hartman, 1992).
4 El número de sociedades dedicadas a las orquídeas es impresionante e ilustra la
pasión por estas plantas. Por citar un ejemplo, en el Sur de Florida, existen 12
sociedades que se reúnen semanalmente para discutir aspectos relacionados con
el cultivo de las orquídeas, organización y programación de exhibiciones, y en
ocasiones se llevan a cabo seminarios impartidos por especialistas invitados de
diferentes áreas de la orquideología. Curiosamente, la mayoría de los miembros
participantes de una sociedad también pertenecen a otras sociedades.
Prácticamente se desarrollan actividades relacionadas con las orquídeas durante
todo el año, como subastas, exhibiciones y competencias (Vendrame y Pinares,
2009).
2.1. Importancia económica en México
Se pueden señalar varias formas de uso y manejo sustentable de las orquídeas
mexicanas mediante su cultivo y propagación como es el caso de las plantaciones
de vainilla, el cultivo de Laelias y otras especies en traspatio y viveros (Hágsater
et al., 2005).
Asimismo se dispone actualmente de varios viveros particulares que cuentan con
colectas de especies de orquídeas mexicanas, algunas de las cuales están siendo
propagadas, aunque muchas de ellas son de poco interés comercial.
Los principales viveros se ubican en: Tenango de las Flores y Atlixco, Puebla, en
Fortín de las Flores, Veracruz, Cuernavaca, Morelos, Valle de Bravo, México y en
la Ciudad de México. Además existen viveros en otras partes de México, como:
Jalisco, Baja California y la Península de Yucatán, entre otros.
2.2. Importancia ecológica
La diversidad de las flores de orquídeas tiene la finalidad de atraer a los
polinizadores para poder producir semillas y perpetuar su especie. Las orquídeas
5 se han podido establecer en casi todos los ambientes de la tierra. Algo que
caracteriza a las orquídeas en conjunto es la complejidad de sus interacciones
con otros seres vivos, sean estos hongos micorrízicos, polinizadores, árboles
hospederos u hormigas mutualistas.
Son el grupo de plantas que ha podido
colonizar con más éxito las copas de los árboles como es el caso de las
orquídeas epífitas (Hágsater et al., 2005). Las epífitas son plantas que crecen
sobre otras plantas adheridas a los troncos y ramas de árboles y arbustos
principalmente, por ello son llamadas con toda propiedad epífitas (del griego epi
que significa “sobre” y phyte “planta”). El hospedero o “forofito” sobre el que crece
una epifita es utilizado solo como soporte sin recibir más daño que el que pueda
provocar su abundancia dentro de su ramaje, por lo tanto, una epifita difiere de
una planta parásita en que esta última obtiene agua y nutrientes del hospedero.
Las epífitas despliegan mecanismos muy variados y novedosos para sobrellevar
no solo la sequía sino también la adquisición de nutrimentos del ambiente sin
tomarlo del forofito (hospedero). Tal especialización requiere en ocasiones de
interacciones mutualísticas con microorganismos artrópodos y algunos grupos de
vertebrados y de características morfoanatómicas y funcionales muy especiales;
este grupo incluye organismos no vasculares pterofitas y angiospermas que se
relacionan ecológicamente con forofitos muy diversos que se establecen en
ambientes con alta humedad atmosférica. Por ello, son responsables, en gran
parte de que los bosques húmedos tropicales contengan la diversidad biótica más
alta de todos los ecosistemas continentales (Granados et al., 2003). Todas las
orquídeas tienen una relación obligada con los simbiontes micorrízicos durante la
germinación de la semilla. Es importante entender la simbiosis micorrízica debido
a que existe una especificidad con las semillas para germinar (Taylor et al., 2003;
Otero et al., 2004). Resulta determinante la disponibilidad de hongos simbiontes
para la distribución y diversidad de las orquídeas (Otero et al., 2002).
6 3. USOS POTENCIALES
7 3. Usos potenciales
3.1. Plantas de ornato
El conocimiento, uso y aprecio de las orquídeas por las culturas prehispánicas no
está documentado, pero cuando los españoles llegaron a México en el siglo XVI
se cultivaban algunas orquídeas como Stanhopea hernandezii y la vainilla (Vanilla
planifolia) (Hágsater et al., 2005).
Existe un verdadero interés por las orquídeas silvestres; esto se debe
primordialmente a fines comerciales y religiosos, como ornato se usan como flor
cortada o bien plantas completas cuyos ejemplares son obtenidos de su hábitat
natural de manera ilegal, año con año cientos de miles de ejemplares se
concentran en los mercados regionales para su venta. El uso de las orquídeas
está asociado a sus características ornamentales, ya sea su aprovechamiento
como flor de corte, planta en maceta o bien en colecciones especiales (Hartman,
1992).
3.2. Usos en la industria
Sin duda alguna, la vainilla (Vanilla planifolia) es prácticamente la única orquídea
que se utiliza con fines industriales y es una aportación de México para el mundo.
La vainilla es una planta epífita trepadora originaria o nativa de los bosques
tropicales o selvas húmedas de México, Centroamérica y posiblemente de las
Antillas.
Fueron los españoles quienes le dieron el nombre de vainilla o vaina pequeña, por
su similitud con los frutos de las legumbres que se denominan vainas. Al inicio
del siglo XIX, llevaron plantas de vainilla de México a diferentes lugares de
Europa y de ahí fue la distribución mundial, siendo los franceses quienes la
8 introdujeron a Madagascar donde actualmente se produce el mayor porcentaje de
la vainilla que se consume en el mundo.
En México, la vainilla se cultiva principalmente en los estados de Veracruz,
Puebla, Oaxaca, Chiapas, y existen pequeñas plantaciones en los estados de
Hidalgo, San Luis Potosí, Quintana Roo, Tabasco y Michoacán (Téllez, 2011).
El extracto de la vainilla (Figura 1)es una mezcla compleja de substancias,
aunque su constituyente principal es un compuesto aromático simple llamado
vainillina. El extracto es utilizado como aromatizante y saborizante en repostería,
elaboración de helados y refrescos embotellados y en las industrias del perfume,
tabaco y aún la farmacéutica. Este producto tiene gran demanda a nivel mundial
y su obtención requiere de grandes cantidades de frutos (“vainas”) que han sido
sometidos a un proceso de fermentación (“curado”) para producir la fragancia de
vainilla (Hágsater et al., 2005).
a)
b)
Figura 1. Planta y fruto de vainilla
a) Don Esteban acomodando la planta de vainilla sobre un tutor,
“El Hular”, Tuzantán, Chis. b) Fruto de la vainilla del cual se
9 extrae la vainillina
Foto: Carmen Ruíz Bello.
Además de Vanilla planifolia, existen otras especies de vainilla que son utilizadas
para la obtención de los principios aromáticos, aunque en una escala mucho
menor debido a la calidad inferior del producto; siendo V. planifolia la más
importante desde el punto de vista comercial (Lee, 2008).
3.3. Otros usos
Las orquídeas mexicanas se utilizan también en la elaboración de pegamentos,
aglutinantes, aromatizantes, saborizantes, dulces, esculturas e imágenes
religiosas, ritos, festividades religiosas y propiedades medicinales
(Moreno y
Menchaca, 2006). Desde el México prehispánico, ya se utilizaban diversas partes
vegetativas de orquídeas que tenían sustancias mucilaginosas con propiedades
adherentes y aglutinantes. La mayoría de estas sustancias son obtenidas de los
pseudobulbos y raíces de algunas especies. Los aztecas y los mayas, las
utilizaban por sus propiedades medicinales, como plantas de ornato y para extraer
pegamentos (Ossenbach, 2005).
