Download Bioquímica y Biología Molecular

Manuales Departamentales
Programa Académico, objetivos del curso, contenido temático y
manual de prácticas de laboratorio
Bioquímica y
Biología Molecular
Primer año
Departamento de Bioquímica
Facultad de Medicina
Universidad Nacional Autónoma de México
Cd. Universitaria, D.F. agosto de.
1
FACULTAD DE MEDICINA
MANUALES DEPARTAMENTALES
Obra general ISBN: 968-36-2767-6
Este volumen ISBM: 970-32-1866-0
© 2004
Nueva edición revisada y estructurada.
© 2005 primera reimpresión.
© 2006 primera reimpresión.
Derechos reservados conforme a la ley.
Facultad de medicina, UNAM.
Folio CAPES: 008/2005
El contenido de este Manual esta protegido por la Ley de
Derecho de Autor y no puede ser reproducido, total o
parcialmente, por ningún medio mecánico, electrónico o
cualquier otro, sin el permiso escrito del Comité Asesor de
publicaciones de la Facultad de Medicina de la Universidad
Autónoma de México.
El cuidado editorial estuvo a cargo del Comité Asesor de
Publicaciones de la Facultad de Medicina, UNAM.
El contenido de este Manual es responsabilidad de sus
Autores ya que constituye un auxiliar en la enseñanza.
2
FACULTAD DE MEDICINA
Dr. Enrique Luis Graue Wiechers
Director
Dra. Rosalinda Guevara Guzmán
Secretario General
Dr. Pelayo Vilar Puig
Jefe de la División de Estudios de Posgrado
e Investigación
Dr. Juan José Mazón Ramírez
Secretaria de Enseñanza Clínica, Internado
y Servicio Social
Dra. Irene Durante Montiel
Dr. Melchor Sánchez Mendiola
Secretaria Técnica del H. Consejo Técnico
Secretario de Educación Médica
Dr. Ricardo Valdivieso Calderon
Secretario de Servicios Escolares
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Secteraría Jurídica y de Control Administrativo
Coordinador de Investigación
Coordinadora de Ciencias Básicas
Coordinador de Servicios a la Comunidad
Secretario Administrativo
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
Dr. Edgar Zenteno Galindo
Jefe del Departamento de Bioquímica
M. en C. Alicia Cea Bonilla
Coordinadora de Enseñanza de Bioquímica
y Biología Molecular
Dr. Raúl Chávez Sánchez
Coordinador de Enseñanza de Inmunología
Dr. Guillermo Mendoza Hernández
M. en C. Rebeca Milán Chávez
Coordinador de Investigación
Coordinadora del Laboratorio de Prácticas
3
Colaboradores
OBJETIVOS DEL CURSO
Guillermo Álvarez Llera
Patricia del Arenal Mena
Alicia Cea Bonilla
Leonor Fernández Rivera Río
Rebeca Milán Chávez
Sara Morales López
Celia Virginia Sánchez Meza
metabolismo del colesterol, estructura y metabolismo
de las lipoproteínas, regulación del metabolismo de
lípidos).
Haydée
Torres
postraduccionales).
Guerrero
(modificaciones
Aída Uribe Medina (características de la materia viva).
Alejandro Zentella Dehesa (virus, oncogenes
transformación).
y
SYLLABUS
Guillermo Álvarez Llera (agua, ciclo de Krebs, oxidación de
los aminoácidos, química y metabolismo de
carbohidratos, química y metabolismo de lípidos).
Patricia del Arenal Mena (ciclo celular).
INTRODUCCIÓN AL MANUAL DE PRÁCTICAS
DE LABORATORIO Y CASOS DE CORRELACIÓN
BIOQUÍMICA Y PRÁCTICA MÉDICA
Alicia Cea Bonilla (fundamentos del metabolismo,
proteínas, enzimas y coenzimas, estructura de
carbohidratos,
metabolismo
de
carbohidratos,
regulación de la glucemia, regulación del metabolismo
de lípidos, síntesis y degradación de fosfolípidos,
regulación
e integración metabólica,
biología
molecular).
Alicia Cea Bonilla (potenciometría y electroforesis).
Rebeca Milán Chávez (gota).
Celia Virginia Sánchez Meza.
Leonor Fernández Rivera Río (nucleótidos).
1. Soluciones. Celia Virginia Sánchez Meza y Rebeca
Milán Chávez.
Óscar Flores Herrera (figuras: ciclo energético, vías que
siguen los protones en las levaduras, ciclo de Krebs y
esquema de un potenciómetro).
Alberto Hamabata Nishimuta (aspectos básicos de
fisicoquímica, niveles de regulación de la expresión
genética).
Noemí Meraz Cruz (síntesis y degradación de fosfolípidos,
regulación del metabolismo de lípidos).
Rebeca Milán Chávez (equilibrio hidroelectrolítico).
Sara Morales López (agua, química y metabolismo de
carbohidratos, química y metabolismo de lípidos).
Celia Virginia Sánchez Meza (tabla periódica, enlaces,
fundamentos
del
metabolismo,
equilibrio
hidroelectrolítico,
proteínas,
radicales
libres,
descarboxilación del piruvato, regulación de la
glucemia, síntesis y degradación de fosfolípidos,
ELABORACIÓN O REVISIÓN DE LAS PRÁCTICAS
DE LABORATORIO
2. Regulación del equilibrio ácido-base después de
ejercicio muscular intenso y de la ingestión de
bicarbonato de sodio. Concepción González López,
Celia Virginia Sánchez Meza y Juan Luis Rendón
Gómez.
3. Titulación de un aminoácido con una base y aplicación
de la ecuación de Henderson-Hasselbalch. Leonor
Fernández Rivera Río y Celia Virginia Sánchez Meza.
4. Estudio general de las proteínas corporales. Celia
Virginia Sánchez Meza y Rebeca Milán Chávez.
5. Cinética enzimática. Efecto de la concentración del
sustrato en la velocidad de la reacción enzimática.
Celia Virginia Sánchez Meza, Rebeca Milán Chávez y
Jesús Antonio Oria Hernández.
4
6. Estudio del bombeo de protones por levaduras; efecto
de los inhibidores de la cadena de transporte de
electrones y de los desacoplantes. Juan Pablo Pardo
Vázquez y Federico Martínez Montes.
7. Efecto de la insulina sobre la glucemia de la rata.
Leonor Fernández Rivera Río.
8. Radicales libres (lipoperoxidación). José Gutiérrez y
Celia Virginia Sánchez Meza.
9. Estudio general del metabolismo de los carbohidratos.
Celia Virginia Sánchez Meza y Rebeca Milán Chávez.
10. Determinación de lípidos y lipoproteínas plasmáticas.
Celia Virginia Sánchez Meza.
11. Determinación de la transaminasa glutámico-pirúvica
sérica. Ma. Eugenia García Salazar y Celia
Virginia Sánchez Meza.
12. Estudio general del metabolismo de los compuestos
nitrogenados. Celia Virginia Sánchez Meza y Rebeca
Milán Chávez.13. Huella génica. Rebeca Milán Chávez
y Eugenia Flores Robles
14. Determinación de glucosa en sangre total. Rebeca
Milán Chávez y Eugenia Flores Robles
15. Integración Metabólica. Rebeca Milán Chávez y
Eugenia Flores Robles.
La revisión y la actualización de los Objetivos del curso se
realizó en colaboración con el proyecto: Mejoramiento de la
Enseñanza de la Bioquímica y Biología Molecular (EN206603) del Programa de Apoyo a Proyectos
Institucionales para el Mejoramiento de la Enseñanza
(PAPIME), siendo el responsable del proyecto el doctor
Federico Martínez Montes.
Corrección y cuidado de la edición: Edgar Zenteno
Galindo, Alicia Cea Bonilla, Rebeca Milán Chavez y
Eugenia
Flores
Robles.
5
CONTENIDO
PROGRAMA ACADÉMICO
I.
Misión de la Facultad de Medicina 8I
II.
Introducción
III.
Datos generales de la asignatura 12 -----
IV.
Objetivos de aprendizaje
12
V.
Metodología educativa
12
VI.
Estructura del curso
13
VII.
Lineamientos de evaluación
18
VIII.
Obligaciones de los profesores y
IX.
10
alumnos
25
Bibliografía
25
Unidad Temática 1: Estructura molecular
I. Lógica molecular de la vida
A. Características de la materia viva
27
B. Niveles de la organización celular
27
B.1 Bioelementos
27
B.2 Moléculas precursoras y
macromoléculas
27
B.3 Estructuras, orgánulos, células, tejidos y
Organismos
29
II. Aspectos fisicoquímicos del funcionamiento
celular
A. Aspectos básicos de fisicoquímica aplicados
a la bioquímica
31
B. Agua
33
C. Equilibrio hidroelectrolítico y ácido-base
35
D. Aminoácidos y proteínas
37
D.1. Aminoácidos
37
D.2. Proteínas
37
E. Enzimas y coenzimas
40
E.1. Características de un sistema enzimático40
E.2. Cinética enzimática
40
E.3. Aspectos médicos de la
enzimología
40
Unidad Temática II: Metabolismo
III. Metabolismo y bioenergética
A. Fundamentos del metabolismo celular
B. Carbohidratos
46
48
B.1. Estructura
48
B.2. Digestión y absorción
48
C. Metabolismo energético
50
C.1. Glucólisis
51
C.2. Papel de la mitocondria en las funciones
oxidativas
51
C.3. Descarboxilación del piruvato
52
C.4. Ciclo de los ácidos tricarboxílicos (ciclo
de Krebs)
52
C.5. Cadena de transporte de electrones
(cadena respiratoria)
54
C.6. Fosforilación oxidativa
55
C.7. Radicales libres
56
D. Otras vías metabólicas de los carbohidratos.
58
D.1. Gluconeogénesis
58
D.2. Glucogenólisis y glucogénesis
59
D.3. Vía del fosfogluconato (ciclo de las
pentosas)
60
D.4. Regulación de la glucemia
60
E. Lípidos
62
E.1. Estructura
62
E.2. Digestión, absorción y transporte
62
F. Metabolismo de lípidos
64
F.1. Oxidación de los ácidos grasos (ßoxidación)
65
F.2. Síntesis y utilización de los cuerpos
cetónicos
65
F.3. Síntesis de ácidos grasos
66
F.4. Síntesis y degradación de triacilgliceroles
66
F.5. Síntesis y degradación de fosfolípidos 67
F.6. Metabolismo del colesterol
68
F.7. Estructura y metabolismo de las
lipoproteínas
69
F.8. Regulación y alteraciones del
metabolismo de lípidos
70
G. Metabolismo de los compuestos
nitrogenados .
72
G.1. Aminoácidos y proteínas
72
G.2. Nucleótidos
74
H. Regulación e integración metabólica
76
Unidad Temática III: Biología Molecular
IV Biología Molecular
A. Organización del genoma
B. Flujo de la información genética
B.1. Flujo de la información genética
B.2. Síntesis del DNA (duplicación)
B.3. Transcripción
80
83
83
83
85
VI
B.4. Traducción
C. Mutaciones y reparación del DNA
D. Niveles de regulación de la expresión
genética
E. Virus, oncogenes y transformación
F. Técnicas de manipulación del DNA
86
89
90
93
95
MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO
I. Conceptos teóricos iniciales
El método científico
El Sistema Internacional de Unidades (SI)
Matemáticas para el laboratorio
Notación científica o exponencial
El método del factor unitario en los cálculos
Logaritmos
Gráficas
Algunos métodos utilizados en bioquímica
Centrifugación
Potenciometría
Electroforesis
Soluciones
Manejo de material biológico
Medidas de seguridad
79
81
85
85
86
86
88
89
89
91
93
96
101
103
II. Experimentos
Práctica 1. Soluciones
133
Práctica 2. Regulación del equilibrio ácido-base
después de ejercicio muscular intenso y de la
ingestión de bicarbonato de sodio
137
Práctica 3. Titulación de un aminoácido
con una base y aplicación de la ecuación
de Henderson y Hasselbalch. Determinación
del pK1 y del pK2
140
Práctica 4. Estudio de las proteínas corporales 142
Práctica 5. Cinética enzimática. Efecto de la
concentración del sustrato en la velocidad
de la reacción enzimática
148
Práctica 6. Efecto de la insulina sobre la Glucemia
de la rata.
152
Práctica 7. Estudio del bombeo de protones
por levaduras; efecto de los inhibidores
de la cadena de transporte de electrones
y de los desacoplantes
153
Práctica 8. El efecto del etanol sobre la lipoperoxidación
156
Práctica 9. Estudio general del metabolismo
de carbohidratos
157
Práctica 10. Determinación de lípidos y lipoproteínas plasmáticas
162
Práctica 11. El efecto del tetracloruro de carbono
sobre las transaminasas
170
Práctica 12. Estudio de los productos finales
del metabolismo nitrogenado
171
Práctica 13. Huella génica
178
Práctica 14. Determinaión de glucosa en sangre
total.
183
Práctica 15. Integración metabólica
186
III. Casos de correlación bioquímica y práctica
médica
Caso 1. Cólera
195
Caso 2. Oclusión intestinal. Acidosis metabólica.
Deshidratación grave
196
Caso 3. Hipoglucemia secundaria a intoxicación
Alcohólica
198
Caso 4. Cetosis por inanición. Obesidad
199
Caso 5. Hipercolesterolemia y aterosclerosis 200
Caso 6. Gota
202
VII
PROGRAMA ACADÉMICO
I. Misión de la Facultad de Medicina
“Formar a los líderes de las próximas
generaciones de médicos mexicanos y contribuir a
establecer un sistema de salud capaz de preservar
y desarrollar las capacidades físicas y mentales de
nuestra población y colaborar en la preparación de
investigadores en el campo de las ciencias
médicas.
•
Para ello, será necesario fortalecer el compromiso
social de sus estudiantes y su vocación
humanística para tener a la vida humana y a la
dignidad del hombre como valores supremos, por
lo que será necesario que los alumnos adquieran
los conocimientos científicos más avanzados para
responder cabalmente a las necesidades de salud
de la sociedad mexicana.
•
La educación y la formación médica en la Facultad
deberán ser factores de cambio e innovación en
las instituciones de salud y contribuir a incrementar
las aportaciones de la medicina mexicana al
conocimiento universal.
El apego a la prestación de servicios de la más
alta calidad, la curiosidad científica y el
compromiso irrestricto con los principios
fundamentales de la ética médica deberán ser la
característica de sus egresados. Para ello será
necesario organizarse en un ambiente de libertad
intelectual, en el que se conjuguen el talento de
profesores y alumnos, fomentando la creatividad y
la productividad individual y colectiva”.
En suma, la Facultad de Medicina deberá
caracterizarse por su calidad académica, su
vitalidad, su compromiso decidido con la
investigación original y los principios humanísticos
de la profesión para poder consolidar el liderazgo
que legítimamente le corresponde.
•
•
Calidad
académica.
Que
significa
favorecer la formación más allá de la
simple información en sus estudiantes,
fortaleciendo su preparación en las
ciencias básicas de la medicina que les
permita seguir el ritmo de los avances en
el conocimiento y sus aplicaciones en la
clínica.
Vitalidad. Para poder enfrentar el futuro
en el contexto del cambio científico y
tecnológico y de las modificaciones que
experimenten
las
condiciones
socioeconómicas de nuestra población.
Para ello, será necesario rescatar la
enseñanza tutorial orientada a la solución
de problemas de manera original e
innovadora y capaz de inducir en el
estudiante una conciencia clara de sus
necesidades de actualización permanente
y educación continua.
Investigación original. Por cuanto que es
un elemento indispensable para alcanzar
un sistema de salud de alta calidad y
eficiencia, y porque es la única vía para
atender
cabalmente
los
complejos
fenómenos que inciden en el proceso de la
salud y la enfermedad en medicina,
educación
e
investigación
son
inseparables.
Humanismo. Porque el fin último del
médico es el hombre mismo. Para ello
habrá de desarrollar una sensibilidad
singular ante el dolor y la angustia de los
enfermos, ante su ignorancia y sus
problemas, para que pueda ayudar a
superarlos. Para poder servir a la sociedad
y los individuos con plena conciencia de
sus valores y potencialidades habrá que
inducir en nuestros estudiantes una actitud
humanitaria.
8
•
Liderazgo. Entendiendo éste como la
capacidad para mantener una actitud de
vanguardia y compartir conocimientos y
experiencia; para orientar la educación
médica nacional y fortalecer tanto la
investigación en salud como nuestro
sistema de educación superior; para
transformar la medicina mexicana y
responder cada vez mejor a una sociedad
que se esfuerza en superarse y demanda,
con razón, una mayor calidad a todo el
sistema de salud.
Congruente con la Misión de la Facultad de
Medicina, la función del médico se caracteriza de
la siguiente manera:
El médico es un profesional comprometido a
preservar, mejorar y restablecer la salud del
ser humano; sus acciones se fundamentan en
el conocimiento científico de los fenómenos
biológicos, psicológicos y sociales. Su
ejercicio
profesional
se
orienta
primordialmente a la práctica clínica, la cual
debe ejercer con conocimiento, diligencia,
humanismo, prudencia y juicio critico,
guiándose por un código ético que considera a
la vida humana como valor supremo.
EL PERFIL PROFESIONAL DEL EGRESADO DE
LA CARRERA DE MÉDICO CIRUJANO
El egresado de la Facultad de Medicina de la
Universidad Nacional Autónoma de México que
cumple satisfactoriamente los objetivos y adquiere
los conocimientos, habilidades, destrezas y
actitudes que integran el Plan Único de Estudios:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
aspectos
afectivos,
emocionales
y
conductuales de los pacientes bajo su
cuidado.
Conoce con detalle los problemas de
salud de mayor importancia en nuestro
país y es capaz de ofrecer tratamiento
adecuado a los pacientes que los
presentan.
Promueve el trabajo en equipo con otros
médicos y profesionales de la salud y
asume la responsabilidad y el liderazgo
que le corresponden, según su nivel de
competencia y papel profesional.
Dispone de conocimientos sólidos acerca
de las ciencias de la salud, lo que le
permite utilizar el método científico como
herramienta de su práctica clínica habitual
y lo capacita para optar por estudios de
posgrado, tanto en investigación como en
alguna especialidad médica.
Tiene una actitud permanente de
búsqueda de nuevos conocimientos, por lo
que cultiva el aprendizaje independiente y
autodirigido, lo que le permite actualizarse
en los avances de la medicina y mejorar la
calidad de la atención que otorga.
Se mantiene actualizado en relación a los
avances científicos y tecnológicos más
recientes; utiliza la información y la
tecnología
computacional
para
la
adquisición de nuevos conocimientos y
como una herramienta de trabajo dentro
de su práctica profesional.
Es un profesional capacitado para ofrecer
servicios de medicina general de alta
calidad y, en su caso, para referir con
prontitud y acierto aquellos pacientes que
requieren
cuidados
médicos
especializados.
En la atención de los pacientes, además
de efectuar las acciones curativas, aplica
las medidas necesarias para el fomento a
la salud y la prevención de las
enfermedades, apoyándose en el análisis
de
los
determinantes
sociales
y
ambientales, especialmente el estilo de
vida.
Se conduce según los principios éticos y
humanistas que exigen el cuidado de la
integridad física y mental de los pacientes.
Como parte integral de su práctica
profesional examina y atiende los
9
II. INTRODUCCIÓN:
1. Mapa curricular:
ANATOMÍA
PRIMER AÑO
BIOLOGÍA CELULAR Y TISULAR
BIOLOGÍA DEL DESARROLLO
BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
PSICOLOGÍA MEDICA I
SALUD PÚBLICA I
ASIGNATURAS DE LIBRE
ELECCIÓN***
ASIGNATURAS DE LIBRE ELECCIÓN***
CIRUGÍA I
SEGUNDO AÑO
FARMACOLOGÍA
FISIOLOGÍA
INMUNOLOGÍA
MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
SALUD PÚBLICA II
ASIGNATURAS DE LIBRE ELECCIÓN***
ASIGNATURAS DE LIBRE
ELECCIÓN***
TERCER AÑO
PROPEDÉUTICA Y
FISIOPATOLOGÍA*
PATOLOGÍA
MEDICINA GENERAL I*
PSICOLOGÍA MÉDICA II**
SALUD PÚBLICA III***
GENÉTICA CLÍNICA*
CUART
O AÑO
SEMINARIO CLÍNICO*
ASIGNATURAS DE LIBRE ELECCIÓN***
ASIGNATURAS DE LIBRE
ELECCIÓN***
SALUD PÚBLICA IV**
HISTORIA Y FILOSOFÍA DE LA
MEDICINA
10
MEDICINA GENERAL II*
CIRUGÍA II*
ASIGNATURAS DE LIBRE ELECCIÓN***
ASIGNATURAS DE LIBRE
ELECCIÓN***
SEXTO AÑO
S E R V I C I O
URGENCIAS COMUNIDAD GINECOLOGÍA Y
OBSTETRICIA CIRUGÍA MEDICINA
INTERNA PEDIATRÍA QUINTO AÑO
INTERNADO MÉDICO*
S O C I A L
* Estas asignaturas son la base del entrenamiento en el área clínica, en éllas el alumno
adquirirá los conocimientos acerca de la patología de los diversos aparatos y sistemas,
así como las habilidades y destrezas necesarias para el manejo de los problemas de
salud más frecuentes.
** Estas asignaturas corresponden al área sociomédica.
*** Su propósito es permitir que el alumno profundice o complemente de acuerdo a sus
preferencias algunos contenidos del plan de estudios; tenga la posibilidad de capacitarse
en ciertas áreas no consideradas en dicho plan, así como también dar flexibilidad al
currículo.
Áreas de rotación bimestral.
11
2. Importancia de la asignatura en la carrera.
La segunda mitad del siglo XX fue el marco
temporal de una expansión acelerada de nuestro
entendimiento del mundo y del Universo en
general y, como consecuencia, la orientación de
una mayor cantidad de recursos humanos y
materiales hacia la investigación en todas las
áreas de la ciencia. El campo de la medicina ha
tenido grandes avances, particularmente en las
áreas del conocimiento de la Bioquímica y de la
Biología Molecular. La información generada por
estas disciplinas ha sido fundamental para
comprender mejor el fenómeno de la vida y para
abordar el estudio de las enfermedades.
Los conocimientos aportados por la Bioquímica y
la Biología Molecular no sólo permiten entender
mejor la manera en la que están estructuradas las
células y los tejidos, el funcionamiento del
organismo y cuáles son las fundamentos de la
patogénesis existente, sino que proporcionan las
bases para el uso racional de las estrategias
terapéuticas, principalmente en el campo del
descubrimiento de fármacos efectivos con un
mínimo de efectos indeseables.
Si bien es cierto que los avances son
extraordinarios, aún quedan muchas interrogantes
por contestar. Día con día se avanza en la
búsqueda de tales respuestas. En consecuencia,
la Bioquímica y la Biología Molecular forman parte
de esa gran plataforma de los programas actuales
de formación académica de los médicos cirujanos.
El Departamento de Bioquímica ofrece a los
estudiantes de la carrera de médico cirujano el
programa de contenidos de este curso, el cual está
dirigido e integrado con un enfoque médico,
adaptado a las necesidades de una modernidad
inquisitiva, demandante de conocimientos cada
vez más aproximados a un contexto que permita
esa aspiración superior de contar con una
medicina de alta calidad.
Por otro lado, ahora que inicias tus estudios
profesionales es importante que sepas que el
aprendizaje
es
una
experiencia activa de descubrimiento, por lo que
no sólo deberás esperar que tus maestros te
guíen a lo largo de tus estudios.
Entre las habilidades que deberás adquirir durante
tu formación profesional están la búsqueda de
información y la autoenseñanza.
Molecular se encuentran descritos en este Manual
de objetivos del curso y prácticas de laboratorio,
por lo que te sugerimos que los revises
cuidadosamente; en caso de que algún concepto
no se estudie en la clase, es tu responsabilidad
buscar
la información correspondiente y
aprenderla. Te deseamos que el aprendizaje de
esta disciplina te resulte grato y que lo lleves a
feliz término.
III DATOS GENERALES DE LA ASIGNATURA
1. Coordinación:
Bioquímica
2. Tipo de Asignatura:
3. Ubicación
4. Duración
5. N° de horas
Departamento
de
Teórica y práctica
Primer año
Anual
Teoría: 160 h
Práctica: 120 h
6. N° de créditos
22
7. Clave
1115
8. Requisitos académicos
Cubrir
los
requisitos de ingreso a la licenciatura
IV OBJETIVOS DE APRENDIZAJE
1. Que el estudiante entienda los fenómenos
biológicos desde el punto de vista molecular y
que sea capaz de integrar este conocimiento
en la estructura fisiológica de la célula, del
tejido y del organismo.
2. Que el estudiante conozca los mecanismos
moleculares del funcionamiento del organismo
humano de una manera dinámica e integral y,
al mismo tiempo, comprenda cómo esos
mecanismos se encuentran alterados en la
enfermedad.
3. Que el estudiante demuestre, mediante
actividades ex profeso, que ha podido integrar
el conocimiento a nivel molecular como una
herramienta fundamental para la comprensión
de los procesos fisiológicos y de la
fisiopatología y con ello entienda los principios
en los que se apoya la tecnología empleada
en el diagnóstico de enfermedades.
