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CAPÍTULO 2.7.10.
ENTERITIS VÍRICA DEL PATO
RESUMEN
La enteritis vírica del pato (EVP) o peste de los patos es una infección aguda contagiosa de los
patos, gansos y cisnes (orden Anseriformes), causada por un herpesvirus. El diagnóstico se basa
en una combinación de la valoración de los signos clínicos, la patología general e histopatología
apoyadas por la identificación del virus mediante aislamiento, o la reacción en cadena de la
polimerasa.
Identificación del agente: El virus se puede aislar a partir del hígado, bazo y riñones de las aves
muertas por esta infección. El virus se puede recuperar infectando patitos susceptibles, en los que
la enfermedad es reproducible, inoculando la membrana corioalantoidea de huevos de pato
Muscovy embrionados, o inoculando cultivos celulares originales de embrión de pato o embrión de
pato Muscovy. La identidad del virus puede confirmarse mediante ensayos de neutralización,
utilizando un antisuero específico para inhibir los cambios patológicos en embriones de pato o los
efectos citopatológicos en cultivos celulares, o mediante ensayos de inmunofluoresecencia directa
o indirecta sobre cultivos celulares infectados. Alternativamente el ADN de la EVP se puede
detectar mediante la reacción en cadena de la polimerasa a partir del esófago, hígado y bazo de
aves infectadas con EVP, así como a partir de embriones de pato Muscovy o células utilizadas
para el aislamiento del virus.
Pruebas serológicas: Los ensayos inmunológicos tienen poco valor en el diagnóstico de la
infección aguda por EVP. Se han utilizado ensayos de neutralización in ovo e in vitro para
monitorizar la exposición de las aves de silvestres a la EVP.
Requisitos para los productos biologicos: Se encuentra disponible una vacuna vírica viva
atenuada para el control del EVP en las aves por encima de las 2 semanas de edad. Los patos se
vacunan subcutáneamente o intramuscularmente para obtener inmunidad activa. Se cree que el
virus de la vacuna no se propaga desde las aves vacunadas a las no vacunadas. Se ha descrito
una vacuna inactivada eficaz en ensayos de laboratorio, pero no ha sido desarrollada o autorizada
para su uso a gran escala.
A. INTRODUCCIÓN
La enteritis vírica del pato (EVP) es una infección vírica aguda contagiosa, a veces crónica, que aparece de
manera natural solamente en patos, gansos y cisnes, todos ellos miembros de la familia Anatidae, del orden
Anseriformes. El agente etiológico, un herpesvirus, es miembro de la subfamilia alphaherpesvirinae de la familia
Herpesviridae. Lal EVP también puede ser mencionado como la peste del pato, herpes de los anátidos,
“eendenpest”, “entenpest”, y “peste du canard”. No se ha descrito la infección en otras especies de aves ni en los
mamíferos o los humanos.
En los patos y patitos domésticos, la EVP se ha descrito en aves que oscilan entre los 7 días de edad y los
reproductores maduros. En las bandadas susceptibles los primeros signos son a menudo repentinos, con una
mortalidad elevada y persistente y una caída significativa en la producción de huevos. En las bandadas
infectadas crónicamente y parcialmente inmunes solamente tienen lugar muertes ocasionales. Las aves
recuperadas pueden ser portadores y expulsar durante años el virus en las heces o sobre la superficie de los
huevos. Recientemente se ha observado en EE.UU. una EVP limitada exclusivamente a los patos Muscovy
(2, 5).
Los signos clínicos y la patología asociada con un brote de EVP varían con la especie, edad y sexo de las aves
afectadas, y la virulencia del virus. La variedad de síntomas en patos reproductores incluyen lacrimeo y
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párpados pegados asociados con fotofobia, polidipsia, pérdida de apetito, ataxia, diarrea acuosa y flujo nasal. A
menudo las aves tienen las plumas erizadas y las cloacas sucias. Las aves enfermas pueden mantener la
posición erecta utilizando sus alas como soporte, aunque el aspecto global es de debilidad y depresión. En
patitos de 2–7 semanas de edad, las pérdidas pueden ser menores que en aves viejas, y los síntomas asociados
con la infección por EVP incluyen deshidratación, pérdida de peso, coloración azul de los picos, y cloacas
manchadas de sangre.