Los antiguos pueblos mesoamericanos conocían y manejaban desde antes de la
conquista española, una gran variedad de productos que tenían la propiedad de
ser adhesivos y aglutinantes. Utilizaban diversas partes vegetativas de orquídeas
que tenían sustancias mucilaginosas con estas propiedades. Con la llegada de
los españoles surgió el asombro y el interés por compilar el conocimiento
indígena.
Cuando los españoles llegaron en el Siglo XVI, los frutos de la vainilla (Vanilla
planifolia Andrews) se vendían en los mercados y de los cormos, seudobulbos y
raíces de algunas especies se extraía un mucílago utilizado como pegamento
(Hágsater et al., 2005).
De este modo, muchas de las especies de orquídeas conocidas han sido
ampliamente utilizadas a lo largo de la historia como: pegamentos, aglutinantes,
10 aromatizantes y saborizantes. Algunas especies se usan de manera tradicional
para la elaboración de dulces y para curar heridas o enfermedades pero de
manera restringida (Cabrera, 1999) así como en la producción de esculturas e
imágenes religiosas en ritos y festividades religiosas. Todas ellas conforman el
abanico de usos diferentes que han tenido y continúan teniendo las orquídeas en
algunas áreas de nuestro biodiverso y pluricultural México (Moreno y Menchaca,
2006).
11 4. RECURSOS FORESTALES NO MADERABLES
12 4. Recursos forestales no maderables
Las orquídeas son consideradas como recursos forestales no maderables. Un
porciento de las que existen en la naturaleza, son epífitas utilizando como
hospedero las cortezas de los árboles (Figura 2).
Firuga 2. Orquídea epífita
Encyclia adenocaula en su hospedero natural Quercus
sp. Bosque de asociación pino-encino.
Temascaltepec, Edo. de México.
Foto: Carmen Ruíz Bello
13 Los recursos naturales son satisfactores de necesidades humanas, que en el
caso de los forestales provienen de vegetación silvestre; contra la creencia
popular, no solo son árboles, sino que también hay arbustos, hierbas, hongos y
animales. Las orquídeas viven sobre los árboles (Figuras 3 y 4) Los bosques se
constituyen de recursos maderables y no maderables.
Figura 3. Dos plantas de Encyclia adenocaula en un mismo
hospedero
Foto: Carmen Ruíz Bello
14 Figura 4. “Flor de la Candelaria” (Guarianthe skinneri) Orquídea
epífita
Foto: José Luis Moreno Martínez
15 5. CLASIFICACION TAXONOMICA
16 5. Clasificación taxonómica
La clasificación taxonómica de la familia es compleja y cambiante. Está basada
esencialmente en los caracteres de la columna y en niveles superiores en la
naturaleza de la polinia. Para su clasificación no se utilizan las formas de vida,
distribución o el espectro ecológico de las especies. Sin embargo, parece estar
bastante correlacionada con los desarrollos evolutivos del grupo más aceptado por
la mayoría de los autores. Dressler (1993), citado por Gil (2007) estableció la
clasificación taxonómica más aceptada para la familia de las orquídeas:
Reino: Plantae
División: Spermatophyta
Subdivisión: Angiospermae
Clase: Monocotyledoneae
Orden: Microspermae
Familia: Orchidaceae
La familia Orchidaceae presenta cinco Subfamilias que son:
Apostasioideae, Cypripedioideae, Spiranthoideae, Orchidioideae, Epidendroideae.
17 6. DESCRIPCION BOTANICA
18 6. Descripción botánica
Las orquídeas son plantas monocotiledóneas, herbáceas perennes de la familia
Orchidaceae. Se caracterizan porque un gran número de ellas poseen flores muy
vistosas, hermafroditas (ambos sexos en la misma flor), zigomorfas (con 1 solo
plano de simetría, trímeras (3 sépalos y 3 pétalos) y una columna central que
sustenta las estructuras reproductivas masculinas (anteras) y femeninas (pistilo)
llamada ginostemo (Figura 5).
Figura 5. Partes que componen a una planta de orquídea
(Sheehan, 1994; citado por Gil, 2007).
19 Algunas viven en las ramas de los árboles (epifitas), otras sobre rocas (litofíticas)
y algunas en el suelo (terrestres).
Las raíces de las epifitas y litófitas están
adaptadas a vivir expuestas al aire o inmersas en materia orgánica, ya que tienen
un tejido acumulador de agua llamado velo.
6.1. Hábitat de desarrollo
De acuerdo al lugar donde se desarrollan se define los posibles hábitats en que
se les puede encontrar y que pueden ser de los siguientes tipos:
6.1.1. Epifitas. Son plantas que se desarrollan únicamente sobre las ramas y
troncos de los árboles, sus raíces no penetran el tallo de sus hospederos, sólo
crecen sobre su corteza, el árbol cumple la función de soporte. La gran mayoría
de las orquídeas presentan este tipo de hábitat. Su alimento lo obtienen del aire,
el agua de lluvia y de algunos desechos acumulados encima de la corteza de los
árboles (Figura 6).
20 Enciclya cordigera
Enciclya acenocaula
Figura 6. Orquídeas epifitas.
Fotos: José Luis Moreno Martínez
Guarianthe aurantiaca
6.1.2. Terrestres. En este caso las orquídeas crecen a nivel del suelo, de donde
toman gran parte de los nutrientes que necesitan.
Por lo general para su
adaptación a este hábitat se ha modificado el pseudobulbo. Las raíces cumplen la
función de estructuras de almacenamiento para épocas de sequía o para la
floración, formación de cápsulas, semillas y para su reproducción (Figura 7).
21 Arundina graminifolia.
Foto Carmen Ruíz
Bello
Sobralia macrantha.
Fotos: Carmen Ruíz Bello
Figura 7. Orquídeas terrestres
22 6.1.3. Litófitas Este tipo de orquídeas crece sobre las rocas. Estas les brindan el
soporte necesario para su desarrollo.
Algunas de las especies terrestres se
pueden adaptar a esta condición, al igual que las litófitas a hábitats terrestres.
6.2. Tipos de crecimiento
6.2.1. Simpodial. Las orquídeas con este tipo de crecimiento poseen un rizoma
que crece de manera horizontal, del cual van surgiendo los retoños nuevos que
tienen un crecimiento vertical y eventualmente forma pseudobulbos; en este tipo
de crecimiento se presenta la posibilidad de ramificaciones (Figura 8a).
6.2.2. Monopodial. Las orquídeas con este tipo de crecimiento crecen de manera
erguida, erectas con un solo tallo que no se ramifica, al cual se insertan las hojas y
no presentan pseudobulbos(Figura 8b).
a) Orquídea simpodial
b) Orquídea monopodial
Figura 8. a) crecimiento simpodial, b)crecimiento monopodial
23 6.2.3. Trepadoras. Este tipo de crecimiento se presenta en orquídeas como la
vainilla (género Vanilla) que va creciendo a lo largo y hacia arriba, sosteniéndose
del tronco de un árbol o tutor (Figura 9).
Figura 9. Vainilla (Vanilla planifolia Andrews).
Foto: Carmen Ruíz Bello
24 6.2.4. Rastrero. Las orquídeas de este tipo crecen sobre la superficie del suelo,
rocas o ramas de los árboles donde se van expandiendo horizontalmente.
25 7. PERDIDA DE LA BIODIVERSIDAD
26 7. Perdida de la biodiversidad
México alberga una flora que ha sido considerada de las más ricas y variadas del
planeta, presentando aproximadamente el 10% de la biodiversidad terrestre, además
no solamente se distingue por este atributo, sino también por su elevado índice de
endemismos, es decir, especies que solamente se encuentran dentro de los límites
geográficos del país (Rzedowski, 1993, Semarnap-Ine-Conabio, 1995). No obstante,
de las especies de plantas vasculares, aproximadamente el 15% se consideran en
peligro de extinción (Vovides, 1995). La principal causa de este problema ha sido la
perturbación y la destrucción de las comunidades naturales, como producto del
creciente impacto de las actividades humanas sobre ellas.
