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Clement-Sengewald
CLONADO DE EMBRIONES
A. Clement-Sengewald
Introducción
En microbiología y biología celular un clon es una población de organismos con una unidad genética.
En ingeniería genética se define como vector clon, aquellos vectores que portan un gen extraño. Es
importante destacar que en el origen y replicación de un clon no ocurren variaciones genéticas (v.G.
mutaciones somáticas) y que sólo se establecen replicaciones del ADN y divisiones nucleares mitóticas.
En organismos multicelulares se emplea el término "clon" cuando éstos son genéticamente idénticos.
Particularmente en el reino vegetal los clones son un fenómeno difundido, la papa es un ejemplo actual
de una población clon.
En el campo de la zoología se encuentran clones en forma natural tanto en organismos inferiores como
en especies altamente desarrolladas como los mamíferos, aunque con limitaciones, dado que el número
de individuos idénticos en estos casos es en general relativamente pequeño (mellizos o trillizos
monocigotas, entre otros). En las especies vegetales los clones se originan a través de reproducción
vegetativa. En las plantas, p. e. a través de los tallos, las yemas o regeneración de sus partes. En los
mamíferos no existe esa via, sólo estadios embrionarios pueden constituir el punto de partida de los
individuos monocigotas.
De acuerdo a lo definido para el término clon se entiende el concepto clonar como:
- En biología celular la unificación de las células con la posterior producción de cultivos celulares a
partir de una sola célula.
- En ingeniería genética la incorporación de un fragmento de ADN (gen) en un vector-clon y su
reproducción clonada en una célula receptora adecuada.
- En embriología la producción de embriones con idéntico genotipo.
En el último caso y para los métodos empleados en los animales domésticos es preciso diferenciar
entre:
- División microquirúrgica de estadios embrionarios tempranos y el posterior desarrollo de las mitades
obtenidas en fetos o individuos.
- Combinación por medio de micromanipulación de estadios embrionarios asincrónicos, con el objeto
de respaldar el desarrollo de blastómeros de estadios más avanzados con blastómeros de estadios
más tempranos. A través de esta vía se pretende aumentar la producción de cuatrillizos hasta 5-8
individuos idénticos (quimera-clon).
- Transferencia de núcleos y células embrionarias nucleadas (blastómeros) en células enucleadas
para producir con un reclonado exitoso, en teoría, un número ilimitado de embriones e individuos
idénticos (clonado embrionario).
Experimentos en el campo del clonado se realizan hace más de 35 a os. La motivación en desarrollar
esta línea de investigación básica resulta de la fascinación ante la posibilidad de lograr la llave de los
conocimientos sobre la totipotencia celular y los procesos de desarrollo embrionario como así también
el significado de esos factores sobre los efectos recíprocos entre el genotipo y el ambiente.
Junto con ese interrogante básico de las ciencias genéticas y biológicas se encuentra también, desde la
década del 80, el creciente interés de la genética animal en aquellos métodos y aplicaciones del
clonado en los animales. Una de las razones del por qué los genetistas incluyen el clonado en sus
proyectos se apoya en el problema que la evaluación genética, especialmente en rodeos bovinos, se
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lleva a cabo con varios años de intervalo generacional y un número relativamente reducido de
descendientes hembras. La variabilidad de la descendencia, a través de la recombinación génica, como
producto de la reproducción sexuada, conduce en muchos casos a un potencial de selección
heterogéneo y útil. La reproducción clonada permitiría sin embargo, variar los genotipos seleccionados
como sobresalientes en forma directa y sin modificaciones.
Técnicas de clonado
División de los embriones
Cuando estadios embrionarios tempranos son divididos, se desarrollan las mitades producidas con un
determinado porcentaje de nacimientos. Las mitades que se desarrollan presentan, sin embargo, en
estadio de blastocisto claramente menos células que aquellos embriones no divididos. Ello significa que
la pérdida de masa celular no puede ser compensada, dado que no se continúa con un crecimiento
compensatorio. La razón para ello es que a partir del momento de la fertilización de un ovocito se
establece el plan de desarrollo, en el cual el número de divisiones celulares es establecido hasta
alcanzar el estadio de blastocisto. Un embrión dividido tendrá en consecuencia tantas divisiones como
las que hubiese tenido en su estado original. Si h-embriones son divididos para producir 4 embriones
idénticos, el posterior desarrollo embrionario hasta el nacimiento se verificará sólo en casos
excepcionales como consecuencia de la pérdida de masa celular. Parece evidente la existencia, en
desarrollos embrionarios tempranos, de la conocida como masa celular crítica y que ésta no debe ser
superada. Un blastocisto funcional puede continuar su desarrollo cuando esa característica está
presente en su masa celular. Si esto no es así se originan vesículas trofoblásticas que se asemejan a
los blastocistos, pero que carecen de la capacidad de desarrollarse, como consecuencia de una falla en
la MCI.
