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Endo-reduplicación y MCP
2016
Ejemplos
• Formación de tejido reservante en granos de
Gramíneas: Endospermogénesis
• Desarrollo de la flor de Brassica
Desarrollo del
endosperma de
maíz
Maíz
Embrión y semilla madura de
maíz
Semilla de trigo
Safranina-Fast green,
DAPI,
TUNEL
Embrión de maíz en diferentes etapas de desarrollo
TUNEL y DAPI
TUNEL
Maíz endospermogénesis
• Se cortó longitudinalmente, se coloreó con Evans
Blue, que es un reactivo que identifica células
muertas (penetra en células cuyas membranas no
han mantenido su integridad
Endosperma de Gramíneas.
Autoflorescencia-Testigo-FCF1
Azul de Nilo-FCF1
Azul de Nilo-FCF1
Trigo y
Azul de
Evans
Young TE, Galli DR. Plant
Molecular Biology 44: 283301 (2000)
ADN, ARN y
Proteínas
solubles
Young TE, Galli DR. Plant Molecular Biology 44: 283-301
(2000)
A los 16 DAP el grano alcanza el
tamaño definitivo
Hormonas
• ABA y etileno: ABA regularía al etileno (producción
o acción)
• Etileno: es producido en el endosperma en dos
fases del desarrollo: la primera coincide con el
comienzo del programa de MCP y la segunda con el
incremento de la actividad nucleasa y la aparición
de los productos finales de la fragmentación
internucleosomal del ADN
Etileno y
Ladder
MCP y ABA
Young TE, Galli DR. Regulation of programmed cell death in maize endosperm by abscisic acid.
Plant Molecular Biology 42: 397-414 (2000)
• Mutante vp1: ABA insensible
• Mutante vp9: ABA deficiente
• En ambas mutantes, la MCP se adelanta: ABA actúa
sobre etileno, y éste sobre la MCP. Al estar ausente
ABA, el etileno está no-controlado y entonces
adelanta la muerte
Etileno y ladder
• Etileno es producido en cantidad en las
mutantes, mas que en WT. Un inhibidor de
etileno reduce la fragmentacion de DNA
Maíz
Young TE, Galli DR. Regulation of programmed cell death in maize endosperm by abscisic acid. Plant Molecular Biology 42: 397-414
(2000)
Electroforesis de campo pulsado
• Fragmentos de ADN de peso molecular de un
rango entre 300 y 50 kb fueron observados 16
DAP en el endosperma de Vp1 y vp1 (WT y
mutante de una línea de maíz)
Maíz
Producción de Ethylene
(nmol/h por grano)
durante el desarrollo de
vp1, vp9, y wild-types Note
la diferencia en escala
entre los dos gráficos
Etileno es producido en mayor
cantidad en la mutante, que en
WT. Un inhibidor de etileno
reduce la fragmentacion de
DNA
Análisis de actividad
nucleasa en el
endosperma y en el
embrión de vp1, vp9, y
VP1, VP9.
Las actividades de
nucleasa fueron
resueltas sobre un gel
SDS-PAGE en el cual el
ADN había sido
embebido. 2 g de
proteína soluble del
endosperma y del
embrión en diferentes
estados de desarrollo. La
presencia de actividad
nucleasa es indicada por
la presencia de una
banda oscura.
Análisis del etileno bajo
diferentes tratamientos
AVG: inhibidor de la síntesis
de etileno
IMCP: inhibidor de la
percepción de etileno
ABA: ácido abscísico
Fluridone: Inhibidor de ABA
GA: Ácido Giberélico
Sabelli PA. 2012. Replicate and die for your own good: Endoreduplication and cell death in the
cereal endosperm. Journal of Cereal Science 56 (2012) 9-20
Sabelli PA. 2012. Replicate and die for your
own good: Endoreduplication and cell death
in the cereal endosperm. Journal of Cereal
Science 56 (2012) 9-20
El endosperma de los cereales es una fuente clave de calorías en la
dieta y materias primas para un gran número de productos
manufacturados.
Si se alcanzara a entender cómo se regula el ciclo durante el
desarrollo del endosperma, se podría incrementar el rendimiento
de los cultivos.
