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EVALUACIÓN DE LA FRAGMENTACIÓN DEL ADN EN SEMEN BOVINO
CONGELADO
1
Posado, R.; 2Hernández, M.; 1García, J.; 1Bartolomé, D.; 2Olmedo, S.; 2Rodríguez, L.,
3
López-Fernández, C.; 3Gosálvez, J.
1
Centro de Investigación del Toro de Lidia. Paseo Canalejas, 77, 2ºA. 37001
Salamanca. www.centrotorolidia.es. E-mail: [email protected]
2
Instituto Tecnológico Agrario de Castilla y León, Finca Zamadueñas. Ctra. Burgos,
Km. 119. 47071 Valladolid.
³ Facultad de Ciencias, Departamento de Biología. UAM. Ctra. Colmenar Viejo, Km.
15,500. 28049 Madrid.
RESUMEN
Evaluar la calidad seminal es fundamental para conseguir altas tasas de fecundidad. El
esperma tiene que traspasar y sobrevivir en el tracto reproductivo de la hembra y
conseguir alcanzar, penetrar y fertilizar el óvulo dando lugar a un satisfactorio
desarrollo embrionario (Ardón, 2005). Tradicionalmente las alteraciones espermáticas
evaluadas, incluyen, entre otros, el análisis de la motilidad y las anormalidades
morfológicas. Los espermatozoides de dosis seminales que son normales en su
motilidad y morfología, no serán rechazados por el tracto reproductivo, pueden iniciar la
fertilización, pero tener deficiencias que afecten al cumplimiento de la misma o al
desarrollo normal del embrión.
Recientemente varios autores han centrado sus trabajos en investigar la inestabilidad de
la estructura de la cromatina (Bungum et al., 2004). La estructura de la cromatina del
esperma es muy compacta y estable, protege la integridad genética durante el transporte
del espermatozoide a través del macho y del tracto reproductivo femenino (Evenson et
al., 2002). Una condensación defectuosa de la cromatina del espermatozoide, debido a
múltiples factores, hace que el ADN sea inestable y sensible a la desnaturalización
(Ahmadi et al., 1999). En el presente estudio, se han analizado los niveles de
fragmentación del ADN en los espermatozoides se ha utilizado el kit Sperm Halomax,
que es un producto pionero para el análisis de fragmentación del ADN en animales,
concretamente se trata de una variante del protocolo Sperm Chromatin Dispersion
usado en humanos, que distingue entre espermatozoides con o sin fragmentación del
ADN mediante de acuerdo con la capacidad del espermatozoide de producir un halo de
dispersión de la cromatina o no.
Para llevar acabo el presente estudio, se han recopilado pajuelas de sementales de
distintas ganaderías de lidia. Se ha procedido a la descongelación de las muestras y tras
realizar el análisis en el laboratorio se ha estimado la tasa basal de los niveles de
fragmentación del ADN de los espermatozoides y la variabilidad individual que
presenta este parámetro entre individuos de la misma raza. Así mismo, se ha realizado
este procedimiento en individuos de otras razas bovinas y la tasa de fragmentación basal
es superior en los individuos analizados de la raza de lidia.
INTRODUCCIÓN
Los parámetros espermáticos clásicos que se consideran en un análisis de calidad
seminal incluyen, en general, motilidad, concentración, vitalidad y anomalías
morfológicas. Recientemente, evaluar el estado de la cromatina es uno de los principales
objetivos porque se ha demostrado una alta correlación con la fertilidad (Evenson &
Wixon, 2006). La inestabilidad de la estructura de la cromatina en el espermatozoide es
un tema de análisis recurrente debido a que nos ofrece información directa de la
“calidad” de la molécula de ADN que transmitirá la información a la siguiente
generación. Cualquier defecto en esta molécula, bien sea en forma de rotura que afecta
a una o a ambas cadenas de la molécula de ADN, puede tener como consecuencia una
reparación que no respete la secuencia original para esa región del genoma y
desencadenar efectos no deseables en el embrión. Sin embargo, el análisis de los niveles
de fragmentación del ADN espermático no se realiza de forma rutinaria en la evaluación
de una muestra seminal por dificultades técnicas.
En el presente trabajo se evaluó la calidad del ADN en muestras de semen procedentes
de sementales de la raza de Lidia, Charolais y Holstein. El estudio se realizó sobre
muestras de esperma congelado y se evaluaron los niveles de fragmentación a 37ºC.
Para ello, se utilizó Halomax, técnica que produce una descondensación diferencial de
la cromatina en aquellos espermatozoides que tienen su ADN fragmentado respecto de
aquellos que no lo tienen. En este caso los resultados se contrastaron con los obtenidos
a través de un control externo basado en la técnica de cometas neutros para evaluar la
naturaleza del daño en la molécula del ADN.
