Download Feijoa sellowiana Berg. - Estación Fitopatolóxica do Areeiro

SINTOMATOLOGIA ASOCIADA A FITOPLASMAS EN
FEIJOA (Feijoa
(Feijoa sellowiana Berg.)
Mansilla J.P., Abelleira A.,Salinero M.C. (1) Abad P., Font I. y Jordá C. (2)
(1) Estación Fitopatológica Do Areeiro. Diputación Provincial de Pontevedra. Subida a la Robleda s/n 36153. Pontevedra.
(2) Dpto. Producción Vegetal. Patología Vegetal. Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos. Universidad Politécnica. Cno. de Vera 14. 46020- Valencia.
DESCRIPCIÓN DE LA PLANTA
La Feijoa sellowiana Berg. es una planta leñosa de la familia
Myrtaceae que crece espontáneamente en países sudamericanos. Su
introducción en Europa, se realizó a finales del siglo XIX. Siendo
California y Nueva Zelanda los países que iniciaron y potenciaron el
valor frutal de esta especie (Salinero et al, 1985).
Es un árbol de hoja perenne ( 2 a 4 m). Las hojas
son elípticas de 4 a 8 cm de longitud, opuestas y
coriáceas. Color verde oscuro en el haz y grisáceo en
el envés .
Las flores son vistosas con 4 pétalos rojos carmín
y largos estambres en un rojo muy intenso. En
nuestra provincia la floración comienza a finales de
Mayo y se extiende, según las zonas hasta Junio. Los
frutos son bayas verdes grisáceas de forma
redondeada a ovoide. El peso medio del fruto oscila
entre 60 y 150 g. La pulpa es blanquecina, jugosa,
aromática y de sabor agradable. La maduración se
realiza de Octubre a Noviembre. Una buena razón
para promocionar la Feijoa es su elevado contenido,
en sales minerales siendo una de las pocas frutas
con cantidades apreciables de Iodo (15 ppm) .
SINTOMATOLOGIA ASOCIADA A STOLBUR
Se ha observado una sintomatología muy característica :
-En las ramas, una fasciación muy acusada de la parte terminal,
-En las flores un engrosamiento y deformación especialmente
visible
a nivel del pistilo al que se sueldan los estambres;
terminandose por caer.
Estos daños se observaron tanto en la plantación experimental
“Do Areeiro” (desde 1987) como en plantaciones de otras
Comunidades (Tenerife y País Vasco, año 1988 y 1990
respectivamente).
Esta fasciación, se detectó inicialmente de manera puntual en
alguna de las variedades cultivadas. En la actualidad se ha hecho
patente y constante en el cultivar ALPE estando afectadas el 100% de
las plantas con una media de 4-6 ramas por árbol y de manera más
esporádica sobre los cultivares Mammouth y Triumph.
SITUACIÓN ACTUAL DEL CULTIVO
El estudio del cultivo de la feijoa (Feijoa sellowiana Berg) y su
problemática fitosanitaria se inició en Galicia en el año 1986. Ese mismo
año, en la Finca “Do Areeiro” (Pontevedra), se estableció una plantación
experimental formada inicialmente
por cultivares locales (Alpe,
Castroviejo y Vilagarcía), obtenidos por estaquillado de plantas antiguas
distribuidas por la provincia. Posteriormente se añadieron nuevas
variedades seleccionadas en Nueva Zelanda, completándose hasta un
total de 10 variedades con 18 pies por variedad. (Salinero et al. 1996)
Hoy en día existen unas 10 ha de cultivo en toda Galicia, en pequeñas
superficies familiares.
