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Estudio de la regulación transcripcional activada por el morfógeno
Dpp durante la formación del ectodermo dorsal en Drosophila
melanogaster
Tesis entregada para optar por el grado de
Doctor en Biotecnología
Calixto Domínguez Portilla
Directora de Tesis:
Dra. Verónica Cambiazo
Co-director de Tesis:
Dr. Tomás Pérez-Acle
Santiago – Chile
2012
Resumen
Durante la embriogénesis de Drosophila melanogaster el ectodermo
dorsal se subdivide en dos tipos celulares, la amnioserosa y la epidermis dorsal.
La diferenciación hacia estos dos tipos celulares es producto de la acción
combinada de dos morfógenos de la familia de Factores de crecimiento TGF-β,
Decapentaplegic y Screw (Dpp/Scw). El gen dpp se expresa en la región dorsal
del embrión en los estados del blastodermo celular y gástrula, mientras que scw
se expresa de forma ubicua, por un corto periodo de tiempo, durante la
celularización del embrión. La acción de Dpp se manifiesta en forma de un
gradiente extracelular, que alcanza niveles máximos de señalización en la
región más dorsal del embrión, determinando directamente el destino de las
células dorsales del embrión mediante la activación transcripcional de diferentes
grupos de genes.
Los TGF-β emiten su señal primaria a través de la familia de factores de
transcripción Smads los cuales forman complejos con cofactores específicos
activando o reprimiendo la expresión de genes blancos. Durante la subdivisión
del ectodermo dorsal, la unión de Dpp y Scw a receptores serina/treonina
kinasa Tipos I y II conduce a la fosforilación de Mad (Mothers-against-dpp) un
factor de transcripción de la familia Smad. La forma fosforilada de Mad (pMad),
forma un complejo con el co-activador conocido como Medea (Med), siendo
ambos translocados al núcleo para activar la transcripción de un número
indeterminado de genes blanco. Las evidencias acerca de la localización
espacial de pMad revelan la formación de un gradiente de concentración del
factor de transcripción con niveles máximos en las células localizadas en la
región más dorsal del embrión disminuyendo de manera simétrica hacia las
regiones laterales. El complejo pMad/Medea se une a módulos de regulación en
cis (MRC) que contiene sitios bipartitos de una secuencia caracterizada por el
patrón rico en GC y un patrón de unión del dominio NH1 GNCN. Este patrón es
similar a la secuencia de unión para la familia Smad (SBE, smad binding
elements) en vertebrados. Los genes regulados por la vía Dpp/pMad se
expresan en dominios celulares centrados en la línea media dorsal del embrión
y claramente correlacionados con el gradiente nuclear de pMad a lo largo del
ectodermo dorsal, sugiriendo que la actividad pMad determina al menos tres
umbrales de expresión. Cada uno de estos umbrales está definido por la
expresión de uno o más genes que han sido clasificados como genes de
umbral tipo I, II o III. Niveles máximos de pMad activan los genes de umbral tipo
I zerknüllt (zen), Ance y pebbled (peb), que se expresan en 4-5 células en la
región más dorsal del embrión. Los genes de umbral tipo II, u-shaped (ush) y
tailup (tup), son activados en un dominio más amplio de 12 hasta 14 células en
la región dorsal. Por otro lado, pannier (pnr) es el único representante de genes
de umbral tipo III y se expresa en un dominio de 36-40 células.
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¿Cúal es el mecanismo utilizado por estos genes para responder al
gradiente de pMad?. El análisis de los MRCs de algunos de ellos ha permitido
postular tres mecanismos alternativos. Primero, una composición de sitios de
unión de Mad/Medea con afinidades relativas. Segundo, un balance entre
señales de activación y represión transcripcional. Tercero, una interacción
sinérgica de pMad/Medea, por ejemplo con el factor de transcripción Zen. zen
es un gen de la familia homeobox, cuya expresión es activada por Mad/Medea.
Durante los estados tempranos de la embriogénesis la expresión del gen zen
está restringida a las 3-5 células más dorsales donde el gradiente de pMad
muestra los niveles más altos de actividad y la actividad de su producto es
esencial para la diferenciación de la amnioserosa. Las descripciones de los
mecanismos empleados para interpretar la señal del gradiente de Dpp durante
la diferenciación del ectodermo dorsal han sido realizadas en un número
limitado de genes diana, por ello no es posible obtener conclusiones más
específicas de cómo estos operan. Más aún, las estructuras de las regiones
reguladoras en cis de distintos genes, necesitan ser comparadas y analizadas
en el contexto de una red de regulación génica controlada por el morfógeno
Dpp.
