Download Estudio fitoquímico de Flaveria bidentis (L.) Kuntze

TRABAJOS ORIGINALES
Estudio fitoquímico de Flaveria bidentis (L.) Kuntze
(Asteraceae)
Ana Pastor de Abram
1
y Bertha Ruth Zelada Mariluz
1
1
Sección Química, Facultad de Ciencias e Ingeniería, Pontificia Universidad Católica del
Perú. Lima 100, [email protected] ;[email protected]
Resumen
El uso etnobotánico de Flaveria bidentis “ matagusano” es el de combatir la parasitosis
y afecciones bronquiales, principalmente en niños. La muestra fue colectada en Supe
Pueblo (Barranca - Lima).
La marcha fitoquímica de las capitulescencias, tallos, hojas y raíces de Flaveria bidentis,
permitió detectar: taninos, flavonoides, leucoantocianidinas, esteroides y
triterpenoides. Mediante técnicas cromatográficas de columna, capa delgada
preparativa y posteriores purificaciones se aislaron: 1-metil-3-(metil-tio)-benceno de
las capitulescencias y el 3-metilbencil mercaptano de las hojas; estos metabolitos
mostraron actividad nematicida al cabo de 72 horas frente a las larvas (J2) de
Meloidogyne incognita.
Palabras clave: Flaveria bidentis; Meloidogyne incognita; nematicida, mercaptanos;
fitoquímica; bioensayo.
Abstract
Ethnobotanical reports indicate that Flaveria bidentis “ matagusano” is a plant used in
antiparasitic and bronchial diseases, mainly in the children of the countryside from
Supe Pueblo (Barranca - Lima), where the plant material was collected for the present
study.
The phytochemical screening of the capitulescences, stems, leaves and roots parts of
Flaveria bidentis permitted to detect: tannins, flavonoids, leucoanthocyanidins, steroids
and triterpenoids. Making use of techniques such as column chromatography and thin
layer chromatography, two compounds were isolated: 1-methyl-3-(methylthio)benzene (capitulescences) and the 3-methylbencil mercaptan (Ieaves). Also the
biological assays showed that both compounds had nematicidal activity after72 hours
against larvae (J2) of Meloidogyne incognita.
Key words: Flaveria bidentis; Meloidogyne incognita; nematicide; mercaptanes;
phytochemistry; bioassay.
l. INTRODUCCIÓN
Desde tiempos remotos Flaveria bidentis, fue empleada por sus propiedades
medicinales. Los nativos machacaban la planta en sal marina y la aplicaban en úlceras
infectadas para impedir la supuración y expulsar los agentes patógenos y microbios que
se formaban en ellas1. Entre los usos medicinales reportados para Flaveria bidentis,
tenemos: antiparasitario, antitusígeno2.3 y antiséptico2. Otros usos son: como
colorantes 1,4 e insecticidas5.
El género Flaveria es conocido por ser fuente de flavonoides sulfatados en alto grado;
contienen también compuestos acetilénicos6.7; se caracterizan porque incluyen
especies pertenecientes a diferentes grupos fotosintéticos, principalmente especies C3 y
C4. Se han reportado variaciones en los patrones de flavonoides sulfatados con relación
a los tipos fotosintéticos; así las especies C4 acumulan flavonoides mono a
tetrasulfatados del tipo isoramnetina y quercetina o kaempferol sulfatados, mientras
que las especies intermedias C3-C4 y C3, acumulan flavonoides con baja sulfatación;
estos últimos utilizan predominantemente quercetina y patuletina como agliconas para
sus flavonoides8.
Flaveria bidentis presenta características fotosintéticas semejantes a las C4,
acumulando una variedad de ésteres de flavonoides sulfatados. Reportándose 3,7bisulfato de isoramnetina, 3,4'- bisulfato de quercetina, y 3,7,4'- trisulfato de
quercetina, 3,7,3'- trisulfato de quercetina, 3-acetil-7,3',4',-trisulfato de quercetina y
3,7,3',4'-tetrasulfato de quercetina6. También presentan compuestos acetilénicos del
tipo de tiofenos y sulfonas, no epoxidadas7,9.
Flaveria trinervia contiene flavonoides como apigenina y kaempferol disulfatos y
kaempferol e isoramnetina trisulfatos8. Para Flaveria chloraefolia se reporta 3-sulfato 6metoxikaempferol, 3-sulfato de eupalitina, 3-sulfato de eupatolitina, 3-sulfato de
eupatina, 3-sulfato de quercetina, 3-sulfato de patuletina, 3,3'-disulfato de quercetina y
3,3'-disulfato de patuletina 6.10.