Para México, la familia Orchidaceae representa un ejemplo de la diversidad de
especies y de la problemática de la extinción de ellas. Cabrera (1999), informa que
en México existen alrededor de 1,200 especies, de las cuales la Norma Oficial
Mexicana NOM-059-SEMARNAT-2001 reporta 180 que presentan algún riesgo de
extinción. Este riesgo se acentúa debido principalmente a la conversión de terrenos
forestales para usos urbanos, agrícolas o pecuarios, así como por la extracción de
plantas de su hábitat para su venta en mercados nacionales e internacionales,
incluyendo aquéllas especies mencionadas en la norma oficial. No existe gran
información confiable respecto a la exportación ilegal de orquídeas, una
aproximación se puede realizar con lo reportado por Banks (2006), quien menciona
que en 1989 se exportaron a Estados Unidos 18,000 orquídeas de las cuales 8000
se encontraban amenazadas de extinción.
De acuerdo a la recomendación del Sistema Nacional de Recursos Fitogenéticos
(SINAREFI) (2004), todas aquellas especies ornamentales que sean raras, que se
encuentren amenazadas o en peligro de extinción deberán propagarse por técnicas
o métodos adecuados para lograr la preservación de la riqueza genética en el
mundo.
27 8. PROPAGACION DE ORQUIDEAS
28 8. Propagación de orquídeas
Las orquídeas como todas las plantas vasculares, poseen dos tipos de
propagación: asexual o vegetativa y sexual o por semilla.
8.1. Propagación asexual o vegetativa
Con la propagación asexual o vegetativa, no habrá variabilidad genética en las
plantas resultantes, estas serán idénticas a la planta madre de donde se separe la
parte vegetativa; así que si lo que deseamos es obtener clones, este resulta ser el
método adecuado. Este tipo de propagación, puede realizarse de dos formas:
Propagación manual; por división de las plantas fraccionando el número de
pseudobulbos y sembrándolos en un sustrato adecuado. Algunas orquídeas (por
ejemplo las del género Dendrobium y Epidendrum) producen pequeñas plantas en
las axilas de sus hojas (llamadas “keikis”) que frecuentemente enraízan estando
todavía en la planta madre, solo se requiere su separación para propagarlas.
No todas las orquídeas se pueden dividir de las mismas formas. Existen algunas
que se pueden dividir simplemente utilizando las manos ó tijeras para cortar las
raíces gruesas y sembrando cada ejemplar de orquídeas en una maceta de un
tamaño apropiado para cada planta así como utilizar sustrato fresco.
Por otra parte existen plantas como Paphiopedilum a los cuales no les gusta ser
divididas, en caso de dividirse es necesario dejar al menos 2 brotes antiguos y un
nuevo crecimiento por división para asegurar el éxito.
29 8.1.1. División de plantas
Cuando una planta ha crecido lo suficiente y se quiere dividir, se recomienda los
siguientes pasos:
-
Primeramente se debe observar que tipo de crecimiento tiene (monopodial
o simpodial).
-
Para hacer el corte se debe
usar navaja, tijeras o cuchillos limpios y
flamearlos con un encendedor, esto evitará la transmisión de enfermedades
entre las plantas.
-
Después de dividir la planta, es recomendable colocar polvo de azufre en
la lesión causada por el corte ó una mescla de cal común, esta medida es
para evitar infecciones por hongos.
-
Se puede aprovechar el trasplante para dividir la planta y obtener varios
ejemplares. Para hacerlo se desmorona el sustrato con las raíces se divide
con las manos hasta donde sea posible y se planta cada división en un
recipiente puede ser maceta
de tamaño diverso con base al tipo de
orquídea, apropiado y con sustrato fresco, esta puede ser de plástico,
barro, ó en cualquier otro sustrato orgánico como, madera de chipe, coco,
bambu, teja, entre otros.
Si la planta que se va a dividir es de crecimiento simpodial, el corte debe hacerse
dejando tres o cuatro pseudobulbos en la nueva planta, nunca se deben dejar
menos, pues existen pocas posibilidades de que sobreviva, ya que existe
intercambio de nutrientes entre los tallos que ayudan a los brotes nuevos a
desarrollarse. Por lo contrario, si presenta crecimiento monopoidal, se deben
cortar plantas que hayan crecido suficiente y que tengan raíces aéreas bien
desarrolladas, así la planta separada podrá absorber agua y nutrientes por si
misma.
30 8.1.2. Tipos de sustratos
Los sustratos pueden ser:
Fibra de coco o corteza de pino: Que no sea nueva, por que posee sustancias
dañinas para las plantas, llamadas taninos, por lo que se prefiere que ya este
interperizada o vieja.
Trozos de madera: estos pueden ser de encino, Jacaranda, chalahuite (Inga sp.),
gasparito (Eritrina americana), etc. Este último resulta un buen sustrato ya que
proporciona fertilización natural por su alto contenido de Nitrógeno, además de ser
una madera porosa que retiene la humedad. Como sustrato para comercializar las
orquídeas se pueden utilizar multiples sustratos entre ellos esta el chipe, conchas
de coco seco, bambu, retazos de madera, canastas de mimbre, ixtle ó alambre
(Figuras 10 y 11).
Figura 10. Mujeres dividiendo plantas de orquídeas y
estableciéndolas en diferentes sustratos.
Foto: Aida Olivera de los Santos
31 Figura 11. Diferentes tipos de sustratos que se pueden utilizar para
establecer los fragmentos de las plantas. Foto: Aída Olivera
de los Santos
32 Malque o Chipe. Es una costumbre muy común usar pedazos de tallo y raíces de
helechos llamados comúnmente malque, maquique o Chipe, sin embargo, estos
se obtienen de un helecho en peligro de extinción, por lo que no se recomienda su
uso, ya que muchos otros materiales son buen sustrato para orquídeas (Figura 12)
y no es justo conservar una especie afectando a otra.
Figura
12. Orquídea en tronco de Yaite (Gliricidia sepium). Foto:
Aída Olivera de los Santos.
Las orquídeas se pueden establecer en forma artesanal haciendo uso de plantas
madres, de las cuales se extraen los hijuelos atraves de la división de plantas, y
pueden establecerse en postes verdes del árbol “cocohite” ó “yaite” (Gliricidia
sepium) (Figura 12).
Tierra preparada: en el caso de las orquídeas terrestres, pueden sembraras en
macetas agregando una mezcla de tierra de monte húmeda con un poco de arena.
Algunas inclusive pueden crecer bien directamente en el suelo.
33 8.2. Propagación sexual o por semillas
Las flores de las orquídeas producen frutos en forma de cápsulas en su mayoría
conteniendo grandes cantidades de semillas como polvo fino (Figura 14).
Figura 13. a) Fruto de orquídea, b) Semillas de orquídea
Las semillas de las orquídeas, carecen de endospermo (sustancia de reserva
alimenticia).
Bajo condiciones naturales (Figura 14), las semillas de orquídeas son liberadas de
sus cápsulas cuando éstas maduran y son llevadas por el viento pudiendo
germinar y crecer si eventualmente caen en un medio adecuado para la
germinación.
Sin embargo dichas semillas tienen pocas posibilidades de
sobrevivir, debido a que muchas de las especies de orquídeas sólo son capaces
de crecer en presencia de un hongo simbiótico como Rhizoctonia spp. (Serna,
1999).
34 Figura 14. Cápsulas (frutos) con semillas de Encyclia adenocaula. Planta en su
hospedero principal (Quercus sp) en condiciones naturales
Foto: José Luis Moreno Martínez
Cada semilla posee una cubierta seminal que encierra un embrión rudimentario
indiferenciado y simple, constituido por unas 100 a 200 células sin endospermo.