4. Que el estudiante aplique el método científico
como una herramienta en la identificación, el
análisis y la solución de problemas médicos.
Los conocimientos mínimos necesarios para
aprobar el curso de Bioquímica y Biología
12
V. METODOLOGÍA EDUCATIVA
Con base en lo descrito en el Plan Único de
Estudios respecto a este tema en los puntos A. 1,
2, 4, 6, 7, 8 y 9 y B. 1 y 2, el profesor utilizará, en
la medida de lo posible, algunos procedimientos y
técnicas que impliquen una metodología centrada
en la solución de problemas, la vinculación teóricopráctica de los conocimientos (el desarrollo y
discusión de prácticas de laboratorio de interés
médico), la aplicación de técnicas de enseñanza
que favorezcan la participación activa de los
estudiantes (como seminarios, discusión de casos,
las semanas de integración básica-clínica), así
como la búsqueda y análisis crítico de la
información, sea de libros como de fuentes
automatizadas, para lograr los objetivos de
aprendizaje.
VI. ESTRUCTURA DEL CURSO
1. ACTIVIDADES PROPUESTAS:
Inicio del curso 25 de agosto de 2008 y termino el
20 de mayo de 2009.
El curso se divide en TRES UNIDADES
TEMÁTICAS:
a) Estructura molecular (correspondiente al 25%
de la calificación).
b) Metabolismo (correspondiente al 50% de la
calificación).
c) Biología molecular (correspondiente al 25% de
la calificación).
El contenido educativo del curso consiste en:
a) Teoría.
b) Trabajo de laboratorio y programas de
aprendizaje de la bioquímica asistida por
computadora.
c) Revisión de casos de correlación bioquímicapráctica médica.
d) Solución de problemas.
e) Semanas de Integración básica-clínica
2.
UNIDADES TEMÁTICAS Y CONTENIDO
TEMÁTICO:
UNIDAD TEMÁTICA I: Estructura molecular
I. Lógica molecular de la vida
A. Características de la materia viva
B. Niveles de la organización celular
B.1 Bioelementos
B.2 Moléculas
precursoras
y
macromoléculas
B.3 Estructuras, orgánulos, células, tejidos y
organismos
II. Aspectos
fisicoquímicos
del
funcionamiento celular
A. Aspectos básicos de fisicoquímica aplicados
a la bioquímica
B. Agua
C. Equilibrio hidroelectrolítico y ácido-base
D. Aminoácidos y proteínas
D.1. Aminoácidos
D.2. Proteínas
E. Enzimas y coenzimas
E.1. Características
de
un
sistema
enzimático
E.2. Cinética enzimática
E.3. Aspectos médicos de la enzimología
UNIDAD TEMÁTICA II: Metabolismo
III. Metabolismo y bioenergética
A. Fundamentos del metabolismo celular
B. Carbohidratos
B.1. Estructura
B.2. Digestión y absorción
C. Metabolismo energético
C.1. Glucólisis
C.2. Papel de la mitocondria en las funciones
oxidativas
C.3. Descarboxilación del piruvato
C.4. Ciclo de los ácidos tricarboxílicos (ciclo
de Krebs)
C.5. Cadena de transporte de electrones
(cadena respiratoria)
C.6. Fosforilación oxidativa
C.7. Radicales libres
D. Otras vías metabólicas de los carbohidratos
D.1. Gluconeogénesis
D.2. Glucogenólisis y glucogénesis
D.3. Vía del fosfogluconato (ciclo de las
pentosas)
D.4. Regulación de la glucemia
E. Lípidos
E.1. Estructura
E.2. Digestión, absorción y transporte
F. Metabolismo de lípidos
F.1. Oxidación de los ácidos grasos (ßoxidación)
F.2. Síntesis y utilización de los cuerpos
cetónicos
F.3. Síntesis de ácidos grasos
F.4.Síntesis y degradación de triacilgliceroles
F.5. Síntesis y degradación de fosfolípidos
F.6. Metabolismo del colesterol
F.7. Estructura y metabolismo de las
lipoproteínas
F.8. Regulación
y
alteraciones
del
metabolismo de lípidos
13
G. Metabolismo
de
los
compuestos
nitrogenados
G.1. Aminoácidos y proteínas
G.2. Nucleótidos
H. Regulación e integración metabólica
UNIDAD
Molecular
TEMÁTICA
III:
Biología
B. Flujo de la información genética
B.1. Flujo de la información genética
B.2. Síntesis del DNA (duplicación)
B.3. Transcripción
B.4. Traducción
C. Mutaciones y reparación del DNA
D. Niveles de regulación de la expresión
genética
E. Virus, oncogenes y transformación
F. Técnicas de manipulación del DNA
IV Biología Molecular
A. Organización del genoma
14
3. CALENDARIO DE ACTIVIDADES:
CALENDARIO SUGERIDO PARA CUBRIR LAS ACTIVIDADES DE LA PRIMERA UNIDAD TEMÁTICA
(BLOQUE 1)
Semana
Fecha
1
25 al 29 de agosto
2
1° al 6 de septiembre
B. Agua
Práctica: Soluciones
3
8 al 13 de septiembre
B. Agua
Amortiguadores
C. Equilibrio hidroelectrolítico y ácido-base
Práctica: Soluciones
Revisión del caso clínico: CÓLERA
4
15 al 20 de septiembre**
C. Equilibrio hidroelectrolítico y ácido-base
Revisión del caso clínico: OCLUSIÓN INTESTINAL
5
22 al 27 de septiembre
D. Aminoácidos
Práctica: Titulación de un aminoácido
6
29 de septiembre al 4 de
octubre
D. Aminoácidos y Proteínas
Práctica: Titulación de un aminoácido
Práctica: Determinación de proteínas plasmáticas
7
6 al 11 de octubre
E. Enzimas y coenzimas
Práctica: Determinación de proteínas plasmáticas
Práctica Cinética Enzimática
8
13 al 18 de octubre/
E. Enzimas y coenzimas
Práctica: Determinación de proteínas plasmáticas
Práctica: Cinética enzimática
9
24 octubre
PRIMER EXAMEN DEPARTAMENTAL: 9:00-11:00 HRS.
Tema
Lógica molecular de la vida: Características de la materia viva y
jerarquía de la organización celular.
A. Aspectos básicos de Fisicoquímica aplicados a la
Bioquímica.
* día de asueto
/ Exámenes departamentales
15
CALENDARIO SUGERIDO PARA CUBRIR LAS ACTIVIDADES DE LA SEGUNDA UNIDAD TEMÁTICA
(BLOQUE 2)
Semana
Fecha
Tema
1
25 de octubre
A. Fundamentos del metabolismo
2
27 de octubre al 1° de noviembre/*
A. Fundamentos del metabolismo
B. Estructura y Digestión de carbohidratos
C. Glucólisis
3
3 al 8 de noviembre/
4
10 al 15 de noviembre
5
17 al 22 de noviembre*/
6
24 al 29 de noviembre /
7
1 al 4 de diciembre/
7
5 de diciembre
C.Glucólisis.
C. Descarboxilación del piruvato
Ciclo de los ácidos tricarboxílicos
Práctica: Efecto de la insulina sobre la Glucemia
de la rata
C.Ciclo de los ácidos tricarboxílicos
C Cadena de transporte de electrones
Práctica: Efecto de la insulina sobre la Glucemia
de la rata.
Práctica: Bombeo de Protones
C Cadena de transporte de electrones
C. Fosforilación oxidativa
Práctica: Bombeo de Protones
C. Fosforilación oxidativa
C.Radicales libres
1ª. Semana de Integración Básica-Clínica
Revisión del caso clínico: HIPOGLUCEMIA E
INTOXICACIÓN ALCOHÓLICA
SEGUNDO EXAMEN DEPARTAMENTAL: 9:0011:00 HRS.
* Día de asueto
/ Exámenes departamentales
16
CALENDARIO SUGERIDO PARA CUBRIR LAS ACTIVIDADES DE LA SEGUNDA UNIDAD TEMÁTICA
(BLOQUE 3)
Semana
Fecha
8 al 11 de diciembre//
1
2
15 de diciembre 2008
al 3 de enero de 2009
3
5 al 10 de enero
3
12 al 17de enero
4
19 al 24 de enero/
5
26 al 31 de enero/
6
2 al 7 de febrero*
7
9 al 14 de febrero
8
16 al 21 de febrero
9
23 al 28 de febrero//
10
2 al 7 de marzo/
11
9 al 14 de marzo//
12
16 al 21 de marzo*
13
23 al 25 de marzo
26 de marzo
•
•
Tema
D. Vía del fosfogluconato
D. Gluconeogénesis
Vacaciones de Navidad
D. Glucogénesis y glucogenólisis
D. Regulación de la glucemia
Práctica : Estudio General del metabolismo de
carbohidratos
B. Estructura y Digestión de lípidos
C.Prácticas comunitarias en los grupos asignados
F. Oxidación de los ácidos grasos
F. Síntesis y utilización de cuerpos cetónicos
F. Síntesis de ácidos grasos
F. Síntesis y degradación de triacilgliceroles
Práctica: El efecto del etanol sobre la
Lipoperoxidación
Práctica: El efecto del etanol sobre la
Lipoperoxidación
Revisión del caso clínico CETOSIS POR INANICIÓN Y OBESIDAD
F. Metabolismo del colesterol
Metabolismo de Lipoproteínas
Práctica: Determinación de lípidos y lipoproteínas
F. Regulación y alteraciones del metabolismo de lípidos
Revisión del caso clínico: HIPERCOLESTEROLEMIA Y
ATEROSCLEROSIS
Práctica: Determinación de lípidos y lipoproteínas
G. Metabolismo de los compuestos nitrogenados
1. Aminoácidos y proteínas
G. Metabolismo de los compuestos nitrogenados
1. Aminoácidos y proteínas
2. Ciclo de la urea
2ª. Semana de integración básica-clínica
Práctica: El efecto del tetracloruro de carbono sobre las
Transaminasas
G. Nucleótidos
1. Purinas
Práctica: El efecto del tetracloruro de carbono sobre las
Transaminasas
G. Nucleótidos
2. Pirimidinas
Revisión del caso clínico: GOTA
Práctica: Determinación de productos finales del metabolismo
H. Regulación e integración metabólica
Práctica: Determinación de productos finales del
Metabolismo nitrogenado
H. Regulación e integración metabólica
TERCER EXAMEN DEPARTAMENTAL: 9:00-11:00 HRS.
Día de asueto
/ Exámenes departamentales
17
CALENDARIO SUGERIDO PARA CUBRIR LAS ACTIVIDADES DE LA TERCERA UNIDAD TEMÁTICA
(BLOQUE 4)
Semana
Fecha
Tema
1
27 al 28 de marzo
A. Flujo de la información genética
B. Estructura de los ácidos nucleicos y sus funciones
2
30 de marzo al 4 de abril
C. y G Organización del DNA
G. Organización del genoma
6 al 11 de abril
Semana Santa
4
13 al 17 de abril
D. Mecanismos de síntesis del DNA
E. Mecanismos de transcripción
Prácticas comunitarias en los grupos asignados
5
20 al 24 de abril
Modificación postranscripcional
F. Mecanismos de traducción
6
27 de abril al 2 de mayo*
F. Modificación postraduccional
H. Mutaciones y reparación del DNA
7
4 al 9 de mayo*
8
11 al 16 de mayo*///
9
18 al 22 de mayo*//
20 de mayo
3
I. Niveles de regulación de la expresión genética
Práctica: Huella Génica
J. Virus, oncogenes y transformación
K. Técnicas de manipulación del DNA
Práctica: Huella Génica
K. Técnicas de manipulación del DNA
CUARTO EXAMEN DEPARTAMENTAL: 9:00-11:00 hrs.
* Día de asueto
/ Exámenes departamentales
Los contenidos específicos correspondientes a este programa, tanto teóricos, como las prácticas de
laboratorio y los casos clínicos a que hace referencia esta calendarización de actividades se encuentran en el
manual de objetivos y prácticas de laboratorio de la Asignatura de Bioquímica y Biología Molecular.
18
VII. LINEAMIENTOS DE EVALUACIÓN
A. Lineamientos Generales para la Evaluación de
los Alumnos en las Asignaturas de la Carrera de
Médico Cirujano
Los presentes lineamientos tienen su
fundamento en el Reglamento General de
Exámenes de la UNAM y en el Plan Único de
Estudios de la carrera, considerando además
las características específicas de las diferentes
asignaturas.
1.
Cada departamento o secretaría responsable
de una asignatura establecerá en el
programa académico correspondiente las
unidades temáticas en que se dividirá y el
número de evaluaciones parciales con que
se calificará a los alumnos.
2.
Los
programas
académicos
de
las
asignaturas incluirán, entre otras, la
definición de:
a) La composición y ponderación de la
forma en que se evaluará a los alumnos
en la calificación del profesor.
presentación de trabajos, participación en
clase, ejercicios de integración y de
laboratorio, prácticas obligatorias, talleres y
actitud asumida por el alumno en el curso.
5.
La evaluación departamental corresponderá
a la calificación obtenida por el alumno en los
exámenes teóricos y prácticos parciales. Los
exámenes serán elaborados colegiadamente
y aplicados por los profesores del curso, bajo
la coordinación de los departamentos o
secretaría correspondientes.
6.
Los exámenes se integrarán a partir de
bancos de reactivos elaborados por cada
departamento
o
secretaría,
con
la
participación de los profesores. Tendrán las
características que permitan evaluar de
forma homogénea, el grado de aprendizaje y
dominio de los conocimientos, habilidades y
competencias definidos en el programa de la
asignatura. Para ello, los bancos contarán
con la definición del grado de dificultad de los
reactivos, su capacidad discriminatoria y los
contenidos evaluados.
7.
El Consejo Técnico definirá el calendario de
exámenes departamentales con base en la
propuesta que formule la Secretaría de
Servicios Escolares, previa consulta con los
departamentos y representantes de alumnos.
8.
Con los resultados de las evaluaciones del
profesor y del examen departamental se
definirá si el estudiante exenta o no la
totalidad del examen ordinario, o si deberá
presentar alguna, algunas o todas las
unidades temáticas del curso, bajo los
siguientes criterios:
b) Si se entrega o no a los alumnos el
examen y su clave de respuestas.
c) El número de reactivos y el tiempo para
resolver los diferentes exámenes.
3.
En todas las asignaturas se contará con dos
calificaciones: la del profesor y la
departamental.
a) Para cada asignatura se definirá la
ponderación de cada una de ellas, la que
podrá variar entre el 40 y 60% y cuya
suma deberá representar el 100%.
b) Para cada unidad temática se contará
con una calificación que permitirá
determinar si el alumno está o no exento
de presentar el examen ordinario en su
totalidad, o si deberá presentar alguna o
algunas de las unidades temáticas del
curso.
4.
La evaluación del profesor incluirá una
calificación por cada unidad temática del
curso. El profesor informará al departamento
o secretaría correspondiente y a sus
alumnos, la forma en que los evaluará, la que
podrá ser compuesta, entre otras, por los
resultados de los exámenes que aplique, la
a) El alumno quedará exento de presentar
la totalidad del examen ordinario, si el
promedio
de
las
calificaciones
aprobatorias obtenidas en las unidades
temáticas es de 8.5 o mayor, y tiene un
mínimo de 80% de asistencias.
b) El alumno podrá exentar la presentación,
en el examen ordinario, de una o varias
unidades temáticas en las que haya
obtenido un promedio mínimo de 8.5.
c) En relación con el inciso que antecede, la
calificación obtenida por el alumno en la
unidad temática exenta, sin redondeo, se
hará equivalente al número de aciertos
que corresponda en el examen ordinario
y esta cifra se sumará a los aciertos
19
obtenidos en las unidades temáticas
presentadas en dicho examen, siempre y
cuando éstas últimas sean aprobatorias.
dos veces en la asignatura no puedan
inscribirse nuevamente a ella, o d) hayan
llegado al límite de tiempo en que pueden
estar inscritos en la carrera.
d) La calificación así obtenida, será la que
se asiente en el acta correspondiente.
9.
El examen extraordinario abarcará la
totalidad del programa y podrá incluir la
evaluación de aspectos teóricos y prácticos
según corresponda. En caso de ser así, para
acreditar la asignatura se requiere obtener
una calificación aprobatoria en cada uno de
estos aspectos.
Los exámenes ordinarios serán elaborados
colegiadamente y aplicados por los
profesores de la asignatura, bajo la
coordinación de los departamentos o
secretaría correspondientes, a los alumnos
que no hubieran alcanzado la exención total
del examen.
Podrán presentar examen ordinario, los
alumnos que habiendo cursado la materia no
hayan quedado exentos de conformidad con
lo arriba señalado. Se considerará cursada
la materia cuando se cuente con al menos el
80% de asistencia al curso, se hayan
presentado los exámenes parciales y
realizado los ejercicios, trabajos y prácticas
obligatorias que el programa académico de la
asignatura determine.
La calificación obtenida en el examen no será
promediada
con
ninguna
calificación
precedente.
11.
a) En calificaciones finales aprobatorias con
fracción de 0.5 a 0.9, éstas se
redondearán al número entero inmediato
superior, las fracciones de 0.1 a 0.4 se
redondearán al entero inmediato inferior;
entendiendo
por
calificación
final
aprobatoria, a la alcanzada en el caso de
la exención total o a la obtenida en los
exámenes ordinarios o extraordinario.
Los exámenes ordinarios podrán incluir la
evaluación de aspectos teóricos y prácticos
según corresponda. En caso de ser así, para
acreditar la asignatura se requiere obtener
una calificación aprobatoria en ambos
aspectos.
b) La calificación mínima aprobatoria será 6
(seis). Las calificaciones menores a este
entero serán expresadas en los
documentos correspondientes como 5
(cinco), que significa No Acreditada.
De acuerdo a la legislación universitaria
habrá dos periodos de exámenes ordinarios,
los cuales deberán tener condiciones
semejantes, pudiendo presentarse el alumno
en cualquiera de ellos, o en ambos. Si el
alumno acredita la materia en alguno, la
calificación obtenida será definitiva.
10.
Los
exámenes
extraordinarios
serán
elaborados colegiadamente y aplicados de
forma similar a los ordinarios. En el caso de
un alumno que hubiera alcanzado la
exención parcial de una o varias unidades
temáticas, no se seguirá el procedimiento
señalado con anterioridad, es decir, el
alumno que presente examen extraordinario
será evaluado en la totalidad de la
asignatura.
Podrán presentar examen extraordinario los
alumnos que: a) habiendo estado inscritos en
la asignatura no la hayan acreditado, b)
siendo alumnos de la Facultad no hayan
estado inscritos en la asignatura o no la
hayan cursado, c) habiendo estado inscritos
La calificación obtenida con decimales se
expresará con base en lo siguiente:
c) Las
calificaciones
parciales
se
expresarán con un decimal, y en relación
con el inciso arriba señalado, las
calificaciones no aprobatorias no se
expresarán como 5 (cinco), sino con la
calificación que corresponda.
12.
En todos los tipos de exámenes parciales, el
profesor realizará la realimentación con sus
alumnos,
dándoles
a
conocer
las
calificaciones en un plazo no mayor de 10
días una vez realizada la evaluación
correspondiente.
Las rectificaciones que
sean necesarias en caso de error, se
realizarán en los siguientes 15 días a partir
de la fecha en que se informen los
resultados.
En caso de revisión de examen, se estará a
lo dispuesto por el artículo 8° del Reglamento
General de Exámenes que señala que a
petición de los interesados, los directores de
20
las facultades y escuelas de la Universidad
acordarán la revisión de las pruebas dentro
de los 60 días siguientes a la fecha en que se
den a conocer las calificaciones finales para
que, en su caso, se modifiquen las
calificaciones, siempre que se trate de
pruebas escritas, gráficas o susceptible de
revisión.
Para tal efecto, el director
designará
una
comisión
formada
preferentemente por dos profesores de la
asignatura de que se trate, la que resolverá
en un plazo no mayor de 15 días.
13.
El proceso de calificación se ajustará a lo
siguiente:
a) La Secretaría de Servicios Escolares
realizará la lectura óptica y análisis
estadístico de los resultados de los
exámenes, los cuales entregará al
departamento
o
secretaría
correspondiente dentro de los cinco días
posteriores a la presentación de los
exámenes.
b) La calificación que se asentará en las
actas como resultado de la exención, de
los exámenes ordinarios o del examen
extraordinario, según sea el caso, será
de acuerdo a la escala 10, 9, 8, 7, 6
(Acreditado), 5 (No Acreditado) o NP (No
Presentado).
c) En un plazo no mayor de cinco días
después
de
presentado
el
correspondiente examen ordinario, los
profesores deberán remitir las actas
revisadas y firmadas a la Secretaría de
Servicios Escolares.
14.
15.
16.
Los titulares de los departamentos o
secretaría correspondientes, revisarán y
analizarán con los profesores los resultados
de los exámenes, con el propósito de
reorientar los programas y los procedimientos
de
enseñanza-aprendizaje
de
las
asignaturas.
La participación de los profesores en la
elaboración de reactivos que conformarán el
banco de la asignatura, será considerada
para su evaluación académica y la de los
diferentes programas de estímulos al
desempeño.
Anualmente, la Dirección de la Facultad
deberá presentar al Consejo Técnico un
informe de los resultados alcanzados en la
evaluación del aprendizaje en todas las
asignaturas, en el examen profesional y en
los resultados obtenidos por los alumnos en
el Examen Nacional de Aspirantes a
Residencias Médicas (ENARM).
17.
Los asuntos no previstos serán resueltos por
el Director siguiendo principios de equidad y
justicia. De sus decisiones y de la necesidad
de ajustar los presentes Lineamientos,
deberá informar al Consejo Técnico para que
se determine lo conducente.
B. Lineamientos específicos de la asignatura
de Bioquímica y Biología Molecular
El programa de la asignatura consta de dos partes
impartidas simultáneamente: Teoría y Práctica.
Cada una de ellas representa un porcentaje tanto
de las calificaciones parciales como de la
calificación final del alumno, integrándose de la
siguiente manera:
Calificación Teórica
Calificación Práctica
85%
15%
Así, la evaluación del aprovechamiento escolar
tanto de la parte teórica como de la práctica, se
efectuará mediante evaluaciones parciales y, en
su caso, mediante examen ordinario o
extraordinario.
1. Evaluaciones Parciales
Para evaluar el aprovechamiento escolar de los
alumnos, se programarán cuatro evaluaciones
parciales, una para la primera Unidad Temática
(25% de la calificación final), dos para la segunda
Unidad Temática (50% de la calificación final) y
una para la tercera (25% de la calificación final).
Cada una de las evaluaciones parciales será
expresada en una calificación, la cual se integrará
por la calificación teórica y la calificación práctica
de la siguiente manera:
Calificación Teórica:
calificación parcial
a) Examen Departamental
b) Calificación del Profesor
Calificación Práctica:
calificación parcial
85% de la
50%
50%
15% de la
21
a) Examen Departamental de Laboratorio
50%
b) Calificación del Profesor
50%
1. 1 Exámenes Departamentales:
Los exámenes departamentales contendrán 70
reactivos de opción múltiple, de los cuales 60
estarán relacionados con la Unidad Temática
teórica correspondiente y los restantes serán
preguntas relacionadas con aspectos de las
prácticas de laboratorio realizadas en el periodo a
evaluar. En las unidades temáticas en las que se
revisen los casos de integración Básica clínica, se
incluirán 5 preguntas correspondientes al caso
revisado, en cada uno de los exámenes
departamentales correspondientes. El tiempo
correspondiente para resolver dichos exámenes
será de dos horas. Una vez realizada la
retroalimentación de los exámenes con el profesor,
éste los devolverá a la coordinación de
enseñanza.
Los temas a explorar en cada examen
departamental serán de la siguiente manera:
Primer Examen Departamental (Unidad Temática
I):
a)
Aspectos Teóricos: Capítulos I y II; Casos
de correlación básico clínicos 1 y 2
b)
Aspectos Prácticos: Prácticas de la 1-5:
Segundo Examen Departamental (Unidad
Temática II):
a)
Aspectos Teóricos: Capitulo III A-D; Caso de
correlación básico clínico 3; 1ª. Semana de
Integración Básica-clínica
b)
Aspectos Prácticos: Prácticas de la 6-9
Tercer Examen Departamental (Unidad Temática
II):
a)
Aspectos Teóricos: Capitulo III E-H; Casos
de correlación básico clínicos 4-6; 2ª. Semana de
Integración Básica-clínica
b)
Aspectos Prácticos: Prácticas de la 9-12
Cuarto Examen Departamental (Unidad Temática
III)
a)
Aspectos Teóricos: Capítulo IV; 3ª. Semana
de Integración Básica-clínica
b)
Aspectos Prácticos: Práctica 13
1.2 Calificación del Profesor:
El profesor estimará la competencia de los
estudiantes a través de la apreciación de los
conocimientos y aptitudes adquiridos durante el
curso, mediante su participación en clases y su
desempeño en los ejercicios, prácticas, trabajos
obligatorios y evaluaciones aplicadas en el periodo
correspondiente.
En todos los casos, la evaluación será expresada
en la escala de 0 a 10 de conformidad con lo
señalado anteriormente en los lineamientos
generales de evaluación, y deberá ser asentada
por el profesor en el lector óptico el día del
examen departamental correspondiente.