A través de la división de los embriones se logró producir en muchos casos descendencias con éxito.
Sin embargo el número de individuos idénticos, a partir de un embrión, se mantiene limitado por las
razones ya mencionadas, a 2 y en casos aislados a 4 como máximo. Por esa razón el método de
división de embriones no es adecuado para producir un mayor número de embriones (BREM, 1986).
El aislamiento y cultivo de blastómeros obtenidos de embriones en estadios tempranos puede también
conducir al desarrollo de individuos idénticos. La tasa de desarrollo es sin embargo menor cuanto más
avanzado es el estadio del embrión utilizado (MOORE y col., 1968), dado que el número de células del
embrión producido es muy reducido.
Clonado quimérico
Para contrarrestar la reducción de la masa celular en el clonado se llevaron a cabo ensayos
experimentales en las especies murina y ovina agregando un blastómero temprano a uno en estadio
avanzado de desarrollo (blastómeros asincrónicos). Los blastómeros se desarrollan juntos en un
blastocisto normal. Con la asincronía se pretendió formar el embrioblasto a partir del blastómero más
desarrollado. Los blastocistos producidos de esa forma implantaron y se desarrollaron en forma normal
(STERN y WILSON, 1972; FEHILLY y col., 1984; WILLADSEN, 1985). WILLADSEN y FEHILLY (1983)
lograron producir quintillizos con ayuda del clonado quimérico en la especie ovina.
Transferencia de núcleos en embriones
La transferencia de núcleos celulares a partir de un embrión multicelular, a varias células receptoras
posibilita la producción de embriones unicelulares que poseen el mismo genoma. Una condición para
ello es que esa información genética sea empleada en la célula receptora (activación) y la división se
inicie como en un ovocito fertilizado. Esta fase se denomina reprogramación. De esta forma, la división
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celular no continúa en el punto en que se detuvo el embrión donante sino nuevamente en el mismo nivel
de un ovocito fertilizado. Núcleos de embriones tetraploides fusionados fueron obtenidos para producir
embriones diploides y luego transferirlos a células receptoras. Los resultados mostraron una capacidad
de desarrollo inferior de los embriones producidos, caracterizando ese tipo de clonado como ineficiente
(CLEMENT-SENGEWALD y BREM, 1990).
BRIGGS y KING llevaron a cabo en 1952 los primeros experimentos de transferencia nuclear en
organismos multicelulares (anfibios) y observaron que una reprogramación de núcleos celulares de
blástula, a través de ovocitos, es posible. Estudios posteriores indicaron que por medio de procesos de
diferenciación avanzados del núcleo celular la reprogramación se pierde (GURDON y col., 1975).
Como células receptoras de los núcleos celulares embrionarias en los mamíferos se adecuan ovocitos
sin fertilizar -madurados in vivo o in vitro- que hayan alcanzado la metafase II de la 2. división meiótica
separando el cúmulus que los rodea. En esas células, contrariamente a lo que ocurre con ovocitos
fertilizados, pueden ser reprogramados núcleos indiferenciados de estadios embrionarios más tardíos.
Para los trabajos experimentales en clonado de embriones bovinos se adecuan tanto los ovocitos
madurados in vivo como in vitro. Por otra parte el empleo de ovocitos madurados in vitro es
técnicamente más simple y económico, dado que los mismos son obtenidos de ovarios de matadero.
La aplicación de diferentes clases de ovocitos madurados in vitro, uniformemente oscuros o
uniformemente claros resultó en las mismas tasas de fusión y desarrollo embrionario (CLEMENTSENGEWALD y col., 1992a, tabla 1).
Tabla 1: Resultados de fusión, activación y cultivo en 3 clases de ovocitos (CLEMENT-SENGEWALD y
col., 1992a)
clase
pulsados
fusionados
n
%
cultivados
n
activados
n
%
1
262
194
74,0
187
74
2
63
546
73,0
45
22
3
89
76
85,3
74
33
39,5
a
48,8
b
44,5
m.+b.
%/C
%/A
14
7,4
18,9
4
8,8
18,1
4
5,4
12,1
C: cultivados; A: activados; m. + b.: mórulas y blastocistos; a,b p<0,05
Dado que el ovocito no fertilizado cuenta con un número haploide de cromosomas, éste podría
conducir, en interacción con el número diploide de cromosomas del núcleo, a la formación de embriones
triploides. En consecuencia el genoma del ovocito debe ser separado del plasma celular. El mismo
puede ser conducido junto con una mitad de la masa citoplásmica al interior de una zona pelúcida vacía
(WILLADSEN, 1986). Los ovocitos resultantes, con o sin el ADN se emplean como células receptoras.
