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Nuevos avances en los métodos de selección embrionaria: el secre t o m a .
R ev i s i ó n
New advances in embryo selection methods: the secretome
María Nava rro-Garberí 1, Jorge Ten Morro 1, Jaime Guerrero Villena1; Joaquin Llácer
Ap a ricio2; Rafael Bernabeu Pérez2
Dpto. Biología de la Reproducción. Instituto Bernabeu de Fertilidad y Ginecología,
Alicante. 2Dpto. Medicina Repro d u c t iva. Instituto Bernabeu de Fertilidad y Ginecología,
Alicante.
1
Resumen
El objetivo de este trabajo es revisar los métodos que actualmente disponemos para llevar a cabo la
selección embri o n a ria previa a la tra n s ferencia al útero mat e rno, así como las técnicas que re c i e n t emente se han desarrollado y que pueden mejorar en las tasas de éxito de los tratamientos de fe rt i l id a d. La selección embri o n a ria es un paso crítico en la aplicación de las técnicas de reproducción
asistida. En la actualidad, la selección se realiza mediante una evaluación del embrión en base a dife rentes cri t e rios morfológicos y cinéticos. Sin embargo, este análisis no siempre permite determinar
el estado fi s i o l ó gico del embrión o la presencia de alguna anomalía cromosómica, siguen siendo subjetivos, no suficientemente fi ables y poco discriminativos. Por esta razón, se siguen buscando nu evo s
métodos de selección embrionaria, que complementen e incluso lleguen a sustituirlos. Con los re c i e ntes avances conseguidos en el campo de la proteómica, el análisis del secretoma embrionario como
método de selección basado en la determinación de las proteínas presentes en el medio de cultivo emb ri o n a rio, podría proporcionar parámetros de medición de calidad y potencial de desarrollo, permitiendo una selección objetiva y segura del embrión que será posteriormente tra n s fe rido.
Pa l ab ras cl ave : Selección embrionaria. Embarazo múltiple. Proteómica. Secretoma embrionario
Summary
The aim of this wo rk is to review the methods that nowadays are ava i l able to perfo rm embryo selection befo re the tra n s fer to the uterus, as well as the tech n o l ogies that have been developed re c e n t ly
and can improve the rates of success of the fe rtility tre atments. The embryo selection is a critical stage in the ap p l i c ation of the assisted rep roduction techniques. Actually, the selection is eva l u ated by
Correspondencia: Dr. Jorge Ten Morro
Avda. Albufereta, 31
03016 Alicante
e-mail: [email protected]
Vol. 26- nº 3 - Mayo-Junio 2009
Nuevos avances en los métodos de selección embri o n a ri a - 1 8 7
means of an embryo observation which is based on different morphologic and kinetic cri t e ri a .
Neve rtheless, this analysis does not allow to determine the phy s i o l ogical condition of the embryo or
the presence of some ch romosomal anomaly, and they continue being subjective, not suffi c i e n t ly re l i able and little discriminat ive. For this reason, the research of new methods of embryo selection continues being important in order to complement or even to replace them. With the recent advances obtained in the area of the proteomics, the analysis of the embryonic secretome as a selection method
based on the determ i n ation of proteins in the embryo culture medium, might provide para m e t e rs of
quality measurement and potential of development, allowing the selection of a high quality embryo to
t ra n s fe r.
Key wo rds: Embryo selection. Multiple preg n a n cy. Proteomic. Embryonic secretome
INTRODUCCIÓN
Las técnicas de rep roducción asistida (TRA) suponen una altern ativa efe c t iva para las parejas que presentan problemas de fertilidad y han adquirido, en apenas unas décadas, una importancia signifi c at iva dentro
de la medicina rep ro d u c t iva. Cada vez son más el número de parejas que deben recurrir a ellas para obtener
descendencia, estimándose que al menos un 1% de los
nacimientos que se producen en países desarro l l a d o s ,
son concebidos por medio del uso de TRA (1).
Este incremento en la tasa de infe rtilidad es consecuencia de que la especie humana ha evo l u c i o n a d o
hacia las llamadas formas “neoténicas”, adquiri e n d o
la capacidad reproductiva óptima en sus fases juve n iles. El claro distanciamiento existente entre la evo l ución biológica y la evolución social del indiv i d u o ,
que re t a rda la edad a la que sucede el primer embarazo, así como los múltiples factores ambientales (2),
entre otros factores, han provocado que, en la última
década, el número de personas que necesitan re c u rri r
a centros de fe rtilidad se haya visto incrementado notabl e m e n t e, alcanzando el 10-15% de parejas en edad
reproductiva (3,4).