1.3 Calificación Práctica:
Las actividades del laboratorio serán evaluadas
periódicamente y se verificará la adquisición de
habilidades y destrezas por parte del alumno,
mediante su participación y desempeño en cada
una de las diferentes prácticas que se realizarán
en cada Unidad Temática.
Esta evaluación permitirá identificar:
a)
La capacidad del alumno para integrar
conocimientos y para aplicarlos a un problema
específico.
b)
Las habilidades y destrezas del alumno para
desarrollar y ejecutar las maniobras señaladas en
el programa académico del laboratorio.
c)
La capacidad del alumno para generar
estrategias que le permitan identificar y proponer
soluciones a problemas específicos mediante
procesos inducto-deductivos.
La evaluación sobre las habilidades y destrezas
adquiridas por los alumnos en cada una de las
prácticas se realizará de acuerdo a los siguientes
criterios:
Protocolo
Desarrollo experimental
Reporte
De esta manera se integrará un promedio de
calificaciones de las prácticas realizadas en cada
Unidad Temática que tendrá el valor porcentual
que ya fue definido. El resultado será expresado
en la escala de 5 a 10 y deberá ser considerado
por el profesor en su evaluación del estudiante,
entregada el día del examen Departamental
correspondiente.
2. Exámenes Ordinarios:
El examen ordinario en su primera o, en su caso,
segunda vuelta, abarcará la totalidad del programa
teórico-práctico de la asignatura y estará dividido
en dos secciones.
22
Contendrá 80 reactivos de opción múltiple
relacionados con todas las Unidades Temáticas
que integran el programa teórico de la asignatura
(68 reactivos) y el resto (12) relacionados con los
aspectos de laboratorio. La duración de cada
examen será de dos horas y se realizará la
retroalimentación correspondiente con el profesor.
Los exámenes se devolverán, después de
realizada
dicha
retroalimentación,
a
la
coordinación de enseñanza.
La evaluación de cada examen ordinario será
expresada en una calificación que resultará de las
calificaciones correspondientes a las secciones
teórica y práctica, integrándose de la siguiente
manera:
Examen teórico
(85%)
Examen de laboratorio
(15%)
68
preguntas
12
preguntas
3. Examen Extraordinario
El examen abarcará la totalidad del programa, de
acuerdo a los objetivos educativos de la asignatura
y estará dividido en 2 secciones: Teórica y práctica
El examen contendrá 80 reactivos de opción
múltiple: 68 reactivos correspondientes a aspectos
relacionados con las dos Unidades Temáticas que
integran el programa teórico de la asignatura y 12
reactivos
que
evaluarán
los
contenidos
correspondientes al total de las prácticas
planteadas en el Programa Académico de la
Asignatura. El examen durará 2 horas y la
coordinación organizará la retroalimentación
correspondiente. Los exámenes se entregarán a la
coordinación.
La evaluación del examen extraordinario será
expresada en una calificación que resultará de las
calificaciones correspondientes a las secciones
teórica y práctica, integrándose de la siguiente
manera:
Examen teórico
Examen práctico
85%
15%
4. Calificación en actas
La calificación en actas se asentará según lo
descrito en los Lineamientos generales para la
evaluación de los alumnos en las asignaturas de la
carrera de médico cirujano en el numeral 13.
Las actas serán firmadas por uno o dos profesores
que hayan impartido diferente Unidad Temática al
mismo grupo y deberán hacerlo en la oficina de la
Coordinación de Enseñanza en la fecha y hora
que se indique en la misma Coordinación.
5. Misceláneos
5.1 Publicación de calificaciones:
Todas las calificaciones a que hace referencia este
Programa se harán del conocimiento de los
alumnos a través de sus
profesores, o
consultando una lista publicada por el
Departamento en lugares visibles.
6. Lineamientos del Laboratorio
6.1 Generales
a) No habrá cambios de grupo o sección de
laboratorio que no sean realizados en el periodo
estipulado para ello, mediante el trámite
administrativo correspondiente ante Servicios
Escolares.
b) Habrá una tolerancia de 10 minutos en la hora
de entrada para cada horario de laboratorio.
c) Los alumnos deberán utilizar bata blanca
durante todas y cada una de las sesiones de
laboratorio
d) El estudiante sólo podrá realizar las prácticas
en el horario y grupo que le corresponda. No se
podrán realizar prácticas en otros horarios o
grupos.
e) Los alumnos que se encuentran repitiendo el
curso de Bioquímica y Biología Molecular deberán
volver a realizar las actividades correspondientes
al laboratorio, ya que el curso es teórico-práctico.
f) Para tener derecho a exentar o a presentar
examen final, el alumno deberá cubrir al menos el
80% de asistencias de laboratorio y haberlo
acreditado.
g) En todas y cada una de las sesiones de
laboratorio, los alumnos deberán de respetar todas
las indicaciones y restricciones que les sean
mencionadas por su profesor, por el personal del
Departamento adscrito a los laboratorios, o a
través de avisos. La persona que transgreda este
lineamiento se hará acreedor a la sanción
correspondiente,
de
conformidad
con
la
Legislación Universitaria.
6.2 Evaluación del Laboratorio
El curso de laboratorio consta de tres Unidades
Temáticas, la primera de las cuales consta de una
sección, la segunda de dos secciones y la tercera,
de una sección. En cada una de ellas el alumno
23
obtendrá una calificación, la cual estará integrada
de la siguiente manera:
6.2.1 Calificación del profesor. Representa el
promedio de las prácticas realizadas durante la
sección a evaluar y equivale al 50% de la
calificación de laboratorio correspondiente a dicha
Sección.
6.2.2. Examen Departamental. Todo examen
departamental contará con 10 preguntas
concernientes a las prácticas de laboratorio y
representarán el 50% de la calificación de
laboratorio de dicha Sección
Como se indicó anteriormente, la calificación del
Laboratorio corresponde al 15% de la calificación
final de la Sección a evaluar y, por lo tanto, de la
calificación final del curso
(tales como asistencia puntual, traer bata, no salir
del laboratorio durante la práctica, no fumar, no
comer, no interferir en el trabajo de otros equipos,
etcétera).
b) Organización
de
las
actividades
experimentales. Saber qué se va a hacer y cómo,
a fin de disponer adecuadamente del equipo de
trabajo.
c) Observación. Descripción de las maniobras
experimentales realizadas y los registros
obtenidos; anotación cuidadosa de maniobras
realizadas.
d) Razonamiento metodológico. El estudiante
propondrá un cambio específico en la variable
dependiente y no hará un experimento solamente
para ver qué pasa (tendrá una hipótesis en la que
identificará las variables involucradas y el
argumento que las relaciona).
6.3 Criterios de calificación del laboratorio
6.3.3 Reporte (40%):
El Profesor evaluará los siguientes puntos:
Éste comprenderá las actividades que el
estudiante realizó durante la sesión de laboratorio
y cómo las realizó. Los primeros cuatro puntos se
reportarán siguiendo las características ya
descritas para el Protocolo (donde se señaló lo
que se realizaría y en este caso se debe señalar lo
que se logró), esto es:
6.3.1 Protocolo
6.3.2 Desarrollo Experimental
6.3.3 Reporte
6.3.1 Protocolo (35% de la calificación de la
práctica)
Deberá ser revisado en la sesión de discusión
correspondiente.
Para
su
evaluación
se
considerarán los siguientes apartados:
a) Título.
b) Antecedentes. Constará de la solución del
cuestionario correspondiente y de las referencias
encontradas en la bibliografía respecto al
problema a revisar en la práctica.
c) Planteamiento del problema. Éste definirá el
estudio a realizar.
d) Hipótesis. Ésta dará la solución tentativa del
problema planteado y será susceptible de
someterse a prueba durante el desarrollo
experimental (la hipótesis no se demuestra, sino
que se acepta o se descarta una vez sometida a
prueba). En la mayoría de las prácticas estos
puntos aparecen en el Manual de Prácticas de
Laboratorio.
e) Referencias. Serán citadas específicamente
con relación a los antecedentes y tendrán un
formato estandarizado para trabajos científicos.
6.3.2 Desarrollo Experimental (25%)
a) Comportamiento personal. Éste se refiere a la
conducción general de las actividades del
estudiante dentro del laboratorio de prácticas
a) Resultados. Presentación y descripción de
registros y datos obtenidos (en este punto queda
fuera de lugar mezclar comentarios e impresiones
sobre los mismos).
b) Análisis de resultados. Descripción del método
utilizado en el análisis (de qué manera fueron
analizados) y los resultados del análisis
(promedios, porcentajes, tablas, gráficas, entre
otros).
c) Interpretación de resultados. Confrontar los
datos obtenidos con aquellos ya publicados e
indicar la concordancia o discordancia de los
mismos a manera de discusión. De ser necesario,
proponer posibles alternativas. Señalar el apoyo
bibliográfico, cuya cita aparecerá en la sección de
referencias.
d) Conclusión. El estudiante evaluará la hipótesis
en función de los resultados obtenidos y
argumentará sobre la validez de la misma.
e) Referencias. Contendrá las citas bibliográficas
utilizadas en la sección de antecedentes y
discusión (dentro de interpretación). Existen casos
particulares en que es obligado citar el método
utilizado. Estas citas se escribirán siguiendo lo
descrito para el Protocolo.
El promedio de las calificaciones de las prácticas
corresponderá al 50% de la calificación de este
24
rubro en la sección correspondiente, sin olvidar
que la calificación de las prácticas representa el
15% de la calificación global de la sección a
evaluar.
IX BIBLIOGRAFÍA
BÁSICAS
VIII OBLIGACIONES DE LOS PROFESORES Y
ALUMNOS
1. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con
aplicaciones clínicas. 4a. ed. Barcelona:
Editorial Reverté; 2004.
Profesores
2. Laguna J, Piña E. Bioquímica de Laguna.
5a.ed. México: Editorial El Manual Moderno;
2002.
Con base en el artículo 56 y 61 del Estatuto de
Personal Académico de la UNAM, el profesor de
Bioquímica y Biología Molecular:
1. Impartirá sus clases teóricas y/o prácticas con
puntualidad, según el horario que le haya asignado
el Departamento, en el calendario escolar
correspondiente.
2.
Impartirá su enseñanza y calificará los
conocimientos de sus estudiantes sin hacer
ninguna distinción entre ellos. Para realizar dicha
evaluación considerará diversos aspectos como
asistencia, desempeño en teoría y laboratorio,
como aparece en los lineamientos de evaluación
de la sección previa de este programa académico.
3. Cumplirá con el programa de la asignatura de
Bioquímica y Biología Molecular aprobado por el
Consejo Técnico de la Facultad y se los dará a
conocer a sus estudiantes el primer día de clases,
así como la bibliografía correspondiente al curso.
4. Aplicará los exámenes departamentales en las
fechas y lugares indicados por la Coordinación de
Enseñanza de la asignatura. Hará la retroalimentación de sus estudiantes después de los
exámenes departamentales y/o finales.
5. Se abstendrá de impartir clases particulares
remuneradas o no a sus propios alumnos.
3. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de
bioquímica. 4a. ed. Barcelona: Ediciones
Omega; 2005.
4. McKee T, McKee RJ. Bioquímica. 3a. ed.
España: McGraw-Hill Interamericana Editores;
2003.
5. Murray KR, Granner DK, Mayes PA, Rodwell
VW. Bioquímica de Harper. 16a. ed. México:
IPN/Editorial El Manual Moderno; 2004.
6. Stryer L. Bioquímica. 5a. ed. Barcelona:
Editorial Reverté; 2003.
COMPLEMENTARIAS
1. Alberts B, Bray D, Lewis J. Biología molecular
de la célula. 3a. ed. Barcelona: Ediciones
Omega; 1992.
2. Bloomfield MM.Química de los organismos
vivos. México: Editorial Limusa; 1997.
3. Holum JR. Fundamentos de química general,
orgánica y bioquímica para ciencias de la
salud. México: Editorial Limusa Wiley; 2001.
Alumnos
Los alumnos de la asignatura de Bioquímica y
Biología Molecular:
1. deberán cumplir con el 80% de asistencias al
curso teórico y al laboratorio y aprobar este último
para tener derecho a la calificación final.
2. deberán presentar los exámenes, tareas y
trabajos que el profesor considere indispensables
para tener derecho a calificación final (Juicio del
Profesor).
3. deberán adquirir y utilizar el Manual de objetivos
y de laboratorio en el aula, tanto de teoría como de
laboratorio.
4. No podrán realizar la práctica del laboratorio si
no traen el manual correspondiente y una bata
blanca.
5. Se abstendrán de introducir alimentos a las
aulas y/o laboratorios de enseñanza.
25
CONTENIDO TEMÁTICO
Primera Unidad Temática
ESTRUCTURA MOLECULAR
26
I
LÓGICA MOLECULAR DE LA VIDA
Al finalizar esta unidad, el alumno conocerá la naturaleza química de los seres vivos y
su organización. La unidad se divide en:
A. Características generales de la materia viva.
B. Niveles de la organización celular.
A. Características generales de la
materia viva
Al finalizar esta subunidad, el alumno conocerá las
características de la materia viva.
A.1
A.2
Discutirá la organización de los seres vivos
(procariotos,
eucariotos,
autótrofos
y
heterótrofos) con base en la complejidad de
las estructuras que los constituyen y la
función específica que tienen.
Discutirá con base en la figura I.1 la
capacidad de los seres vivos para obtener,
transformar y utilizar la energía, así como su
capacidad de autorregulación y
de
autoduplicación.
Los sistemas vivientes son organizaciones en
extremo complejas que operan bajo principios
fisicoquímicos. Esta organización de la vida hace
posible un elevado número de procesos
fundamentales que se llevan a cabo en forma
organizada y regulada en todos los sistemas
vivientes. Se ha propuesto que la vida está limitada
por los principios de la física y la química, pero lo
cierto es que logra trascender hasta los más
elevados principios biológicos.
Todos los seres vivos son sistemas organizados y
funcionando en forma coordinada, constituidos
fundamentalmente por moléculas de carbohidratos,
lípidos, proteínas y ácidos nucleicos. Estos sistemas
Fig. I.1. Ciclo del CO2 y del O2 en los seres vivos.
Modificada de: Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de
bioquímica. 4a. ed. Barcelona: Ediciones Omega; 2005.
intercambian materia y energía con su entorno, del
cual están separados por una membrana. Las
funciones básicas de transformación y utilización de
la energía realizadas por estos sistemas, así como su
reproducción se llevan a cabo con un alto grado de
precisión por proteínas catalíticas específicas
llamadas enzimas. Estas enzimas están presentes en
las células y actúan como catalizadores que hacen
posible que se lleven a cabo reacciones sin que la
célula sufra daño alguno.
La materia evoluciona aumentando su
complejidad debido al incremento en la variedad de
unidades que la constituyen y a la especialización
que éstas alcanzan. Cuanto más complejo es un
27
sistema más especializadas son sus partes y, por
ello, más dependen unas de otras.
Las características universales de los
sistemas se encuentran a nivel bioquímico. Todas las
células obtienen energía, ya sea de la luz del sol o de
las moléculas de alimento ricas en energía y la
almacenan en una molécula con un alto contenido
energético: el ATP. Las células han desarrollado
fundamentalmente tres vías para generar ATP:
fermentación, respiración y fotosíntesis.
Todas las células tienen la capacidad de
autoduplicarse: las moléculas en las que se
almacena esta propiedad son el DNA y el RNA. La
universalidad de estas moléculas en todos los
organismos vivos revela que todas las formas de vida
sobre la Tierra tienen un origen común.
La importancia del DNA en la reproducción y
el crecimiento de las células reside en la información
contenida en los genes. Las moléculas de DNA son
polímeros de unidades, llamadas nucleótidos,
constituidos por un azúcar, un fosfato y una base
nitrogenada de cuatro tipos diferentes. La secuencia
precisa de bases en el DNA constituye la información
genética. La función clave de esta información es la
de especificar la composición de las proteínas. Más
que ninguna otra molécula, las proteínas hacen que
un organismo sea lo que es.
El copiado exacto del DNA, aunque esencial
para el desarrollo individual, no es suficiente para
permitir los cambios evolutivos; tiene que existir una
fuente de variación que proviene, fundamentalmente,
de la aparición de mutaciones o de la recombinación
del material genético. Las mutaciones surgen por un
error en el proceso de copiado.
Los organismos más complejos a nuestro
alrededor son multicelulares. La célula es la unidad
estructural y funcional de los seres vivos, así como el
átomo es la unidad fundamental de las estructuras
químicas.
Resumiendo, la diversidad de los organismos
depende de un programa genético codificado por los
ácidos nucleicos, ejecutado por medio de complejos
reguladores
que
controlan
las
actividades
bioquímicas de las células, lo que da como resultado
diferentes niveles estructurales en la organización
molecular y celular de dicho organismo.
Hay dos principales clases de células: las
procarióticas y las eucarióticas. Las células
procarióticas tienen un solo cromosoma que ocupa
un espacio dentro de la célula denominado nucleoide
y se halla en contacto directo con el citoplasma. Las
células eucarióticas poseen varios cromosomas
contenidos en un núcleo verdadero con una
envoltura nuclear. Adicionalmente presentan una
serie de orgánulos que realizan funciones
especializadas como por ejemplo, las mitocondrias
que son potentes generadoras de ATP.
Se ha propuesto en la teoría de la
endosimbiosis que, desde el punto de vista evolutivo,
las células procarióticas son antecesoras de las
eucarióticas.
Con base en el mecanismo que utilizan para
obtener la energía necesaria para realizar sus
funciones vitales podemos agrupar a todas las
células y organismos en otras dos clases principales:
los autótrofos, que utilizan el proceso de fotosíntesis
para transformar moléculas inorgánicas en glucosa, a
partir de la cual se construyen moléculas más
complejas, y los heterótrofos, que obtienen la energía
de moléculas complejas que han sido sintetizadas
por organismos autótrofos. La energía que contienen
estas
moléculas
complejas
es
liberada
principalmente por su oxidación hasta CO2 y agua en
un proceso llamado respiración.
He
H
Li
B C N O F
Ne
Al Si P S Cl
Ar
Ge
As Se Br
Kr
In
Sn
Sb Te
I
Xe
Au Hg Tl
Pb
Bi
At Rn
Be
Na Mg
K Ca
Sc Ti
Rb Sr
Y
Cs Ba
V Cr Mn Fe Co Ni Cu Zn Ga
Zr Nb
Hf
Ta
Mo Tc
W
Ru Rh Pd
Re Os
Ir
Pt
Ag Cd
Po
Fr Ra
Figura I.2. Elementos que forman parte de la materia viva. Los
más abundantes o macroelementos (negritas), los presentes en
pequeñas
cantidades
en
todos
los
organismos
o
microelementos(cursivas), y los que son necesarios en algunos
organismos
en
cantidades
mínimas
o
elementos
traza
(subrayados).
28
Se llama metabolismo al total de reacciones que
ocurren en la célula. Hay reacciones catabólicas por
las cuales las sustancias complejas se degradan
a sustancias más simples y reacciones anabólicas
que realizan el proceso inverso.
En resumen, las células tienen las siguientes
características:
1) Un programa genético específico que permite la
reproducción de nuevas células del mismo tipo. 2)
Una membrana celular que establece un límite que
regula todos los intercambios de materia y energía.
3) Una maquinaria biológica que puede utilizar la
energía adquirida por la célula a partir de la energía
luminosa o de los alimentos.
4) Una maquinaria para la síntesis de proteínas y
todas las demás moléculas que integran a las células
de un organismo.
B.1.3
B.2
que hacen que estos elementos
sean
apropiados
como
constituyentes de la materia viva.
Describirá los tipos de enlace (tabla
I.1, pág. 4) y funciones químicas que
aparecen en las moléculas biológicas
(alcohol, carboxilo, carbonilo, éster,
amida, amino, éter y tiol).
Moléculas precursoras y macromoléculas.
B.2.1
Conocerá
los
aminoácidos,
nucleótidos, monosacáridos y ácidos
grasos
como
precursores
de
proteínas,
ácidos
nucleicos,
polisacáridos y lípidos, así como las
diversas funciones que llevan a cabo
en el organismo.
B. Niveles de la organización celular
B.3
Al finalizar esta subunidad, el alumno analizará y
discutirá los diferentes niveles de la organización
celular.
B.1
Bioelementos.
B.1.1 Identificará en una tabla periódica
(figura I.2) los elementos que forman
parte de la materia viva.
B.1.2 Conocerá
las
características
fisicoquímicas
(configuración
electrónica, electronegatividad e
hibridación) del carbono, nitrógeno,
oxígeno, hidrógeno, azufre y fósforo,
Estructuras, orgánulos, células, tejidos y
organismos.
B.3.1 Describirá la manera cómo se
ensamblan las macromoléculas para
obtener un nivel mayor de
organización.
B.3.2 Describirá la estructura de las
membranas biológicas.
B.3.3 Definirá a la célula como la unidad
mínima de organización de la
materia viva.
29
Tabla I.1
CARACTERÍSTICAS DE LOS ENLACES QUÍMICOS
Tipo de enlace
IÓNICO
COVALENTE
•Simple
•Coordinado
•Polar
•Múltiple
Enlaces
intermoleculares
PUENTE DE
HIDRÓGENO
FUERZAS DE
VAN DER WAALS
INTERACCIONES
HIDROFÓBICAS
INTERACCIÓN
IÓN DIPOLO
Descripción general
Es la fuerza de atracción entre iones con signos
contrarios que se forman por la transferencia completa
de electrones desde el átomo con mayor tendencia a
perderlos, al que tiene mayor afinidad por ellos.
Resulta de compartir electrones entre dos o más
átomos que tienen una afinidad electrónica semejante
Se forma mediante la donación de un electrón por parte
de cada átomo que participa en el enlace.
Ambos elctrones los da uno solo de los átomos que
participan en la formación del enlace.
Se establece cuando los electrones del enlace
covalente se encuentran más cerca del elemento de
mayor electronegatividad. En el enlace se forma un
polo relativamente positivo y otro relativamente
negativo.
En algunos compuestos de los átomos comparten más
de un par electrónico (enlaces dobles o triples).
Fuerzas de atracción débiles entre diferentes
moléculas y iones
Interacción dipolo-dipolo. Se establece cuando un
átomo de hidrógeno sirve como puente entre dos
átomos electronegativos, unido a uno con un enlace
covalente, y al otro, con fuerzas de naturaleza
electrostática.
Son fuerzas electrostáticas transitorias. La atracción se
establece entre los extremos de dipolos momentáneos
con cargas opuestas.
Enlaces polares. Las moléculas se reunen
conjuntamente asociándose entre sí en el seno del
agua debido a que las interacciones agua-agua son
muy fuertes y rodean a las moléculas apolares
Es la atracción de un ión positivo por el extremo
negativo de las moléculas de un disolvente polar
(solvatación). Cuando el disolvente es el agua, se dice
que las partículas de soluto se hidratan.
Energía de enlace
10-20 kcal/mol
42-84kJ/mol
Para la unión:
C–C
83 kcal/mol
348 kJ/mol
___
O–H
111kcal/mol
464kJ/mol
C–C
146kcal
611kJ/mol
___
2.5kcal/mol
8-21kJ/mol
1kcal/mol
4kJ/mol
1-2kcal/mol
4-8kJ/mol
0.01 kcal/mol
0.04kJ/mol
30
II
ASPECTOS FISICOQUÍMICOS
DEL FUNCIONAMIENTO CELULAR
Al finalizar esta unidad, el alumno deberá conocer y aplicar los conceptos
fundamentales de fisicoquímica a la comprensión de la estructura y comportamiento de
las moléculas biológicas en la célula y en su interacción con el ambiente; además,
conocerá algunos aspectos médicos de ellos. La unidad se divide en:
A.
A.
B.
C.
D.
Aspectos básicos de fisicoquímica aplicados a la bioquímica.
Agua.
Equilibrio hidroelectrolítico y ácido-base.
Aminoácidos y proteínas.
E.
Enzimas y coenzimas.
Aspectos básicos de fisicoquímica
aplicados a la bioquímica
Al finalizar esta subunidad, el alumno conocerá los
conceptos básicos de fisicoquímica necesarios para
la comprensión de la bioquímica.
A.4
A.5
A.6
A.1
Definirá el concepto de sistema y conocerá
sus diferentes tipos con base en su
capacidad de intercambiar materia y energía
con su ambiente (sistemas abiertos y
cerrados).
A.2
Conocerá las leyes de la termodinámica y
definirá el concepto de entropía, entalpía así
como energía interna.
A.3
Definirá el concepto de energía libre de
Gibbs y de energía libre estándar de una
reacción y su empleo como criterio de
espontaneidad de un proceso.
Identificará los procesos exergónicos y
endergónicos y los relacionará con procesos
reversibles e irreversibles.
Analizará la estrategia de las reacciones
acopladas. Se sugiere usar como ejemplo
una reacción catalizada por una cinasa.
Definirá los conceptos de energía de
activación y de estado energizado de una
reacción.
En termodinámica un sistema se define como la parte
del Universo en estudio. Por lo tanto, un sistema
puede ser un tubo de ensayo, una máquina, una
planta o el hombre.