Con este método se pueden desarrollar, sin embargo, sólo la mitad de los ovocitos como máximo, como
consecuencia de la imposibilidad del desarrollo posterior del embrión triploide. Por otra parte la gran
pérdida de citoplasma puede tener un efecto negativo sobre la continuidad del desarrollo del embrión
producido (BONDIOLI y col., 1990). La particularidad que el ADN del ovocito madurado se encuentra
próximo al corpúsculo polar, permite a través de un método de extracción mecánico, eliminar el genoma
citoplásmico. El mismo se lleva a cabo aumentando, en primero lugar, la elasticidad celular con
citocalasina B y aspirando el corpúsculo polar y el citoplasma contiguo (fotos 2 y 3) con una
micropipeta. A través de esta operación es eliminado el ADN endógeno en la mayor parte de los
ovocitos (92%, STICE y ROBL, 1988). La tabla 2 presenta los resultados obtenidos con la transferencia
nuclear por medio de micromanipulación con ovocitos madurados in vitro.
Tabla 2: Resultados de la manipulación de los ovocitos (CLEMENT-SENGEWALD y col. 1991)
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Ovocitos
metafase II
Enucleación
Intactos
Degenerados
Transferencia nuclear Intactos
Degenerados
n
597
585
12
582
3
(%)
100
98,0
2,0
99,5
0,5
A través de la coloración del ovocito con el colorante para ADN (HOECHST 33342) es posible, bajo
observación visual, controlar la enucleación y lograr una eficacia del 100% (PRATHER, 1989). Como
donantes de blastómeros se emplean embriones con estadios de 4 células hasta mórulas. Junto con el
empleo de embriones ex-vivo (obtenidos de un lavaje uterino) se emplean también ovocitos madurados
in vitro (MI) en forma creciente como donantes de blastómeros (CLEMENT-SENGEWALD y col. 1990;
SIMS y col., 1991). Hasta el momento se obtienen tasas similares de fusión y activación empleando
ovocitos obtenidos in vivo o madurados in vitro. Sin embargo las tasas de desarrollo de los embriones
clonados con ovocitos madurados in vitro es aún inferior a los ex vivo (CLEMENT-SENGEWALD y col.,
1992b, tabla 3). En los ensayos de WHITESELL y col. (1992) fue posible producir embriones in vitro de
dos vacas sacrificadas. Los embriones producidos fueron empleados como donantes de blastómeros.
Los autores pudieron producir 8 embriones de una vaca y de esos, 8 preñeces después de la
transferencia nuclear. El clonado de 9 embriones de la segunda vaca resultó en 21 preñeces.
Tabla 3: Comparación entre ovocitos madurados in vitro y obtenidos in vivo para su empleo en el
clonado (CLEMENT-SENGEWALD y col., 1992b)
Embrión
donante
COBs
a
fusionados
b
b/a
cultivados
c
divididos
d d/c
Σm+b
e e/c
c/d
in vitro
182
130 (71)
102
60 (59)
10 (10)
(16,6)a
in vivo
112
81
81
37 (46)
16 (20)
(43,2)b
(72)
a,b p<0,01 COBs: complejos ovocitos/blastómeros, m+b: mórulas y blastocistos
La aislación de los blastómeros, conteniendo un núcleo cada uno, puede llevarse a cabo por medio de
disgregación del embrión con un medio libre de Ca2+y Mg2+ (STICE y ROBL, 1988), con la previa
separación de la zona pelúcida por medios químicos o mecánicos. La aislación de los blastómeros se
realiza sin dificultades por medio de aspiración con una pipeta. Además es posible aspirar el núcleo de
un blastómero sin lesionar la membrana celular. De esta forma se obtiene una vesícula, rodeada por
una membrana celular (carioplasto), conteniendo un núcleo (Mc GRATH y SOLTER, 1983a). En la
actualidad el método de obtención del núcleo más empleado es la aspiración de un blastómero
completo de un embrión multicelular (fotos 4 y 5). Para ello se emplea una pipeta con punta afilada a fin
de atravesar la zona pelúcida (PRATHER y col., 1987). El empleo de pipetas de punta roma es posible
si se practica una incisión en la zona a fin de facilitar el paso de la pipeta en el interior del espacio
perivitelino hasta el blastómero (TSUNODA y col., 1986). La pipeta conteniendo el carioplasto es
introducida en el espacio perivitelino de un ovocito previamente enucleado (fotos 6-7). Con ayuda de
una ligera presión positiva se deposita el blastómero. En nuestros ensayos la transferencia de núcleos
fue exitosa en 582 de 585 casos (99,5%). Después de la transferencia se provoca la fusión de las
membranas. A través de la fusión se induce la formación de poros en las membranas celulares, de tal
forma que se establecen pequeños canales entre el ovocito y el blastómero. A través de éstos puede
circular el contenido de ambas células. Luego de la fusión de ambas membranas en contacto se
incorpora el núcleo transferido en el citoplasma del ovocito receptor (fotos 10-12). La fusión puede ser
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provocada también por el virus Sendai inactivado (OKADA y col., 1957), que se inyecta en el espacio
perivitelino junto con el blastómero. Este método fue utilizado hasta el momento en experimentos de
transferencia de núcleos celulares en ratón (Mc GRATH y SOLTER, 1983b), ovino (WILLADSEN, 1986)
y bovino (ROBL y col., 1987). La tasa de fusión en animales domésticos fue muy reducida. Otro método
de fusión del blastómero con el ovocito es la electrofusión. Con pulsos eléctricos muy cortos e idénticos
se provoca la desintegración de pequeñas porciones de la membrana celular en la zona de contacto
entre el ovocito y el blastómero y en consecuencia la fusión de ambas membranas (ZIMMERMANN y
VIENKEN, 1982; CLEMENT-SENGEWALD y BREM, 1989). En comparación con el método de fusión
con el virus Sendai, la electrofusión se presenta como un método más efectivo, con una tasa de fusión
de 90% frente a 50% en la especie ovina y 80% frente a 8% en la bovina.