En la necropsia, hay escasa evidencia de demacración en los adultos muertos. En los machos maduros puede
aparecer prolapso del pene. En las hembras maduras, se pueden observar hemorragias en los folículos ováricos.
Las lesiones generales se caracterizan por daño vascular, con hemorragias tisulares y sangre libre en las
cavidades corporales, erupciones o hemorragias anulares, y lesiones difteroides de las superficies mucosas del
tracto digestivo, lesiones de los órganos linfoides, y cambios retrógados de los órganos parenquimatosos. En
conjunto, estas lesiones son patognomónicas para la EVP. Se ha revisado la patología e histopatología del EVP
en patos blancos de Pekín (19). Las lesiones microscópicas se caracterizan por el daño vascular y sus
consecuencias en los órganos viscerales. Generalmente se encuentran presentes inclusiones eosinofílicas
intranucleares e inclusiones citoplasmáticas en las células epiteliales del tracto digestivo.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
El aislamiento primario del virus se consigue mejor a partir de muestras de hígado, bazo o tejido renal, los cuales
han sido homogenizados en tampón salino que contiene antibióticos y clarificados mediante centrifugación a baja
velocidad (1.800 g). Se puede intentar el aislamiento inoculando dichos homogenizados en cultivos celulares,
patitos o embriones de pato.
a)
Cultivos celulares
El cultivo celular está descrito como el método preferible para el aislamiento del virus de EVP, aunque es
posible que no siempre tenga éxito. Si se intenta, los aislamientos pueden ser realizados en fibroblastos
primarios de embrión de pato (DEF) (22), o preferiblemente fibroblastos primarios de embrión de pato
Muscovy (MDEF) (9, 14). Se cree que Las células de embrión de hígado de pato Muscovy (MDEL) son más
sensibles (R. E. Gough, comunicación personal). Las monocapas celulares crecidas en medio mínimo
esencial de Eagle (MEM) que contiene suero bovino fetal al 10% (FCS), 2mM glutamina, y 0,17% de
bicarbonato sódico y gentamicina se lavan con medio MEM libre de suero y se inoculan con la muestra
homogenizada y clarificada sospechosa de contener el virus de EVP. Después de incubar durante 1 hora a
37°C para permitir la adsorción del virus, los cultivos se mantienen en medio MEM que contiene FCS al 2%,
glutamina 2mM, y 0,17% de bicarbonato sódico y gentamicina, y se incuban en una atmósfera que contiene
CO2 al 5%. El efecto citopático (ECP) se caracteriza por la aparición de células redondeadas y en grumos
que se dilatan y se vuelven necróticas 2–4 días más tarde. Para identificar el virus, los cultivos se
deberían teñir con un anticuerpo conjugado fluoresecente utilizando un método directo o indirecto (ver
Sección B. 1. d.) Las células también se pueden fijar y teñir con hematoxilina y eosina para mostrar la
formación de sincitios, las inclusiones intranucleares, y la granulación citoplasmática acusada. Se ha
descrito (1) que el aislamiento de EVP en células MDEF se favorece mediante la incubación a temperaturas
entre 39,5 y 41,5 °C. Sin embargo, la temperatura elevada no parece esencial para el aislamiento, el cual a
menudo es llevado a cabo a 37°C. Puede ser necesario más de un pase en cultivo celular para aislar el
virus. El método de aislamiento del virus en cultivos celulares puede ser modificado por un ensayo de placa,
recubriendo la monocapa celular con medio de mantenimiento que contiene agarosa al 1%. Como el virus
puede asociarse a las células, se puede llevar a cabo el pase secuencial tripsinizando las células
potencialmente infectadas y resembrándolas, así como inoculando células frescas con el sobrenadante del
cultivo infectado del pase anterior.
b)
Patitos
Los patitos susceptibles de 1 día de edad mueren entre 3–12 días cuando se inoculan intramuscularmente;
los patitos no inoculados, mantenidos separadamente, se deberían mantener al mismo tiempo como
controles. Los patitos Muscovy (Cairina moschata) son más susceptibles que los patitos blancos de Pekín.