Los estudios in vitro con larvas juveniles (J2) de Meloidogyne incognita son empleados
en bioensayos para una variedad de sustancias tóxicas. Este método biodirigido ha sido
aplicado a extractos vegetales; sus resultados orientan el aislamiento de componentes
bioactivos11-12, siendo un procedimiento sencillo, rápido y de bajo costo.
II. PARTE EXPERIMENTAL
Material biológico
Las muestras de Flaveria bidentis, fueron colectadas en un campo de cultivo de la
hacienda "Pan de azúcar" en Supe Pueblo, Barranca, Lima.
Para la marcha fitoquímica se emplearon las capitulescencias, hojas, tallos y raíces
secas y molidas. Para el análisis fitoquímico, las capitulescencias y hojas secas y
molidas.
Se realizó el bioanálisis de letalidad3 con Meloidogyne incognita utilizando nemátodos
del segundo estadio larval (J2). Éste fue desarrollado en paralelo al análisis fitoquímico.
La actividad nematicida de los compuestos bioactivos fue calculada utilizando análisis
estadístico porcentual y el programa Excel.
Marcha fitoquímica
La marcha fitoquímica se basó en el trabajo de Rondina & Coussio 13 en la parte aérea,
y en la raíz.
Análisis fitoquímico
a) Extracción y separación
Se elaboraron extractos con 438 g de capitulescencias y 390 g de hojas maceradas
independientemente a temperatura ambiente en 1,7L de diclorometano, fueron
sometidos a CCD para reconocer su comportamiento cromatográfico. De la extracción
por maceración se obtuvo 21,95 g y 19,74 g de extractos diclorometánicos de
capitulescencias y hojas, respectivamente.
En la separación por CC, se emplearon 5 g de extracto diclorometánico de
capitulescencias y 134 g de sílica gel (70- 230 mesh ASTM) en una columna de 80 X
2,4 cm. La CC de hojas fue con 4 g de extracto diclorometánico en 120 g de sílica,
eluyéndose en ambos casos con solventes de polaridad creciente. Las diferentes
fracciones colectadas fueron analizadas por CCD y reunidas en base a su
comportamiento cromatográfico, revelándose con vapores de yodo y luz UV a 254 y
366nm.
Para la CC se emplearon como eluyentes: éter de petróleo; éter de petróleo/ acetato de
etilo (99: 1), (90: 10) y (50:50); acetato de etilo y diclorometano. De la CC de las
capitulescencias se colectaron 69 fracciones las que fueron reagrupadas por CCD en
12: 1(1), 2(2-7), 3(8-12), 4(13-19), 5(20-25), 6(26-32), 7(33), 8(34-38), 9(3947),10(48-63), 11(64-65) y 12(66-69). A nivel de hojas, se colectaron 113 fracciones,
reagrupándose en las siguientes:1(1-6), 2(7 -14), 3(15-22), 4(23-25), 5(2650), 6(51-59), 7(60-69), 8(70-79), 9(80-87), 10(88-97), 11(98-103) y12(104-113).
Ambos grupos fueron sometidos al bioanálisis. Aquellas fracciones que mostraron
actividad nematicida fueron purificadas.
b) Purificación
La purificación se realizó con CCDP sucesivas, empleando para ello placas de sílica gel
(Kieselgel 60 HF 254). Se revelaron con luz UV (254 y 366 nm), vapores de yodo y
ácido súlfurico al 50%. La identificación estructural de los compuestos bioactivos
aislados se realizó empleando las técnicas de UV, IR, 13C-RMN y 1H- RMN.
De las fracciones 7, 8 y 9 de capitulescencias con actividad nematicida, se aisló 22,31
mg de cristales aciculares amarillos, denominado compuesto D, el cual fue purificado
por recromatografías por CCDP con éter de petróleo; D, posee punto de fusión de 92°
C, con Rf =0,4528 en éter de petróleo, soluble en éter de petróleo, diclorometano y
poco soluble en etanol. La fracción 5 de hojas, reportó actividad nematicida; esta
fracción fue purificada como en el caso anterior, obteniéndose 10 mg del compuesto T2,
de punto de fusión 89,5° C, con Rf = 0,4528. Se presentan como cristales aciculares
amarillos, con un fuerte olor pungente azufrado.
Análisis biológico
Al someter independientemente los extractos diclorometánico, etanólico y acuoso de
hojas y capitulescencias, a larvas de Meloidogyne incognita, se observó una mayor
inmovilidad larval en el extracto diclorometánico, el cual fue investigado.
Los compuestos aislados de las capitulescencias (D) y de las hojas (T2), mostraron
actividad nematicida al cabo de las 72 horas, la cual se incrementó aún después de que
los nemátodos fueron resuspendidos en agua bidestilada, hasta la mortalidad de un
100% a las 120 horas. Este efecto nematicida también se observó en las fracciones 7,8
y 9 de las capitulescencias y 5 de las hojas, pero a las 24 horas.