Nuestros ensayos de electrofusión indicaron que las tasas de fusión de los blastómeros obtenidos de
embriones producidos in vitro son iguales a las obtenidas con blastómeros de embriones obtenidos in
vivo (tabla 4).
Tabla 4: Resultados de la fusión de blastómeros con ovocitos receptores por medio de pulsos
eléctricos (CLEMENT-SENGEWALD y col., 1991)
Donantes de
núcleos
COB
n
Fusionados
n
%
No fusionados
n
%
In vitro
312
230
73,7
38
12,2
44
14,1
In vivo
249
189
75,9
38
15,3
22
8,8
Suma
561
419
74,6
76
13,6
66
11,8
Degenerados
Otra ventaja de la electrofusión es la activación del ovocito, mediante la cual se inicia la división celular.
El mecanismo de esa activación es hasta el momento desconocido. Se supone, sin embargo, que la
despolarización de la membrana del ovocito es similar a la que ocurre durante la fertilización normal y
que la concentración intracelular de calcio es alterada como consecuencia de la formación de poros en
las membranas plasmáticas (COLLAS y col., 1989). La tasa de activación es altamente dependiente de
la edad del ovocito y del número, intensidad y duración del pulso eléctrico empleado, como así también
del intervalo entre pulsos (COLLAS y col., 1989; KONO y col., 1989; WARE y col., 1989).
Los embriones producidos luego de la micromanipulación son cultivados in vitro o in vivo hasta el
estadio de M o B, para ser transferidos a hembras receptoras. El cultivo in vitro permite controlar el
desarrollo del embrión. Para el cultivo in vivo se emplean hembras de la misma o diferente especie
(conejo, ovino). Para el cultivo de embriones ovinos se emplean con frecuencia hembras de la misma
especie.
Los embriones recubiertos con agar son colocados en el oviducto (ROBL y col., 1987) y después de 5-6
d de cultivo son recuperados. Con el cultivo de los embriones bovinos en oviducto de coneja se
obtienen los mismos resultados (WESTHUSIN y col., 1989). Dado que ese método es engorroso y caro
los esfuerzos se concentran en el cultivo exclusivamente in vitro de los embriones producidos
(CLEMENT-SENGEWALD y col., 1990; SIMS y col., 1991). Para el cultivo in vitro se emplean sistemas
de co-cultivo con células del oviducto (CO, CLEMENT-SENGEWALD y col., 1990; SIMS y col., 1991),
células de la granulosa (CG) o medios condicionados con células de la granulosa (MCCG, CLEMENTSENGEWALD y col., 1991; tabla 5). Los resultados indican que hasta el momento, el co-cultivo con
células del oviducto parece ser el más adecuado. De los embriones cultivados 7% alcanzaron los
estadios de mórula y blastocisto, cuando embriones producidos in vitro fueron empleados como
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donantes de blastómeros. Cuando fueron empleados blastocistos de embriones obtenidos in vivo se
alcanzaron tasas de 16%.
Tabla 5: Resultados del cultivo de embriones producto de la electrofusión con diferentes medios
(CLEMENT-SENGEWALD y col., 1991)
Donante de
blastómeros
Sistema de
cultivo
Cultivados
n
In vitro
CCO
149
70a
46,9
11e
7,3
CCG
73
28
38,3
2
2,7
MCCG
298
99b
33,2
19
6,3
CCO
113
51c
45,1
18f
15,9
CCG
79
19d
24,0
5g
6,3
In vivo
Activados
n
%
M+B
n
%
McLAUGHLIN y col,. (1992) alcanzaron 20% de mórulas y blastocistos (28/128) cultivando los
embriones clonados en un medio sintético (SOFM) sin sistema de co-cultivo. Después de la
transferencia nació un ternero. Coincidentemente informaron NORTHEY y col., (1992) similares tasas
de desarrollo de embriones clonados a las obtenidas con el co-cultivo con células de oviducto (20% y
28% respectivamente).