Durante el examen post–mortem deberían ser visibles las lesiones macroscópicas y microscópicas típicas
de EVP. El diagnóstico puede confirmarse bien vacunando los patitos frente a EVP e inoculándolos
posteriormente con el aislado vírico, o mediante inmunofluorescencia. Sin embargo, existen cepas
virulentas del virus frente a las cuales la vacuna puede ser infectiva (13). En la experiencia del autor con
infecciones naturales ocurridas en patos Muscovy, este método de aislamiento ha demostrado ser más
sensible que los métodos de cultivo celular.
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c)
Embriones de pato
Los aislamientos primarios del virus pueden realizarse mediante inoculación en la membrana
corioalantoidea (CAM) de huevos embrionados de pato Muscovy de 9–14 días. Los embriones pueden
morir, mostrando hemorragias extensas características 4–10 días después de la inoculación. Pueden ser
necesarios de dos a cuatro pases seriados de las CAMs homogenizadas antes de que se pueda lograr el
aislamiento. Este método no es tan sensible como el que utiliza patitos susceptibles de un día de edad.
Los huevos embrionados de pollo no son muy susceptibles a la infección con cepas silvestres de EVP. No
obstante el virus puede adaptarse a los embriones de pollo mediante pases seriados. Los embriones del
pato de Pekín varían en su susceptibilidad frente a las cepas del virus de EVP.
d)
Métodos inmunológicos.
Las pruebas serológicas empleadas para confirmar la identidad de los virus recién aislados incluyen
ensayos de neutralización practicados bien en huevos embrionados o en cultivos celulares. Se ha descrito
un ensayo de placa para EVP en cultivos celulares de embrión de pato (4). En el laboratorio del autor se
usa un ensayo de microtitulación empleando células primarias MDEF o MDEL. Con tal que se emplee un
antisuero hiperinmune de título suficientemente alto, la prueba de inmunofluorescencia (directa o indirecta)
es el siguiente ensayo más sensible después del aislamiento en patitos de 1–9 días de edad (8). Se ha
descrito un ensayo de hemaglutinación pasiva reversa para EVP (6), pero se ha encontrado que es menos
sensible que los ensayos de placa e inmunofluorescencia. Se ha descrito un método de tinción de
inmunoperoxidasa con avidina–biotina–peroxidasa para detectar el antígeno de EVP en secciones e hígado
y bazo fijadas con formol y embebidas en parafina, a partir de aves infectadas experimentalmente (12); este
método puede tener un potencial diagnóstico. La identidad del virus también se puede confirmar mediante
microscopía electrónica de tinción negativa, aunque no es una confirmación positiva de que el herpesvirus
observado es el virus de EVP. Recientemente se ha desarrollado microscopía inmunoelectrónica utilizando
suero hiperinmune frente a EVP (15).
e)
Métodos de reconocimiento de ácidos nucleicos
Recientemente se ha descrito la detección del virus de EVP mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) (10, 11, 16, 17). Se han identificado cebadores que son capaces de amplificar ADN del
virus de EVP presente en varios tejidos, incluyendo el esófago, hígado y bazo, a partir de un brote original y
después del paso por embriones de pato Muscovy. A continuación se presentan dos protocolos con
métodos de PCR para la detección del virus de EVP.
•
Método de PCR 1
Este procedimiento de extracción de ADN puede ser usado con suspensiones celulares rotas a partir del
cultivo de tejido infectado con EVP; suspensiones de tejido homogenizado al 10%, o frotis cloacales en
medio de transporte. Este método se usa para preparar ADN de la peste del pato para los controles
positivos conocidos del PCR.
•
Extracción del ADN vírico
Nota: Todas las transferencias de producto en los pasos (i) a (v) se realizan en una cabina de seguridad
biológica.