El compuesto T2 de las hojas, presentó un mayor efecto nematicida que el compuesto
D de las capitulescencias.
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Compuesto D
Espectro UV en etanol, Figura 1.
Se observan absorciones a 210, 251 y 352 nm. Las dos primeras correspondientes a las
transiciones π → π* y la última a la transición n → π*, confirmando la existencia de un
grupo cromóforo fuertemente conjugado.
Espectro IR (KBr), Figura 2.
3098 (CH olefínico); 3000 (C-H saturado); 2350,d (S-CH3) 2000-1600 (sobretonos
aromáticos); 1495,1-1422,3 (C=C); 1068 (C-H def.); 832,6-797,5 [cm1] (aromático
disustituido).
Espectro 1H-RMN, 200 MHZ, CDCI3, Figura 3.
δ [ppm]: 1,261 (s, S-CH3); 1 ,551 (s, -CH3); 7,025 (q, H-5); 7,083 (s, H-2); 7,1785
(dd, H-4); 7,223 dd, H-6) los 4 H-aromáticos conforman un sistema ABCD. En base a
estos datos se propone la estructura del 3-metilbencil mercaptano, compuesto
aromático azufrado de tipo tiol.
Espectro
13
C-RMN 50,3 MHZ, CDC13, Figura 4.
δ [ppm]: 15,20 (C-8); 29,938 (C-7); 123,924 (C-5); 124,539 (C-2); 124,709 (C-4) y
128,107 (C-6); 136,438 (C-3) y 137,357 (C-1). Los datos del espectro de 13C-RMN
confirman la estructura propuesta anteriormente.
Compuesto T2
Espectro UV, etanol, Figura 5.
Se observan absorciones a 207, 253 y 353 nm. Las dos primeras justifican
transiciones π → π* y la última a la transición n → π*, debido a los electrones n del
azufre. La presencia de grupos cromóforos fuertemente acoplados se evidencia por la
coloración amarilla del compuesto T2.
Espectro IR (KBr), Figura 6.
3029 (CH olefínico), 2923,8 (C-H saturado), 2000-1600 (sobretonos aromáticos), 16651430 (C=C), 1050 (C-H def); 832-797 [cm-1] (anillo aromático disustituido).
Espectro 1H-RMN, 200 MHZ, CDC13, Figura 7.
δ [ppm]: 0,845 (t, -SH); 1,253 (s, -CH2-); 1,544 (s, -CH3); 7,023(q, H-5), 7,080 (s, H-2),
7,1750 (dd, H-4), 7,22 (dd, H-6), los 4 H-aromáticos conforman un sistema ABCD. Se
propone que el compuesto T2 es el 1-metil-3-(metiltio)-benceno, aromático azufrado del
tipo tioéter.
Espectro
13
C-RMN, 50,3 MHZ, CDC13, Figura 8.
δ [ppm]: 26,681 (C-8); 29,922 (C7); 123,916 (C-5); 124,527 (C-2); 124,701 (C-4) y
128,095 (C-6); 136,426 (C-3) y 137,344 (C-1). Estos datos confirman la estructura
propuesta anteriormente.
IV. CONCLUSIONES
1. Las capitulescencias, tallos, hojas y raíces de Flaveria bidentis contienen taninos,
flavonoides, leucoantocianidinas, esteroides y triterpenoides.
2. De las capitulescencias y hojas de Flaveria bidentis, órganos vegetales muy
utilizados en la medicina tradicional, se aislaron los compuestos: l-metil-3(metiltio)-benceno y el 3-metilbencil mercaptano respectivamente, ambos
mostraron actividad nematicida sobre larvas (J2) de Meloidogyne incognita al
cabo de las 72 horas.
3. El compuesto 3-metilbencil mercaptano, dio un mayor efecto nematicida al cabo
de las 108 horas, con una movilidad larval del 4 % comparado con el 21 % del
correspondiente al 1-metil-3-(metiltio)-benceno; ambas a una concentración de
2 mg/mL. Este resultado fue debido posiblemente a que las fracciones de
capitulescencias y hojas bioactivas, presentaron además de los compuestos
aislados otros, con el mismo efecto. Por lo que se recomienda realizar
bioensayos con todos los compuestos presentes en las fracciones que dieron
actividad biológica.
V. AGRADECIMIENTOS



A la Dra. Desamparados Tortajada de la Universidad de Valencia (España) por
los espectros de 1H-RMN y 13C-RMN.
Al Dr. Alvaro Marcelo, por su asesoramiento en la ejecución de los bioensayos en
el laboratorio de Química Biorgánica del Centro de Investigación de Bioquímica y
Nutrición de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos.
Al Centro Internacional de la Papa - CIP, por suministrar raíces de papas
infectadas con Meloidogyne incognita.