El desarrollo de los embriones después de la transferencia nuclear permite emplearlos como donantes
estableciendo un reclonado. A través del reclonado es posible en consecuencia, disponer teóricamente
de un número ilimitado de núcleos celulares idénticos, si los embriones obtenidos son siempre
empleados como donantes. En la práctica debe considerarse, sin embargo, que la tasa de desarrollo de
los embriones producidos disminuye con el aumento creciente del reclonado (BONDIOLI y col., 1990;
STICE y col., 1991). La razón de esto es desconocida, aunque posiblemente el motivo sea la falta de
una óptima manipulación y de adecuadas condiciones en los cultivos.
Fotos 1: pipetas de sostén (PS) y de inyección (PI)
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Foto 2: fijación del ovocito
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Foto 3: Extracción del corpúsculo polar y del Foto 4: Aspiración del blastómero
citoplasma adyacente
Foto 5: Aspiración del blastómero
Foto 6: Colocación de blastómero en el ovocito
receptor
Foto 7: Colocación de blastómero en el ovocito Foto 8: Bastómero del embrión donante en el
receptor
esapacio perivitelino
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Experimentos de clonado en animales de interés zootécnico
Conejo
BROMHALL informó en el año 1975 por primera vez sobre los ensayos de transferencia nuclear
llevados a cabo en embriones de conejo. El genoma de los ovocitos receptores no fue extraído,
produciendo embriones triploides. Los embriones donantes fueron mórulas. Sólo el 2,6% de los
embriones producidos continuaron su desarrollo hasta el estadio de mórula. STICE y ROBL (1988)
informaron el nacimiento de 6 conejos a partir de la transferencia de núcleos de embriones de 8 células
a 164 ovocitos receptores enucleados. La tasa de sobrevivencia de los embriones logrados fue de
3,7%. Los 6 animales fueron gestados en 6 diferentes hembras. HEYMANN y col. (1990) informaron el
nacimiento de 6 clones, en ese ensayo la tasa de sobevivencia fue de 3,9%, comparable con los
resultados de STICE y ROBL (1988). Un año después COLLAS y ROBL lograron producir un clon
séxtuplo con una tasa de sobrevivencia de los embriones de 7,2%.
Porcino
PRATHER y col. (1988) informaron sobre la primera gestación después de la transferencia de
embriones producidos por medio de transferencia nuclear. A pesar que la gestación fue comprobada,
hasta el día 59 no hubo nacimientos en ese ensayo. Un año después fue publicado el nacimiento de un
lechón a partir de un embrión donante de 4 células (PRATHER y col. 1989) La tasa de sobrevivencia de
los embriones manipulados fue muy baja (1,1%), 1 lechón vivo de 88 embriones transferidos.
PROCHAZKA y col. (1990) emplearon ovocitos de cerdo madurados in vivo como receptores de
blastómeros de embriones de 2 a 8 células. Los autores comprobaron que una parte de los ovocitos
tuvo una buena capacidad de regular el normal desarrollo de los núcleos transferidos, la otra careció de
esa capacidad. En las primeras 24 a 30h de cultivo in vitro se dividieron 12 de 16 embriones producidos,
1 embrión se dividió hasta el estadio de blastocisto (d 7).
Recientes investigaciones indicaron que ovocitos porcinos madurados in vitro pueden ser utilizados
como receptores de blastómeros (NAGASHIMA y col., 1992). Después del cultivo in vitro pudieron
desarrollarse 11,9% de mórulas y blastocistos (TERLOUW y col., 1992).
Ovino y caprino
WILLADSEN informó en el año 1986 el nacimiento de 3 corderos, producto de la fusión de blastómeros
de embriones de 8 células con ovocitos enucleados. Dos de 3 animales se originaron del mismo
embrión (mellizos homocigotas). Ello llamó la atención en el mundo científico y desencadenó
numerosos ensayos que sirvieron para el posterior desarrollo y transferencia de la técnica a otras
especies domésticas. SMITH y WILMUT (1989) informaron el nacimiento de 4 corderos, producto de la
transferencia de blastómeros de 16 células y de la MCI de un blastocisto en mitades de ovocitos
enucleados. A través de este experimento los autores comprobaron que los núcleos pueden
reprogramar una célula y regular el desarrollo normal del embrión producido. McLAUGHLIN y col.
(1990) lograron comprobar el desarrollo de 4 hermanos clones el día 45 de la preñez a través de la
técnica de ultrasonido. Los mismos fueron producidos transfiriendo blastómeros de embriones de 8 y 16
células. Actualmente es posible cultivar los embriones clonados hasta el estadio de mórula (PUGH y
col., 1992). YONG y col. (1991) produjeron 2 cabras idénticas después de la transferencia de los
blastómeros de un embrión de 32 células. La tasa de sobrevivencia en ese experimento fue de 21%.