1
i)
Para una suspensión homogenizada de tejido al 10%, añadir 400 µl a un tubo de microcentrífuga de
1,5 ml y microcentrifugar a 16.000 g durante 5 minutos. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo e
ir al paso (ii).
ii)
Para suspensiones de cultivo celular y material de frotis de la cloaca, añadir 400 µ de la muestra, o el
sobrenadante del paso i anterior, a un tubo de 1,5 ml y microcentrifugar a 16.000–20.000 g durante
45 minutos para precipitar el virus.
iii)
Descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado con 200 µ de tampón ácido Tris/etilén diamino
tetra–acético (EDTA) (10 mM Tris/HCl, pH 8,0, 1mM EDTA).
iv)
Añadir 10 µl de una solución de proteinasa K a 5 µg/µl para dar una concentración final de 0,2 µg/µl,
mezclar exhaustivamente e incubar a 56°C durante 1 hora.
Proporcionado por el Dr W. R. Hansen, US Geological Survey, Biological Resources Division, National Wildlife Health
Center, 6006, Schroeder Road, Madison, WI 53711, USA. Este procedimiento utiliza los siguientes productos
comerciales: GeneAMP PCR Reagent Kit que contiene dNTPs, 10x tampón de amplificación para PCR “hot start”, Taq
ADN polimerasa, reactivos control Lambda PCR , bolas Ampliwax (Applied Biosystems), y un marcador de 100 pares de
bases de tamaño molecular (Invitrogen)
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v)
Añadir 25 µl de solución de dodecil sulfato sódico (SDS) al 10% para dar una concentración final de
SDS del 1%, mezclar exhaustivamente e incubar a 37°C durante 1 hora.
vi)
Añadir 15 µl de Na Cl 5M para obtener una concentración final de 0,3 M y mezclar exhaustivamente.
vii)
Añadir al tubo 300µl de fenol fresco tamponado con Tris/HCl, pH 8,0, y mezclar invirtiendo 50 veces.
viii) Microcentrifugar el tubo a 16.000 g durante 5 minutos y transferir la fase acuosa superior (muestra) a
un tubo nuevo.
ix)
Repetir las fases (vii) y (viii) de extracción con fenol une vez más.
x)
Añadir 500 µl de eter al tubo, mezclar exhaustivamente, y microcentrifugar a 16.000 g durante
1 minuto.
xi)
Descartar la fase acuosa superior (éter) y repetir el paso de extracción con éter (paso (x)) una vez
más.
xii)
Calentar el tubo con la tapa abierta a 56°C durante unos 15 minutos o hasta que el olor a éter haya
desaparecido.
xiii) Dividir el contenido del tubo en dos y añadir a cada tubo 2,25 veces el volumen de la muestra en
etanol, mezclar el contenido del tubo invirtiéndolo varias veces y dejar a temperatura ambiente (22°C)
durante 30 minutos.
xiv) Microcentrifugar tubo a 16.000g durante 45 minutos y descartar el sobrenadante.
xv)
Añadir 200 µl de etanol al 70% para lavar cuidadosamente el tubo y centrifugar a 16.000 g durante
15 minutos.
xi)
Descartar el sobrenadante y secar el precipitado a 56°C durante 30–45 minutos con la tapa del tubo
abierta.
xii)
Resuspender el ADN en 30 µl de agua destilada libre de ARNsas y ADNsas.
xiii) Almacenar la muestra a 4°C hasta que se ensaye (pocos días) o a –20 °C para almacenamiento a
largo plazo.
•
Reacción en cadena de la polimerasa
Las mezclas de reacción primarias para el PCR del EVP y el control lambda se preparan por adelantado en
una cabina de seguridadd biológica utilizando los métodos recomendados por el fabricante del producto
para un PCR “hot start”. La mezcla de reacción primaria se reparte en tubos, se sellan con Ampliwax a 80°C
como se recomienda por el fabricante, y se almacenan a 4°C durante 1–2 meses.