Debido a la falta de reservas alimenticias, el proceso germinativo y el subsiguiente
desarrollo de las orquídeas, se encuentran supeditados a la existencia de una
simbiósis con un hongo que proporcione los elementos nutritivos necesarios para su
realización. Cuando el fruto abre en forma natural y las semillas son liberadas, la
35 germinación dependerá de que al caer entren en contacto con el hongo, el cual
penetrará al embrión a través de una gran célula suspensora; el hongo crece en el
interior de las células del embrión, éste es digerido por la orquídea que comienza a
crecer rápidamente para formar un protocormo. La primera hoja se desarrolla algún
tiempo después de la germinación (Mitchell, 1989).
Lee (2008) menciona que las semillas de orquídea contienen un pequeño embrión
de solamente cerca de 0.1 mm de diámetro, sin ningún tejido de reserva asociado
y que un método de germinación ha sido plantar semillas en suelo previamente
mezclado con suelo obtenido de los alrededores de la planta madre. Sin embargo,
un método más eficiente de germinación y rápido desarrollo es por cultivo in vitro
de las semillas.
36 9. PROPAGACION IN VITRO
37 9. Propagación in vitro
La propagación por medio de cultivo
in vitro; por medio de la siembra de
meristemos u otra parte de la planta sembrándolos en un medio de cultivo
preparado en un laboratorio.
El término cultivo in vitro, se utiliza para denominar a los cultivos asépticos de origen
vegetal. El cultivo in vitro ofrece ventajas adicionales a las técnicas convencionales
de propagación, como son: germinar semillas que bajo condiciones de semillero no
germinan, o bien, obtener una rápida multiplicación a partir de pequeñas fracciones
de la planta libres de patógenos.
Para lograr la propagación de plantas por cultivo in vitro, es posible utilizar cualquier
fragmento vegetal por ejemplo; tallos, parte de la flor, secciones de hojas,
meristemos, células en suspensión, entre otros; a estos materiales biológicos se les
denomina explantes (Fay, 1994). Mediante el uso de explantes es factible inducir la
morfogénesis, término que se utiliza para denominar al conjunto de procesos
relacionados con la diferenciación y desarrollo de órganos o tejidos para dar una
planta completa (Fhan, 1982).
La utilización del cultivo in vitro ha tenido un impacto en el mejoramiento de las
plantas vasculares, estableciendo nuevas y mejores alternativas como son; rescate
de embriones, hibridación, obtención de plantas libres de patógenos y rápida
propagación clonal. La utilización de estas técnicas se justifica cuando por los
métodos tradicionales, la producción de nuevos individuos es muy lenta y limitada o
no se ha logrado.
Los métodos de cultivo de tejidos vegetales in vitro tienen una amplia aplicación
en el conocimiento y la explotación de los recursos genéticos, como son: la
propagación masiva, el intercambio de germoplasma, la inducción de la
variabilidad genética y la germinación de semillas de orquídeas fuera de su
38 ambiente natural. Mediante la germinación in vitro, se reproducen semillas en
frascos de vidrio o plástico sobre un medio de agar nutritivo que contiene los
azúcares y minerales necesarios para que las semillas germinen y crezcan
(Mckendrick, 2000).
39 10. PROPAGACION IN VITRO DE ORQUIDEAS
40 10. Propagación in vitro de orquídeas
10.1. Propagación asexual ó vegetativa
Las orquídeas pueden ser propagadas asexualmente ó vegetativamente, por
medio de la siembra de meristemos (Figuras 15 y 16) en medios de cultivo de
tejidos in vitro preparados en un laboratorio.
Figura 15. Meristemo de la planta. (Se señala con el bisturí un meristemo de la planta)
Foto: José Luis Moreno Martínez
41 Figura 16. Meristemo de orquídea propagado in vitro
Foto: José Luis Moreno Martínez
Ventajas y desventajas
Ventajas: si logramos hacer que se propaguen plantas por este medio, de un solo
meristemo podremos realizar una propagación masiva (clones) de la especie que
se trate en particular.
Desventajas: los pseudobulbos de las plantas, solamente poseen dos meristemos
que son sus puntos nuevos de crecimiento, los cuales si los cortamos, estamos
destruyendo totalmente a la nueva planta.
10.2. Propagación sexual ó por semilla
La familia Orchidaceae requiere buscar metodologías de cultivo in vitro debido a que
las plantas tienen bajas tasas de crecimiento, ciclos de vida relativamente largos
aunado al problema que presenta la germinación de las semillas en forma natural ya
que requieren de la asociación con el hongo simbionte.
42 10.2.1. Germinación de las semillas in vitro
Mediante la germinación in vitro, se reproducen semillas en frascos de vidrio o
plástico sobre un medio de agar nutritivo que contiene los azúcares y minerales
necesarios para que las semillas germinen y crezcan (Mckendrick, 2000).
Hay dos tipos básicos de germinación in vitro: simbiótica y asimbiótica:
10.2.1.1. Germinación simbiótica
En la germinación simbiótica, las semillas (Figura 17) se siembran con una
pequeña porción del hongo micorrízico apropiado. El hongo crece en el medio,
coloniza a las semillas en proceso de germinación y se origina una relación
simbiótica que se espera alimente al protocormo hasta que este produzca hojas y
se vuelva autotrófico.
10.2.1.2. Germinación asimbiótica
La germinación asimbiótica consiste en depositar semillas en un medio de agar
nutritivo, el cual es más complejo que para la germinación simbiótica ya que todos
los nutrientes orgánicos e inorgánicos y los azúcares deberán estar disponibles
para la orquídea en una forma apropiada puesto que ya no existe la
intermediación del hongo (Mckendrick, 2000).
El cultivo in vitro asimbiótico (sin la presencia del hongo micorrízico) surge en 1922,
cuando Lewis Knudson encontró un medio propicio para la germinación sin la
presencia del hongo (Arditti, 1990). Posteriormente Knudson C (1946) mejoró el
medio de cultivo teniendo éxito en un amplio número de especies. Desde entonces,
se han desarrollado medios para especies específicas como por ejemplo Vacin y
Went (1949), Murashige y Skoog (1962), Ichihashi y Yamashita (1977) y Dalla Rosa
y Laneri (1977), entre otros.
43 Por la dificultad que presentan las semillas de las orquídeas para germinar en
forma natural, se han desarrollado metodologías de germinación asimbiótica bajo
condiciones in vitro (Arditti y Ernst, 1993; Serna, 1999; Mckendrick, 2000;
Cavalcante et al., 2001; Damon et al., 2004; Pedroza et al., 2005; Yamazaki y
Kasumitzu, 2006; Pedroza y Mican, 2006; Haddix et al., 2006; Steele, 2007 entre
otros). Sin embargo, cada especie de orquídea requiere diferentes nutrimentos
para germinar, por lo que hay que investigar cual es el medio de germinación
adecuado para cada una de ellas.
Figura 17. Semillas de orquídeas vistas con microscopio
Fotos: José Luis Moreno Martínez
44 La propagación sexual o por semillas, asegura un intercambio genético y ayuda a
mantener la variabilidad genética.
La madurez de las semillas al momento de la germinación in vitro es un factor
importante (Damon et al., 2004). Las semillas pueden ser colectadas a partir de
cápsulas verdes ó cápsulas maduras.
45 11. CAPSULAS O FRUTOS DE LAS ORQUIDEAS
46 11. Cápsulas ó frutos de las orquídeas
En la naturaleza las orquídeas producen pocas cápsulas (órgano de la planta que
contiene las semillas las cuales son diminutas) pero se compensa por la presencia
de miles de semillas por cápsula, hasta uno o dos millones en algunos casos y un
máximo de cuatro millones de semillas, como en Cynoches sp. recurso de suma
importancia para la conservación y cultivo sustentable de estas plantas (Arditti,
1990).