En el maíz, un gen, RetinoBlastoma-Related-1 gene, RBR1, juega un
rol central en regular la expresión, endoreduplicación, número,
tamaño, y muerte de las células del endosperma.
RBR1 está genéticamente acoplado a Cyclin-Dependent-Kinase A;1
Controla la endoreduplicación pero no la expresión del gen.
Las semillas down-regulated para RBR1 desarrollan normalmente, lo
cual sugiere mecanismos que controlan el desarrollo del
endosperma de más alto orden, superpuestos a la regulación del
ciclo celular.
Sabelli PA et al. 2013. Control of cell proliferation, endoreduplication, cell size, and cell death by the retinoblastoma-related pathway in
maize endosperm. PNAS 22, 2013: E1827–E1836
En el modelo, el
camino CDKA(CYCLIN
DEP KINASE; 1/RBR1
(RETINOBLASTOME
RELATED) regula
expresión de genes,
endoreduplicación
proliferación celular,
muerte celular y
tamaño celular
durante el desarrollo
del endosperma de
maíz
Sabelli PA et al. 2013. Control of
cell proliferation,
endoreduplication, cell size, and
cell death by the retinoblastomarelated pathway in maize
endosperm. PNAS 22, 2013:
E1827–E1836
1. Down regulation de RBR1 por RNAi
promueve RBR3, familia de genes
MINICHROMOSOME MAINTENANCE 2-7 Y
PROLIFERATING CELL NUCLEAR ANTIGEN,
los cuales codifican factores esenciales de
replicación de DNA
2. Se estimulan los ciclos mitóticos y de
endoreduplicación
3. Endosperma transgénico contiene 4258% más células y 70 % más DNA que el
WT, pero el tamaño celular y de los
núcleos es menor
4. MCP aumenta
5. El DNA del endosperma maduro
incrementó 43% sobre el RBR1 down
regulado, pero el contenido de proteínas y
el peso del grano no fue afectado
6. Down regulación de RRBR1 y CYCLIN
DEPENDENT KINASE A (CDKA);1 indica que
CDKA;1 es epistático a RBR1 y controla la
endoreduplicación a través de un camino
dependiente
7. RBR1 reguló negativamente la actividad
de CDK sugiriendo un feedback loop.
Sabelli PA et al. 2013. Control of cell proliferation,
endoreduplication, cell size, and cell death by the
retinoblastoma-related pathway in maize endosperm. PNAS
Generación de RNAi (RBR1DS1) y anticuerpos específicos RBR1/3
Alineamiento esquemático de secuencia de aa de maíz respecto al de humano –
Una línea transgénica de maiz denominada RBR1DS! se obtuvo por transformación
embrionaria con una construcción de ADN que produce ARN doble cadena bajo el
control del promotor de maiz 27-kDa γ-zein
Sabelli PA et al. 2013. Control of cell proliferation,
endoreduplication, cell size, and cell death by the
retinoblastoma-related pathway in maize endosperm. PNAS
22, 2013: E1827–E1836
Endoreduplicación es estimulada
en endosperma transgénico
RBR1DS1
A. Niveles promedio de ploidía
en 5 estados de desarrollo,
entre 10 y 22 DAP (cambio
doble)
B. Distribución de núcleos del
endosperma expresado en %
del total de números de
núcleos
C. Distribución de la cantidad de
DNA expresado en % del total
de DNA
Sabelli PA et al. 2013. Control of cell
proliferation, endoreduplication, cell size, and
cell death by the retinoblastoma-related
pathway in maize endosperm. PNAS 22, 2013:
E1827–E1836
MCP es aumentada en endosperma RBR1DS1
Sabelli PA et al. 2013. Control of cell proliferation, endoreduplication, cell size, and cell death by the retinoblastoma-related pathway
in maize endosperm. PNAS 22, 2013: E1827–E1836
Tamaño celular reducido RBR1DS1
Áreas celulares fueron medidas en tres zonas indicadas de WT y transgénica
Sabelli PA et al. 2013. Control of cell proliferation, endoreduplication, cell
size, and cell death by the retinoblastoma-related pathway in maize
endosperm. PNAS 22, 2013: E1827–E1836
Interacción genética entre CDK;1 y RBR1. A. Wb de CDKA;1 y CDKA1DN en endosperma de 19 DAP de 4 genotipos::
WT, CDKA1DN, RBR1DS1, CDKA1DN/RBR1DS1 derivados del cruzamiento de CDKA1DN x RBR1DS1.