En este proyecto, se diseñaron experimentos utilizando microarreglos
que contienen el transcriptoma completo de D. melanogaster para identificar
nuevos genes diana de la vía Dpp/pMad. Hemos medido los cambios de
expresión entre muestras de ARNs extraídas de embriones silvestres y
embriones con carencia y exceso de la función de Dpp. Paralelamente, se
generó un mapa con las zonas que contienen grupos de motivos de unión de
Mad como probables MRCs involucrados en los estadios tempranos del
desarrollo de D. melanogaster. Estos resultados se integraron con datos de
conservación de secuencias, siguiendo la huella filogenética y bases de datos
de expresión in situ y logramos identificar los MRCs de tres genes (CG13653,
CG12420 y CG8147) cuya expresión varía bajo las perturbaciones de la señal
de Dpp. Finalmente, examinamos la funcionalidad in vivo de los MRCs en
ensayos en líneas transgénicas con genes reporteros (lacZ).
Finalmente, el análisis de nuestros resultados nos ha permitido generar
un modelo que asimila e integra el conocimiento de los mecanismos por los
cuales las células interpretan el gradiente de Dpp/Mad para ser traducidos en
patrones estables del destino celular
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Abstract
The Drosophila dorsal ectoderm is subdivided into two cell types, the
amnioserosa and the dorsal epidermis. The differentiation into two cell types is
the result of the combined action of two members of growth factors family (TGFβ), Screw and Decapentaplegic ligands (Scw/Dpp). The dpp gene is expressed
in the dorsal region of the embryo during the cellular blastoderm and gastrula
states, while scw is ubiquitously expressed for a short period of time, during the
embryo cellularisation. Dpp acts as an extracellular gradient, reaching maximum
levels of signaling in the most dorsal region of the embryo. The gradient
determines directly the destination of the embryo dorsal cells by transcriptional
activation of different sets of genes.
TGF-β pathway emits the primary signal via the family of transcription
factor Smads that form complexes with cell-specific cofactors activating or
repressing the expression of target genes. During subdivision the dorsal
ectoderm, binding of Scw/Dpp to receptors serine/threonine kinase Types I and
II leads to Mad phosphorylation (Mothers-against-dpp) a transcription factor of
the Smad family. The phosphorylated form of Mad (pMad), forms a complex with
the co-activator known as Medea (Med), both are translocated to the nucleus to
activate transcription of an unknown number of target genes. Evidence for the
spatial localization of pMAD reveals the formation of a concentration gradient
with maximum levels in the most dorsal cells of the embryo decreasing
symmetrically towards the lateral regions. The complex pMAD/Medea binds to
cis-regulatory modules (CRM) containing bipartite sites characterized by a
sequence rich in GC pattern and a pattern of GNCN NH1 binding domain. This
pattern is similar to the binding sequence for Smad family (SBE, Smad binding
elements) in vertebrates. Genes regulated via Dpp/pMAD are expressed in
nested domains centered in the dorsal midline cells and clearly correlated with
the pMAD nuclear gradient along the dorsal ectoderm. The pMAD activity
determines at least three expression thresholds each of these thresholds is
defined by the expression of one or more genes that have been classified as
threshold genes of type I, II or III. Maximum levels of pMad activate the type I
threshold genes zerknüllt (zen), Ance and pebbled (peb), which are expressed
in 4-5 cells in the dorsal region of the embryo. The type II threshold genes, ushaped (ush), tailup (tup), C15 are activated in a broader domain of 12-14 cells
in the dorsal region. Furthermore, pannier (pnr) is the only representative of type
III threshold genes and is expressed in a domain of 36-40 cells.
This thesis address the question about the mechanisms used by these
genes that permit then to respond the gradient of Dpp/Mad. Analysis of some
CMRs has suggesting three mechanisms. First, a composition of binding sites
affinities with Mad/Medea. Second, a balance among transcriptional activation
and repression signals. Third, a synergistic interaction of pMAD/Medea with
specific co-factors, for instance, with Zen. Zen is a transcription factor homeobox
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gene whose expression is activated by Mad/Medea. During the early stages of
embryogenesis the expression of zen is restricted to the most dorsal 3-5 cells
where the gradient of pMAD shows the highest levels of activity and the activity
of its product is essential for the amnioserosa differentiation. The proposed
mechanisms used to interpret the signal of Dpp gradient during the dorsal
ectoderm differentiation were analyzed on a limited number of target genes,
impeding more specific conclusions as they operate. Moreover, the structures of
CMRs of different genes need to be compared and analyzed in the context of a
gene regulatory network controlled by the Dpp morphogen.
In this project, I designed experiments using microarrays containing the
complete transcriptome of D. melanogaster to identify novel target genes
downstream of Dpp/Mad pathway. We measured the change of expression
among samples of RNAs extracted from wild type embryos and embryos with
loss-of-function and gain-of-function of Dpp. In parallel, we generated a map
with groups of Mad binding motifs to predict probable CMRs involved in the early
development of D. melanogaster. These results were integrated with data from
sequence conservation, following the phylogenetic footprinting and in situ
expression databases. I identified three novel genes (CG13653, CG12420 and
CG8147) whose expression varies under perturbations Dpp signals and are
expressed in the ED region. Finally, we examined the CRMs in vivo functionality
assays in transgenic lines of flies with reporter genes (lacZ).
Finally, our results permit a model to be proposed that assimilates and
integrates the knowledge of the mechanisms by which cells interpret the
gradient of Dpp/Mad for translation into stable patterns of cell fate.
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