Las cápsulas (Figuras 18 y 19) de las orquídeas tardan meses para que sus
semillas alcancen la madurez adecuadas para que puedan germinar in vitro.
Cápsulas de Encyclia chacaoensis
Foto: Carmen Ruíz Bello
Cápsula de Encyclia adenocaula
Foto: Jose Luis Moreno Martínez
Figura 18. Cápsulas (frutos) de orquídeas
47 Cápsula de Guarianthe skinneri
Foto: Carmen Ruíz Bello
Figura 19. Cápsulas de orquídeas
Cápsula de vainilla (Vanilla planifolia
Andrews) Foto: Carmen Ruíz Bello
George (1993), citado por Lee (2008) reporta que la germinación de la semilla
inicia cuando el embrión se alarga para formar una pequeña estructura como un
cormo, llamado protocormo, el cual posee un brote quiescente y un meristemo
48 radical, en polos opuestos. En la naturaleza, el protocormo se torna de color
verde y acumula reservas de carbohidratos a través de la actividad fotosintética.
Solamente cuando ha crecido lo suficiente, la materia orgánica almacenada da
lugar a un brote y una raíz. El desarrollo normal continúa utilizando las reservas
de alimento almacenadas en el protocormo.
Sin embargo, la eficiencia de este proceso de propagación a través de la
germinación simbiótica de semillas de orquídea es muy baja, de únicamente el 5
% y está limitado a la existencia natural de microorganismos fúngicos para
completar exitosamente la formación de una planta completa.
Cuando se lleva a efecto la germinación asimbiotica en cultivo in vitro, es mejor no
permitir que las cápsulas se abran para que las semillas no se contaminen. Ruíz
et al., (2008) recomienda sembrar las semillas, cuando las cápsulas tengan una
coloración amarillenta .
En la Figura 20 podemos observar; que una de las tres cápsulas que se presentan
en la misma planta tiene una coloración amarilla, esta es la que se considera apta
para la siembra in vitro. Cuando las cápsulas abren; las semillas son expuestas a
contaminarse y si se desea germinarlas in vitro habría que esterilizarlas con
alcohol o cloro y esto hace que pierdan su viabilidad. Es conveniente llevar las
cápsulas cerradas y esterilizar las mismas en el laboratorio para poder extraer sus
semillas que en este caso estarían completamente estériles, porque no se
expusieron al medio exterior para contaminarse.
49 Figura 20. Cápsulas de Encyclia adenocaula
Foto: José Luis Moreno Martínez
El interior de las cápsulas de orquídeas se mantiene estéril si estas están intactas,
por lo tanto, si se esteriliza la parte exterior de las mismas, y se abren bajo
condiciones estériles, las semillas podrán mantenerse desinfectadas. La ventaja
de este método es que no se requiere de la esterilización de las semillas, lo que
podría provocar su deterioro (McKendrick, 2000).
Cápsulas de los géneros Cattleya y Cymbidium fueron utilizadas para la siembra
de semillas in vitro por Serna (1999); Pedroza et al. (2005) estudiaron un medio de
cultivo adecuado para germinar Comparettia falcata; Pedroza y Mican (2006)
germinaron semillas de Odontoglossum gloriosum; Damon et al., (2004)
estudiaron la germinación in vitro de tres especies de orquídeas de la región del
Soconusco en Chiapas (Brassavola nodosa, Guarianthe (Cattleya) aurantiaca y
Prosthechea (Encyclia) chacaoensis); Steele (2007), estudió la germinación in vitro
de semillas de Cypripedium arietinum, asimismo; Ruíz et al., (2008) germinaron in
vitro semillas de E. adenocaula.
50 12. PREPARACION DEL MEDIO DE CULTIVO IN VITRO
51 12. Preparación del medio de cultivo in vitro
Existen dos vías para la adquisición de medios de cultivo in vitro: La vía más fácil,
es adquirir el medio ya preparado que para algunas especies en particular ya los
venden en algunos laboratorios, solo se adiciona agua destilada según venga la
presentación, por ejemplo si es para 1 litro, se adiciona 20 gr. de sacarosa se ajusta
el pH a 5.5 y 6.5 gr. de agar bacteriológico, pero esto resulta de costo muy elevado.
La otra vía es adquirir los químicos que se enlistan en la tabla 1 y se preparan
soluciones madre, esto es necesario ya que las cantidades a pesar son muy
pequeñas y es posible equivocarse cuando se pesa, además generalmente se
prepara mas de un litro de medio. Debe utilizarse agua destilada para diluir los
compuestos.
De las soluciones concentradas se tomará el volumen indicado para un litro y se
mezclarán, se agregará la sacarosa ó azúcar (20 gr), se ajusta el pH a 5.7 (si no se
cuenta con un potenciómetro, puede usar papel pH) y por último se adiciona el agar
bacteriológico (6.5 gr). Se disuelve el agar mediante agitación manual y
posteriormente se introduce un microondas por 2 minutos o a calor directo sin dejar
que hierva, y repitiendo la acción hasta su total dilución. Se vacían 20 ml de medio
en frascos Gerber de 100 ml, se tapan y se esterilizan por autoclave a 121˚C, 1.1
Kg/cm3 durante 15 minutos (o bien puede usar una olla Express).
Para ajustar el pH se puede usar papel indicador de pH o un potenciómetro, para
ajustarlo se utilizan las soluciones 1 N ó 0.5N de ácido clorhídrico o sosa (hidróxido
de potasio)
Preparación de KOH 0.5 N. Disolver 2.8 g de KOH en 80 ml de agua destilada y
aforar (llevar) a 100 ml.
Preparación de KOH 1.0 N. Disolver 5.611 g en 80 ml de agua destilada y aforar a
100 ml.
52 Preparación de HCl 1N. Disolver 4 ml de HCl en agua y aforar a 50 ml.
Preparación de HCl 0.5 N. Disolver 2 ml de HCl en agua y aforar a 50 ml.
Nota: causa una reacción exotérmica por lo que se debe vaciar lentamente
por las paredes el ácido sobre el agua nunca el agua sobre el ácido.
53 Cuadro 1. Medio Murashige y Skoog (1962) (MS)
Compuesto
SALES
Nitrato de amonio
Nitrato de potasio
Sulfato de magnesio
Sulfato manganoso
Sulfato de zinc
Sulfato cúprico
Cloruro de calcio
Yoduro de potasio
Cloruro de cobalto
Fosfato de potasio
Ácido bórico
Molibdato de sodio
Na2EDTA
Sulfato ferroso
VITAMINAS MS
Inositol
Ac. Nicotínico
Piridoxina – HCL
Tiamina – HCL
Glicina
Fórmula química
Cantidad (g/l)
NH4NO3
KNO3
MgSO4.7H2O
MnSO4.H2O
ZnSO4.7H2O
CuSO4.5H2O
CaCl2.2H2O
Kl
CoCl2.6H2O
KH2PO4
H3BO3
Na2MoO4.2H2O
Na2C10H14N2O8.2H2O
FeSO4.7H2O
1.65
1.90
0.37
0.0169
0.0086
0.000025
0.44
0.00083
0.000025
0.17
0.0062
0.00025
0.03724
0.02784
C6H12O6
C6H5NO2
C8H11NO3-HCl
C12H17CIN4OS.HCl
NH2CH2COOH
0.1
0.0005
0.0005
0.0001
0.002
54 12.1. Preparación de soluciones madre
MS
Macroelementos
mg/l
g/l
10x-200
NH4 NO3
1650
1.61
16.5 g
KNO3
1900
1.90
19.0 g
.