Bovino
Las primeras transferencias de núcleos en esta especie fueron descriptas por ROBL y col. (1987). Los
autores utilizaron ovocitos fertilizados como células receptoras, a las cuales se les extrajeron los
pronúcleos con ayuda de centrifugación. Después de la transferencia de los blastómeros extraños en
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las células receptoras se desarrollaron 5 de los 38 embriones recuperados (17%) del oviducto de oveja
hasta el estadio de M y B. Después de la transferencia de 2 blastocistos a hembras receptores se
produjo el nacimiento de 2 terneros. La transferencia de núcleos de blastómeros de embriones de 2, 4 y
8 células a ovocitos receptores, fertilizados y enucleados resultó en la división hasta 2 y 4 células. Ese
año el mismo grupo de investigación (PRATHER y col., 1987) informó el nacimiento de 2 terneros,
resultado de la transferencia de núcleos de mórulas en ovocitos fertilizados y enucleados. En total
fueron transferidos 19 M y B a 13 receptoras después de un cultivo previo en oviducto de oveja durante
4-5 días. En este trabajo llamó la atención que los ovocitos madurados in vitro mostraron un desarrollo
significativamente menor hasta M y B que los ovocitos receptores obtenidos frescos 36h después del
celo (BARNES y col., 1987). El cultivo in vivo de los embriones producidos a partir de la transferencia
nuclear, en oviducto de oveja fue superior al cultivo in vitro en medio Tyrode con 3mg/ml de BSA, en el
cual se obtuvieron como máximo estadios de 6 células después de un cultivo de 3 días. MAREK y col.
(1990) observaron que el estadio del embrión donante de blastómeros (d 5, 5,5 y 6) no afecta la tasa de
electrofusión. Sin embargo, después de la transferencia de los blastómeros de embriones de 6 días se
desarrollaron más embriones a estadios de M y B (34,5%, después de un cultivo in vivo) que con
embriones donantes de 5 días. STICE y col. (1991) observaron que con el reclonado tanto las tasas de
fusión (66%, 60%, 52% y 54%) como las tasas de desarrollo hasta los estadios de mórula y blastocisto
(20, 10, 19 y 12%) disminuían con el aumento del reciclaje desde el primer clonado al tercer reclonado
respectivamente.
Mientras se llevaban a cabo los ensayos con embriones donantes de blastómeros, obtenidos in vivo, de
los cuales los embriones clonados eran cultivados en oviducto de oveja, CLEMENT-SENGEWALD y col.
(1990) y SIMS y col. (1991) describían el empleo de embriones producidos in vitro como donantes de
blastómeros y el cultivo in vitro de los embriones clonados. Con el empleo simultáneo de ovocitos
receptores madurados in vitro, por ambos grupos de trabajo, se comprobó la posibilidad de producir
embriones clonados hasta estadios transferibles in vitro.
El grupo de trabajo de BONDIOLI (1990) informó sobre numerosos ensayos de transferencia de
núcleos. Para ello fueron empleados sólo ovocitos obtenidos in vivo después de la extracción y lavaje
del oviducto de vacas superovuladas. Los embriones donantes fueron obtenidos entre el dia 5 y 6,5 por
medios no quirúrgicos (estadio de 16-64 células). Después de la transferencia nuclear, los embriones
producidos fueron cultivados transitoriamente en oviducto de oveja y transferidos a vacas receptores
(sincrónicas) en estadios de M y B. Después de la transferencia de 337 embriones fueron
diagnosticadas, el día 42, 79 gestaciones (23,4%). Después de la transferencia de 62 M y B, producidos
con blastómeros de embriones descongelados, se diagnosticaron (d 42) 10 animales preñados (16,1%).
Cuando los embriones fueron congelados/descongelados y empleados para el reclonado se lograron
sólo 3 (13,0%) gestaciones de 23 embriones (d 42). En promedio se obtuvieron 22,5% de gestaciones
(106 preñeces de 463 embriones). De esas gestaciones se obtuvieron 92 terneros vivos. De un embrión
donante se pudieron lograr como máximo 8 gestaciones (d 42). Siete toros fueron idénticos. Cuando los
embriones producidos no fueron cultivados en oviducto de oveja sino in vitro se dividieron 13% de los
embriones hasta M y B. Después de la transferencia de esos 11 embriones se obtuvieron 3 terneros
vivos. WILLADSEN y col. (1991) alcanzaron 42% de preñez (d35) y 38-33% de nacimientos (100
terneros). Llamó la atención en un número importante de terneros el elevado peso y los problemas de
parto como consecuencia de ello. Se requirió asistencia en 84% de los partos. WILLADSEN y col.
(1991) produjeron 13 clones de un par de mellizos idénticos cada uno, 10 clones trillizos y 5 clones con
4 hermanos idénticos. El mayor clon bovino lo constituyen 7 toros vivos (BONDIOLI y col., 1990).