Cebadores de PCR para el gen de la ADN polimerasa dependiente de ADN del EVP
Secuencia del cebador 1: 5´–GAA–GGC–GGG–TAT–GTA–ATG–TA–3´ (delantero)
Secuencia del cebador 2: 5´–CAA–GGC–TCT–ATT–CGG–TAA–TG–3´ (reverso)
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i)
La mezcla de reacción secundaria se prepara el día del ensayo de acuerdo con las recomendaciones
del fabricante del producto, y se distribuye en cada tubo problema incluyendo los tubos control de
lambda y EVP.
ii)
Añadir 10 µl de la suspensión de ADN de los tubos problema almacenados a los tubos de reacción
primaria de PCR con las correspondientes etiquetas.
iii)
Colocar ADN de un virus EVP conocido diluido hasta 1 pg/10 µl en un tubo control y 10 µl de agua
destilada en el tubo control sin ADN. Añadir 10 µl de ADN de lambda proporcionado en el kit, y 10 µl
de agua a los tubos control de lambda correspondientes.
iv)
Colocar los tubos en un termociclador que está programado como se indica:
Un ciclo:
Mantener a 94°C durante 2 minutos
Mantener a 37°C durante 1 minuto
Mantener a 72°C durante 2 minutos
35 ciclos:
Mantener a 94°C durante 1 minuto
Mantener a 55°C durante 1 minuto
Mantener a 72°C durante 3 minutos
Un ciclo:
Mantener a 72°C durante 7 minutos
Mantener a 4°C hasta su almacenamiento
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Los tubos de PCR se almacenan a 4°C hasta que las muestras se examinan para los productos de
amplificación.
•
Análisis electroforético de los productos de reacción
i)
Se prepara tampón 1 x TAE fresco (40 m Tris acetato, EDTA 1 mM, pH 8,3) a partir de un stock 10x
para la preparación de la agarosa y su uso en la cubeta de electroforesis.
ii)
Se prepara una solución de agarosa al 1% en tampón TAE, se calienta para disolver la agarosa, y ,
cuando se enfríe, se vierte en un formador de geles con un peine.
iii)
El gel solidificado se coloca en la cubeta de electroforesis y se añade el tampón TAE.
iv)
Las muestras problema de PCR, incluyendo los controles EVP y lambda, se mezclan 1/10 con 1 µl de
tampón de carga (0,25% [ p/v ] de azul de bromofenol, 0,25% [ p/v ] de xilen cianol, 0,01M Tris/HCl,
pH 8,0, y 50% [ v/v ] de glicerol), y se añaden 10 µl de cada una en pocillos individuales del gel. Los
marcadores de tamaño molecular de 100 bp se añaden en cada lado del gel.
v)
Se corre el gel durante 1 hora a 120 voltios y se tiñe en solución de bromuro de etidio al 1% durante
20 minutos. Se destiñe el gel durante 45 minutos en agua desionizada y se observa en un
transiluminador de luz UV. Fotografiar el gel para registrar los resultados.
•
Interpretación de los resultados
La amplificación de una banda de 500 bp en la muestra control de lambda indica que el PCR se ha
desarrollado con éxito. Una banda de 446 bp en el control conocido de ADN de EVP indica que los
cebadores de EVP están funcionando. Una banda de 446 bp en la muestra problema desconocida indica la
presencia de ADN vírico de EVP. No existirán productos de amplificación en los controles de EVP o lambda
sin ADN. Si aparecen bandas en los productos de los controles negativos, ha tenido lugar una
contaminación cruzada durante el ensayo de puesta a punto y la prueba debe repetirse.
f)
Variación de cepa
Aunque las cepas de EVP varían considerablemente en virulencia, existe escasa evidencia descrita de
variación serológica.
2.
Pruebas serológicas
Las pruebas serológicas tienen poco valor en el diagnóstico de infecciones agudas por DEV, aunque se han
empleado ensayos basados en la neutralización del suero en huevos embrionados y cultivos celulares, para
seguir los anticuerpos en aves salvajes después de su exposición a EVP. La respuesta humoral a la infección
natural con virus EVP es a menudo baja y los anticuerpos pueden tener una vida corta (7); se asume que la
inmunidad mediada por célula también juega un papel en la infección (18). Sin embargo, es posible la detección
en suero de anticuerpos neutralizantes frente a virus EVP. Los ensayos de neutralización vírica (NV) (21) en los
que se utiliza un método de suero constante/variación en virus pueden llevarse a cabo en embriones de pollo o
patos utilizando virus embrio–adaptados, o en cultivos celulares. En aves acuáticas salvajes y domésticas que no
habían sido expuestas a EVP se detectaron índices de neutralización (NI) (21) entre 0 y 1,5; un NI igual o
superior a 1,75 se consideró evidencia de una exposición anterior al virus EVP (3). Alternativamente, los sueros
pueden ser investigados utilizando un método de suero constante/variación en virus. En el laboratorio del autor
se usa un ensayo de neutralización por microtitulación empleando MEDF o DEF primarios. Se preparan
diluciones seriadas dobles de cada muestra de suero (inactivada por calor a 56°C) en 50 µl de MEM libre de
suero en placas de microtitulación. Se añaden aproximadamente 102.0 DICT50 (dosis infectiva 50% de cultivo de
tejidos) de virus EVP en 50 µl de MEM a cada pocillo, y las muestras se dejan reaccionar a 37°C durante 1 hora.