El resto del Universo se conoce como
ambiente. El organismo humano es un sistema
abierto porque es capaz de intercambiar materia y
energía con el ambiente que lo rodea; toma los
nutrimientos, oxígeno y agua del ambiente; elimina
productos de desecho, y genera trabajo y calor.
31
La primera ley de la termodinámica, o ley de
la conservación de la energía, dice que la energía no
se crea ni se destruye, sólo se transforma.
U = U final – U inicial = q – w (1)
Esta expresión matemática muestra que el
cambio de energía, pérdida o ganancia que sufre un
sistema (U) corresponde a la diferencia entre el
contenido de energía al principio (U inicial) y al término
(U final) del estudio.
La segunda relación matemática: (U = q –
w) significa que parte de ese cambio de energía se
utiliza para hacer trabajo (w) sobre el ambiente y el
resto se libera en forma de calor (q). Los procesos en
los cuales el sistema libera calor se llaman
exotérmicos (q con signo negativo por convención), y
a los que absorben calor se les llama endotérmicos
(q con signo positivo).
La medida de este intercambio de calor,
liberado o absorbido con el ambiente, se llama
entalpía (H):
H = qp (2)
donde qp se lleva a cabo a presión constante.
La segunda ley de la termodinámica dice que
el Universo tiende hacia el máximo desorden. Esta
ley provee un criterio para determinar si un proceso
es espontáneo. Un proceso espontáneo ocurre en
una dirección que aumentaría el desorden del
sistema y del ambiente. La medida del desorden del
sistema se llama entropía (S) y el cambio puede ser
en el sentido de aumentar el desorden (S con signo
positivo) o de disminuir el desorden (S con signo
negativo).
La tercera ley de la termodinámica o ley cero
dice que a una temperatura de 0°K (-273 °C) la
entropía de un sistema es igual a cero.
J. Willard Gibbs (1878) formuló el concepto
de energía libre (G) que engloba los dos indicadores
de espontaneidad de un proceso a temperatura y
presión constantes:
G = H – TS
y los cambios quedarían indicados como:
G = H – TS (4)
De esta manera, un cambio en la energía
libre sería la suma algebraica del cambio de la
entalpía y el cambio de la entropía multiplicada por la
temperatura (°K).
Un proceso con G negativo (espontáneo y
exergónico) puede darse por una disminución en la
entalpía (liberación de calor) o por un aumento en la
entropía (aumento de desorden). Por el contrario, un
proceso endergónico, no espontáneo, tiene un G
positivo, caracterizado por un aumento en la entalpía
(absorción de calor) o por una disminución en la
entropía. El G representa la energía que se emplea
para ejercer un trabajo.
En muchos sistemas, entre ellos los
biológicos, un valor negativo grande predice que la
reacción se puede llevar a cabo de manera
espontánea, pero no dice nada acerca de la
velocidad del proceso, ni del camino que éste sigue.
Por ejemplo, en algunas reacciones químicas, el G
puede ser negativo, y esto predice que la reacción
será espontánea, pero como el camino ocurre a
través de un estado energizado (de mayor contenido
de energía) de los reactivos, el proceso no se lleva a
cabo a menos que se introduzca energía al sistema
para que se alcance ese estado energizado (energía
de activación); entonces, el proceso se realizaría de
manera espontánea. La introducción de enzimas
para realizar una reacción, tiene el efecto de
disminuir la energía de activación de dicha reacción
(debido a la formación del complejo enzima-sustrato).
Una estrategia que se sigue en los sistemas
biológicos para lograr que las reacciones no
espontáneas, con G positivo, se lleven a cabo,
consiste en acoplarlas a otras reacciones
relacionadas que tengan un G muy negativo. De
esta manera, en las vías metabólicas las reacciones
exergónicas “empujan” o “jalan” a las reacciones
endergónicas y desplazan el equilibrio químico. Por
ejemplo, la fosforilación de la glucosa por ATP
catalizada por la hexocinasa:
(3)
32
Ecuación:
B.3
;
G
(kcal/mol)
Glucosa + Pi = Glucosa 6 fosfato + H2O
+3.3
ATP + H2O = ADP + Pi + H+
–7.3
+
Glucosa + ATP = Glucosa 6 fosfato + ADP + H –4.0
B.
Agua
Al finalizar esta subunidad, el alumno conocerá las
propiedades fisicoquímicas del agua y los conceptos
de reacción química, pH, ácido, base y amortiguador.
B.1
Conocerá
las
siguientes
propiedades
fisicoquímicas del agua: su composición, sus
enlaces químicos, densidad electrónica,
características de dipolo, puentes de
hidrógeno, estructura en sus estados físicos,
calor latente de vaporización, calor
específico, tensión superficial, conductividad
térmica, constante dieléctrica y su papel
como solvente.
B.2
Soluciones acuosas.
B.2.1 Definirá qué es una solución y los
diferentes tipos de soluciones que
existen.
B.2.2 Explicará los cálculos y los
procedimientos
para
preparar
soluciones porcentuales molares,
osmolares y normales, así como las
diferentes diluciones de estas.
Conocerá la composición de las
siguientes soluciones utilizadas en
medicina: solución isótonica, de
Ringer, de Darrow, de Hartman.
B.2.3 Revisará las propiedades coligativas
de las soluciones y su importancia en la
medicina.
B.2.4 Definirá
los
conceptos
de
osmolaridad,
osmolalidad,
hiper
e
hipoosmolaridad, así como el de isotonicidad.
Realización de la práctica 1 "Soluciones" (ver pág.
133)
Analizará el concepto de pH.
B.3.1 Definirá lo que es una reacción
química
y
sus
componentes.
Describirá la ley de acción de masas
y definirá la constante de equilibrio y
su significado.
B.3.2 Conocerá la reacción de ionización
del agua, su constante de equilibrio y
el producto iónico del agua.
B.3.3 Conocerá el concepto de pH y
establecerá su escala de medición.
Aplicará dicho concepto para calcular
los valores de pH a partir de la
concentración de iones hidronio y de
la concentración de H+ a partir de los
valores de pH.
Uno de los compuestos más abundantes en nuestro
planeta es el agua. Se cree que fue en los océanos
primitivos donde se originaron los primeros indicios
de vida. El agua constituye el medio en el cual se
realizan la mayoría de los procesos celulares (de
hecho podría decirse que la conformación que toman
las moléculas dentro de las células depende del
agua). Es por ello que el agua es una molécula muy
importante para sostener la estructura de las células
y los organismos.
Las características peculiares del agua
derivan de su estructura química particular, en la cual
los dos hidrógenos y el oxígeno se encuentran
formando un tetraedro irregular en el que el oxígeno
ocupa el centro y los hidrógenos, junto con los dos
orbitales del oxígeno no compartidos, están dirigidos
hacia los vértices. La diferencia de electronegatividad
entre el oxígeno y los hidrógenos hace que los
enlaces entre ellos sean covalentes polares, dando
cargas parciales positivas y negativas a la molécula
que la constituyen como un dipolo. Esta
característica permite que exista una fuerza de
atracción entre los extremos cargados opuestamente
de las moléculas vecinas.
La atracción entre las moléculas de agua
permite que se establezcan enlaces débiles llamados
puentes de hidrógeno que configuran redes
transitorias cuya existencia continuada confiere al
33
agua sus propiedades fisico-químicas características:
ser líquida a temperatura ambiente, alto punto de
fusión, alto punto de ebullición, elevada tensión
superficial, alta constante dieléctrica, alta capacidad
calorífica y baja tensión de vapor.
Todas esas propiedades permiten que el
agua desempeñe muy variadas funciones en los
seres vivos; por ejemplo, servir como medio universal
de solución, de suspensión y de reacción para todas
las moléculas, o intercambiar cantidades importantes
de calor sin mucha variación de su temperatura, lo
cual le permite mantener constante la temperatura
del organismo y controlarla mediante los fenómenos
de vasoconstricción y de sudoración. El transporte de
sustancias entre los diversos órganos y tejidos del
cuerpo humano se hace por el plasma y los líquidos
extracelulares, ambos de naturaleza acuosa. Las
interacciones del agua con las diversas moléculas
permiten el mantenimiento de las estructuras
celulares. La presencia de partículas en solución va a
modificar las propiedades características del agua y
da origen a lo que se conoce como propiedades
coligativas de las soluciones (propiedades que
dependen del número de partículas en la solución y
no de su naturaleza). Entre éstas, la más notable es
la aparición de la presión osmótica.
Una molécula de agua tiene la capacidad de
ceder un protón a la molécula vecina y esto ocasiona
que la molécula que cedió su protón quede con una
carga neta negativa y la molécula de agua que lo
acepta quede con una carga positiva. Esto indica que
el agua se ioniza, ya que actúa como un ácido al
donar protones (H+) y como una base al aceptarlos,
según la teoría de Brönsted y Lowry. Así, el agua
puede encontrarse en dos especies iónicas: el
hidronio H3O+, que funcionaría como ácido, y el
hidroxilo OH–, que es la especie que queda al ceder
la molécula de agua su protón, y que funciona como
una base, ya que puede aceptar protones. Para
facilitar la expresión de la ionización del agua se
simplifica así:
H2O
H+ + OH–
A las sustancias que tienen esta capacidad
se las llama anfóteras o anfolitos.
La velocidad de las reacciones químicas
depende de la concentración de las moléculas
implicadas en ellas, así como de una constante de
velocidad de la reacción (k), que es una medida
indirecta de la capacidad intrínseca de las moléculas
para reaccionar entre sí. En la reacción:
A+B
C+D
la velocidad (v) es igual a k [A][B].
Como la mayoría de las reacciones son
reversibles, existen dos constantes de velocidad, una
correspondiente a la reacción directa y una
correspondiente a la reacción inversa. Cuando la
velocidad de la reacción directa es igual a la
velocidad de la reacción inversa se establece una
condición de equilibrio en la que hay una relación
particular del producto de las concentraciones de los
productos entre el producto de las concentraciones
de los reactivos. Esta relación es lo que se conoce
como constante de equilibrio (Keq) y es igual a ki/kd
o [C] [D] / [A] [B]. La constante de equilibrio es
característica para cada reacción y permite conocer
si la reacción es más favorable hacia los productos (a
la derecha), en cuyo caso el valor será siempre
mayor a la unidad, o más favorable a la aparición de
los reactantes (a la izquierda) cuando el valor de la
constante será menor a la unidad. Si el valor es igual
a uno no hay una tendencia clara en ninguna de las
direcciones.
En el caso del agua, la Keq tiene un valor de
1.8 X 10–16 mol/l, que es mucho menor a la unidad, lo
cual indica que la molécula tiende a estar asociada;
la concentración del agua sin disociar es tan elevada
que puede considerarse constante. Cuando el valor
de esta concentración se multiplica por la Keq se
obtiene el valor del producto de la concentración de
ambos iones H+ y OH–, lo que se conoce como Kw o
producto iónico del agua, donde Kw = [H+] [OH–] = 1
X 10–14mol2/l2. Aquí la concentración de ambos iones
es de 1 X 10–7. A partir de esta constante (Kw) se
puede deducir el carácter de una solución diluida
respecto a su grado de acidez o basicidad; se ha
elegido al ion hidronio (H3O+), simplificado como H+,
como valor numérico para expresarla. Como las
concentraciones que se manejan son tan pequeñas,
aun
expresadas
matemáticamente
como
submúltiplos de 10 (potencias negativas de 10), su
34
manejo puede resultar “complicado” por lo que se
utiliza el -log de base 10 para expresarlo. Esto es lo
que se conoce como “p” y referido a la concentración
+
de H se denomina pH. El pH, entonces, corresponde
al -log de la concentración de hidrogeniones, o sea:
+
+
pH = –log [H ] o bien pH = log 1/[H ]
Nótese que la “p” es minúscula, ya que se
trata de una sigla que indica potencial.
Si se considera que el valor de la
–7
concentración de protones es de 1 x 10 , se tiene
que:
pH = log 1/ (1 x 10–7) = log 1 – log 1 x 10–7 = 0 – (–7)
=7
Es a partir del agua que se define la escala
de pH, por lo cual se habla de soluciones ácidas
cuando tienen valores de concentración de
hidrogeniones mayores de 1 X 10–7 o pH menores de
7 y de soluciones alcalinas con concentraciones de
hidrogeniones menores de 1 X 10–7 y pH mayores a
7.
Cuando la concentración de hidrogeniones
en solución acuosa es de 1.0 M, el valor del pH es 0,
ya que el log10 1 es 0. En el otro extremo, cuando la
concentración de H+ es (1 X 10–14) el pH es de 14. El
punto de neutralidad es de pH = 7 o en concentración
de H+ de 1 X 10–7. El intervalo de pH para indicar la
acidez de una solución va del 0 al 7, mientras que el
correspondiente a la basicidad o alcalinidad de una
solución va del 7 al 14.
C.
Equilibrio hidroelectrolítico
y ácido-base
Al finalizar esta subunidad, el alumno conocerá los
conceptos de electrólito, ácido, base y amortiguador;
así como la composición de los compartimientos
líquidos del organismo, el balance del agua y de los
electrólitos.
C.1
Definirá los conceptos de anión, catión,
electrólito, anfolito
y conocerá la
composición
electrolítica
de
los
compartimentos líquidos del organismo
(plasma, líquidos intracelular e intersticial,
jugo gástrico, jugo pancreático y bilis).
C.2
Definirá los conceptos de ácido y base, su
fuerza, y analizará los cambios del pH de una
solución al agregar un ácido o una base
explicando el porqué de este fenómeno.
C.3
Analizará
el
concepto
de
sistema
amortiguador.
C.3.1 Definirá
el
concepto
de
amortiguador, de pK y explicará la
importancia
de
los
sistemas
biológicos de amortiguación.
C.3.2 Aplicará la ecuación de HendersonHasselbalch al cálculo del pH y de la
concentración de sal o de ácido de
diferentes soluciones.
C.3.3 Identificará
los
sistemas
amortiguadores más importantes en
los medios intra y extracelular.
Explicará cómo se regula el pH de los
líquidos orgánicos y la participación de los
sistemas amortiguadores, el intercambio
iónico,
así
como
los
mecanismos
respiratorios y renales.
C.4.1 Revisará las principales alteraciones
del equilibrio ácido-base en el
organismo y los mecanismos para su
control.
C.4
Realización de la práctica 2 "Regulación del equilibrio
ácido-base después del ejercicio muscular intenso y
de la ingestión de bicarbonato de sodio" (ver pág.
137).
Discusión de los casos clínicos 1 "Cólera" y 2
"Oclusión
intestinal.
Acidosis
metabólica.
Deshidratación grave" (ver págs. 195-196).
Es importante recordar que un ión es una especie
química (átomo o conjunto de átomos) con carga
eléctrica positiva (catión) o negativa (anión) por
ganancia o pérdida de electrones; los iones disueltos
en agua pueden conducir la electricidad. El paso de
la electricidad a través de una solución con iones se
llama electrólisis. Los solutos que pueden liberar
iones en el agua por disociación o ionización y que
35
forman una solución conductora de electricidad se
llaman electrólitos.
El agua es el mayor constituyente de los
seres vivos; su cantidad debe mantenerse dentro de
un margen estrecho ya que tanto su carencia como
su exceso producen problemas clínicos que se
conocen como desequilibrios hídricos.
El agua corporal la encontramos en
diferentes compartimentos y su cantidad en éstos,
depende de las concentraciones de ciertos
electrólitos como Na+, K+, Cl–, HCO3-, Mg2+ y Ca2+,
fosfatos y proteinatos. Las concentraciones de estos
electrólitos se mantiene dentro de ciertos límites que
al alterarse, producen desequilibrios que pueden
llegar hasta la muerte.
En la práctica médica está indicada la
cuantificación de electrólitos en cualquier paciente
con síntomas neuromusculares. El tratamiento de las
alteraciones hidroelectrolíticas se basa en la
evaluación del agua corporal total y su distribución,
así como en las concentraciones de electrólitos y en
la osmolaridad del suero.
Agua corporal
El agua en el cuerpo humano ocupa cerca de 70%
del peso corporal dependiendo de la edad, el sexo y
la grasa corporal. La cantidad de agua puede variar
desde alrededor de un 40% en personas mayores a
más de un 75% en niños recién nacidos. Su
porcentaje también es mayor en personas delgadas
que en obesas, así como un hombre tendrá mayor
cantidad de agua que una mujer. La cantidad de
agua presente en los diferentes tejidos varía de
acuerdo con las funciones y características de cada
uno,
siendo
más
abundante
en
células
metabólicamente muy activas (~ 90%) y de menos
del 10% en el tejido adiposo o aún menor, en
estructuras relativamente inactivas como el
esqueleto.
El agua se encuentra distribuida en el líquido
intracelular (30-40% del peso corporal total) y el
líquido extracelular que, a su vez, está conformado
por el líquido intersticial y la linfa (15%), el plasma
(4.5%) y los fluidos transcelulares que incluyen los
fluidos gastrointestinales, peritoneal, sinovial, líquido
cefalorraquídeo, entre otros.
Electrólitos
La composición electrolítica del líquido intracelular
(LIC) y del líquido extracelular (LEC) difiere en forma
sustancial. Para fines prácticos el LIC tiene al K+
como el principal catión y como aniones al fosfato y a
las proteínas, mientras que en el LEC, el Na+ es el
catión más importante y el cloruro como anión.
La concentración total de cationes presentes
en el plasma es aproximadamente de 150 mmol/l,
siendo la concentración de sodio de 140 mmol/l. Los
aniones presentes en el plasma más abundantes son
el cloruro, con una concentración aproximada de 100
mmol/l y el bicarbonato, con una concentración de 25
mmol/l. Dado que en cualquier sistema biológico la
suma de los cationes debe ser igual a la suma de los
aniones, el resto de los aniones que constituyen la
diferencia o brecha aniónica del plasma son el
fosfato, el sulfato, las proteínas y los ácidos
orgánicos como son el lactato, el citrato, el piruvato,
el acetoacetato y el 3--hidroxibutirato.
En la práctica, esta brecha aniónica se
calcula de acuerdo a la siguiente ecuación:
Brecha aniónica = {[Na+] + [K+]} – {[Cl-] + [HCO3-]}
Calculada de esta forma, la brecha aniónica
es de aproximadamente 12 mmol/l. Puede aumentar
muchas veces en ciertos desórdenes como cuando
los ácidos inorgánicos y los aniones orgánicos se
acumulan, por ejemplo, en la cetoacidosis diabética y
en la insuficiencia renal.
El potasio es el principal catión en el LIC,
cuya concentración es de 110 mmol/l, es
aproximadamente 30 veces más alta que la que se
encuentra en el LEC. La concentración de sodio y
cloruro en el LIC es de 10 mmol/l y 4 mmol/l,
respectivamente.
La movilización y el metabolismo de los
principales cationes extra e intracelulares depende
de la actividad celular así como de transportadores
específicos, entre los cuales se encuentra la bomba
36
+
+
de Na /K . Los cambios en la concentración de iones
conlleva a cambios en la osmolaridad del medio.
Osmolaridad
Las diferentes moléculas disueltas en el agua
corporal contribuyen a la presión osmótica, la cual es
proporcional a la concentración molar de la solución.
Un cambio en la concentración iónica en cualquiera
de los compartimentos celulares crea un gradiente de
presión y como consecuencia, existe un cambio en la
cantidad de agua que fluye del compartimiento que
presenta una menor osmolaridad hacia el de mayor.
Para determinar la concentración osmolar de
una solución que contiene una mezcla de electrólitos
y no electrólitos hay que tener en cuenta las
concentraciones
individuales
de
todos
sus
componentes. Una fórmula sencilla para cuantificar la
osmolaridad del suero y que ofrece una utilidad
clínica es:
+
Osmolaridad =2(Na mmol/l) + glucosa mmol/l + BUN
mmol/l
= 280 a 320 mOsm
Osmolaridad = 2(Na+ meq/l) + glucosa mg/dl + BUN mg/dl
——--——-18
——-----—
2.8
donde el factor 2 se debe a que se consideran los
aniones asociados al Na+ (Cl– y HCO3–); 1 mOsm de
glucosa equivale a 180 mg/l (18 mg/dl) y 1 mOsm de
nitrógeno ureico (NUS o BUN de sus siglas en inglés)
a 28 mg/l (2.8 mg/dl) que corresponde a la masa
molecular de 2 átomos de nitrógeno en la urea.
Los electrólitos Na+, Cl– y HCO3–, contribuyen
con más del 92% a la osmolaridad del suero; los
otros electrólitos, junto con las proteínas séricas,
glucosa y urea son responsables del restante 8%.
El mantenimiento del agua extracelular
depende básicamente de la concentración del Na+.
El organismo mantiene esta concentración por medio
de la hormona antidiurética. Cambios de hasta 2 meq
de sodio en sangre estimulan los receptores
osmolares y causan retención renal de agua cuando
aumenta y su eliminación cuando la osmolaridad
disminuye.
D.
Aminoácidos y proteínas
Al finalizar esta subunidad, el alumno conocerá las
características más importantes de los aminoácidos y
de las proteínas, así como sus funciones generales.
D.1
Aminoácidos.
D.1.1 Identificará en la fórmula de un
aminoácido los grupos funcionales
carboxilo y amino.
D.1.2 Relacionará las cadenas laterales de
los
aminoácidos
con
sus
propiedades y los clasificará en
grupos.
D.1.3 Reconocerá a los aminoácidos como
ácidos débiles e identificará los
valores de sus pKs y su punto
isoeléctrico.Usar
como modelos
glicina, fenilalanina, ácido aspártico,
lisina e histidina.
D.1.4 Identificará la carga eléctrica de los
amino-ácidos en soluciones de
diferentes valores de pH y su
movilidad en un campo eléctrico.
D.1.5 Conocerá las fórmulas de los
aminoácidos presentes en las
proteínas.
D.1.6 Conocerá las funciones generales
de los aminoácidos proteicos y no
proteicos en los seres vivos.
Realización de la práctica 3 "Titulación de un
aminoácido con una base. Determinación del pK1 y
pK2" (ver pág. 140).
D.2
Proteínas.
D.2.1 Identificará
los
productos
de
hidrólisis de las proteínas.
D.2.2 Clasificará a las proteínas con base
en su composición, función y
localización.
D.2.3 Conocerá las características más
importantes de la unión peptídica.
Describirá qué es un péptido y
mencionará
algunos
de
los
polipéptidos
importantes
en
medicina.
37
D.2.4
Describirá el estado nativo de las
proteínas y sus diferentes niveles de
organización: estructuras primaria,
secundaria, terciaria y cuaternaria y
mencionará las fuerzas que las
estabilizan. Describirá el proceso
general de la desnaturalización.
D.2.5 Relacionará la función de las
proteínas con su estructura:
Globulares
(albúmina
y
hemoglobina).
Fibrosas (colágena, miosina y
actina).
De reconocimiento (receptores de
insulina o complejo mayor de
histocompatibilidad).
De membrana (porina, ATPasa de
sodio/potasio).
D.2.6 Describirá los diferentes métodos de
purificación de las proteínas con
base
en
sus
propiedades:
ultracentrifugación, precipitación por
sales, electroforesis y cromatografía
por peso molecular, por intercambio
iónico y por afinidad.
D.2.7 Conocerá el propósito de estudiar las
proteínas plasmáticas en medicina.
Realización de la práctica 4 "Determinación de las
proteínas plasmáticas" (ver págs. 142).
Las proteínas están formadas por una o varias
cadenas polipeptídicas, cada una de las cuales está
constituida por 20 diferentes aminoácidos unidos por
enlaces tipo amida (enlaces peptídicos) en una
secuencia específica para cada proteína. La masa
molecular de una proteína varía desde cerca de 6
000 (>50 aminoácidos) hasta 1 000 000 Da o más.
(Da o Dalton es la unidad de masa atómica y es igual
a 1.6605655 X 10–27 kg).
Las proteínas pueden dividirse, según su
composición, en dos grupos principales: proteínas
simples y proteínas conjugadas. Las proteínas
simples están constituidas sólo por aminoácidos,
mientras que las proteínas conjugadas presentan,
además de los aminoácidos, otro componente, que
puede ser de diferente naturaleza química y en
ciertos casos es llamado grupo prostético. Algunos
ejemplos de proteínas conjugadas son las
glucoproteínas (contienen azúcares como grupo
prostético),
las
lipoproteínas
(contienen
triacilglicéridos, fosfolípidos y colesterol), las
nucleoproteínas (asociadas a ácidos nucleicos) y las
metaloproteínas (que pueden unir iones metálicos
como en el grupo hemo).