Sin embargo, aunque son indudables los ava n c e s
obtenidos en los últimos años dentro de este ámbito,
las TRA continúan presentando serias limitaciones
que impiden, en muchas ocasiones, llegar a cumplir
el primer objetivo que se persigue con su aplicación,
que no es más que la de obtener un hijo sano.
Junto a ello, las TRA deben aportar datos que nos
permitan emitir un diagnóstico de la causa de la esterilidad y un pronóstico sobre las posibilidades re a l e s
de éxito en posibles futuros intentos o bien aconsejar
otras TRA como donación de gametos y/o embri o n e s ,
decisiones que conllevan una gran carga emocional a
los pacientes y al clínico imposibilidad de emitir juicios ciert o s .
Una de las principales complicaciones tras la ap l icación de las TRA es el embara zo múltiple derivado
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de la tra n s ferencia de más de un embrión. Aunque las
pro b abilidades de gestación son mayo res, en estos casos, suponen un elevado ri e s go obstétrico y mat e rn o
(5). Por lo tanto, la selección de un único embri ó n
con capacidad implantatoria sería de vital import a ncia para erradicar esta situación (6, 7).
N o rm a l m e n t e, la elección de los embriones a
t ra n s fe rir se lleva a cabo mediante la observa c i ó n
morfológica, bajo microscopio, de la cohorte embri on a ria obtenida tras la inseminación/micro i nye c c i ó n
ovo c i t a ria (8,9). Sin embargo y aunque los cri t e ri o s
morfológicos van mejorando continuamente, resulta
i m p o s i ble predecir y ga rantizar el potencial implantatorio embri o n a rio. Estudios recientes apuntan a que el
análisis del secretoma embrionario podría ser, en un
f u t u ro cercano, el método complementario idóneo
que nos permita seleccionar un único embrión con capacidad implantatoria.
M É TODOS ACTUALES DE SELECCIÓN
EMBRIONARIA
Actualmente, el método más empleado para evaluar la calidad embri o n a ria es la observación de su
m o r fo l ogía basada en dife rentes cri t e rios. Recientemente, la Asociación para el Estudio de la Biolog í a
de la Reproducción (ASEBIR) ha publicado un manual de clasificación en cuat ro cat egorías, basadas en
criterios morfo l ó gicos y cinéticos (10). La observación de dife rentes parámetros, como la simetría, el
grado de fragmentación, el ritmo de división y la
mu l t i nu cleación, son buenos indicadores para valorar
qué embriones poseen mayor capacidad implantatoria. Sin embargo, es cierto que la morfo l ogía embri on a ria no siempre es un buen indicativo de calidad, ya
que puede no mostrar la presencia de anomalías cromosómicas implicadas en fallos de implantación y
aborto. Además está sujeto a va riaciones intra e intero b s e rvador. Por tanto, no es un método suficiente y
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d e fi n i t ivo en la elección del embrión con mayor potencial implantatorio (11).
El diagnóstico genético preimplantacional (DGP),
puede emplearse en casos concretos en los que sea necesaria su aplicación, es decir, en parejas que presentan
un elevado ri e s go de trasmisión de ciertas altera c i o n e s
genéticas/cromosómicas a su descendencia (12-14).
Por tanto, el DGP nos puede ayudar a evitar la transferencia de embriones cromosómicamente anómalos, incrementando los porcentajes de implantación y embarazo evolutivo. No obstante, la eficacia del DGP está
siendo cuestionada por considera rse una técnica aún
experimental y con múltiples limitaciones (15). La realización de una biopsia embri o n a ria es una técnica inva s iva para el embrión y que compromete seriamente
su viabilidad (16). Además, el fenómeno de mosaicismo cromosómico no es tenido en cuenta en el análisis
genético de un bl a s t ó m e ro, de fo rma que el resultado
obtenido a partir de él puede conllevar a un error diagnóstico. La utilidad de la información que proporciona
el análisis de células del tro fo e c t o d e rmo resulta ge n eralmente dudosa al no implicar el examen de células de
la masa interna (17). Por tanto, el empleo del DGP
queda restringido a casos concretos, pero no como método ru t i n a rio complementario de la evaluación de la
calidad embrionaria convencional.