Se ajusta una suspensión de MDEF primarios o DEF en MEM suplementado con 2 mM L–glutamina, 0,17%
bicarbonato sódico y FCS al 10% para contener 3 x 105 células por ml. A continuación las células se añaden a
las placas a 100 µl por pocillo y se incuban hasta 96 horas a 37°C en una atmósfera húmeda con 5% de CO2.
Después de la incubación, las células se observan diariamente mediante microscopía de luz visible y se fijan
finalmente con tampón salino con formol y se tiñen con cristal violeta al 1%. Las placas se leen
macroscópicamente. La titulación de la actividad neutralizante del virus se expresa como el inverso de la dilución
más alta del suero al que creció la monocapa, es decir, no existe evidencia de ECP y por tanto la neutralización
completa del virus ha tenido lugar. Normalmente un título menor de log2 3 se considera negativo. Un título NV de
8 o superior se considera significativo y es evidencia de exposición al virus EVP (7). El anticuerpo NV puede
también detectarse utilizando cultivos celulares mezclando sueros a una sola dilución, por ejemplo 1/10, con
100–200 virus DICT50 y probando los cultivos celulares inoculados mediante inmunofluorescencia para la
presencia de virus no neutralizado. Aunque este método no es cuantitativo, puede ser útil para analizar gran
cantidad de sueros. Estos últimos métodos, utilizando virus constante/suero variable, son mucho más
económicos en suero que los métodos NI.
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C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
Se puede utilizar una vacuna viva atenuada para controlar la EVP en aves por encima de las 2 semanas de edad
(18, 19). Los patos de engorde o reproducción se pueden vacunar subcutáneamente o intramuscularmente para
producir una inmunidad activa. Se cree que el virus de la vacuna no se transmite por contacto de patos
vacunados a no vacunados, ya que las aves no vacunadas son susceptibles a la infección.
Se ha descrito una vacuna inactivada que es tan eficaz como una vacuna viva modificada (20). Esta vacuna se
ha probado únicamente en condiciones de laboratorio; no se ha ensayado a gran escala y no está autorizada.
Las guías para la producción de vacunas veterinarias se dan en el Capítulo I.1.7. Principios de producción de
vacunas veterinarias. Las directrices dadas aquí y en el Capítulo I.1.7 están destinadas a ser de naturaleza
general y pueden ser complementadas por requisitos nacionales o regionales.
1.
Control del inóculo
a)
Características del inóculo
La vacuna EVP se puede preparar a partir de una cepa del virus que ha sido atenuada mediante pase
seriado en huevos de pollo embrionados. En EE.UU. el inóculo de la cepa de la vacuna fue importado
originalmente desde Holanda y ha sido reinoculada 41–46 veces.
b)
Método de cultivo
El inóculo vírico debería prepararse en huevos embrionados de pollo especificados libres de patógenos
(SPC) de 8–11 días de edad, mediante inoculación en la CAM seguida de incubación a 37°C. El inóculo
debe almacenarse a – 70°C o a menor temperatura en tampón salino en forma de homogenizado de la
CAM del embrión.
c)
Validación como vacuna
El inóculo vírico debería encontrarse libre de virus exógenos patógenos para patos, pollos y pavos.
También debería encontrarse libre de contaminación por bacterias, hongos y micoplasmas.