Hasta el momento nacieron terneros del primer clonado y tercer reclonado (STICE y col., 1991). Se
describó también la gestación de clones de embriones donantes congelados/descongelados y con
subsiguiente reclonaje (BONDIOLI y col., 1990). Los resultados más importantes de los experimentos
de clonaje en el bovino se resumen en la tabla 6.
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Clonado de embriones
Tabla 6:
149
Resultados obtenidos en los experimentos de clonado
Origen del embrión donante
in vivo
in vivo
in vitro
in vitro
in vitro
Origen de los ovocitos
in vivo
in vivo
in vitro
in vitro
in vitro
72
S.r
66
80
in vivo
in vivo
in vitro
in vitro
in vitro
24
S.r.
11
-
33
-
28
Tasa máxima de fusión (%)
Cultivo
m & b obtenidos (%)
Embriones transferibles (n)
463
Terneros nacidos (n)
92
(302 transferencias)
100
Sobrevivencia embrionaria (%)
19
(33)
Tamaño máximo del clon
7
4
16-64bl.
8-64bl.
BONDIOLI
WILLADSEN y col.
CLEMENT-
SIMS y
NORTHEY y
y col.
(1986)
SENGEWALD
col. (1991)
col. (1992)
Estadio del embrión donante
de núcleos
Fuente
(1990)
y col. (1990)
S.r = Sin referencias; m & b: mórulas y blastocistos
Perspectivas
No obstante que en conejos la tasa de ovocitos/blastómeros fusionados en los experimentos de
HEYMAN y col. (1990) fue de 91,5%, es necesario mejorar la tasa de fusión en las otras especies,
como por ejemplo en el bovino. BONDIOLI y col. (1990) informaron la fusión de cerca de 70% de los
ovocitos/blastómeros sometidos a pulsos eléctricos. Las tasas de fusión parecen ser más altas
empleando estadios embrionarios tempranos como donantes de blastómeros (SMITH y WILMUT, 1989).
Ello puede ser consecuencia de la diferencia de tamaño de los blastómeros. Un blastómero grande
inyectado bajo la zona pelúcida será presionado con fuerza contra la membrana celular y la superficie
de contacto será mayor, estos aspectos facilitan el proceso de fusión después de aplicados los pulsos
eléctricos. A partir de un determinado estadio del embrión donante de blastómeros parece que la
diferencia de tamaño no juega un rol de importancia.
Las tasas de fusión de embriones de 5, 5,5 y 6 días obtenidas por MAREK y col. (1990) no presentan
diferencias. El agregado de citocalasina B en el medio en el cual son colocados los complejos
ovocito/blastómero después del pulso eléctrico, puede aumentar la tasa de fusión en embriones ovinos
(SMITH y WILMUT, 1989). En el bovino no ha podido ser comprobado ese efecto (LEVANDUSKI y
WESTHUSIN, 1990).
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Clement-Sengewald
150
Tasa de activación
La división de los ovocitos sin fertilizar puede provocarse por medio de diferentes estímulos. Este
proceso se define como activación partenogenética. Como estímulos pueden servir: etanol, Ca2+,
Mg2+-ionóforo o pulsos eléctricos. La activación partenogenética de los complejos ovocitos/
blastómeros después de la transferencia nuclear es necesaria, porque la activación natural del ovocito a
través del espermatozoide falta. Dado que los procesos intracelulares que se originan a través de la
activación no son conocidos, deben establecerse estudios futuros para esclarecer estos fenómenos.
Solo entonces será posible determinar en qué momento la mayor parte de los ovocitos responderá al
estímulo partenogenético y de que manera deberá ser modificado el estímulo para lograr mayores tasas
de activación.
Estadios del embrión donante de blastómeros
Para los trabajos de clonado se destinan embriones donantes en un estadio avanzado, con el fin de
obtener un mayor número de núcleos idénticos. A partir de un estadio embrionario determinado no es
posible reprogramar los núcleos. Su diferenciación celular es irreversible. En el futuro deberá precisarse
el momento exacto de la diferenciación nuclear. Los estadios más avanzados con los cuales se
pudieron lograr animales vivos se describen en la tabla 7. Los resultados de WILLADSEN en ovinos
fueron superados por SMITH y WILMUT (1989) a través de la transferencia de blastómeros de la MCI
de blastocistos en ovocitos ovinos con el nacimiento de corderos. No puede ser descartado el empleo
con éxito de estos estadios en todas las especies animales. Cuando se aclare el mecanismo exacto de
la diferenciación nuclear existirá la posibilidad de trabajar para invertirlo o diferirlo.
Estadio de los blastómeros
Llama la atención en la transferencia de núcleos, que una parte de los blastómeros del mismo embrión
puede ser reprogramada por el ovocito. La otra parte no sigue ese proceso. Como consecuencia de ese
comportamiento heterogéneo puede concluirse que sólo blastómeros de un estadio determinado son
adecuados para la transferencia. Estudios futuros deberán determinar cuál es ese estadio, como
pueden sincronizarse y mantenerse en el mismo.