Los aminoácidos son compuestos alifáticos,
aromáticos o heterocíclicos que contienen por lo
menos un grupo amino y un grupo carboxilo. En los
aminoácidos biológicamente activos, el grupo amino
se encuentra en el átomo de carbono alfa con
respecto al grupo carboxilo. Este carbono alfa es un
carbono asimétrico (con excepción de la glicina)
porque presenta cuatro grupos funcionales
diferentes:el grupo amino, el grupo carboxilo, un
hidrógeno y una cadena lateral. Los aminoácidos
proteicos pueden clasificarse en función de las
cadenas laterales que presentan. Así, tenemos
aminoácidos no polares, aminoácidos polares sin
carga y aminoácidos polares con carga, la que puede
ser negativa o positiva a pH neutro. Todos los
aminoácidos (con excepción de la glicina) son
ópticamente activos y pertenecen a la serie L en los
organismos superiores. Los aminoácidos tienen por
lo menos dos grupos ionizables: el grupo alfa amino y
un carboxilo. Cada aminoácido en solución tiene un
pH característico en el que no se mueve en un
campo eléctrico, es decir, tiene un pH en el que se
presenta en forma de ion dipolo o zwitterion, donde
tanto el grupo alfa amino como el grupo carboxilo se
encuentran ionizados y, por lo tanto, tiene el mismo
número de cargas positivas y negativas (punto
isoeléctrico). Junto a los grupos ionizables
principales, algunos aminoácidos contienen otros
grupos que pueden ionizarse: grupos amino,
carboxilo, sulfhidrilo, hidroxilo o imidazol. A pH
fisiológico, estos grupos pueden estar ionizados y
confieren al aminoácido que los contiene cargas
positivas o negativas, según sea la naturaleza del
grupo ionizado. Las proteínas,
como los
aminoácidos, se encuentran cargadas en solución; la
magnitud de la carga depende del tipo de proteína y
del pH. Cada proteína posee un punto isoeléctrico
característico; a pH por arriba del punto isoeléctrico
38
presenta carga negativa, mientras que a pH por
abajo del punto isoeléctrico tiene carga positiva.
Organización estructural de las proteínas
La función de las proteínas sólo puede entenderse
en términos de la estructura de la proteína, es decir,
de las relaciones tridimensionales entre los átomos
que componen las proteínas. Se han descrito cuatro
niveles de organización:
1. La estructura primaria es la secuencia de
aminoácidos en la cadena polipeptídica unidos
mediante enlaces peptídicos.
2. La estructura secundaria es el arreglo espacial
local de los átomos del esqueleto de un polipéptido
sin considerar la conformación de sus cadenas
laterales. La estructura secundaria es mantenida
por puentes de hidrógeno entre el oxígeno y el
nitrógeno involucrados en los enlaces peptídicos
de aminoácidos. El enlace peptídico tiene una
estructura plana, rígida, que es consecuencia de
interacciones de resonancia (a) que le dan 40% de
carácter de doble enlace entre los átomos de C y
N (b), esta última estructura es la que le permite
establecer puentes de hidrógeno.
a)
b)
O
C
C
O
N
C
H
C
N+
H
Pauling y Corey determinaron que los grupos
peptídicos asumen una configuración trans, es
decir, los carbonos alfa sucesivos están en lados
opuestos del enlace peptídico que los une.
Pueden existir varios tipos de estructura
secundaria; entre ellos destacan dos: la alfa hélice,
en la que los aminoácidos de la cadena
polipeptídica se presentan formando una especie
de cilindro orientado a la derecha y la lámina beta
plegada, en la que los aminoácidos se acomodan
de manera paralela o antiparalela, uno respecto al
otro y se conectan entre sí por puentes de
hidrógeno.
3. La estructura terciaria se refiere al arreglo
tridimensional de un polipéptido y está determinada
por las estructuras primaria y secundaria. Se forma
espontáneamente y depende del tamaño, forma y
polaridad de los aminoácidos que forman la
proteína, los que interactúan entre sí y con el
medio en el que se encuentran. Esta estructura
puede estar estabilizada por enlaces de hidrógeno,
enlaces iónicos, interacciones hidrofóbicas, los
enlaces covalentes disulfuro, etcétera. Por ejemplo,
las cadenas peptídicas de las proteínas globulares
se organizan en una forma muy compacta en la
que los aminoácidos hidrofílicos se encuentran en
la superficie externa mientras que los residuos
hidrofóbicos permanecen enterrados en el interior
de la molécula.
4. La estructura cuaternaria es el arreglo espacial de
las diversas subunidades polipeptídicas que
componen algunas proteínas.
Desnaturalización
Se dice que una proteína se desnaturaliza cuando
pierde sus diversos niveles de organización
estructural. Algunos agentes que desnaturalizan las
proteínas son: el calor, los pH extremos, los rayos X,
la luz UV, o la agitación vigorosa. La
desnaturalización es causada por un colapso de la
estructura original con la ruptura de los enlaces de
hidrógeno, de los enlaces iónicos y de las
interacciones hidrofóbicas, sin cambios en la
estructura primaria. La desnaturalización va
acompañada de la disminución de la solubilidad,
cambios en la rotación óptica, pérdida de la función
biológica y una mayor susceptibilidad al ataque de
las enzimas digestivas. En algunos casos, al eliminar
los agentes que causan la desnaturalización, la
proteína recupera su conformación original; a este
fenómeno se le conoce como renaturalización.
Una mezcla de proteínas puede separarse a
partir de las diferentes movilidades en un campo
eléctrico (electroforesis), por cromatografía de
distintos tipos o por su diferente solubilidad.
Clasificación de las proteínas
Las proteínas pueden ser clasificadas en función de
aspectos tan diversos como su composición, su
39
disposición espacial, su función biológica y su
localización.
Atendiendo a su composición la proteínas pueden
ser:
• Simples: aquellas compuestas únicamente de
aminoácidos.
• Conjugadas: cuando además de aminoácidos
poseen un componente no proteico, el que puede ser
de origen orgánico o inorgánico y que se denomina
grupo
prostético.
Algunos
ejemplos
son:
nucleoproteínas, formadas por la asociación de la
cadena polipeptídica con ácidos nucleicos; las
glucoproteínas,
cuyo
grupo
prostético
son
carbohidratos; las fosfoproteínas, asociadas con
fósforo o como las metaloproteínas, cuando un ión
metálico está enlazado directamente a la proteína,
entre otras.
Con base en su disposición espacial, las proteínas
pueden clasificarse en globulares y fibrosas. Las
proteínas globulares son de forma esférica y solubles
en agua. La mayor parte de las enzimas, hormonas y
anticuerpos tienen estructura globular.
Las proteínas formadas por cadenas polipeptídicas
dispuestas paralelamente a un eje, reciben el nombre
de proteínas fibrosas, como la colágena y la fibrina.
Estas proteínas son de forma alargada, baja
solubilidad en agua y resistentes a la tracción.
Clasificación de las proteínas de acuerdo a su
función. Las proteínas desempeñan una amplia
variedad de funciones muy importantes en el
organismo. La lista siguiente, aunque no es
exhaustiva, da una idea de la diversidad de las
funciones biológicas en las cuales se sabe que
intervienen las proteínas:
•Catalítica: las enzimas catalizan casi todas las
reacciones que se efectúan en los organismos vivos.
•Estructural: las proteínas proporcionan a las
células forma y soporte mecánico (como la colágena
y las proteínas contráctiles).
•Reguladora: algunas proteínas son hormonas o
sirven como receptores de las hormonas (insulina y
glucagón).
•Protectora: por ejemplo las inmunoglobulinas que
defienden al organismo contra las infecciones virales
y bacterianas.
•Transporte: las proteínas se pueden unir a otras
moléculas a fin de transportarlas en el organismo
(albúmina, transferrina).
•Trabajo mecánico: por ejemplo la contracción de
los músculos, el movimiento de los flagelos y la
separación de cromosomas en la mitosis (miosina y
actina).
Entre las funciones que son comunes a todas las
proteínas encontramos:
•Capacidad amortiguadora: debido a que las
proteínas son compuestos anfóteros y poseen
muchos grupos ionizables (con valores diferentes de
pK), funcionan como amortiguadores para reducir al
mínimo cambios súbitos en el pH.
•Energética: liberan 4 kcal/g de proteína oxidada
hasta CO2 y H2O. Los aminoácidos pueden ser
desaminados para formar cetoácidos, los cuales
pueden movilizarse para producir energía calórica o
transformarse en carbohidratos y lípidos.
•Participan en el mantenimiento del equilibrio
osmótico entre los diferentes compartimentos del
organismo. Las proteínas, por ser grandes moléculas
coloidales, no son difusibles, esto es, no pueden
atravesar las membranas y ejercen una presión
osmótica coloidal, la cual sirve para mantener un
volumen normal de sangre y un contenido normal de
agua en el líquido intersticial y los tejidos.
•Fuente de nutrición para los tejidos (sobre todo, la
albúmina): por constituir una fuente de los
aminoácidos indispensables para el organismo, las
proteínas son una forma de almacenamiento de
aminoácidos.
Por último, en función de su localización, las
proteínas pueden clasificarse en:
•Hísticas o tisulares: son las proteínas de los
tejidos.
•Plasmáticas o hemáticas: son las proteínas de la
sangre.
Las proteínas de la sangre (la hemoglobina en los
eritrocitos y las proteínas plasmáticas), por su gran
40
E.2.4 Conocerá las estrategias de control
de la actividad de las enzimas: disponibilidad
de
sustrato,
modificación
covalente,
alosterismo,
retroalimentación
y
concentración de la enzima.
E.2.5 Describirá la
acción
de
los
inhibidores
competitivos
y
no
competitivos y de los moduladores
alostéricos sobre la actividad de las
enzimas.
E.2.6 Conocerá el efecto del pH y de la
temperatura sobre la actividad
enzimática.
accesibilidad, son muy utilizadas en el laboratorio
clínico.
E.
Enzimas y coenzimas
Al finalizar esta subunidad, el alumno conocerá qué
es una enzima y cómo actúa; podrá calcular sus
principales parámetros cinéticos y el efecto de
algunas moléculas que modifican su acción y
describirá ciertas aplicaciones médicas de las
enzimas.
E.1
Características de un sistema enzimático.
E.1.1 Conocerá qué son las enzimas y su
clasificación de acuerdo con su
función.
E.1.2 Identificará los componentes de un
sistema enzimático y mencionará las
coenzimas
y
cofactores
que
participan.
E.1.3 Analizará el papel de vitaminas
hidrosolubles como precursores de
las coenzimas e identificará al
magnesio, al manganeso y al fierro
como ejemplos de cofactores
metálicos.
E.1.4 Definirá los conceptos de zimógeno
e isoenzima.
E.1.5 Conocerá el modo de acción de las
enzimas y en qué consiste su
especificidad.
E.2
Cinética enzimática.
E.2.1 Analizará una reacción enzimática
para identificar al sustrato, al
complejo enzima-sustrato y al
producto.
E.2.2 Definirá lo que es la velocidad de
una reacción enzimática y conocerá
cómo se calcula su constante de
equilibrio; mencionará el significado
de dicha constante.
E.2.3 Analizará
las
ecuaciones
de
Michaelis Menten y de LineweaverBurk; describirá sus usos e
identificará el significado de los
valores de Vmáx y de Km.
E.3
Aspectos médicos de la enzimología.
E.3.1
Conocerá que el uso de la
determinación de la actividad de
algunas enzimas en el diagnóstico
contribuye al seguimiento de ciertas
enfermedades
(transaminasas,
lactato deshidrogenasa, creatina
cinasa, fosfatasas y amilasa).
E.3.2 Describirá la etiología de algunos
padecimientos
congénitos
del
metabolismo
y
la
actividad
enzimática empleada para su
diagnóstico
(fenilcetonuria,
albinismo,
anemia
hemolítica,
glucogenosis).
E.3.3 Describirá el uso de ciertas enzimas
como reactivos de laboratorio en la
cuantificación de algunos metabolitos
(determinación de glucosa, de
colesterol y de ácido úrico).
Realización de la práctica 5 "Cinética enzimática.
Efecto de la concentración de sustrato sobre la
velocidad de una reacción enzimática" (ver pág.148).
Las enzimas son proteínas especializadas de
actividad catalítica. Algunas de ellas están formadas
únicamente de aminoácidos mientras que otras
presentan algún otro componente de naturaleza no
aminoácida. La parte proteica se denomina
apoenzima, mientras que la parte no proteica se
denomina coenzima; cuando se encuentran aisladas,
41
ambas son no funcionales, pero juntas forman una
proteína funcional denominada holoenzima.
Las coenzimas funcionan a menudo en la
transferencia de electrones o de grupos funcionales.
Generalmente son derivados de vitaminas, las cuales
no pueden ser sintetizadas en las células de los
organismos superiores, por lo que deben ser
adquiridas en la dieta.
Las enzimas presentan algunas características que
las diferencian de los catalizadores químicos, como:
1. Mayor velocidad de reacción, ya que las
reacciones catalizadas enzimáticamente alcanzan
velocidades de reacción de 106 a 1 012 veces
mayores que las reacciones no catalizadas y de
varios órdenes de magnitud mayor que las
catalizadas químicamente.
2 .Condiciones de reacción más suaves, ya que
trabajan a temperaturas relativamente bajas, a
presión atmosférica y en condiciones de pH neutro.
3. Mayor especificidad de reacción, ya que presentan
una gran selectividad por la identidad de los grupos
químicos de sus sustratos y productos, de tal
manera que rara vez se obtienen productos
colaterales o secundarios.
4. Capacidad de regulación, es decir, que sus
actividades varían de acuerdo con la concentración
de otras moléculas diferentes de sus sustratos. Los
mecanismos de regulación incluyen la inhibición,
control alostérico, modificación covalente de la
enzima y variación en la cantidad de enzima
sintetizada.
Las enzimas aceleran las reacciones biológicas al
disminuir la energía de activación de una reacción
dada sin alterar su equilibrio. Su mecanismo de
acción consiste en la formación de un complejo entre
la enzima y el sustrato (ES), el cual realiza la
reacción química adecuada y permite la recuperación
de la enzima original en el momento en que el
complejo enzima-producto se rompe para liberar al
producto.
El sustrato se une a la enzima en el sitio activo, el
cual consiste en un arreglo espacial de algunos
aminoácidos de la proteína donde se encuentran
generalmente el grupo prostético o la coenzima y que
tienen la capacidad de interactuar con el sustrato.
Hay algunas enzimas que se sintetizan directamente
en su forma activa, otras se sintetizan en forma de
proenzimas inactivas o zimógenos y deben ser
activadas por procesos especiales para llegar a ser
funcionales. Algunas otras enzimas presentan sitios
diferentes del sitio activo donde se asocian moléculas
que modulan su actividad. Estas enzimas se conocen
como enzimas alostéricas y el sitio donde interactúan
con el modulador se llama sitio alostérico.
La velocidad de las reacciones enzimáticas
depende de:
a) La concentración y la actividad de la enzima.
La velocidad de las reacciones enzimáticas se
ve modificada por la cantidad de enzima y por
su capacidad de interactuar con su sustrato.
Una enzima puede atacar, dado que interactúa
con su sustrato, por un reconocimiento
espacial, tridimensional o estereoespecífico. Si
la especificidad es absoluta, la enzima puede
actuar sobre un único compuesto, mientras
que, si es relativa, puede usar como sustrato
varios
compuestos
relacionados.
La
estereoespecificidad indica que una enzima
acepta sólo un cierto estereoisómero (L ó D).
Un sustrato puede ser transformado por una o
varias reacciones teóricamente posibles
catalizadas por diferentes enzimas. Esto es
importante en algunos procesos de control
metabólico.
Las unidades con que se mide la velocidad de
una enzima se determinan como unidades
internacionales (UI). Una UI es la cantidad de
enzima en miligramos que convierte un
micromol de sustrato por minuto, en katales
(kat), que es la cantidad de enzima que
convierte un mol de sustrato por segundo. La
actividad específica de una enzima se expresa
en unidades por mg de proteína.
b) La concentración del sustrato. A bajas
concentraciones de sustrato la reacción
enzimática sigue una cinética de primer orden,
es decir, la velocidad de la reacción es
proporcional a la concentración del sustrato. A
altas concentraciones de sustrato, la reacción
es de orden cero, es decir, la enzima está
saturada por su sustrato y, por lo tanto, se
encuentra en su velocidad máxima. Cada
42
enzima tiene su característica constante de
Michaelis o Km, que define la concentración de
sustrato a la que la reacción enzimática
alcanza la mitad de la velocidad máxima.
c) El pH y la composición de la solución en que se
lleve a cabo la reacción. Toda reacción
catalizada enzimáticamente tiene su pH óptimo.
d)
La temperatura. Toda reacción catalizada
enzimáticamente tiene una temperatura óptima.
e)
La presencia de activadores e inhibidores. La
actividad enzimática puede ser modificada
positiva
o
negativamente
por
algunos
compuestos. Los activadores aumentan la
reacción enzimática propiciando la formación de
un sitio activo funcional y a menudo son iones
metálicos como Mg2+, Zn2+, etcétera. La
activación de las enzimas alostéricas que están
compuestas por subunidades es de gran
importancia en el control de los sistemas
multienzimáticos y se realiza generalmente por
varias moléculas orgánicas.
Los inhibidores enzimáticos pueden ser de varios
tipos; los más importantes son los competitivos y los
no competitivos. Los inhibidores competitivos
interactúan con el sitio activo de la enzima y se
parecen al sustrato en su estructura, por lo que
compiten con él para unirse al sitio activo. En
general, se remueven con un exceso de sustrato.
Los inhibidores no competitivos reaccionan con
otra estructura importante de la molécula.enzimática.
La inhibición puede ser reversible o irreversible en el
caso de que el inhibidor realice un cambio
permanente de un grupo funcional de la enzima. El
efecto de un inhibidor no competitivo no puede
revertirse por un exceso de sustrato.
El comportamiento cinético de las enzimas, así
como el efecto de los diferentes tipos de moléculas
sobre la actividad enzimática, puede ser estudiado
mediante diversas técnicas cinéticas y gráficas. Así,
al graficar la velocidad de la reacción enzimática
contra la concentración de sustrato se obtiene una
hipérbola
rectangular
(fig.
II.1),
descrita
matemáticamente por la ecuación de MichaelisMenten. Las enzimas alostéricas presentan un
comportamiento sigmoidal y los moduladores
positivos desplazan la curva hacia la izquierda,
mientras que los moduladores negativos hacen más
pronunciado el efecto sigmoidal (fig. II.2).
Otra manera de estudiar el comportamiento
cinético de las enzimas, es graficar la inversa de la
velocidad inicial contra la inversa de la concentración
de sustrato, lo que genera una línea recta, descrita
matemáticamente por la ecuación de LineweaverBurk. En la figura II.3 se observa este
comportamiento lineal de la enzima con y sin
inhibidores.
43
In vivo, la mayoría de las enzimas se organiza en
sistemas multienzimáticos, los cuales se unen a
estructuras celulares o están libres en diversos
compartimientos celulares y son una forma de hacer
más eficiente la acción de las enzimas involucradas
en una vía, así como su regulación.
Las enzimas pueden clasificarse en seis grandes
grupos según el tipo de reacción que llevan a cabo:
OXIDORREDUCTASAS.
Transfieren
electrones
o
hidrógenos.
TRANSFERASAS. Transfieren
entre dos moléculas.
grupos
funcionales
HIDROLASAS. Realizan reacciones de ruptura de
enlaces con entrada de la molécula de agua.
LIASAS. Realizan reacciones de adición a dobles
enlaces y ruptura no hidrolítica del sustrato.
ISOMERASAS.
Realizan
interconversiones
de
isómeros.
LIGASAS. Realizan reacciones de formación de
enlaces con gasto de ATP.
44
CONTENIDO TEMÁTICO
Segunda Unidad Temática
METABOLISMO
45
III
METABOLISMO Y. BIOENERGÉTICA
Al finalizar esta unidad, el alumno conocerá en forma integral las rutas metabólicas de las diversas
moléculas biológicas en las células y las alteraciones que aparecen asociadas a su disfunción en algunas
enfermedades. La unidad se compone de:
A.
B.
C.
D.
E.
F.
G.
H.
A.
Fundamentos del metabolismo celular.
Carbohidratos.
Metabolismo energético.
Otras vías metabólicas de los carbohidratos.
Lípidos.
Metabolismo de los lípidos.
Metabolismo de los compuestos nitrogenados.
Regulación e integración metabólica.
Fundamentos del metabolismo celular
en nutrimientos y las vías metabólicas a las
que entran para satisfacer las demandas de
energía y mantenimiento de los tejidos
(homeostasis) con base en el esquema
general del metabolismo
Al finalizar esta unidad, el alumno conocerá los
principios generales del metabolismo intermediario
de una célula normal.
A.1
Conocerá las
metabolismo.
funciones
generales
del
A.2
Definirá los conceptos de vía metabólica,
complejo multienzimático y encrucijada
metabólica.
A.3
En un esquema general del metabolismo
identificará, con base en sus características,
las vías anabólicas, catabólicas y anfibólicas.
A.4
Describirá el papel central del piruvato, la
+
acetil CoA, el par NAD(P) /NAD(P)H y el
ciclo del ATP en el metabolismo
intermediario. Definirá los conceptos de
fosforilación oxidativa y fosforilación a nivel
de sustrato.
A.5
Conocerá la transformación de los diferentes
componentes de la dieta
A.6
Conocerá los diferentes niveles de regulación
del metabolismo: síntesis de enzimas
(inducción-represión), compartimentalización,
actividad enzimática (activación, inhibición y
enzimas alostéricas).
El metabolismo puede definirse como el conjunto de
todas las reacciones químicas que ocurren en el
organismo. Los organismos se caracterizan por
poseer miles de reacciones catalizadas por enzimas,
constituyendo las vías metabólicas. El objetivo del
metabolismo es mantener las funciones vitales del
organismo tales como el trabajo mecánico, el
transporte activo de moléculas contra gradientes de
concentración y la biosíntesis de moléculas
complejas, entre otras.
Las rutas o vías metabólicas son secuencias
de reacciones en donde un precursor o sustrato se
convierte en un producto final a través de una serie
de
intermediarios
metabólicos.
El
término
46
metabolismo intermediario se aplica a las actividades
combinadas de todas las vías
metabólicas
que
interconvierten
sustratos,
metabolitos y productos. Por ejemplo, la secuencia
consecutiva de A —> B —> C —> D —> E tiene el
mismo efecto neto que
A —> E.
Toda esta actividad celular muy coordinada y
dirigida tiene como objetivo el que los sistemas
multienzimáticos cooperen para cumplir cuatro
funciones básicas:
1. Obtener energía química a partir de la energía
solar en los organismos fotótrofos o de la energía
contenida en los nutrientes obtenidos del ambiente
en los organismos quimiótrofos.
2. Convertir las moléculas nutrientes en las
moléculas características de la propia célula,
incluidos los precursores macromoleculares.
3. Transformar los precursores monoméricos en
polímeros (proteínas, ácidos nucleicos, lípidos,
polisacáridos y otros componentes celulares).
4. Sintetizar y degradar las biomoléculas requeridas
en las funciones celulares especializadas.
El metabolismo
anabolismo
se
divide
en
catabolismo
y
El catabolismo, del griego katá, "abajo" es la fase
degradativa del metabolismo en la que nutrientes
orgánicos como carbohidratos, lípidos y proteínas se
convierten en productos más pequeños y sencillos
(H2O, CO2, NH3). Las rutas catabólicas generan
transportadores electrónicos reducidos (NADH,
FADH2 y NADPH) y liberan energía, parte de la cual
se conserva en la molécula del ATP.
En el anabolismo, del griego aná, "arriba",
también llamado biosíntesis, los precursores
pequeños y sencillos se transforman en moléculas
más grandes y complejas propias de cada célula
(polisacáridos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos).
Las reacciones anabólicas requieren un aporte
energético, que proviene generalmente de la
hidrólisis del ATP y del poder reductor del NAD(P)H.
En el siguiente cuadro aparece el resumen
de las características de estos dos tipos de procesos.
Catabolismo
Anabolismo
Biodegradativa.
Biosintética.
Oxidativa.
Reductora.
Generador de energía.
Consumidor de energía.
Variedad de materiales
iniciales, pero productos
finales bien definidos
(convergente)
Materiales iniciales bien
definidos y variedad en
los productos
(divergente)
Dentro de la gran complejidad del
metabolismo es posible distinguir algunos puntos de
convergencia:
1. La mayoría de las vías metabólicas son
irreversibles y exergónicas.
2. Cada vía tiene una etapa obligada. Generalmente,
al principio de cada vía existe una reacción
exergónica irreversible que permite que el
intermediario que produce continúe a lo largo de la
vía.
3. Todas las vías metabólicas están reguladas. La
regulación tiene el objeto de ejercer un control
enzimático sobre el flujo de metabolitos a través de
una vía metabólica. En toda vía existe una reacción
enzimática que funciona tan lentamente que impide
que sus sustratos y productos se equilibren. Dado
que la mayoría de las otras enzimas funcionan
próximas al equilibrio, esta reacción enzimática es
la que determina la velocidad de la vía, y por lo
tanto, su regulación. Esta es la forma más eficaz
de ejercer el control porque evita la síntesis
innecesaria de metabolitos de la vía.
Una manera de controlar la actividad de la
enzima limitante es regulando su actividad catalítica,
mediante interacciones alostéricas (como en la
inhibición por producto) o por modificaciones
covalentes. Otra manera sería controlando la
velocidad de la síntesis de enzimas particulares.
47
condroitin
sulfato,
glicosaminoglucanos,
peptidoglicanos). Reconocerá los
carbohidratos como componentes de
las
glicoproteínas
y
de
los
glicolípidos y conocerá su función
como receptores y moléculas de
reconocimiento.
El hecho de que las vías de síntesis y
degradación de moléculas sean diferentes,
contribuye también a la regulación metabólica.
4.
En
las
células
eucarióticas,
la
compartimentalización permite la localización
específica de las vías metabólicas y su control.