MgSO4 7H2O
370
0.37
3.7 g
KH2 PO4
170
0.17
1.7 g
Pesar y disolver en 80 ml aprox. Llevar a 100 ml. Etiquetar macroelementos 10X200 ml. De esta solución se deberán tomar 20 ml por cada litro de medio.
MS
Calcio
mg/l
g/l
10x-100
.
CaCl2 2H2O
440
0.44
4.4 g
Pesar y disolver en 80 ml aprox. Aforar a 100 ml (usar agua destilada).
Etiquetar Calcio 10X100 ml. De esta solución se deberán tomar 10 ml por
cada litro de medio.
SOL. DE FIERRO
mg/l
MS
g/l
10x-100
FeSO4.7H2O
Na2EDTA.2H2O
27.8
37.3
0.0278
0.0373
0.278 g
0.373 g
Disolver el EDTA en agua destilada caliente (30 ml ), en otro vaso disolver el Fe
en agua fría, en un matraz adicionar los dos y aforar a 100 ml. Etiquetar Sol. de
Fe 10X-100ml. De esta solución se deberán tomar 10 ml por cada litro de medio.
55 MS
MICROS
mg/l
g/l
g/20 (20X)
KI
H3BO3
MnSO4.4H2O
0.83
6.20
22.3
0.00083
0.0062
0.0223
ZnSO4.7H2O
Na2MoO4.2H2O
CuSO4.5H2O
CoCl2.6H2O
8.6
0.25
0.025
0.025
0.0086
0.00025
0.000025
0.000025
0.0166 g
0.124 g
0.446 g
Nota: si es MnSO4.H2O pesar
0.338 g
0.172 g
0.005 g
0.0005 g
0.0005 g
Pesar y disolver en 80 ml aprox. Aforar a 100 ml (usar agua destilada). Etiquetar
Micros 20X-100 ml. De esta solución se deberán tomar 5 ml por cada litro de
medio.
MS
VITAMINAS
Tiamina-HCl
Acido nicotínico
Piridoxina-HCl
mg/l
0.1
0.5
0.5
g/l
0.0001
0.0005
0.0005
20x-100
0.002 g
0.01 g
0.01 g
Pesar y disolver en 80 ml aprox. Aforar a 100 ml (usar agua destilada). Etiquetar
Vitaminas 20X-100 ml. De esta solución se deberán tomar 5 ml por cada litro de
medio.
MS
mg/l
g/l
g/10 (10X)
100
0.1
1.0 g
Pesar y disolver en 80 ml aprox. Aforar a 100 ml (usar agua destilada). Etiquetarar
Vitaminas 20X-100 ml. De esta solución se deberán tomar 10 ml por cada litro de
medio.
MYO-INOSITOL
56 12.2. Condiciones ambientales de los cultivos in vitro
Una vez realizada la siembra, los frascos sembrados se tapan y con papel adherente
se sella alrededor de las tapaderas, posteriormente deberán colocarse en un cuarto
de incubación con temperaturas de 20 -25 ºC. Se pueden colocar en un sitio donde
haya buena luminosidad siempre y cuando se encuentre cerca del sitio donde se
desarrolle la especie que se trate.
12.3. Características del cuarto de crecimiento
Ø Instalación eléctrica (110 y 220 v)
Ø Aire acondicionado para mantener una temperatura de 27 °C
Ø Colocar balastras fuera del cuarto de cultivo
Ø Fotoperiodo por nivel (control automático)
Ø Lámparas (Grolux, Solar, Dro-tes o Power Grove), buscar que se cubra todo el
espectro de luz
Los cultivos se deberán mantener con un fotoperíodo de 16 horas luz por 8 de
oscuridad, una temperatura constante de 25oC y una intensidad lumínica de 2000
lux.
57 13. PROCEDIMIENTO PARA ESTABLECER EL CULTIVO IN VITRO
58 13. Procedimiento para establecer el cultivo in vitro
13.1. Preparación del medio nutritivo
En las Figuras 21A y 21B podemos observar la secuencia en la preparación del
medio de cultivo de interés y por último, refrigerarlo esterilizado para cuando se
requiera efectuar la siembra de semillas de alguna especie en particular.
Selección de nutrientes
Ajuste de PH
Peso de nutrientes
Disolución de nutrientes
Figura 21A. Selección y Preparación de los medios de cultivo
in vitro. Fotos: Carmen Ruíz Bello
59 Se seleccionan y se pesan los nutrientes, se disuelven en agua y se mide el pH
recomendado
Continúa la preparación del medio de cultivo in vitro
Añadir agar Medios esterilizados en refrigeración Frascos Gerber de 100 ml Esterilizar medio 20 min Depositar 20 ml en cada frasco Frascos en autoclave Figura 21B. Selección y preparación del medio de cultivo. Fotos: Carmen Ruíz Bello
Se añade el agar al agua, el medio se deposita en frascos Gerber, se esterilizan en
autoclave y se guardan en refrigerador.
60 13.2. Siembra de las semillas y germinación de las mismas
En la Figura 22 podemos observar los pasos a seguir para la siembra de las semillas
en cultivo in vitro; asi como de la germinación in vitro de las mismas.
Figura 22. Secuenciación de la disección de la cápsula, siembra de semillas in
61 vitro y germinación . Fotos: Carmen Ruíz Bello.
Pasos para la siembra de semillas en el cultivo in vitro
1. Se lava la cápsula con agua y jabón
2. Se introduce la cápsula en alcohol etílico y se flamea. Se repite el mismo
procedimiento tres veces
3. Se espera que la cápsula se enfríe y se disecta para extraer las semillas
4. Se recogen las semillas con la ayuda de un bisturí para depositarlas al medio de
cultivo dentro del frasco Gerber
5. Se sella el frasco Gerber con papel parafilm
6. Se ponen los frascos en un cuarto de incubación
7. Se observa si hay germinación a los días siguientes
13.3. Formación de protocormos y de hojas
En la Figura 23 podemos observar la formación de los protocormos de las semillas
germinadas; y el desarrollo de las hojas de las nuevas plántulas.
62 Figura 23. Formación de protocormos, desarrollo de las hojas.
Fotos: José Luis Moreno Martínez
13.4. Formación de raíces y crecimiento de las plántulas
En la Figura 24 puede apreciarse la formación de raíces y el crecimiento de las
plántulas (Figura 25).
63 Figura 24. Formación de raíces, crecimiento de plántulas.
Fotos: José Luis Moreno Martínez
64 Figura 25. Plántulas de orquídeas, provenientes de semillas
germinadas in vitro. Fotos: Carmen Ruíz Bello.
13.5. Trasvase y separación de las plántulas
Cuando las plántulas tengan competencia alimenticia, hay que trasvasar a medios
nuevos separándolas para que puedan nutrirse (Figura 26)
65 Figura 26. Trasvase de plántulas.
Fotos: Carmen Ruíz Bello
Se continúa el trasvase las veces que se considere necesario hasta que las
plántulas alcancen un tamaño adecuado para adaptarlas al medio ambiente. Una
vez que las plántulas alcancen un crecimiento considerable, son sacadas de los
medios de cultivo in vitro y se busca sembrarlas en un sustrato adecuado
13.6. Adaptación al medio ambiente
Cuando las plantas alcancen un tamaño aproximado de cinco centímetros de altura,
se procede a sacarlas de los frascos gerber para adaptarlas a condiciones de
invernadero sembrándolas en un sustrato adecuado (Figura 27).