DETALLE DE LOS SÍNTOMAS
MATERIAL Y MÉTODOS
RAMA SANA
RAMA AFECTADA
FLOR SANA
FLOR AFECTADA
En 1997 se han procesado plantas de feijoa que presentaban la sintomatología descrita así como plantas de esta especie vegetal aparentemente sanas para el
diagnóstico de fitoplasmas. La detección de estos microorganismos patógenos se ha realizado mediante la amplificación de una secuencia conservada de la fracción 16S
del ADN ribosómico (ADNr) de los fitoplasmas usando la técnica "nested-PCR" según las condiciones descritas por Lee et al. (1994).En primer lugar se procedió a una
extracción de ADN total, basada en el protocolo publicado por Prince et al. (1993), partiendo de 2 g de material vegetal constituido por nervios principales de hojas. El ADN
purificado se resuspendió en 200 ml de tampón TE pH 8. Para la primera amplificación del ADN se empleó la pareja de primers universales de fitoplasmas R16mF2/R16mR1
(mF2/R1) (Gundersen y Lee, 1996) que delimita una secuencia conservada del ADNr 16S de los fitoplasmas de 1.3 kpb de tamaño. El producto de esta amplificación se
sometió a una segunda amplificación interna con la pareja de primers universales del ADNr 16S de fitoplasmas R16F2n/R16R2 (F2n/R2) (Gundersen y Lee, 1996; Lee et al.,
1993). En ambas reacciones de síntesis de ADN, la mezcla de PCR contenía 1 ml de ADN, dNTP 200 mM, pareja de primers 0.4 mM, tampón de reacción 1x y 1.25 unidades de la
ADN polimerasa termoestable Amplitaq (Perkin Elmer) en un volumen total de 50 ml. Los parámetros programados en el termociclador fueron: 94°C 2 min para la
desnaturalización inicial del ADN, 35 ciclos de 94°C 1 min, 55°C 2 min y 72°C 3 min para la amplificación del ADN y un ciclo de 72°C 7 min para la extensión final. El control
negativo de la PCR contenía todos los reactivos de la mezcla PCR excepto ADN. Los ADN de cepas de fitoplasmas de referencia empleados en este diagnóstico han sido:
"aster yellow" y "stolbur" cedidas por R.E. Davis (ARS-USDA, Beltsville, Maryland). Los productos de amplificación se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa
1% con tampón TAE 1x. Los geles se tiñeron con bromuro de etidio y se visualizó el fragmento de ADNr amplificado con un transiluminador de luz UV.
Para la identificación del fitoplasma o fitoplasmas presentes en las plantas de feijoa se realizó un análisis RFLP del ADN sintetizado por PCR. Alícuotas del ADNr 16S
amplificado mediante "nested-PCR" con la pareja de primers F2n/R2 se digirieron con las endonucleasas de restricción AluI, HpaI, KpnI, MseI y TaqI (Boehringer Mannheim)
durante 24h a 37°C, excepto en la digestión con TaqI cuya temperatura de incubación fue 65°C. Los fragmentos de restricción se separaron mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida 5% en tampón TBE 1x. Los geles, teñidos con bromuro de etidio e iluminados con luz UV, se fotografiaron con película Polaroid para su posterior análisis.
RESULTADOS
Figura 1. Análisis RFLP del segmento amplificado de ADNr
16S digerido con las endonucleasas AluI y MseI. Marcador
(M): fragmentos (pares de bases) de ADN ØX174 digerido
con HaeIII.
Figura 2. Análisis RFLP de la secuencia amplificada de ADNr
16S con las enzimas de restricción KpnI y TaqI. Marcador
(M): fragmentos (pb) de ADN ØX174 digerido con HaeIII.
Figura 3. Electroforesis PAGE 5% de la secuencia
amplificada de ADNr 16S digerida con las endonucleasas de
restricción AluI y MseI. Marcador (M): fragmentos (pb) de
ADN ØX174 digerido con HaeIII.
Figura 4. Electroforesis PAGE 5% de la secuencia
amplificada de ADNr 16S digerida con las enzimas de
restricción KpnI y HpaI. Marcador (M): fragmentos (pb) de
ADN ØX174 digerido con HaeIII.