B. Carbohidratos
B.2
Al finalizar esta subunidad, el alumno explicará la
estructura química de los carbohidratos, sus fuentes,
su digestión, su absorción y la función que
desempeñan en la célula.
B.1
Estructura.
B.1.1 Definirá qué son los carbohidratos y
cuál es su importancia biológica.
B.1.2 Conocerá la clasificación de los
carbohidratos con base en el número
de unidades sacáridas que los
componen (mono, di, tri, oligo y
polisacáridos) y con base en su
composición
(homo
y
heteropolisacáridos).
B.1.3 Conocerá la estructura química de
los monosacáridos con base en su
grupo carbonilo, en su estructura
lineal o cíclica y en el número de
átomos de carbono. Señalará las
siguientes
características
fisicoquímicas:
solubilidad
y
propiedades ópticas. Definirá el
concepto de carbono asimétrico y los
diferentes tipos de isómeros ópticos:
epímero, enantiómero y anómero.
B.1.4 Describirá la estructura de los
carbohidratos
de
importancia
fisiológica: ribosa, glucosa, fructosa,
manosa,
galactosa,
sacarosa,
lactosa, maltosa, almidón, glucógeno
y celulosa.
B.1.5 Describirá
la
estructura
y
características de los principales
heteropolisacáridos
(quitina,
heparina, sulfato de dermatan,
Digestión y absorción.
B.2.1 Señalará las fuentes dietéticas de los
carbohidratos y el papel de la celulosa
en la dieta de los mamíferos.
B.2.2 Conocerá el proceso de la digestión y
la absorción de los carbohidratos de la
dieta.
B.2.3 Conocerá
los
cinco
principales
transportadores de glucosa (GLUT 1 a
GLUT 5) y su distribución en los
diferentes tejidos.
Realización de la práctica 6 "Efecto de la insulina
sobre la glucemia de la rata" (ver pág.152).
Lecturas recomendadas
1.
Díaz HD, Burgos HLC. ¿Cómo se
transporta la glucosa a través de la
membrana celular? IATREA. 2002; 15 (3):
179-189.
2.
Maeder T. Sweet Medicine. Scientific
American. 2002; 287(1): 24-31.
Los carbohidratos, o sacáridos, son las biomoléculas
más abundantes en la naturaleza y son
indispensables en los organismos vivos. Se les llama
carbohidratos debido a que su estructura química
semeja formas hidratadas del carbono y se
representan con la fórmula (CH2O)n; químicamente
se definen como derivados aldehídicos y cetónicos
de alcoholes polivalentes y no puede haber menos
de 3C para constituir un carbohidrato.
48
Transportador
Distribuidor
Propiedades
GLUT 1
Eritrocitos,
Ingreso
barrera
de glucosa.
hematoencefáli
Km 1.6 mM.
basal
ca,
placenta,
retina,
riñón y cerebro.
GLUT 2
Hígado,
Transportador
páncreas
de
e
galactosa
intestino
delgado
glucosa,
y
fructosa.
Sensor
de
glucosa
en
páncreas.
Km de 15 mM o
más.
GLUT 3
Cerebro,
placenta,
hígado, riñón
y corazón.
Ingreso basal
de glucosa.
KM 2 mM.
Transportador
de glucosa y
galactosa.
GLUT 4
Tejido
adiposo,
corazón
y
músculo
esquelético.
Yeyuno,
espermatozoi
des,
riñón,
cerebro.
Dependiente
de insulina.
Km de 5 mM.
GLUT 5
Transportador
de
fructosa.
Se clasifican según el número de unidades
sacáridas en monosacáridos y polisacáridos. Los
monosacáridos, según el número de carbonos en su
molécula, se dividen en triosas (3C), tetrosas (4C),
pentosas (5C), hexosas (6C), heptosas (7C),
etcétera. Según su función carbonilo pueden ser
aldosas o cetosas, por ejemplo, la glucosa es una
aldohexosa y la fructosa una cetohexosa. Los
polisacáridos son carbohidratos que resultan de la
unión de varias moléculas de monosacáridos. Este
grupo se puede clasificar en disacáridos, con dos
unidades monosacáridas, como la sacarosa, la
maltosa, la lactosa y la celobiosa; oligosacáridos, con
3 a 10 unidades de monosacárido y polisacáridos,
con más de 10 unidades de monosacárido, que
tienen alto peso molecular, como el almidón, el
glucógeno y la celulosa.
Los carbohidratos provienen de la dieta; se
encuentran en los cereales (maíz, trigo y arroz),
hortalizas (bulbos, raíces, verduras), legumbres (frijol,
garbanzo, lenteja), tubérculos (papa, yuca), frutas,
leche y productos lácteos, así como en algunos
productos procesados como dulces, jaleas,
mermeladas y pastas. Los carbohidratos son los
componentes más abundantes de la dieta del
humano, aportan aproximadamente el 55% de las
calorías de la dieta.
Los carbohidratos tienen diversas funciones
en el organismo son: a) La fuente principal de
energía (1 g de carbohidrato produce 4 Cal); b)
Precursores en la bio-síntesis de ácidos grasos y
algunos aminoácidos; c) Constituyentes de moléculas
complejas
importantes
como
glucolípidos,
glucoproteínas, ácidos nucleicos y nucleótidos.
Estructura de los monosacáridos
Los alcoholes y los aldehídos o cetonas pueden
reaccionar entre sí para producir hemiacetales y
hemicetales. Cuando existen estos grupos hidroxilo y
carbonilo en una misma molécula provocan que la
molécula se ciclice. La naturaleza del ciclo depende
de la posición del grupo hidroxilo que participa. Si el
compuesto es una aldosa y tiene 5 carbonos será el
C 4 el que reaccione y el anillo formado es un furano.
De la misma manera, si el compuesto tiene 6
carbonos, será el C 5 el que reaccione y se formará
un anillo de pirano. La transferencia de un protón del
grupo hidroxilo al oxígeno del carbonilo ocasiona un
nuevo carbón asimétrico. La posición del hidroxilo en
este carbono determina dos formas isoméricas alfa o
beta que, en solución, guardan un equilibrio con la
forma lineal (forma carbonilo).
Glucósidos
Son los compuestos resultantes de la unión
covalente de azúcares con varias moléculas. Se
49
clasifican en homoglucósidos, si se unen
exclusivamente carbohidratos (osas) mediante
enlaces glucosídicos, y en heteroglucósidos, si
forman enlaces con otro tipo de moléculas como
proteínas o lípidos. Los homoglucósidos pueden
clasificarse según el número de unidades en:
disacáridos, oligosacáridos y polisacáridos. Los
polisacáridos, también llamados poliósidos, pueden
clasificarse en homopolisacáridos, que pueden ser de
reserva, como el almidón, el glucógeno, la inulina, o
estructurales, como la celulosa, la lignina y la quitina,
y en heteropolisacáridos, que pueden dividirse en no
nitrogenados, como las pectinas, el agar y la goma
arábiga,
o
nitrogenados,
como
los
glucosaminoglucanos.
Muchos de los alimentos que se ingieren a
diario contienen almidón y glucógeno que son
polisacáridos de reserva. El almidón forma gránulos
en las células de las plantas y el glucógeno se
encuentra en el citoplasma de las células musculares
y hepáticas de los animales. El azúcar que constituye
la unidad estructural de estas moléculas es la
glucosa, la cual se encuentra formando dos tipos de
enlaces: los enlaces 1
4 se encuentran en la
amilosa (formada por unidades de maltosa) y el
enlace 1
6 conecta a la estructura llamada
amilopectina. La estructura del glucógeno es similar a
la del almidón, pero con una mayor cantidad de
ramificaciones. El almidón está compuesto por 3 000
residuos de glucosa y tiene un peso molecular
cercano a 5 X 105; el glucógeno tiene un peso
molecular de 1 a 4 X 106. La degradación de estos
polisacáridos es diferente si se realiza en el aparato
digestivo o en el interior de las células; es hidrolítico
en el primer caso y fosforolítico en las células.
Durante la digestión, la amilosa es
hidrolizada por una alfa amilasa, la cual rompe los
enlaces 1
; 4. Los productos primarios son
oligosacáridos con 6 a 7 residuos; los últimos
productos son una mezcla de maltosa y glucosa. En
la cadena de amilopectina, la alfa amilasa rompe los
enlaces 1
4, pero no los 1
6; éstos son
hidrolizados por una 1
6 glucosidasa. El
resultado de la acción de las dos enzimas es la
hidrólisis de la amilopectina hasta glucosa y maltosa.
Existe también otra enzima llamada maltasa
(alfa amilasa), que hidroliza los enlaces 1
4
glucosídicos de la malto-sa; la acción de esta enzima
facilita la formación de la dextrina límite. Esta
partícula está constituida por moléculas de
amilopectina que tienen una gran cantidad de
ramificaciones. Las dextrinas límite son degradadas
por la 1
6 glucosidasa y se obtiene una mezcla
de glucosa y maltosa.
Los productos de la digestión de los
carbohidratos se absorben en el intestino a través de
GLUT2 y GLUT5 o por cotransporte con sodio y
pasan a la circulación portal.
C. Metabolismo energético
Al finalizar esta subunidad, el alumno conocerá las
vías involucradas directamente en la generación de
la energía de la célula.
C.1
Glucólisis.
C.1.1 Describirá las reacciones de la vía
glucolítica, indicando las reacciones
irreversibles y aquellas que generan
NADH o ATP por fosforilación a nivel
de sustrato.
C.1.2 Señalará los productos de la vía y su
destino en presencia y en ausencia
de oxígeno; discutirá la importancia
fisiológica de la formación de lactato.
C.1.3 Conocerá el balance energético y la
regulación de la vía glucolítica; hará
énfasis en el papel de las siguientes
moléculas: ATP, ADP, AMP, fructosa
2,6-bisfosfato, alanina y citrato.
C.1.4 Señalará la importancia de la
glucólisis en los eritrocitos, en las
células musculares, en las células
nerviosas y en los hepatocitos.
Las células de los organismos heterótrofos obtienen
su energía de reacciones oxidativas en las cuales los
electrones de un sustrato donador se transfieren a un
aceptor.
Bajo
condiciones
anaeróbicas,
un
compuesto orgánico sirve como aceptor de
50
electrones; bajo condiciones aeróbicas, el oxígeno es
el aceptor final.
Los sustratos preferidos por la célula para
obtener la energía requerida para sus funciones
vitales
son
los
azúcares
(mono,
di
y
homopolisacáridos). Asimismo, las células son
capaces de usarlos también como intermediarios
para la formación de otros compuestos importantes
en biología.
La glucólisis es la vía metabólica por la que
se degrada la glucosa; filogenéticamente, es la vía
más antigua y consiste en una secuencia de
reacciones enzimáticas en las cuales se degrada la
glucosa. La glucólisis puede dividirse en dos fases:
una de activación y una oxidativa. La fase de
activación consiste en la transferencia de fosfatos a
la glucosa con gasto de dos ATP y en su ruptura en
dos moléculas de gliceraldehído 3 fosfato; en la fase
oxidativa, el gliceraldehído 3 fosfato es transformado
en piruvato con la obtención de cuatro moléculas de
ATP por fosforilación a nivel de sustrato.
Las reacciones de la glucólisis ocurren en el
citoplasma y no están ligadas a estructuras celulares.
El producto de la vía es el piruvato, el cual
puede seguir diversos destinos según las
condiciones de la célula. En condiciones
anaeróbicas, el piruvato se transforma en lactato por
acción de la lactato deshidrogenasa en presencia del
NADH + H+ obtenido en la oxidación del
gliceraldehído 3 fosfato. En las levaduras, el piruvato
se descarboxila a acetaldehído y se forma etanol por
la reducción del acetaldehído con el NADH mediante
la acción de la deshidrogenasa alcohólica. Bajo
condiciones aerobias, el piruvato se descarboxila en
las mitocondrias y produce NADH y acetil CoA, la
cual es el sustrato principal del ciclo de Krebs.
Sólo una pequeña parte de la energía
almacenada en la molécula de la glucosa se libera en
la glucólisis (2 ATP netos por cada molécula de
glucosa). En estricta anaerobiosis, la glucólisis es la
única fuente de energía de la célula.
La regulación de la vía glucolítica se realiza a
nivel de la transformación de la fructosa 6 fosfato en
fructosa 1,6 bisfosfato. Esta reacción es catalizada
por la fosfofructocinasa I, la que es una enzima
alostérica cuya actividad se estimula por AMP, ADP y
fructosa 2,6 bisfosfato y se inhibe por ATP y citrato.
La deshidrogenasa de gliceraldehído 3 fosfato
también desempeña un papel importante en la
regulación de la glucólisis.
C.2
Papel de la mitocondria en las funciones
oxidativas.
C.2.1 Conocerá la biogénesis de la
mitocondria.
C.2.2 Señalará la estructura de la
mitocondria
y
describirá
las
características
de
su
matriz,
membrana
externa,
membrana
interna y espacio intermembranal;
hará énfasis en su papel en la
transducción de energía.
C.2.3 Reconocerá que en la mitocondria se
realizan, entre otras, las siguientes
vías: síntesis de algunas proteínas,
descarboxilación del piruvato, ßoxidación, ciclo de Krebs, cadena de
transporte
de
electrones
y
fosforilación oxidativa.
La respiración celular es una secuencia de
reacciones de óxidorreducción de la que los
organismos
obtienen
energía
para
formar
compuestos como el ATP. La base molecular de este
proceso es una oxidación, paso a paso, de los
compuestos orgánicos hasta CO2 y la transferencia
de hidrógeno (protones más electrones) al oxígeno
con la formación de una molécula de agua. La
energía obtenida por la respiración celular es, por
tanto, una parte de la energía liberada en la reacción
del hidrógeno con el oxígeno. Todos estos procesos
se realizan en las mitocondrias de los organismos
eucariotos y en las membranas plasmáticas de los
organismos procariotos.
Las
mitocondrias
son
orgánulos
relativamente autónomos cuya estructura está
adaptada a su función principal, es decir, a la
conversión de la energía de oxidación en aquella de
los compuestos de reserva con un alto contenido
energético. Una mitocondria está constituida por dos
membranas separadas: una membrana externa lisa y
muy permeable y una membrana interna con
51
plegamientos irregulares (crestas) y selectivamente
permeable. El interior de la mitocondria está
constituido por la matriz. Cada compartimiento tiene
un contenido característico de enzimas y moléculas
de acuerdo con los procesos que se realizan en ellos.
La cadena de transporte de electrones (cadena
respiratoria) y la generación de enlaces de alta
energía asociada a esta transferencia de electrones
tiene lugar en la membrana interna. La mitocondria
contiene además un DNA circular específico y todos
los componentes necesarios para la síntesis de
proteínas, lo que podría indicar que el origen de la
mitocondria pudo ser una bacteria que estableció una
simbiosis con una célula eucariótica a la que infectó.
C.3
Descarboxilación del piruvato.
C.3.1 Conocerá las reacciones de la
descarboxilación
oxidativa
del
piruvato e indicará sus productos y el
destino de los mismos.
C.3.2 Analizará el carácter irreversible de
la descarboxilación del piruvato y su
regulación
por
producto,
por
alosterismo y por modificación
covalente.
En los organismos aeróbicos el piruvato, producto de
la glucólisis, entra a la mitocondria para ser oxidado a
acetil CoA y CO2. Este proceso oxidativo irreversible
es realizado por la piruvato deshidrogenasa, un
complejo de tres enzimas y cinco diferentes
coenzimas o grupos prostéticos: pirofosfato de
tiamina (TPP), lipoato, flavin adenin dinucleótido
(FAD), CoA y nicotin adenin dinucleótido (NAD).
En la primera reacción se forma CO2 y un
grupo -hidroxietilo derivado del piruvato, el cual se
une covalentemente al TPP de la piruvato
deshidrogenasa (E1). En el siguiente paso el grupo
-hidroxietilo es oxidado a acetato y se transfiere al
lipoato unido covalentemente a la dihidrolipoil
transacetilasa (E2). El TPP se regenera en este
paso.
La siguiente reacción consiste en transferir el
grupo acetato del lipoato a la CoA para formar acetil
CoA. El lipoato permanece reducido. Los siguientes
pasos tienen como finalidad regenerar la forma
oxidada de este lipoato. Para ello, el FAD unido a la
dihidrolipoil deshidrogenasa (E3) remueve los
+
electrones del lipoato y los entrega al NAD
+.
reduciéndolo a NADH + H
La actividad del complejo de la piruvato
deshidrogenasa es regulada por tres mecanismos:
1. Inhibición por producto: tanto el acetil CoA como el
+
NADH + H actúan como moduladores alostéricos
negativos.
2. Por disponibilidad de sus sustratos: deben existir
concentraciones adecuadas de piruvato, CoA y
NAD+.
3. Por modificación covalente: la piruvato
deshidrogenasa (E1) existe en dos formas: una
fosforilada (inactiva) y otra desfosforilada, que es
activa. La fosforilación es llevada a cabo por una
proteína cinasa dependiente de Mg2+ y ATP,
mientras que la desfosforilación la realiza una
fosfoproteína fosfatasa, cuya actividad es
estimulada por altas concentraciones de Ca2+. Este
último evento ocurre cuando existe una
concentración elevada de ADP, el cual es indicador
de carencia energética.
Los individuos que tienen deficiencia de
tiamina, como ocurre en el beriberi, presentan
problemas a nivel neurológico debido a que el
cerebro obtiene toda su energía por oxidación
aeróbica de la glucosa.
C.4
Ciclo de los ácidos tricarboxílicos (ciclo de
Krebs).
C.4.1 Definirá
el
concepto
de
óxidorreducción,
par
redox
y
potencial de óxidorreducción.
C.4.2 Señalará la localización subcelular
de la vía en función de sus
alimentadores y precisará el papel
del ciclo en la generación de la
energía celular.
C.4.3 Describirá
las
reacciones
enzimáticas involucradas en el ciclo,
sus sustratos y productos, así como
las sustancias que intervienen en la
regulación de la vía.
C.4.4 Conocerá el papel anfibólico de la
vía y los diferentes destinos de sus
52
C.4.5
C.4.6
intermediarios: citrato, isocitrato, Įcetoglutarato, succinil CoA, malato y
oxaloacetato.
Definirá el concepto de reacción
anaplerótica y conocerá las enzimas
involucradas en estas reacciones
para el ciclo de Krebs.
Conocerá el balance energético de la
vía y hará énfasis en el número y tipo
de coenzimas reducidas producidas
en la oxidación de una molécula de
acetil CoA.
La mayor parte del ATP generado en los organismos
aerobios se produce en el proceso de la fosforilación
oxidativa en el cual, los hidrógenos extraídos de los
metabolitos
mediante
las
reacciones
de
deshidrogenación son cedidos a la cadena
respiratoria, en donde se genera el potencial
protonmotriz que sirve de fuerza impulsora para la
síntesis
del
ATP.
La
mayoría
de
las
deshidrogenaciones de los metabolitos se llevan a
cabo en una secuencia cíclica de reacciones
conocida como ciclo de Krebs, ciclo del ácido cítrico
o ciclo de los ácidos tricarboxílicos. El ciclo de Krebs
se lleva a cabo por enzimas solubles (a excepción de
la succinato deshidrogenasa que es parte integral de
la membrana interna) de la matriz mitocondrial y
durante él se oxidan los residuos de acetato activo
(acetil CoA) provenientes de la glucosa, los ácidos
grasos y los aminoácidos, hasta CO2 y coenzimas
reducidas. Aproximadamente dos tercios del ATP
utilizado por los organismos aerobios se genera
como resultado de la oxidación de los restos de
acetato en el ciclo de Krebs.
El ciclo de Krebs es una vía de confluencia
para el catabolismo celular (fig. III.1) que, en una
secuencia de ocho reacciones oxida al residuo
acetato de la acetil CoA conforme a la ecuación
siguiente:
CH3 – COOH + 2H2O
de las cuales tres donan sus hidrógenos al NAD+ y
una al FAD.
a) La oxidación de la Acetil CoA derivada de la
b)
c)
d)
e)
2CO2 + 4(2H+)
f)
En el ciclo ocurren dos reacciones en las que
se desprende CO2 y hay cuatro deshidrogenaciones,
glucosa, los ácidos grasos y los aminoácidos es
la función primaria del ciclo de Krebs, el cual la
procesa en una serie de reacciones que se
inician y terminan con el oxaloacetato; en cada
vuelta del ciclo de Krebs se produce un GTP por
fosforilación a nivel del sustrato y se liberan
cuatro pares de hidrógeno que alimentan la
cadena respiratoria con la producción de 9 ATP
en la fosforilación oxidativa.
Además de su papel central en la oxidación de la
acetil CoA, el ciclo de Krebs participa en los
siguientes procesos metabólicos:
Gluconeogénesis. Reúne numerosos sustratos que
se convierten en oxaloacetato. Este compuesto
sale de la mitocondria en forma de malato, citrato
o aspartato y se transforma en el citosol, primero
en fosfoenol piruvato y después en glucosa.
Biosíntesis de las ácidos grasos. Aporta la molécula
de citrato que, al salir de la mitocondria, es
transformada con gasto de un ATP por la citrato
liasa en oxaloacetato y acetil CoA, que es el
alimentador inicial de la biosíntesis de los ácidos
grasos. El oxaloacetato se reduce a malato, el
cual es oxidado por la enzima málica para la
producción de NADPH, coenzima indispensable
en la biosíntesis de los ácidos grasos.
Interconversión
de
Aminoácidos.
Numerosos
aminoácidos entregan sus carbonos al ciclo de
Krebs al transformarse, por reacciones
sucesivas, en alguno de los metabolitos clave del
ciclo: -cetoglutarato, succinil-CoA, fumarato y
oxaloacetato; una vez ahí, mediante las
reacciones del ciclo de Krebs, pueden
transformarse en algún otro aminoácido que se
derive de otro intermediario del ciclo.
Biosíntesis de Purinas y Pirimidinas. El ciclo de
Krebs alimenta la síntesis de bases púricas y
pirimídicas aportando, de manera indirecta,
aspartato y glutamina.
Biosíntesis de Porfirinas. El ciclo de Krebs aporta
uno de los sustratos iniciales necesarios para
que se lleve a cabo esta vía: la succinil-CoA.
53
Regulación del ciclo de Krebs
Por el hecho de que entrega NADH y FADH2 a la
cadena respiratoria y recibe de ella las mismas
coenzimas oxidadas, el ciclo de Krebs funciona bajo
el control de la cadena respiratoria y depende en
última instancia de la fosforilación oxidativa. Sin
embargo, el ciclo de Krebs responde a moduladores
deshidrogenasa y -cetoglutarato deshidrogenasa
son las enzimas reguladoras del ciclo.
C.5
Cadena de transporte de electrones (cadena
respiratoria).
C.5.1 Describirá la naturaleza de los
componentes de la cadena de
transporte de electrones y señalará
su secuencia con base en los
potenciales
de
oxidorreducción.
Calculará la energía generada en
cada paso del transporte de
electrones.
C.5.2 Identificará los alimentadores de la
vía, así como su sitio de entrada a
ésta y el último aceptor de los
electrones.
C.5.3 Señalará el sitio de acción de los
siguientes inhibidores de la cadena
respiratoria:
amital,
rotenona,
antimicina, cianuro, NaN3, CO y H2S.
C.5.4 Describirá los sistemas de transporte
de los equivalentes reductores a la
mitocondria (lanzaderas).
C.5.5 Citará
algunos
ejemplos
de
alteraciones en los componentes
mitocondriales, como las isoenzimas
e isoformas de la citocromo c
oxidasa, entre otras.
Lecturas recomendadas
1.
Schon EA. Mitochondrial genetics and disease.
TIBS. 2000; 25(11): 555-5560.
2.
Raha S, Robinson BH. Mitochondria, oxygen free
radicals, disease and aging. TIBS. 2000; 25(10):
502-508.
3.
Cardellach F, Casademont J. Enfermedades
mitocondriales: un diagnóstico todavía difícil.
Medicina Clínica. 2000; 114 (4): 139-140.
4.
alostéricos generados en el propio ciclo y también en
otras vías del metabolismo; son moduladores
negativos NADH, ATP, citrato, succinil CoA y
oxaloacetato y moduladores positivos ADPy Ca2+.
Las
enzimas
citrato
sintasa,
isocitrato
Rubio JC, Matín MA, del Hoyo P, Bustos F,
Campos Y, Arenas J. Déficits de los complejos
enzimáticos
de
la
cadena
respiratoria
mitocondrial. Rev Neurol. 1998; 26 (supl 1): S15S20.
5.
Castro-Gago M, Novo MI, Eirís J. Tratamiento de
las
enfermedades
mitocondriales
durante la
54
infancia y adolescencia. Rev Neurol. 1998; 26
(supl 1): S92-S98.
C.6
Fosforilación oxidativa.
C.6.1 Describirá brevemente la hipótesis
quimiosmótica
propuesta
para
explicar la síntesis de ATP y los
datos que existen en favor de ella.
Definirá
los
conceptos
de
vectorialidad,
impermea-bilidad,
fuerza protonmotriz e ionóforo,
empleados en esta hipótesis.