Otros métodos de evaluación del estado embri o n ario que últimamente están siendo desarrollados se basan en el conocimiento del metabolismo embri o n a ri o
mediante el análisis de determinados compuestos presentes en el medio de cultivo, como la glucosa, el lactato o el piru vato, cuyos incrementos o disminuciones
en su concentración durante el desarrollo embri o n a ri o
pueden ser asociados a su estado de “salud”(18). Por
ejemplo, en cuanto a la presencia de glucosa, se ha
observado que la duplicación en su tasa de consumo
en día cuatro del desarrollo embri o n a rio es un parámetro claramente indicat ivo de un elevado potencial
implantatorio (19).
Del mismo modo, los cambios en la composición
de los aminoácidos del medio también han sido analizados con el objeto de encontrar una correlación entre
su tasa de intercambio aminoacídica y la calidad embri o n a ria. En este caso, se ha observado que el intercambio de tres aminoácidos, Asn, Gly y Leu, indicar ía qué embriones tendr ían un mayor éxito de
implantación (20). La comparación entre el perfil de
intercambio aminoacídico de embriones que implantaron con éxito frente al de aquellos que no lo hicieron ha sido recientemente estudiada, demostra n d o
que la presencia de elevados niveles de Met en el medio de cultivo embri o n a rio está directamente re l a c i onada con elevadas posibilidades de implantación (21).
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Otros grupos de inve s t i gación han centrado sus estudios en el análisis del antígeno leucocitario humano
(HLA-G), relacionado con la tolerancia materno-fetal
durante la gestación (22, 23). El HLA-G expresado
por el embrión podría establ e c e rse como marc a d o r
indicat ivo de su potencial de desarrollo (24). Se han
realizado múltiples estudios en los que se afirma que
si se tra n s fieren embriones que en día tres de su desarrollo ex p resan ciertos niveles de esta proteína, las tasas de gestación se incrementan enormemente (25,
26). No obstante, otros trabajos ponen en contradicción estos datos e incluso cuestionan los métodos de
detección empleados (27).
R e c i e n t e m e n t e, la proteómica ha ab i e rto nu eva s
vías de inve s t i gación ligadas a la selección embri o n aria que ap o rtarían info rmación muy útil dentro de esta
conflictiva situación que atañe al campo de la embri ología.
PROTEÓMICA Y EMBRIOLOGÍA
La proteómica es la ciencia que estudia el conjunto completo de proteínas que se ex p resan a partir de
un genoma, e implica el uso de un amplio número de
técnicas bioquímicas y moleculares de alta sensibilidad. Engloba toda una serie de variantes, que son los
llamados métodos Omics, todos ellos basados en el
análisis de las proteínas ex p resadas por un genoma en
un momento determinado y bajo unas condiciones
concretas.
El análisis del secretoma embrionario podría ser
un método de selección complementario a la clasificación morfo l ó gica actual que ay u d a ra a la determ inación objetiva de aquel embrión de mayor calidad y
potencial evo l u t ivo, reduciendo con ello las tasas de
embara zo múltiple.
Este método consiste en monitorizar la actividad
metabólica del embrión analizando el medio de cultivo en el que se desarrollan durante sus estadios más
tempranos, determinando el perfil proteico y corre l acionándolo con la presencia de alteraciones o pro bl emas cromosómicos embri o n a rios, así como con su
viabilidad y potencial de implantación (28).
Sin embargo, la proteómica es aún una ciencia en
desarrollo que presenta ciertas limitaciones, ya que
algunas de las técnicas que emplea no reúnen la suficiente sensibilidad y capacidad re s o l u t iva para analizar las proteínas presentes en el secretoma embri o n ario. Sea como fuere, se han realizado análisis del
medio de cultivo embri o n a rio mediante el empleo de
ciertas técnicas, como cro m at ografía de ga s e s - e s p e ctrometría de masas (GC-MS), cro m atografía líquida
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de alta presión (HPLC), cro m atografía líquida-espect rometría de masas (LC-MS), infra rrojo cerc a n o
(NIR), espectrometría de masas (MS), espectrometría
de masas en tándem (MS-MS) y resonancia mag n é t ica nu clear (NMR), entre otras. Se han observado diferencias en el perfil proteico analizado cada ve i n t ic u at ro horas (29).