66 Figura 27. Plántulas en proceso de adaptación en el
invernadero. Fotos: Carmen Ruíz Bello
Un sustrato adecuado puede ser una mezcla de tezontle triturado, cáscara de coco
molida y corteza de encino en una proporción 1:1:1. Es importante considerar que la
adaptación de las plántulas del laboratorio al invernadero deberá ser en forma
paulatina; como se indica a continuación:
1. Trasladar los frascos del laboratorio al invernadero y quitar el plástico adherente
2. Aflojar las tapaderas de los frascos sin quitarlas y dejarlos un día. Se deberán ir
67 destapando gradualmente los frascos.
3. Esterilizar las charolas donde se colocará el sustrato, utilizando alcohol o cloro.
4. Depositar el sustrato en las charolas.
5. Se sacan del frasco las plántulas y eliminar los restos del agar de las raíces con
agua destilada (no deberá quedar ningún residuo de agar ya que puede ser fuente
de contaminación).
6. Sumergir las plántulas en un recipiente que contenga fungicida (Captán).
7. Sumergir las raíces en una mezcla que contenga un producto enraizador.
8. Transplante de las plántulas en el sustrato.
9. Cubrir las charolas con plástico para conservar la humedad relativa.
10. Considerar que la temperatura ambiente en el invernadero al momento del
transplante no sea muy elevada.
11. Dar seguimiento de manejo a las plántulas para favorecer su mayor crecimiento.
Menchaca y Moreno (2006) recomiendan que lo ideal para el desarrollo de las
orquídeas epífitas es colocarlas en pedazos de troncos de encino de unos 20 ó 30
centímetros de largo y diámetro superiores a cinco centímetros, las plantas deberán
sujetarse al tronco con hilos o pedazos de tela de algodón o bien hilo de ixtle o
henequén. Todo material utilizado para la fijación de las plantas en el tronco deberá
ser degradable para evitar que obstruya o ligue el crecimiento del pseudobulbo y la
raíz. Es recomendable colocar musgo entre la planta y el tronco, y mantenerlo
siempre verde lo cual nos servirá como indicador de la humedad.
68 13.7. Establecimiento de plantas en macetas
Cuando las plántulas crecen se recomienda establecer las plantas en macetas.
Figura 28. Plantas sembradas en macetas adaptadas al
medio ambiente (Encyclia adenocaula).
Fotos: José Luis Moreno Martínez
69 14. POLINIZACION MANUAL PARA OBTENER CAPSULAS CON SEMILLAS
70 14. Polinización manual para obtener cápsulas con semillas
Cuando no se encuentran cápsulas con semillas en forma natural, se pueden
polinizar en forma manual las flores; esto consiste en ubicar el polen en la flor
(Figura 29A), desprenderlo completo y depositarlo en el gineceo de la flor (Figura
29B) ya sea de la misma flor si se desea autofecundar, o bien hacer un
cruzamiento con otra flor de otra planta
A) Con el bisturí se señala el polen
de la flor
B) Gineceo de la flor (al fondo)
donde se deposita el polen
Figura 29. A) Ubicación del polen; B) Ubicación del gineceo.
Fotos: José Luis Moreno Martínez
Si la polinización se lleva a cabo y se produce la fecundación, se originaría un
fruto o cápsula con los óvulos fecundados por dentro que serían las semillas
(Figura 30).
71 Figura 30. Fruto ó cápsula producto de la fecundación
Foto: José Luis Moreno Martínez
72 15. CONSERVACION DE ORQUIDEAS
73 15. Conservación de orquídeas
La obsesión por las orquídeas llegó a afectar la sobrevivencia de varias especies de
orquídeas a través de la colecta desenfrenada de las mismas; colocando a la familia
Orchidaceae en la lista de especies en peligro de extinción o raras, y en algunos
casos muchas de las especies de la familia ya son declaradas extintas.
El peligro causado por las expediciones realizadas durante los siglos XIX y XX
continúa hoy en día y constituye una amenaza a la sobrevivencia de las especies de
orquídeas.
Es necesario, la concientización de las personas al respecto y la
búsqueda de soluciones que satisfagan las necesidades de los productores y
coleccionistas. Además, es importante trazar estrategias para la conservación ex
situ e in situ de especies de orquídeas amenazadas, con el fin de lograr un eficiente
manejo de las mismas para un uso sustentable y la obtención de colecciones vivas
ex situ, que representen genéticamente a las poblaciones naturales (Vendrame y
Pinares, 2009).
El cambio climático global es una razón para conservar una gama de recursos
genéticos en las especies comerciales. Los modelos climáticos proyectan hasta
un aumento de 5º C en la temperatura global en los próximos 50 años como
resultado del “efecto de invernadero” (Ledig, 2004) ¿Qué pasará si los recursos
genéticos se pierden?
México tiene una gran amenaza en cuanto a la pérdida de su biodiversidad debido
a innumerables factores como: incendios, plagas y enfermedades, la tala
inmoderada, el saqueo, así como el cambio de uso de suelo. Resulta apremiante
desarrollar estrategias que permitan la conservación eficaz y permanente de los
recursos fitogenéticos. En particular es de gran importancia la conservación de las
especies nativas ornamentales, muchas de cuales se encuentran amenazadas o
en vías de extinción. Por tal motivo urge implementar estrategias biotecnológicas,
como el cultivo in vitro de células y tejidos vegetales que permitan el rescate,
74 conservación y multiplicación de diversas especies amenazadas (Rodríguez,
2003).
Debido a la importancia de preservar los recursos genéticos, aproximadamente 30
países, entre ellos México, han venido realizando esfuerzos tendientes al
establecimiento de bancos de germoplasma. Convencionalmente el germoplasma
se colecta en forma de semillas, pues estas ocupan relativamente poco espacio y
pueden almacenarse por muchos años. Las semillas se pueden secar y mantener
a bajas temperaturas.
De esa forma pueden distribuirse a otros centros de
introducción o a diferentes bancos de germoplasma. Aunque el almacenamiento
de germoplasma por medio de semillas es la forma más eficiente, no siempre es
posible hacerlo puesto que algunas plantas no producen semillas fértiles o pierden
rápidamente su viabilidad. Por otro lado, las semillas de algunas especies se
deterioran fácilmente debido al ataque de microorganismos y plagas
1990).
(Ochoa,
Blanco (1985) informa que para lograr la preservación de la riqueza
genética en el mundo es recomendable la creación de bancos de germoplasma.
Sin embargo, la implantación de bancos genéticos requiere de un fuerte apoyo de
investigación en el campo de cultivo de tejidos para poder lograr una correcta
conservación de las plantas que representan problemas para conservarse. Por lo
tanto, es necesario impulsar la investigación de estas áreas con el fin de
integrarse al avance y a la comprensión de los últimos desarrollos y de las
consecuencias de sus aplicaciones.
15.1. Estrategias de conservación in situ y ex situ
Las especies de plantas de propagación vegetativa, con un ciclo biológico largo o
con semillas de corta duración (recalcitrantes) suelen mantenerse en bancos de
germoplasma de campo. Casi todos los países cuentan con al menos un banco
de germoplasma de campo, y otros poseen varios.
Aunque son fáciles de
caracterizar y evaluar las plantas provenientes de los bancos de germoplasma de
campo, estas están expuestas a pérdidas, debido al ataque de plagas y
75 enfermedades o a condiciones ecológicas adversas, como la sequía, las
inundaciones, los incendios y el viento, entre otros. Actualmente se trabaja para
perfeccionar la metodología que permita el almacenamiento in vitro como un
método alternativo complementario. Son en la actualidad muchos los países que
han indicado que es necesario mejorar y organizar tecnologías apropiadas de
conservación para las especies con semillas no ortodoxas y para las plantas de
propagación vegetativa (FAO, 1996).
15.1.1. Conservación in situ
La conservación in situ (Figura 31)es una vía apropiada para preservar las
especies que no pueden desarrollarse o regenerarse fuera de su hábitat natural.