Debería confirmarse la identidad del virus mediante un ensayo NV realizado con antisuero específico usado
en el método suero constante/virus variable. Este ensayo debería realizarse en huevos embrionados de
pollo. El antisuero debería reducir el título vírico hasta 101.75 ELD50 (50% de la dosis letal embrionaria).
Se puede valorar la inmunogenicidad de la vacuna en patos susceptibles a EVP mediante la inoculación
intramuscular de la dosis recomendada de vacuna, y sensibilizando intramuscularmente 21 días después
con virus EVP virulento. Las aves vacunadas deberían sobrevivir a la sensibilización mientras que las aves
control no vacunadas deberían morir. Esta prueba debería hacerse con el inóculo original, pero no es
necesrio realizarla rutinariamente con cada lote de la vacuna producido. Para la puesta en el mercado de
lotes posteriores, el título del virus debería ser una indicación suficiente de la potencia de la vacuna.
Una vez congelada a – 70°C o a una temperatura más baja la vacuna se almacena correctamente durante
al menos 1 año con poca perdida en el título. Una vez emitida, la vacuna no debería congelarse otra vez.
Debería mantenerse a 4°C y utilizarse lo antes posible.
2.
Método de fabricación
La vacuna se produce en huevos de pollo embrionados de 8–11 días de edad inoculados en la CAM e incubados
a 37°C. La mayoría de las muertes del embrión ocurren entre las 48 y 96 horas después de la inoculación. Se
centrifugan los embriones, sus CAMs y los fluidos corioalantoideos se juntan y se homogenizan en tampón
salino, y se clarifican mediante centrifugación a baja velocidad (1.800 g). La preparación se diluye
apropiadamente y se incorpora un estabilizante. Entonces se reparte en viales y, preferiblemente, se congelan
rápidamente a –70°C o a menor temperatura.
3.
Control interno
Los huevos que han sido inoculados, deben ser mirados al trasluz 24 horas despues para identificar cualquier
embrion muerto por causas inespecificas.
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4.
Control de Lotes
a)
Esterilidad
Las pruebas de esterilidad y ausencia de contaminación de los materiales biológicos se puede encontrar en
el Capítulo I.1.5.
b)
Inocuidad
Se debería inocular subcutáneamente o intramuscularmente un grupo de patitos de 1 día de edad
susceptibles a EVP con 10 veces la dosis de vacuna recomendada, y observarlos durante 7–14 días para la
posible aparición de signos de reacciones adversas.
El producto final debería encontrarse libre de contaminación por bacterias, hongos y micoplasmas, así
como virus exógenos potencialmente patógenos para las aves de corral.
c)
Potencia
El título vírico de la vacuna debería determinarse en huevos embrionados de pollo de 9–11 días de edad
inoculados en la CAM e incubados a 37°C. La vacuna debería contener un mínimo de 103.0 ELD50 por
dosis en el momento de su uso.
d)
Duración de la inmunidad
En los patos vacunados la inmunidad debería durar a lo largo de una temporada de engorde. Se
recomienda la revacunación anual (19).
e)
Estabilidad
Cuando se almecena a –70°C o a una temperatura más baja la vacuna es estable durante al menos 1 año.
Después de este tiempo, debería repetirse la prueba de potencia con una alicuota de la vacuna para
determinar si se ha mantenido el título vírico. Una vez descongelada la vacuna no se debería congelar de
nuevo. Debería mantenerse en el refrigerador a 4°C, pero durante no más de una semana. La vacuna
liofilizada debería almacenarse a 4–8°C y utilizarse antes de la fecha de caducidad señalada.
f)
Conservantes
No se añaden conservantes a la vacuna.
g)
Precauciones (riesgos)
Ninguna
5.
Pruebas en el producto final
La vacuna se emite como un vial de virus vacuna concentrado y congelado, junto con una botella de diluyente
estéril (tampón fosfato salino) en que se han realizado las pruebas estándar de esterilidad (ver Sección C.4.a.).
a)
Inocuidad
No se realizan pruebas adicionales después del ensayo del lote.
b)
Potencia
No se realizan pruebas adicionales después del ensayo del lote.
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004