C.6.2 Con base en el cálculo de energía
libre de Gibbs, señalará el número
de ATP que se genera al reoxidarse
las coenzimas NADH y FADH2 en la
cadena respiratoria. Definirá el
concepto de control respiratorio
indicando el papel del ADP, del
transportador de adenin nucleótidos
y del acarreador de fosfatos y su
efecto sobre la síntesis de ATP.
C.6.3 Señalará el sitio de acción de los
inhibidores de la ATP sintasa
(oligomicina y venturicidina), de los
desacoplantes sintéticos y naturales
(dinitrofenol y termogenina) de los
procesos de transporte de electrones
y la fosforilación oxidativa
y el
inhibidor del translocador de adenin
nucleótidos (atractilósido) y hará
énfasis en su efecto sobre la síntesis
de ATP.
Realización de la práctica 7 "Estudio del bombeo de
protones por levaduras; efecto de los inhibidores de
la cadena de transporte de electrones y de los
desacoplantes" (ver pág.153).
Lectura recomendada
1. Hinkle PC. ¿Cómo fabrican ATP las células?
Investigación y Ciencia 1978; 20: 58-75.
Mientras que el CO2 se forma por la oxidación del
sustrato durante el ciclo del ácido cítrico en la matriz
mitocondrial, la secuencia de las reacciones que
participan en la transferencia de hidrógenos y
electrones (la cadena respiratoria) se localiza en la
membrana interna de la mitocondria. La cadena se
puede dividir en cuatro complejos: el complejo I o
NADH deshidrogenasa (que cede sus electrones a la
coenzima Q); el complejo II o las deshidrogenasas
que ceden sus electrones al FADH2 (como la
succinato deshidrogenasa) y a través de él a la
misma coenzima Q; el complejo III o citocromo c
reductasa, y el complejo IV o citocromo c oxidasa,
que transfiere los electrones al oxígeno, que es el
aceptor final.
Los componentes de la cadena respiratoria
están arreglados de acuerdo con potenciales de
oxidorreducción crecientes (de valores negativos a
positivos). La energía liberada en el curso de la
transferencia de hidrógeno y electrones a través de la
cadena respiratoria se utiliza para la formación de
ATP por la llamada fosforilación oxidativa. La energía
requerida para la formación de un ATP a partir de un
ADP es equivalente a una diferencia de potencial
redox de 0.15 V. En promedio, la oxidación de una
molécula de NADH da origen a 2.5 moléculas de
ATP, mientras que se forman 1.5 moléculas de ATP
cuando se oxida FADH2 vía succinato (no involucra
NADH). El rendimiento de energía de la fosforilación
oxidativa es alrededor de 40% del valor teórico de la
energía liberada en la reacción del hidrógeno con el
oxígeno.
El transporte de los electrones entre los
diferentes componentes de la cadena respiratoria
puede ser inhibido por diversos compuestos, entre
ellos: los barbituratos, la rotenona, la antimicina, el
CO, las azidas, el H2S y el cianuro, los que actúan en
distintos sitios de la cadena respiratoria.
Las reacciones de la cadena respiratoria y la
fosforilación oxidativa están acopladas; si se
desacoplan, la energía se pierde como calor y no hay
síntesis de ATP. Pueden desacoplarse in vitro por 2,4
dinitrofenol o compuestos similares e, in vivo, por la
termogenina presente en tejido adiposo pardo, el que
es abundante en recién nacidos.
La membrana interna de la mitocondria debe
estar intacta para generar ATP. Las moléculas de
ATP formadas en el interior de la mitocondria son
translocadas al exterior en intercambio con moléculas
55
de ADP presentes fuera de la mitocondria por medio
de un acarreador altamente específico presente en la
membrana mitocondrial: la translocasa de los adeninnucleótidos.
Hay otro mecanismo de síntesis de ATP no
asociado al transporte de electrones en el que los
donadores de la energía y del fosfato final del ATP
son compuestos con enlaces fosfato de alta energía.
Este tipo de fosforilación se conoce como
fosforilación a nivel de sustrato.
Los sustratos metabolizados dentro de la
mitocondria son transportados al exterior por
mecanismos específicos (transporte de ácidos
dicarboxílicos, de aminoácidos, de iones, etcétera).
Este transporte, como el del ATP, se convierte en
uno de los factores de control en la función
mitocondrial.
Dado que la membrana interna de la
mitocondria es impermeable para el NAD+ y el NADH
y a que una forma eficiente, energéticamente
hablando, de reoxidar al NADH que se obtiene en la
glucólisis es un proceso mitocondrial, existen
lanzaderas que son sistemas de transporte de los
hidrógenos citoplasmáticos (equivalentes reductores)
a través de la membrana mitocondrial. Las dos
lanzaderas más importantes son la del glicerol fosfato
y la del malato.
C.7
Radicales libres.
C.7.1 Definirá el concepto de radicales
libres y cuáles son derivados del
oxígeno.
C.7.2 Describirá cómo y dónde se generan
los radicales superóxido, hidroxilo y
otras moléculas reactivas: peróxido
de hidrógeno y singulete de oxígeno.
C.7.3 Describirá el efecto de estos
radicales y moléculas reactivas sobre
otras
moléculas,
células
y
organismos y su contribución en las
siguientes condiciones: fagocitosis,
inflamación,
lipoperoxidación
y
perfusión postisquemia.
C.7.4 Describirá las condiciones en las que
se genera el radical NO y su relevancia
fisiológica.
C.7.5 Describirá los mecanismos protectores
del organismo contra las especies
reactivas de O2: superóxido dismutasa,
catalasa,
glutatión
peroxidasa,
vitaminas E y C y ȕ-carotenos.
Realización de la práctica 8 "El efecto del etanol
sobre la lipoperoxidación" (ver pág.156).
Lecturas recomendadas
1.
Piña GE, Huberman A, Chávez R, Lascurain
R, Zenteno E, Frenk S. Los radicales libres.
Beneficios y problemas. Gac Méd Méx 1996;
132 (2): 183-203.
2.
Fernández AA, Abudara V, Morales FR. El
óxido nítrico como neurotransmisor y
neuromodulador. Actas de Fisiología. 1999;
5: 39-77.
3.
Raha S, Robinson BH. Mitochondria, oxygen
free radicals, disease and aging. TIBS. 2000;
25 (10): 502-508.
Un gran número de enfermedades, como el
Parkinson, aterosclerosis, enfisema pulmonar y
cáncer, entre otras, tienen su origen en una
producción excesiva o anormal de derivados del
oxígeno, químicamente muy activos: los radicales
libres.
Un radical libre es cualquier especie química,
molécula o átomo, portadora de uno o más
electrones desapareados. Se llama electrón
desapareado al electrón que se encuentra solo en un
orbital. La presencia de un electrón desapareado
hace que los radicales libres sean muy reactivos,
pues buscan con avidez completar su par electrónico.
No obstante, existen radicales libres relativamente
estables, como las moléculas con estructuras
resonantes (con múltiples enlaces dobles), que
permiten la deslocalización del electrón desapareado.
La colocación de un punto, generalmente al final de
la fórmula química, indica el carácter de radical libre
de una molécula (•).
Los radicales libres son capaces de alterar
reversible
o
irreversiblemente
compuestos
bioquímicos de todo tipo y pueden modificar en forma
importante su estructura y, como consecuencia,
56
alterar la capacidad funcional de las sustancias
atacadas. El principal blanco de los radicales libres
son las insaturaciones de los lípidos de membrana en
los cuales provocan una peroxidación. La presencia
de lípidos peroxidados en las membranas biológicas
disminuye su fluidez, lo que se traduce en
alteraciones de la permeabilidad a sustancias o,
incluso, su integridad, lo que provoca la lisis celular.
Los radicales libres también son capaces de inactivar
o destruir enzimas y otras proteínas y atacar a los
ácidos nucleicos. El daño al DNA puede causar
mutaciones y dar origen a cánceres. La acción sobre
los carbohidratos puede alterar su función como
receptores (de hormonas o neurotransmisores). Es
decir, los radicales libres influyen sobre actividades
celulares tanto a nivel de la membrana como en las
vías metabólicas y en la expresión genética.
Una de las características más importantes
de las reacciones de los radicales libres es que se
forman por reacciones en cadena; esto significa que
un radical libre puede dar lugar a la formación de
otro, de manera que este mecanismo permite que la
actividad se propague y que el daño se generalice.
Los radicales derivados del oxígeno
Las especies reactivas del oxígeno son el anión
superóxido, el peróxido de hidrógeno, el hidroxilo y el
singulete de oxígeno.
Anión superóxido. La transformación del
oxígeno en radical libre puede efectuarse cuando el
oxígeno acepta un electrón que transforma este
elemento en un radical con carga negativa, el anión
superóxido: O2 •–.
Probablemente la fuente más importante de
producción de radicales superóxido sea el estallido
respiratorio (aumento súbito del consumo de
oxígeno) de los macrófagos y de los leucocitos
polimorfonucleares en respuesta a una señal
inmunitaria provocada por alguna infección.
Peróxido de hidrógeno. El anión superóxido
sufre espontáneamente, o bajo la acción de la
enzima superóxido dismutasa (SOD), una reacción
de dismutación: dos radicales libres reaccionan entre
sí, uno de ellos perdiendo electrones y el otro
ganándolos. Esta dismutación produce agua
oxigenada, que no es realmente un radical libre, pero
este compuesto por captación de un electrón y de un
protón, puede dar lugar a la formación de especies
oxigenadas muy activas, especialmente al radical
hidroxilo.
Radical hidroxilo. El •OH es un oxidante
extremadamente reactivo que interactúa con casi
todas las moléculas a velocidades sólo limitadas por
su difusión. El radical hidroxilo es formado por la
ruptura de una molécula de agua bajo el efecto de
una radiación gamma o en el ciclo de Haber-Weiss:
•
+
O2 + H2O2
1. 2 O2 – + 2 H
2+
Fe3+ + •OH + OH–
2. H2O2 + Fe
2+
3. Fe3+ + O2•–
Fe + O2
el ciclo global se expresa:
2+
3+
Fe /Fe
O2•– + H2O2
O2 + •OH + OH–
1. La dismutación del radical anión superóxido
produce peróxido de hidrógeno.
2. El peróxido de hidrógeno se descompone en el
radical hidroxilo con intervención del Fe2+ (reacción
de Fenton).
3. La regeneración del Fe2+ por medio del radical
anión superóxido.
Singulete de oxígeno. El singulete de
oxígeno, representado gráficamente como 1O2*, se
caracteriza por tener un par electrónico antiparalelo
en su última órbita; no es realmente un radical, sin
embargo, es incluido aquí por ser un derivado muy
oxidante del oxígeno. Se forma principalmente en
reacciones en las que los pigmentos biológicos,
como el retinal, las flavinas o las porfirinas, son
expuestos a la luz en presencia de oxígeno.
Antioxidantes
Para controlar los efectos devastadores de los
radicales libres existen mecanismos protectores.
Estos sistemas tienen la función de neutralizar el
efecto de los radicales libres o evitar su aparición. El
nivel primario de defensa lo constituyen tres enzimas
especializadas.
1. Superóxido dismutasa. Existe en las mitocondrias
(SOD de Mn2+) y en el citosol (SOD de Cu2+ y de
Zn2+). Cataliza la dismutación del radical anión
57
superóxido para dar oxígeno molecular y peróxido
de hidrógeno:
•
+
2 O2 – + 2 H
O2 + H2O2
2. Glutatión peroxidasa. Existe principalmente en el
citosol y contiene selenio. Cataliza la siguiente
reacción:
2GSH + H2O2
GSSG + 2H2O
(donde: GSH-glutatión reducido y GSSG-glutatión
oxidado).
3. Catalasa. Existe principalmente en los
peroxisomas y su función es destruir el agua
oxigenada por dismutación:
H2O2 + H2O2
2H2O + O2
Otro tipo de protección contra los radicales
libres es la que prestan unas sustancias capaces de
neutralizar a los radicales o limitar su reactividad,
llamadas atrapadoras. Entre ellas cabe mencionar:
Vitamina E (tocoferol) y beta caroteno.
Reaccionan con los radicales peróxido y suspenden
la cadena de reacciones radicalares. Son liposolubles
y por eso pueden proteger las membranas.
Vitamina C. Reacciona directamente con los
superóxidos, con el singulete de oxígeno y con el
radical hidroxilo; regenera la vitamina E al reaccionar
con el radical tocoferilo y lo convierte en radical
ascorbilo, también muy estable.
Algunos minerales como el selenio, el cinc, el
cobre y el manganeso, constituyentes de las enzimas
antes mencionadas; proteínas y péptidos como el
glutatión, la albúmina, la ceruloplasmina, la ferritina,
la transferrina, etcétera y, por último, sustancias
quelantes que evitan que el hierro, cobre y otros
metales de transición catalicen reacciones de
oxidación.
D.
Otras
vías
metabólicas
carbohidratos
de
los
Al finalizar esta subunidad, el alumno podrá analizar
en forma integral el metabolismo de los
carbohidratos, identificar su papel como combustible
celular y como generador de intermediarios de otras
vías metabólicas y podrá explicar en forma integral la
regulación de la glucemia.
D.1
Gluconeogénesis.
D.1.1 Señalará en qué consiste la
gluconeogénesis,
los
sustratos
gluconeogénicos,
los
compartimentos celulares de la vía y
los tejidos con mayor actividad
gluconeogénica.
D.1.2 Comparará
y
analizará
las
reacciones de esta vía con las de la
glucólisis desde el punto de vista
energético
y
describirá
los
mecanismos empleados para evitar
las barreras energéticas.
D.1.3 Indicará el destino metabólico del
producto de la gluconeogénesis
hepática.
D.1.4 Describirá el ciclo de Cori y el ciclo
de la alanina y el significado
fisiológico de ambos.
D.1.5 Elaborará el balance energético y
explicará la regulación de la
gluconeogénesis y hará énfasis en
el papel de la
fructosa 2,6 bisfosfato.
Es el proceso por el cual se sintetiza la glucosa a
partir de diversos sustratos como son:
a) Lactato o piruvato.
b) Aminoácidos glucogénicos (Ala, Arg, Cys, Asp,
Glu, Gly, His, Met, Pro, Ser, Tre, Val).
c) Cualquier otro intermediario que pueda ser
metabolizado vía piruvato (o que entre al ciclo de
Krebs).
La gluconeogénesis no puede verse como la
vía en sentido contrario de la glucólisis ya que
algunas de las reacciones de esta última son muy
exergónicas, lo que las hace irreversibles. Tal es el
caso de las reacciones catalizadas por la
piruvatocinasa (transforma al fosfoenolpiruvato en
piruvato), la fosfofructocinasa (paso de fructosa 6
58
fosfato a fructosa 1,6 bisfosfato) y la hexocinasa
(glucosa a glucosa 6 fosfato). Estas reacciones se
evitan por medio de las siguientes alternativas:
1. La formación del fosfoenolpiruvato a partir de
oxaloacetato. El oxaloacetato se forma en la
mitocondria por carboxilación del piruvato con una
enzima dependiente de biotina y ATP llamada
carboxilasa del piruvato. También se puede
obtener el oxaloacetato en el citoplasma por
carboxilación del piruvato y reducción con NADPH
para formar el malato, el cual se deshidrogena para
producir el oxaloacetato.
Estas reacciones son llevadas a cabo por la enzima
málica. La fosforilación del oxaloacetato con GTP o
ITP y su descarboxilación simultánea por la
fosfoenolpiruvato
carboxicinasa
producen
el
fosfoenolpiruvato.
2. La degradación hidrolítica de la fructosa 1,6
bisfosfato a fructosa 6 fosfato catalizada por la
fructosa 1,6 bisfosfatasa.
3. La degradación de la glucosa 6 fosfato a glucosa
por la glucosa 6 fosfatasa.
La síntesis de una molécula de glucosa a
partir de dos moléculas del piruvato requiere seis
moléculas de ATP.
La posibilidad de que la gluconeogénesis
proceda completamente (es decir, que su producto
final sea glucosa) depende de la presencia de todas
las enzimas clave en un tejido determinado. Se lleva
a cabo con facilidad en el hígado y en los riñones; no
ocurre en el cerebro ni en el músculo esquelético ya
que la glucosa 6 fosfatasa se encuentra ausente en
estos tejidos. Es por esto que el producto de la
degradación del glucógeno muscular (glucosa 6
fosfato) no puede servir como una fuente para
mantener el nivel de la glucosa sanguínea. En el
músculo, el glucógeno se degrada hasta lactato que
sale a la circulación sanguínea y se transfiere al
hígado donde se transforma en glucógeno hepático o
en glucosa libre por la vía de la gluconeogénesis.
Esta contribución indirecta del lactato del músculo a
la glucosa sanguínea se conoce como el ciclo de
Cori. El músculo también contribuye a mantener la
glucemia, al transformar el piruvato en alanina, la que
sale a la circulación y en el hígado se convierte otra
vez en piruvato para entrar a la gluconeogénesis.
D.2
Glucogenólisis y glucogénesis.
D.2.1
D.2.2
D.2.3
D.2.4
D.2.5
Conocerá la distribución tisular del
glucógeno.
Describirá las reacciones de la
glucogenólisis y de la glucogénesis e
indicará los
sustratos y los
productos, así como la localización
subcelular de las vías.
Discutirá el balance energético y la
regulación de ambas vías por
alosterismo (glucosa, glucosa 6
fosfato, AMP y Ca2+). Revisará el
papel de las las hormonas epinefrina,
glucagón e insulina en la regulación
de estas vías.
Indicará
las
diferencias
del
metabolismo del glucógeno en el
músculo y en el hígado.
Mencionará los defectos enzimáticos
de las siguientes glucogenosis: von
Gierke, McArdle y Andersen.
El glucógeno es un polisacárido de reserva localizado
en forma de gránulos en el citoplasma de las células;
es osmóticamente inactivo y facilita la rápida y
reversible transformación de la glucosa en una
molécula de reserva, según la situación energética
de la célula. La degradación del glucógeno se
conoce como glucogenólisis y su síntesis como
glucogénesis (glucogenogénesis).
La glucogenólisis se inicia por una ruptura
fosforolítica del glucógeno por la fosforilasa. En
presencia de fosfato, se separa una glucosa del
glucógeno como glucosa 1 fosfato y ésta, por acción
de una fosfoglucomutasa, se transforma en glucosa 6
fosfato, la que puede entrar entonces a la vía
glucolítica. La energía invertida para la inclusión de
una molécula de glucosa en el glucógeno y su
regreso a glucosa 6 fosfato es de dos moléculas de
ATP.
La síntesis de glucógeno se inicia con la
fosforilación de la glucosa para formar glucosa 6
fosfato que se transforma posteriormente en glucosa
1 fosfato por acción de la fosfoglucomutasa. Esta
59
molécula reacciona con UTP por acción de la UDPglucosa pirofosforilasa y origina UDP-glucosa, que es
el sustrato de la glucógeno sintetasa. Las numerosas
ramificaciones presentes en el glucógeno son
introducidas por la acción de una enzima ramificante.
La degradación y la síntesis de glucógeno
están finamente reguladas por el AMP cíclico a
través de la actividad de la proteína cinasa. En una
secuencia de reacciones, este compuesto se
involucra en la conversión de la fosforilasa b
(inactiva, no fosforilada) en fosforilasa a (activa,
fosforilada).Inversamente, la glucógeno sintetasa que
está en su forma activa (no fosforilada o forma I)
cambia a su estado inactivo (fosforilado o forma D).
La concentración intracelular de AMP cíclico (AMPc)
es regulada por las hormonas epinefrina y glucagon,
las que aumentan la concentración de AMPc, y por la
insulina, que la disminuye.
D.3
Vía del fosfogluconato (ciclo de las
pentosas).
D.3.1 Indicará la distribución tisular de
esta vía.
D.3.2 Señalará las reacciones de la fase
oxidativa y de la no oxidativa e
indicará sus productos y su destino
metabólico.
D.3.3 Mencionará las relaciones de la vía
del fosfogluconato con otras vías
metabólicas como la glucólisis, la
síntesis de nucleótidos, la síntesis de
ácidos grasos, la síntesis de
colesterol y los sistemas oxidantes
de las células fagocíticas.
D.3.4 Discutirá la regulación de la actividad
de la vía y hará énfasis en su
importancia
para
las
síntesis
reductoras.
D.3.5 Mencionará la consecuencia de la
deficiencia de la glucosa 6 fosfato
deshidrogenasa en eritrocitos.
El ciclo de las pentosas es una vía colateral a la
glucólisis. Presenta dos fases: una oxidativa y una no
oxidativa. En la fase oxidativa, una molécula de
glucosa es gradualmente degradada y se forma el
NADPH; en la fase no oxidativa, la ribosa 5-fosfato y
la eritrosa 4 fosfato son formadas por una
interconversión de ésteres fosfóricos de azúcares de
3C, 4C, 5C, 6C y 7C.
En el sentido biosintético, las reacciones del
ciclo de las pentosas sirven para la fijación de bióxido
de carbono durante la fotosíntesis.
Algunos de los intermediarios de esta vía
están relacionados con la glucólisis como la glucosa
6 fosfato, la fructosa 6 fosfato y el gliceraldehído 3
fosfato. Las enzimas del ciclo de las pentosas, al
igual que las de la glucólisis, son solubles en el
citoplasma.
El ciclo de las pentosas no es una vía
principal para el metabolismo de la glucosa y sus
relaciones con la glucólisis pueden variar de acuerdo
con el tipo de tejido y sus funciones biológicas.
Las reacciones de este ciclo no pueden ser
utilizadas en la obtención de energía, ya que la
oxidación del NADPH no forma ATP directamente.
El ciclo de las pentosas es importante en
todas las células ya que es la principal forma de
obtener el NADPH necesario en los procesos de
síntesis (reductoras); asimismo, es la fuente de la
ribosa 5-fosfato, la cual es precursora de la
biosíntesis de nucleótidos y ácidos nucleicos.
D.4
Regulación de la glucemia.
D.4.1 Explicará el significado de los términos:
glucemia, hipo e hiperglucemia.
D.4.2 Discutirá la importancia biológica de
mantener una glucemia normal.
D.4.3 Discutirá el papel de las siguientes
hormonas:
epinefrina,
glucagon,
cortisol e insulina en la regulación de la
glucemia normal indicando las vías
metabólicas, los tejidos involucrados y
las fuentes endógenas y exógenas de
los carbohidratos.
D.4.4 Reconocerá la glucosilación no
enzimática
de
las
proteínas
(hemoglobina
glucosilada
y
fructosaminas) como consecuencia de
una hiperglucemia prolongada.
60
Realización de la práctica 9 "Estudio general del
metabolismo de los carbohidratos" (ver pág.157).
Discusión del caso clínico no. 3 “Hipoglucemia
secundaria a intoxicación alcohólica” (ver pág. 198).
Lecturas recomendadas
1.
Beisswenger PJ, Szwergold BS, Yeo KT.
Glycated proteins in diabetes. Clin Lab Med.
2001; 21 (1): 53-78.
2.
Cohen MP. Intervention strategies to prevent
pathogenetic effects of glycated albumin.
Arch Biochem Biophys. 2003; 419 (1): 25-30.
3.
Desmond A. Glicosilación no enzimática de
proteínas: su rol en las complicaciones
crónicas de la diabetes y el envejecimiento.
Acta Bioquím Clín Latinoamer. 1995; 29 (2):
173-190.
La concentración sanguínea de la glucosa o glucemia
debe mantenerse dentro de límites muy estrechos
debido a que algunas células como las nerviosas y
los eritrocitos utilizan a la glucosa como única fuente
de energía, lo que las hace especialmente sensibles
a la disminución de la glucemia. Por otro lado, el
aumento de las concentraciones de glucosa en
sangre se asocia a problemas de hiperosmolaridad y
a la aparición de proteínas glucosiladas que se
asocian a algunas patologías, como la diabetes y sus
consecuencias.
La concentración normal de glucosa en
sangre en ayunas es de 80-100 mg/dl, y sus límites
extremos son 65 y 120 mg/dl. Los niveles superiores
a los valores normales se conocen como
hiperglucemia, mientras que los inferiores se
designan como hipoglucemia.
La glucosa sanguínea puede provenir de dos
fuentes: una exógena (la dieta) y una endógena
(glucogenólisis y gluconeogénesis hepática). En el
primer caso, después de una comida que contenga
carbohidratos, la glucemia se incrementa para volver
en unas dos horas a los niveles basales. Si por el
contrario, el individuo está en ayunas la glucosa
desciende pero nunca por debajo de 60 mg/dl. Esto
hace un contraste notable con las grandes
variaciones en la concentración de los ácidos grasos
que pueden aumentar hasta 10 veces y en el caso de
los cuerpos cetónicos hasta 100 veces.
La principal regulación de la glucemia se
realiza por hormonas. Las principales son: glucagon,
insulina, epinefrina, gluco-corticoides y las hormonas
tiroideas.