Esta vía, además, permite la conservación de varias especies al mismo tiempo en
un ecosistema y facilita la investigación en su hábitat natural. Recientemente ha
surgido el interés en la conservación de poblaciones de cultivos nativos en
comunidades rurales con sistemas de agricultura tradicional, así como en el
establecimiento de programas de mejoramiento participativo. Este sistema
involucra la participación tanto de los fitomejoradores como de los agricultores
(Ramírez et al., 2000).
15.1.2. Conservación ex situ
La conservación ex situ (Figura 32) tiene dos principales variantes: la propagación
y el mantenimiento de las especies que ya no pueden subsistir en la naturaleza, y
otra modalidad que consiste en la propagación masiva y subsecuente
comercialización de la mayor cantidad de especies por parte del mayor número
posible de personas, lo que es de suma importancia porque reduce y desalienta la
colecta de ejemplares en la naturaleza (Hágsater et al., 2005).
La conservación in situ de las orquídeas mexicanas y de la biota del país en
general enfrenta graves problemas que deben resolverse. Uno de ellos es que un
número grande de regiones importantes para la conservación no están ubicados
dentro del SINAP (Sistema Nacional de Areas Protegidas) ni son protegidas por
los pobladores locales. Esto es especialmente evidente en Oaxaca y Guerrero, y
76 es bien sabido que el primero de ellos es el estado más biodiverso de México.
Otro problema se refiere a la permanencia de los hábitats dentro de las áreas ya
incluidas en el SINAP, pues no hay vigilancia adecuada en casi ningún área
natural protegida. La tala, la extracción de especies útiles, la invasión de terrenos,
la ganadería, la agricultura nómada y otros problemas relacionados con la
tenencia de la tierra son cuestiones cotidianas en todas ellas.
Existen sin
embargo, ejemplos exitosos de conservación como las reservas de la biosfera de
Chamela-Cuixmala y Calakmul, los bosques comunitarios de la Unión ChinantecoZapoteca en el norte de Oaxaca y el Monumento Natural Bonampak, manejado
por los lacandones (Hágsater et al.,2005). Si bien el cultivo de orquídeas por parte
de aficionados no necesariamente es “hacer conservación ex situ”, puede llegar a
serlo. Las especies vistosas o al menos con cierto interés hortícola tienen más
posibilidades de ser atractivas para los cultivadores; para estas especies, los
viveristas y los aficionados pueden desempeñar un papel importante en su
conservación, por ejemplo manteniendo un buen cultivo, colecciones grandes,
diversas y bien organizadas, y permitiendo que el germoplasma que resguardan
pueda ser utilizado para propagación y otras acciones cuando sea necesario
(Hágsater et al., 2005).
La aplicación de estas tecnologías para establecer bancos de germoplasma se ha
convertido en una alternativa muy eficaz para la conservación de numerosas
especies vegetales a nivel mundial. Los métodos convencionales de conservación
de germoplasma a través de los bancos de semillas cumplen un papel muy
importante dentro de las estrategias de conservación de material vegetal ex situ.
Sin embargo, son muchos los problemas asociados a este método de
conservación. Destaca entre ellos la susceptibilidad que muestran las plantas al
ataque de plagas y/o patógenos, la dificultad de conocer los requerimientos
naturales para la germinación de ciertas semillas y la pérdida de la viabilidad que
se produce al cabo de cortos períodos de tiempo de almacenamiento bajo las
técnicas convencionales (Serna, 1999). Por ello desde el punto de vista
conservacionista, las técnicas de cultivo in vitro han resultado ser muy útiles para
la protección de la flora amenazada.
77 Figura 31. Conservación in situ
Foto: Carmen Ruíz Bello
Figura 32. Conservación ex situ
Foto: Carmen Ruíz Bello
78 15.2. Conservación in vitro de tejidos vegetales
El descubrimiento de la totipotencialidad de las células vegetales y la posibilidad
de desarrollar plantas normales y completas a partir de diferentes explantes ha
permitido pensar en el establecimiento de bancos de germoplasma utilizando el
cultivo de tejidos vegetales. En estos casos la conservación de los genotipos se
realiza mediante el mantenimiento de plantas vivas o mediante el cultivo in vitro de
ápices caulinares o de nudos. El mantenimiento de los recursos fitogenéticos
mediante los métodos de cultivo in vitro se logra generando cambios en el
ambiente de cultivo que permitan desacelerar el crecimiento de las células y de los
tejidos (Scocchi y Hebe, 2004).
Las técnicas para la preservación de
germoplasma están basadas en la disminución de la actividad metabólica de las
células, tejidos ú órganos vegetales, de tal manera que se evite el crecimiento y
que se mantenga la posibilidad regenerativa de los mismos. Para cultivar material
vegetal in vitro siempre se desea establecer las condiciones óptimas de nutrientes,
vitaminas, reguladores de crecimiento y factores ambientales adecuados. Cuando
se modifican tales factores, el crecimiento puede disminuir o inhibirse
completamente.
En general, el crecimiento se puede limitar, reduciendo la
temperatura, modificando la composición química del medio de cultivo,
disminuyendo el contenido de agua que se almacena o alterando la atmósfera
gaseosa (Ochoa, 1990).
De acuerdo con Rublúo (1985), la preservación de vegetales in vitro puede
efectuarse por dos vías: corto-mediano plazo, en la que se limita el crecimiento de
las plántulas in vitro mediante bajas temperaturas, inductores de estrés osmótico,
entre otros, y la vía del largo plazo, en la que los tejidos se almacenan a
temperaturas superbajas (–196ºC).
La posibilidad de aplicar las técnicas de
cultivo in vitro a la conservación a medio o largo plazo de material vegetal deriva
de la propia dinámica que esta técnica impone. El hecho de mantener los tejidos o
células vegetales en crecimiento continuo bajo condiciones más o menos óptimas
asegura no solo la posibilidad
de propagar la planta de la que derivan tales
79 células sino implícitamente una forma de mantener el cultivo durante períodos
prolongados (Serna, 1999).
En orquídeas, se están llevando a cabo estudios para aplicar diversas
metodologías de crioconservación que ayuden a su conservación in vitro
(Nikishina et al., 2001; Na y Kondo, 1996; Ishiikawa et al., 1997; JunHui et al.,
1999; Devi et al., 1998; Tsukazaki et al., 2000; Divakaran et al., 2006; Thammasiri,
2000).
Divakaran et al., 2006 realizaron estudios de conservación in vitro de
vainilla (Vanilla planifolia) mediante la técnica de crecimiento lento, con buenos
resultados.
Devi et al. (1998) estudiaron el comportamiento de protocormos
encapsulados
de
las
orquídeas:
Agrostophyllum
myrianthum,
Cymbidium
longifolium Phaius tankervilliae y Renanthera imschootiana; almacenados a 4ºC
los cuales mostraron 70% de viabilidad. Entre los trabajos de investigación en
orquídeas por la técnica de crioconservación, se pueden citar algunos: Nikishina et
al. (2001) estudiaron la crioconservación de semillas de orquídeas tropicales
(Angraecum magdalenae, Trichopilia tortilis, Miltonia flavescens x Brassia
longissima, Encyclia cochleata y Eulophiella roempleriana), Na y Kondo (1996)
estudiaron la criopreservación de raíz primordia de Vanda pumila, Ishikawa et al.
(1997) crioconservaron semillas germinadas por 10 días de Bletilla striata, JunHui
et al. (1999) investigaron la crioconservación de semillas- protocormos de
Dendrobium candidum, Tsukazaki et al., 2000 estudiaron la criopreservación de
células en suspensión por vitrificación de Doritaenopsis, Thammasiri (2000)
estudió la criopreservación de semillas de Doritis pulcherrima. Sin embargo, falta
mucho por estudiar para poder conservar estos valiosos recursos naturales.
80 16. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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