Aunque hasta el momento no han sido defi n i d o s
estos patrones proteicos, sí se ha observado una gra n
diferencia entre las proteínas expresadas por blastocistos evo l u t ivos respecto a blastocistos degenerados
(30). Entre ellas, se ha observado con especial re l evancia a una proteína cuya presencia va en aumento
conforme avanza el desarrollo embri o n a rio, llega n d o
a tener su máxima ex p resión en día cinco de desarrollo, y cuya detección es, además, nula en el medio de
cultivo de blastocistos dege n e rados. La identidad de
esta proteína, cuyo peso molecular es de 8,5 kDa, está
siendo discutida, pero se cree que la principal candid ata para ella es la ubiquitina, de la cual se piensa
que tiene importante influencia en el proceso de implantación embri o n a ria. Niveles elevados de ubiquitina hallados en el secretoma implicarían elevadas probabilidades de gestación (29). Esta identificación no
está consolidada a día de hoy, pero entraña un comienzo demostrat ivo de la utilidad de la info rmación
que puede obtenerse del estado metabólico y evo l u t ivo del embrión mediante el análisis proteico del medio en el que se desarrolla. Sin embargo, existe la duda de que la ausencia de la citada proteína en el
medio de cultivo de los embriones dege n e rados no se
deba a la falta de secreción de ella por parte del embrión, sino a que el propio proceso de degeneración
de éste implique la secreción de proteasas que destruyan a la proteína de estudio, de fo rma que no podría
ser detectada. Sin duda, son necesarios nu evos estudios que continúen ahondando en este planteamiento.
Inve s t i gaciones recientes concl u yen que el estudio
del perfil proteico presente en el medio de cultivo
embrionario, mediante el empleo de espectroscopía
de infra rrojo cercano y Raman, permite establecer un
Índice de Viabilidad (VI) con el que se podría diferenciar entre embriones de idéntica morfo l ogía, aquel
de mayor calidad y capacidad implantat o ria (31).
Otro trabajo hace re fe rencia al concepto de VI, en el
cual se analizaba el medio de cultivo de blastocistos
en día cinco, empleando la técnica NIR. Tras realizar
un estudio estadístico mediante el análisis de curva s
ROC, establ e c i e ron el valor 0’52 como punto de cort e
en el VI, por encima del cual, el 80% de los bl a s t o c i stos tra n s fe ridos se implantaron con éxito, frente al
81,3% de los blastocistos situados por debajo de este
VI, los cuales no anidaron. Por tanto, mediante la
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combinación de los cri t e rios de selección morfo l ó gicos con los resultados obtenidos a partir del análisis
p roteico de medio, se seleccionó y llevó a cabo la
tra n s fe rencia de un único embrión (SET) logrando un
claro incremento en las tasas de implantación (32).
CONCLUSIÓN
La selección de un único embrión de mayor potencial implantatorio de entre todos los pertenecientes
a una misma cohorte supone un punto crítico para los
embriólogos clínicos, existiendo un gran deb ate entre
los cri t e rios que deben tenerse presentes en el momento de seleccionar el embrión que será tra n s ferido.
Es evidente que con el aumento del número de pacientes que se someten a tratamientos de fe rtilidad a
nivel mundial resulta fundamental conseguir mejora s
y avances dentro de este campo, para poder llevar a
cabo un método de selección rápido, no inva s ivo, fi able y objetivo.
Estudios recientes sugieren que el conocimiento
del metabolismo embri o n a rio puede dar info rm a c i ó n
muy útil que, adjuntada a la info rmación que la propia morfo l ogía del embrión pro p o rciona sobre su estado, podría solucionar las principales limitaciones
que actualmente env u e l ven a las técnicas de rep roducción asistida, como la elevada tasa de embarazo
múltiple y los fallos de implantación embri o n a ria.
Como quiera que la búsqueda de los criterios de
calidad embri o n a ria son de gran importancia, re s u l t a
necesario el establecimiento de métodos re s o l u t ivos
que puedan ser empleados como cri t e rios fi ables y seg u ros en la selección del mejor embrión de la cohort e.
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