A partir de ADN total, extraído de plantas de feijoa con síntomas de posible fitoplasmosis y de una planta de la misma especie vegetal asintomática, se ha obtenido un
producto de amplificación de 1.2 kpb aplicando la técnica "nested-PCR" con las parejas de primers mF2/R1 y F2n/R2 consecutivamente. El tamaño de este fragmento de ADN
amplificado coincide con el de la secuencia de ADNr 16S de los fitoplasmas que es amplificada por PCR con los oligonucleótidos F2n/R2 (Gundersen y Lee, 1996). En el análisis
RFLP del segmento amplificado de ADNr 16S procedente de muestras de plantas de feijoa con síntomas, la digestión con las endonucleasas de restricción AluI y MseI
coinciden totalmente con el obtenido a partir del fitoplasma de referencia "stolbur" (Fig.1). El tamaño de los fragmentos de ADN obtenidos tras la digestión con las enzimas
de restricción KpnI y TaqI de la secuencia amplificada de ADNr 16S de feijoa enferma son idénticos a los del fitoplasma de referencia "stolbur" (Fig. 2). Estos resultados
concuerdan con el mapa de restricción del segmento de ADNr 16S amplificado con los oligonucleótidos F2n/R2 del fitoplasma "stolbur" publicado por Davis et al. (1997). En el
análisis RFLP de la secuencia amplificada de ADNr 16S procedente de planta de feijoa aparentemente sana, la digestión con las enzimas AluI y MseI revela la existencia de
polimorfismos al compararlo con el patrón RFLP obtenido del fitoplasma de referencia "aster yellow" (Fig.3). Esta misma secuencia de ADN de feijoa asintomática digerida
con KpnI (Fig.4) revela un RFLP típico de fitoplasmas del grupo "aster yellow" o del grupo "stolbur", ya que los fitoplasmas que pertenecen a otros grupos de la clasificación
basada en el segmento ADNr 16S amplificado con la pareja de primers F2n/R2 no poseen ningún punto de reconocimiento para KpnI en esta secuencia génica (Gundersen y
Lee, 1996). La digestión de esta secuencia génica con HpaI (Fig.4) no proporciona información para la identificación del fitoplasma presente en la planta de feijoa sin
síntomas analizada.
Los resultados obtenidos en el presente estudio demuestran que las plantas de feijoa enfermas están infectadas con el fitoplasma "stolbur". Este patógeno está descrito en
numerosos cultivos y plantas silvestres (Seemüller et al. 1998) y es transmitido por diversas especies de insectos, siendo la cicádula Hyalesthes obsoletus el vector más citado,
aunque en el caso de feijoa se desconoce el vector de transmisión implicado. La detección mediante "nested-PCR" del fitoplasma "stolbur" en planta de feijoa aparentemente
sana es muy importante para el control de la enfermedad descrita en este trabajo. Es esencial que el cultivo de la feijoa se base en el uso de material de propagación sano.
REFERENCIAS
Davis R.E., Dally E.L., Tanne E y Rumbos C. 1997. Phytoplasmas associated with grapevine yellows in Israel and
Greece belong to the stolbur phytoplasma subgroup, 16SrXII-A. Journal of Plant Pathology 79(3):181-187.
Gundersen D.E. y Lee I.-M. 1996. Ultrasensitive detection of phytoplasmas by nested- PCR assays using two
universal primer pairs. Phytopathologia Mediterranea 35 :144-151.
Lee I.-M., Hammond R.W., Davis R.E. y Gundersen D.E. 1993. Universal amplification and analysis of pathogen
16S rDNA for classification and identification of mycoplasmalike organisms.Phytopathology 83:834-842.
Lee I.-M., Gundersen D.E., Hammond R.W. y Davis R.E. 1994. Use of mycoplasmalike organism (MLO) groupspecific oligonucleotide primers for nested-PCR assays to detect mixed-MLO infections in a single host plant.
Prince J.P., Davis R.E., Wolf TK., Lee I.-M., Mongen B.D., Dally E.L., Bertaccini A., Credi R. y Barba M. 1993.
Molecular detection of diversa mycoplasmalike organisms (MLOs) associated with grapevine yellows and their
classification with aster yellows, X- disease, and elm yellows MLOs. Phytopathology 83:1130-1137.
Salinero M.C., Mansilla J.P. y Abelleira A. 1985. El cultivo de la Feijoa en Pontevedra; Ed. Excma. Dip. Prov.
Pontevedra, Monografía 24 pp.
Salinero M.C., Aguin O., 1996. Comportamiento en plantación experimental de distintas variedades de Feijoa
sellowiana Berg:. ITEA , vol extra nº 92 nº 3: 224-237.
Seemüller E., Marcone C., Laner U., Ragozzino A. y Goschl M. 1998. Current status of molecular classification of
the phytoplasmas. Journal of Plant Pathology 80:3-26.
IX CONGRESO DE LA SOCIEDAD ESPAÑOLA DE FITOPATOLOGÍA. SALAMANCA, 19 al 23 Octubre 1998
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