MATERIAL Y MÉTODOS
Se ha realizado un estudio prospectivo sobre la calidad de los espermatozoides de
muestras seminales criopreservadas, elegidas al azar, de 10 sementales de raza de Lidia,
4 de la raza Holstein y 4 de raza Charolais, en edad reproductiva al azar para visualizar
la fragmentación del ADN.
El procedimiento comienza con el descongelado de cada pajuela en agua a 37ºC,
durante 45”, se obtiene una alícuota de esperma, que posteriormente, fue procesada
utilizando Halomax. El esperma fue añadido y mezclado en un eppendorf con agarosa
atemperada. Una pequeña parte de la alícuota de la mezcla de agarosa-esperma fue
extendida en un portaobjetos pretratado y colocado en un refrigerador sobre una placa
fría. Tras la solidificación, el portaobjetos con el esperma fue colocado horizontalmente
en solución de lisis para, finalmente, realizar un lavado de la preparación en agua
destilada, antes de su deshidratación en una serie secuencial del 70 %, el 90 %, y el
etanol del 100 %.
Tras el proceso observamos el daño del ADN con microscopía de fluorescencia y se
realizó el conteo de los espermatozoides clasificándolos en dos categorías según la
morfología obtenida. Algunos núcleos mostraron pequeños halos de dispersión de la
cromatina, que debería corresponder a los espermatozoides que contienen ADN no
fragmentado, mientras que otros núcleos del esperma expusieron grandes halos de
difusión de la cromatina con un aspecto estelar, correspondientes a núcleos
fragmentados.
Figura 1. Visualización del daño en el espermatozoide del toro de lidia tras SCD (a) y tras ensayo
cometa (b).
RESULTADOS
Tras el análisis de las 30 muestras, se ha obtenido la tasa basal de la fragmentación del
ADN de los espermatozoides de sementales de la especie bovina.
Los individuos de la raza de Lidia numerados con el 3, 5, 7, 9 presentan un índice de
fragmentación (IF) basal superior al 10%, destacando sobremanera el toro número 5 que
presenta un índice del 35% de espermatozoides con daño en su ADN. Por el contrario,
con un índice de fragmentación basal por debajo del 5% han resultado los toros 1, 2, 4,
6, 10. El promedio basal del IF en los individuos analizados fue del 10%.
Con respecto a la raza cárnica Charolais (T11, 12, 13,14), las muestras han dado un
índice de fragmentación entre el 6 y el 12 % de los espermatozoides, con un promedio
del 8%, algo inferior al resultado de los sementales evaluados de la raza de Lidia.
Las muestras evaluadas pertenecientes a los sementales de la raza Holstein (T15, 16,
17,18) han dado como resultado un promedio en la fragmentación del esperma
analizado, del 3,5%, valor muy inferior al obtenido en las otras razas, probablemente
esto esté ligado al alto grado de selección al que ha sido sometida esta raza.
Azul: % IF Lidia. Naranja:% IF Charolais. Verde: % IF Holstein.
40
30
20
10
0
T1
T2
T3
% IF Basal 1,67 2,33 19
T4
T5
T6
T7
T8
2
34
3
10,3
8
T9 T10 T11 T12 T13 T14 T15 T16 T17 T18
18,7
1
6,33
6
7,67 12
1
1,33 5,33 6,33
Gráfico 1. Índice de fragmentación de las muestras analizadas.
CONCLUSIÓN
Los resultados muestran que existe una gran heterogeneidad, en la fragmentación basal
en las razas bovinas e incluso entre individuos.
La raza de Lidia presenta un porcentaje del índice de fragmentación del ADN superior a
la raza Charolais y Holstein. Por otro lado hay que destacar que el conjunto de los
individuos analizados de la raza Holstein, presentan el nivel más bajo de daño en el
ADN de los espermatozoides.
Desde un punto de vista teórico y de acuerdo con los resultados mostrados en el
presente trabajo, se debería tender a la utilización de muestras seminales con un bajo
índice de fragmentación de su ADN, si el resto de parámetros seminales no se vieran
afectados.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
Ardón, F. (2005) Studies on the interaction of chromatin-unstable boar sperm with the
female reproductive trac. Edita:University of Veterinary Medicine Hannover.
Bungum, M. (2005).The predictive value of sperm chromatin structure assay (SCSA)
parameters for the outcome of intrauterine insemination, IVF and ICSI. Human
Reproduction, 20(3):839-840.
Evenson, D.; Wixon, R. (2006). Clinical aspects of sperm DNA fragmentation detection
and male infertility. Theriogenology, 65 (5): 979–991.
Ahmadi, A. (1999). Developmental capacity of damaged spermatozoa. Human
Reproduction, 14 (9): 2279-2285.