El anticuerpo contra CDKA;1 (αCDKA;1) reconoce tanto la proteína endógena como la mutante.
Fosforilación de la histona H1 por p13suc1- adsorbió actividad kinasa en los 4 genotipos
B. Niveles de expresión de transcripto RBR1 en los cuatro genotipos
C. Niveles de ploidía promedio en los cuatro genotipos
D. Niveles de expresión del homólogo DNA METHYLTRANSFERASE 1 DMT101, en los cuatro genotipos
1. Represión de RBR1 por RNAi promueve RBR3,
familia de genes MINICHROMOSOME
MAINTENANCE 2-7 Y PROLIFERATING CELL
NUCLEAR ANTIGEN, los cuales codifican factores
esenciales de replicación de DNA
2. Fueron estimulados los ciclos mitóticos y de
endoreduplicación
3. Endosperma transgénico contiene 42-58% más
células y 70 % más DNA que el WT, pero el
tamaño celular y de los núcleos fue menor
4. MCP fue aumentada
5. El DNA del endosperma maduro incrementó
43% sobre el RBR1 down regulado, pero el
contenido de proteínas y el peso del grano no fue
afectado
6. Down regulación de RRBR1 y CYCLIN
DEPENDENT KINASE A (CDKA);1 Iindica que
CDKA;1 es epistático a RBR1 y controla la
endoreduplicación a través de un camino
dependiente
7. RBR1 reguló negativamente la actividad de
CDK sugiriendo un feedback loop.
Estados de desarrollo de Brassica oleracea cv. Iro-Dori.
Estado 0 joven pimpollo floral;
Estado 1: pimpollo 6 mm en longitud;
Estado 2: pimpollo 8 mm en longitud;
Estado 3: pimpollo 10 mm en longitud;
Estado 4: 1 día antes de la antesis
Estado 5: antesis
Nobuhiro Kudo · Yasuo Kimura. 2001. Flow
cytometric evidence for
endopolyploidization in cabbage
(Brassica oleracea L.) flowers.
Sex Plant Reprod 13:279–283
Histograma de distribución
de núcleos en estados
(A) Estado 0: joven
pimpollo floral
(B–E) Estado 5: (B) sépalo;
(C) carpelo, (D) filamento,
(E) pétalo
Nobuhiro Kudo · Yasuo Kimura. 2001. Flow
cytometric evidence for
endopolyploidization in cabbage
(Brassica oleracea L.) flowers.
Sex Plant Reprod 13:279–283
Check points
Bibliografía
• Beest M e t al. 2012- The more the better? The role of polyploidy in facilitating
plant invasions. Annals of Botany 109: 19–45.
• Dilkes et la. 2012. Genetic Analyses of Endoreduplication in Zea mays
Endosperm: Evidence of Sporophytic and Zygotic Maternal Control. J. Exp. Bot
53: 1017-1023.
• Nobuhiro Kudo · Yasuo Kimura. 2001. Flow cytometric evidence for
endopolyploidization in cabbage (Brassica oleracea L.) flowers. Sex Plant
Reprod 13: 279–283.
• Sabelli PA et al. 2013. Control of cell proliferation, endoreduplication, cell size,
and cell death by the retinoblastoma-related pathway in maize endosperm.
PNAS 22, 2013: E1827–E1836.
• Sabelli PA. 2012. Replicate and die for your own good: Endoreduplication and
cell death in the cereal endosperm. Journal of Cereal Science 56 (2012) 9-20.
• Young TE, Galli DR. 2000. Regulation of programmed cell death in maize
endosperm by abscisic acid. Plant Molecular Biology 42: 397-414.
• Young TE, Galli DR. 2000. Programmed cell death during endosperm
development. Plant Molecular Biology 44: 283-301.