Tabla 7: Eficacia de los pasos metodológicos, sobrevivencia de los embriones y tamaño de los clones
(número de animales vivos) de trabajos experimentales con embriones de animales de interés
zootécnico
ESPECIE
leporina
porcina
ovina
caprina
Enucleación (%)
100
74
75
s.i.
Fusión (%)
91,5
82
90
51,1
E transferidos
207
88
4
48
Animales nacidos
8
1
3
10
(n)
Sobrevivencia (%)
3,9
1,1
75
20,8
número de células
del donante
32
4
8
2-32
Fuente
HEYMAN y col
(1990)
PRATHER y col.
(1989)
WILLADSEN
(1986)
YONG y col.
(1990)
s.i. = sin información
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Clonado de embriones
151
Cultivo de los embriones clonados
A través de mejores condiciones in vitro es posible obtener una mayor tasa de M y B. Con la
transferencia de estos estados avanzados es posible mejorar considerablemente las tasas de preñez y
con ello la eficacia de un programa de clonado. Ello permitiría excluir aquellos embriones que se ven
intactos después de las primeras divisiones pero que no alcanzan los estadios de mórula o blastocisto.
Con el reemplazo del cultivo temporal in vivo de los embriones clonados en receptoras intra- o ínter
específicas a través del cultivo in vitro pueden evitarse las pérdidas en la recolección de los embriones.
Con la modificación de las condiciones del cultivo toman importancia los cultivos "monolayer"
(monocapa de células granulosas y de oviducto) o cultivos de suspensiones (células de oviducto) y la
aplicación de medios condicionados de células de granulosa u oviducto.
Después del mejoramiento de los pasos metodológicos del clonado y del aumento del número de
animales idénticos puede estudiarse el efecto de la unión del plasma celular del blastómero con el
ovocito (Cybrid). Ello puede ser importante porque no sólo existe ADN en el núcleo sino también en el
citoplasma (mitocondrias). Ello puede hacer necesario que para la producción de individuos matroclin
homocigotas deban emplearse, junto con los blastómeros de un mismo embrión también ovocitos de
una misma vaca. Existe la posibilidad que los blastómeros posean diferente información genética como
consecuencia de mutaciones numéricas o estructurales de los cromosomas durante la división celular.
El desarrollo del clonado de embriones dependerá en el futuro del desarrollo de los biométodos
asociados como la congelación o vitrificación de los embriones, la producción de embriones como
donantes potenciales de blastómeros, el desarrollo de medios de cultivo in vitro como así también de la
transferencia de los embriones. Sólo la asociación del reclonado, congelado y transferencia no
quirúrgica de los embriones hace posible la intensificación del aprovechamiento de animales de alto
valor genético.
Resumen de los pasos metodológicos del clonado de embriones
1.
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7.
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10.
11.
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14.
15.
16.
17.
18.
Maduración in vitro de los ovocitos, obtenidos de ovarios de matadero, en MPM + 20 % de SVC +
FSH durante un mínimo de 20 h.
Eliminación de las células del cumulus con Tripsina/EDTA (0,1/0,2%) y una pipeta fina (170 µm).
Montaje de la unidad de micromanipulación. El medio de micromani-pulación debe contener
Citocalasina B (5 g/ml).
Pretratamiento de 10 a 15 de los ovocitos denudados durante 10 min. en medio conteniendo
Citocalasina B (5 g/ml).
Transporte de los ovocitos tratados a las gotas de manipulación.
Enucleación del ovocito, eliminando el corpúsculo polar y el citoplasma adyacente.
Enucleación del primer grupo de ovocitos.
Colocación del embrión donante de núcleos en la gota de manipulación.
Después de 5-10 min., comenzar entonces con la recolección de los blastómeros.
Fijar el embrión donante y aspirar un blastómero con la pipeta de enucleación.
Fijar un ovocito enucleado e inyectar el blastómero en el espacio perivitelino (emplear el mismo
orificio de la zona pelúcida).
Repetir el procedimiento con los otros ovocitos enucleados.
Transportar el complejo ovocito-blastómero en medio sin Cito B.
Recomenzar con un nuevo grupo a partir del punto 4.
Montaje de la unidad de electrofusión.
Trasladar un máximo de 10 a 15 complejos ovocitos-blastómeros al medio Zimmerman de fusión
celular, esperar por lo menos 5 minutos.
Colocar un máximo de 2 complejos en la cámara de fusión.
Orientación manual de los complejos (superficies de contacto blastómero/ ovocito paralelas a los
electrodos).
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Clement-Sengewald
19.
20.
21.
22.
Descarga de los pulsos de fusión.
Colocación de los complejos tratados en MPM + 20% SVC o TL Hepes.
Evaluación del resultado de la fusión después de 30 a 60 minutos.
Cultivo de los complejos fusionados en medio condicionado o en cultivos celulares (cultivo de
células de la granulosa u oviducto).
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