Cuando la concentración de glucosa
disminuye, como en el ayuno, el páncreas secreta
glucagón El resultado neto es que en el hígado se
detienen las vías de utilización de la glucosa
(glucogénesis y glucólisis) y se activan las vías
productoras
de
glucosa
(glucogenólisis
y
gluconeogénesis). Por otra parte, la disminución en el
consumo de glucosa por los tejidos insulinodependientes (músculo y tejido adiposo), causada
por la disminución en los niveles de esta hormona,
contribuye a preservar la glucosa para que pueda ser
utilizada por el cerebro, ya que la glicemia inferior a
los 60 mg/dl, provoca que este órgano no reciba las
cantidades de glucosa suficientes para obtener la
energía necesaria para realizar adecuadamente sus
funciones, por lo que, si esta situación se prolonga,
pueden sobrevenir el coma y la muerte. Otras
hormonas que intervienen para aumentar la glucemia
en el caso de ayunos prolongados son los
glucocorticoides, quienes provocan la hidrólisis de
proteínas musculares a fin de proveer de sustratos
gluconeogénicos al hígado, mientras que las
hormonas tiroideas estimulan la glucogenólisis
hepática.
Por otro lado, cuando la glucemia aumenta,
como después de una dieta rica en carbohidratos, los
islotes de Langerhans detectan este aumento y
secretan insulina. Esta hormona produce un
incremento en el transporte de glucosa al interior del
músculo y del tejido adiposo, por los receptores
GLUT 4 y, activa la glucógeno sintasa, tanto
muscular como hepática. De esta manera, la
glucemia disminuye y los depósitos de glucógeno
hepático y muscular aumentan.
El aumento de los valores de glucosa en
sangre presenta algunos efectos fisiológicos que
pueden explicarse por las propiedades osmóticas y
químicas de la glucosa. Entre dichos efectos se
encuentran la deshidratación de los tejidos y el
envejecimiento de proteínas. En el primer caso, la
61
salida del agua al torrente circulatorio causa que los
tejidos pierdan, además del agua, algunos iones
importantes, como el potasio. En el segundo caso,
las concentraciones altas de glucosa sanguínea
(superiores a 120 mg/dl) aceleran el envejecimiento
proteínico por glucosilación no enzimática o glicación.
La glucosa reacciona con los grupos amino
expuestos de las proteínas y cambia las propiedades
catalíticas y estructurales de las mismas. La
hemoglobina, la colágena, las proteínas del cristalino
y muchas más sufren glicación en proporción a la
concentración de glucosa en la circulación. Este
efecto permite comprender el origen de algunas de
las complicaciones que aparecen en el caso de los
diabéticos, como la aparición de cataratas por la
glicación irreversible de las proteínas del cristalino, o
los elevados niveles de hemoglobina glicada
(hemoglobina A1c), que en los diabéticos llegan a ser
de dos a tres veces mayores que en los individuos
normales. El nivel de hemoglobina A1c revela la
concentración de glucosa en sangre durante un
período de varias semanas, por lo que su
determinación puede ser muy útil para comprobar si
los pacientes diabéticos han sido tratados
adecuadamente.
E.1.3
E.1.4
E.1.5
E.2
Clasificará a los lípidos con base en
su composición, en su grado de
complejidad y en su grado de
polaridad.
Identificará a los lípidos como los
componentes principales de las
membranas celulares y relacionará el
contenido y las características
químicas de los lípidos con la
impermeabilidad y fluidez de la
membrana.
Mencionará las diferencias en cuanto
a la asimetría y la composición de las
membranas celulares (citoplasmática
y mitocondrial).
Digestión, absorción y transporte.
E.2.1
E.2.2
E.2.3
Señalará la fuente dietética de los
lípidos.
Conocerá el mecanismo por el cual
el organismo realiza la digestión y
absorción de los lípidos.
Conocerá el transporte de los lípidos
de la dieta en el organismo
(quilomicrones).
E. Lípidos
Al finalizar esta subunidad, el alumno explicará las
características principales de los lípidos, sus
estructuras, el papel que desempeñan en los seres
vivos, así como su digestión y absorción.
E.1
Estructura.
E.1.1 Definirá qué son los lípidos, cuál es
su importancia biológica.
E.1.2 Conocerá
las
propiedades
fisicoquímicas
de
los
lípidos:
solubilidad,
naturaleza
química,
apolaridad.
E.1.2 Reconocerá las fórmulas de los
lípidos que emplea la célula: ácidos
grasos,
triacigliceroles,
fosfoglicéridos
y
glicolípidos,
terpenos y esteroides.
Los lípidos son sustancias biológicas solubles en
solventes orgánicos, pero escasamente solubles en
el agua. Pertenecen a este grupo moléculas tan
diversas como las grasas, los aceites, algunas
vitaminas y hormonas, así como todos los
componentes no proteicos de las membranas.
Los lípidos pueden clasificarse en dos
grandes grupos: los saponificables y los no
saponificables. Los primeros tienen la característica
de que, en soluciones alcalinas, se hidrolizan
produciendo ésteres de ácidos grasos, mientras que
los segundos no son objeto de hidrólisis alcalina. A
los
lípidos
saponificables
pertenecen
los
acilgliceroles, los fosfoacilgliceroles, los esfingolípidos y las ceras, mientras que en el grupo de los
lípidos insaponificables encontramos los terpenos,
los esteroides y las prostaglandinas, así como los
compuestos relacionados con éstos. Asimismo,
62
existen lípidos con un grupo extremo polar y otro
grupo opuesto no polar. Este grupo se conoce como
lípidos anfipáticos y son los responsables de
estabilizar las emulsiones o forman parte de la bicapa
lipídica de las membranas.
Los
ácidos
grasos
biológicamente
importantes son ácidos monocarboxílicos con
cadenas alifáticas de diverso tamaño, con un número
par de átomos de carbono, que pueden ser saturados
o insaturados. En el caso de los insaturados, los de
origen natural son isómeros geométricos cis; pueden
ser monoinsaturados o poliinsaturados y son líquidos
a temperatura ambiente. Los ácidos grasos
poliinsaturados no son sintetizados en el organismo
por lo que se consideran esenciales. En soluciones
fisiológicas se encuentran en forma ionizada
formando sales o "jabones". Los ácidos grasos de
cadena larga son insolubles en agua, pero los
jabones forman micelas. Los ácidos grasos forman
ésteres con alcoholes y tioésteres con la coenzima A.
Las prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos son
derivados de ácidos grasos poliinsaturados de 20
carbonos, especialmente del ácido araquidónico.
Los acilgliceroles son compuestos en los que
uno o más de los grupos hidroxilo del glicerol están
esterificados. Pueden dividirse en monoacilgliceroles,
diacilgliceroles
y
triacilgliceroles.
En
los
triacilgliceroles los tres grupos hidroxilo están
esterificados con ácidos grasos, que pueden o no ser
iguales. Las propiedades de los triacilgliceroles están
determinadas por la naturaleza de sus ácidos grasos
componentes y se dividen en aceites (líquidos) o
grasas (sólidos) de acuerdo con la longitud de sus
cadenas o con su grado de saturación. Los
triacilgliceroles son hidrofóbicos y no forman micelas.
Los fosfoacilgliceroles o fosfoglicéridos son
derivados del ácido fosfatídico, es decir, del Lglicerolfosfato esterificado con dos ácidos grasos. El
ácido fosfatídico se esterifica, a su vez, a través de
su grupo fosfato, con un alcohol y forma las diversas
familias de fosfoglicéridos, las cuales poseen un
carácter anfipático.
Los plasmalógenos son glicerofosfolípidos en
los que la posición 1 del glicerol fosfato está
combinado con un alcohol de cadena larga mediante
una unión tipo éter.
Los esfingolípidos son lípidos complejos
derivados de un alcohol insaturado llamado
esfingosina, el que se une con un ácido graso de
cadena larga por medio de un enlace amida para
formar una ceramida. Las esfingomielinas contienen
una ceramida esterificada con fosforilcolina o
fosforiletanolamina. Cuando la ceramida se combina
con un azúcar forma los glucoesfingolípidos, que
pueden subdividirse en cerebrósidos (si sólo
contienen una unidad de azúcar), sulfátidos
(contienen un sulfato esterificado en la unidad de
azúcar) y gangliósidos (contienen oligosacáridos con
uno o más ácidos N-acetilneuramínicos).
Los
esteroides
son
derivados
del
ciclopentanoperhidrofenantreno. El núcleo esteroide
es una estructura rígida, casi plana, no polar. Los
esteroides más importantes son el colesterol y sus
derivados (los ácidos biliares, las hormonas
esteroidales
–estrógenos,
progestágenos,
glucocorticoides, mineralcorticoides y andrógenos– y
la vitamina D que, aunque no es propiamente un
esteroide, deriva del colesterol).
Los terpenos son polímeros de dos o más
unidades de isopreno, que pueden ser lineales o
cíclicos, con dobles enlaces trans en su mayoría. Las
vitaminas A y K, así como el escualeno, pertenecen a
este grupo.
En la dieta, la grasa constituye cerca de 60 g,
de los cuales 90% son triacilgliceroles. Es de todos
conocida la dificultad para digerir la grasa, que en
mucho está determinada por su casi nula solubilidad
en agua. Esto ocasiona que se aglomere la grasa y
que forme vacuolas, lo que impide que sea atacada
fácilmente por las enzimas digestivas. Para facilitar
su hidrólisis, durante el proceso digestivo que se
inicia en la boca la lipasa lingual hidroliza algunos
triacilglicéridos y produce ácidos grasos libres y
monoacilglicéridos que, junto con otros ácidos grasos
libres, posibilitan que las vacuolas de grasa se hagan
más pequeñas y formen gotitas. Tanto los
monoacilglicéridos como los fosfolípidos funcionan
como factores tensoactivos. La acción de esta lipasa
lingual es muy breve ya que, al llegar al estómago, es
inhibida por el pH ácido y es hasta llegar al duodeno
donde se continúa el proceso de digestión. Puede
considerarse que la dificultad de la digestión de los
63
lípidos se supera si se aumenta el área entre la fase
acuosa y la lipídica y se logra un aumento en la
solubilización de los productos de hidrólisis con
detergentes (sales biliares). El aumento del área y la
solubilización suceden cuando en el duodeno, por
efecto de la colecistocinina, que es una hormona
secretada por la llegada de los lípidos al duodeno, se
estimula la contracción de la vesícula biliar con la
consecutiva salida de sales biliares y otros lípidos,
que forman agregados que reciben el nombre de
micelas mixtas; éstas son diferentes a las gotitas
emulsionadas. La acción de las sales biliares es
romper la tensión superficial de la gotita de grasa
favoreciendo la interacción con el agua y su
fragmentación; así se origina la micela. Este proceso
también recibe el nombre de emulsificación. Al
mismo tiempo, la lipasa pancreática, que es
secretada como proenzima, hidroliza, al igual que la
lingual, la unión alfa éster de los triacilglicéridos y
deja libres dos ácidos grasos y un monoacilglicérido
que también serán emulsificados por las sales
biliares.
Además de la lipasa, el jugo pancreático
contiene otras esterasas que actúan sobre los
ésteres de colesterol, monoacilglicéridos y los
ésteres de vitamina A. Los fosfolípidos son
hidrolizados por fosfolipasas específicas, pero la más
abundante en el jugo pancreático es la fosfolipasa A2
que hidroliza la unión éster beta del ácido graso. La
presencia de sales biliares es necesaria para la
absorción de otros lípidos, como el colesterol y las
vitaminas A y K.
Se ha calculado que una persona sana
absorbe cerca de 70 a 90% de los lípidos, tanto
exógenos como endógenos; otro de los productos
derivados de la hidrólisis de los acilglicéridos, el
glicerol, se absorbe por difusión facilitada. Las sales
biliares son absorbidas en forma muy eficaz por el
intestino y son llevadas por la vena porta
nuevamente al hígado, de ahí a la bilis y una vez más
al intestino; a esta circulación de las sales biliares se
le llama circulación enterohepática.
En la célula intestinal los lípidos son
resintetizados formando triacilglicéridos por efecto de
una enzima que activa a los ácidos grasos y los une
a los monoacilglicéridos; también se forman
fosfolípidos y ésteres de colesterol. La absorción de
los lípidos y la actividad del retículo endoplásmico
liso de la célula intestinal dan como resultado la
formación de vesículas que se enriquecen con
proteínas (apoproteínas), lo que genera los
quilomicrones, partículas ricas en triacilglicéridos.
F.
Metabolismo de los lípidos
Al finalizar esta subunidad, el alumno podrá definir en
forma integral el metabolismo de los lípidos en
relación con su función como combustibles. Analizará
la regulación del metabolismo de los lípidos en
algunos estados fisiológicos.
F.1
Oxidación de los ácidos grasos (ß-oxidación).
F.1.1 Describirá la reacción de activación
de los ácidos grasos en el citoplasma
y el mecanismo de transporte al
interior de la mitocondria.
F.1.2 Describirá las reacciones de la ßoxidación e identificará sus sustratos
y productos.
F.1.3 Conocerá las reacciones adicionales
necesarias para la oxidación de los
ácidos grasos insaturados y de
cadena impar.
F.1.4 Calculará el número de moléculas de
ATP generadas en la oxidación
completa del ácido palmítico y
señalará los tejidos que dependen
energéticamente de esta vía.
Los ácidos grasos almacenados en los tejidos son
utilizados por la célula para la producción de energía
en magnitudes que varían de tejido a tejido, así como
del nivel metabólico del organismo. Son los
músculos, principalmente el cardiaco y el esquelético,
los que más dependen de los ácidos grasos como
fuente de energía.
La mayoría de los ácidos grasos que se
oxidan en los tejidos provienen de los triacilglicéridos
del tejido adiposo, desde donde son liberados por la
acción de la enzima lipasa sensible a hormonas y
transportados en la circulación como complejos
64
albúmina-ácidos grasos. Al llegar al hígado y a las
células de otros tejidos, el ácido graso es activado en
el citosol mediante la acción de la acil coenzima A
sintetasa (tiocinasa) con gasto de ATP, en esta
reacción se produce un acil coenzima A (acil CoA) y
AMP. El proceso de oxidación del ácido graso se
realiza dentro de la mitocondria; sin embargo, su
membrana es impermeable a los ácidos grasos y
derivados del acil CoA, por lo que se requiere de un
transportador: la molécula de carnitina es la
encargada de llevar al ácido graso al interior de la
mitocondria. Una vez dentro de la mitocondria, el acil
CoA sufre una serie de cambios que permiten
obtener un fragmento de dos carbonos, la acetil CoA.
Los cambios preparan al acilo para quedar
nuevamente activado y éstos son realizados por: a)
Una deshidrogenasa que requiere de FAD y
transforma al grupo acilo en uno enoilo (molécula con
un doble enlace entre el carbono alfa y beta); b) Una
hidratasa que elimina la doble ligadura y deja un
hidroxilo en el carbono beta. Esta molécula se llama
-hidroxiacil-CoA; c) Otra deshidrogenasa específica,
cuya coenzima es el NAD+, transforma el grupo
hidroxilo de la posición beta en un grupo ceto; d) Una
tiolasa que requiere de una coenzima A (HSCoA)
para unirla al carbono que tiene la nueva función
cetona y romper entre el carbono beta y alfa para
producir una molécula de acetil-CoA. Estas cuatro
enzimas siguen trabajando con el acil CoA que en
cada vuelta pierde dos carbonos como acetil CoA. Al
mismo tiempo, el FADH2 y el NADH obtenido en cada
ciclo de la oxidación generan 4 ATP en la cadena
respiratoria y las acetil CoA entran al ciclo de Krebs
para ser totalmente oxidadas con la ganancia de 10
ATP netos por cada acetil CoA que entra al ciclo. Así
tenemos que, por ejemplo, un palmitato (16C) genera
108 ATP al oxidarse hasta CO2 y H2O. Si
consideramos el gasto de la fase de activación del
ácido graso, obtenemos una ganancia neta de 106
ATP.
F.2
Síntesis
cetónicos.
y
utilización
de
los
cuerpos
F.2.1
F.2.2
F.2.3
F.2.4
Describirá la estructura de los
cuerpos cetónicos: acetoacetato, ßhidroxibutirato y acetona.
Conocerá las vías de síntesis y de
utilización de los cuerpos cetónicos e
indicará sus sustratos y sus
productos.
Señalará los tejidos involucrados en
la síntesis y utilización de los
cuerpos cetónicos.
Analizará la importancia fisiológica
de los cuerpos cetónicos en el
ayuno, la diabetes y dietas
deficientes en carbohidratos.
Cuando bajan los niveles de glucosa se estimula la
gluconeogénesis a partir del oxaloacetato y se
incrementa la vía de oxidación de los ácidos grasos,
lo que provoca el aumento concomitante de los
niveles de acetil CoA. En el hígado, el exceso de
acetil CoA se transforma en un grupo de moléculas
conocidas genéricamente como cuerpos cetónicos.
La vía de síntesis de los cuerpos cetónicos
(cetogénesis) se inicia con la condensación de dos
moléculas de acetil coenzima A; al producto de la
reacción, acetoacetil CoA, se le une una tercera
molécula de acetil CoA para formar el ß-hidroxi-ßmetil glutaril CoA. Esta molécula, al romperse por
una liasa (HMGCoA liasa), produce una acetil CoA y
un ácido acetoacético o acetoacetato. Este producto
se reduce con NAD+ y forma el ß-hidroxi-butirato; el
acetoacetato,
por
una
descarboxilación
no
enzimática, produce la acetona.
El acetoacetato es utilizado por otros
órganos, como el músculo cardiaco y el cerebro,
donde, por acción de una transferasa en presencia
de succinil coenzima A, se transforma en acetoacetilCoA, molécula que se rompe por una tiólisis, en
presencia de otra CoA para formar dos acetil CoA; la
enzima responsable de esta reacción es una tiolasa.
Las dos acetil CoA resultantes son oxidadas para la
obtención de energía en los órganos mencionados.
Al incremento de acetoacetato en la sangre
se le llama cetonemia. Puede deberse a una
deficiencia en el metabolismo de los carbohidratos
con el consiguiente aumento en el catabolismo de las
65
grasas y la desviación de la acetil CoA a la síntesis
de cuerpos cetónicos. Algunos ejemplos de
situaciones en las que ocurre lo anterior son: la
diabetes, el ayuno prolongado y la dieta deficiente en
carbohidratos.
F.3
Síntesis de ácidos grasos.
F.3.1
Indicará
las
fuentes
de
los
alimentadores de la ß-reducción:
acetil CoA y NADPH. Mencionará el
papel del citrato y de las lanzaderas
(malato-aspartato y citrato) como
transportadores
del
acetil-CoA
mitocondrial.
F.3.2
Describirá la síntesis de novo de un
ácido graso e indicará las enzimas
involucradas, sustratos, coenzimas y
productos.
F.3.3
Describirá las reacciones necesarias
para el alargamiento e insaturación
de los ácidos grasos, así como la
localización subcelular
de
los
sistemas involucrados en este
proceso.
F.3.4
Señalará la fuente de los carbonos
del ácido palmítico y calculará el
gasto energético de la síntesis de
dicho ácido.
F.3.5
Conocerá la función de los ácidos
grasos
poliinsaturados
como
precursores de prostaglandinas,
tromboxanos,
leucotrienos
y
lipoximas e indicará la función de
estos eicosanoides en el organismo
humano.
Cuando el requerimiento de energía en la célula ha
sido satisfecho y existen suficientes sustratos
oxidables, procede su almacenamiento bajo la forma
de triacilglicéridos que constituyen la reserva de
energía a largo plazo más importante de las células y
del organismo. El primer paso de este proceso es la
biosíntesis de los ácidos grasos, la cual se realiza en
el citoplasma celular a partir de la acetil CoA, el ATP
y el NADPH proveniente del ciclo de las pentosas y
de otros sistemas generadores de poder reductor.
La biosíntesis de los ácidos grasos se inicia
con la salida de la acetil-CoA desde la mitocondria en
forma de citrato y su transformación en malonil CoA
mediante la fijación del CO2 por una sintetasa
dependiente de biotina, que utiliza ATP. Tanto la
acetil CoA como la malonil-CoA se unen a un
complejo multienzimático llamado sintetasa de los
ácidos grasos. Este complejo está formado por un
conjunto de proteínas enzimáticas dispuestas
alrededor de la proteína transportadora de acilos
(PTA). En pasos sucesivos ocurre la condensación
de la acetil y la malonil CoA con desprendimiento de
CO2 y el resto del acetoacetilo de cuatro carbonos es
llevado por el brazo central de la PTA a los sitios
activos de las enzimas del complejo para
transformarlo, sucesivamente, en hidroxiacilo, enoilo
y acilo saturado, mediante el gasto de dos NADPH.
El ciclo se repite al incorporar dos carbonos del
malonil-CoA en cada vuelta, hasta que se completa
el ácido palmítico, un ácido graso saturado de 16 C.
El citrato desempeña un papel muy
importante en la síntesis de los ácidos grasos ya que
al salir al citoplasma se convierte en acetil CoA y
oxaloacetato. Este proceso alimenta con carbonos a
la síntesis de los ácidos grasos y aporta NADPH por
la acción de la enzima málica sobre el sistema
oxaloacetato-malato-piruvato. Por otra parte, el
citrato es un modulador positivo de la malonil CoA
sintetasa (también llamada acetil CoA carboxilasa),
que es la principal enzima reguladora de la síntesis
de los ácidos grasos.
F.4
Síntesis y degradación de triacilgliceroles.
F.4.1
F.4.2
F.4.3
Conocerá la estructura química y la
distribución
tisular
de
los
triacilglicéridos en función de su
carácter
de
combustible
con
importancia fisiológica.
Describirá la vía de degradación de
los tri-acilglicéridos (lipólisis) e
identificará sus enzimas, sustratos,
productos y función en el organismo.
Señalará las fuentes de sustratos
para la síntesis de triacilglicéridos:
acil CoA y glicerol fosfato.
66
F.4.4
F.4.5
Describirá la síntesis de los
triacilglicéridos
(lipogénesis)
e
identificará sus intermediarios y
enzimas.
Explicará
tanto
la
regulación
hormonal como la metabólica de la
lipólisis y de la lipogénesis e indicará
el papel de la concentración de
sustratos y productos de las vías, así
como el estado energético celular.
Una vez formados los ácidos grasos procede la
lipogénesis o síntesis de los triacilglicéridos: dos
ácidos grasos activados como acil CoA reaccionan
con una molécula del glicerol fosfato para formar el
ácido fosfatídico. Esta última molécula es precursora
de los triacilglicéridos y de los fosfolípidos. Para
sintetizar los primeros se hidroliza el fosfato, con
producción del diacilglicerol, el cual recibe enseguida
otra molécula de acil CoA, con la cual se completa el
triacilglicérido. La mayoría de las enzimas
participantes en este proceso son aciltransferasas y
tiocinasas.
En el organismo humano la acción de la
insulina estimula todo el proceso de la lipogénesis al
favorecer la entrada de la glucosa a los adipocitos, el
ciclo de las pentosas, la descarboxilación del
piruvato, la biosíntesis de los ácidos grasos y la
acumulación de los triacilglicéridos.
La hidrólisis de los triacilglicéridos en el tejido
adiposo, llamada también lipólisis, es estimulada a
nivel de la triacilglicérido lipasa en una acción
mediada a través de AMP cíclico, por numerosas
hormonas entre las cuales se cuentan: la epinefrina,
el glucagón, los glucocorticoides, la tiroxina y el
ACTH; mientras que es inhibida por la insulina y por
el incremento de la concentración de ácidos grasos
libres. La hidrólisis se completa por la acción de la
diacilglicérido lipasa y la monoacilglicérido lipasa que
en conjunto liberan un glicerol y tres ácidos grasos de
cada triacilglicérido.
F.5
Síntesis y degradación de fosfolípidos.
F.5.1
Describirá la síntesis de novo de los
fosfoglicéridos
y
de
los
esfingolípidos,
indicando
los
sustratos, intermediarios, enzimas y
productos de las vías.
F.5.2 Describirá la degradación de los
fosfoglicéridos
y
de
los
esfingolípidos.
La síntesis de los fosfoglicéridos es similar en los
pasos iniciales a la síntesis de los TAG: el glicerol 3fosfato se esterifica con dos acil CoA para formar
ácido fosfatídico. Este compuesto es el precursor de
todos los fosfoglicéridos. Existen dos estrategias para
la obtención de los fosfolípidos que contienen
glicerol, según la naturaleza de la cabeza polar.
En la formación de fosfatidilinositoles y de
cardiolipina, el ácido fosfatídico reacciona con CTP
para formar CDP-diacilglicerol, el cuál reacciona con
la cabeza polar (inositol o fosfatidilglicerol) para
formar el fosfoglicérido correspondiente.
El fosfatidilinositol puede ser fosforilado para
formar la familia de los fosfatidilinositol 4,5 bisfosfato.
Estos compuestos son hidrolizados por la fosfolipasa
C en respuesta al estímulo de algunas hormonas y
producen dos segundos mensajeros muy potentes:
IP3 y el diacilglicerol, los cuales causan movilización
de Ca2+ del retículo endoplásmico y proveen de ácido
araquidónico para la síntesis de prostaglandinas,
tromboxanos y leucotrienos.
En la síntesis de fosfadiletanolamina y de
fosfatidilcolina, el ácido fosfatídico pierde su fosfato y
el diacilglicerol resultante reacciona con CDP-colina o
CDP-etanolamina.
La fosfatidiletanolamina también puede
obtenerse por descarboxilación de fosfatidilserina y la
fosfatidilcolina por metilación de fosfatidiletanolamina,
utilizando S-adenosil metionina como donador de
metilos. La fosfatidilserina se obtiene por recambio
de la cabeza polar de la fosfatidiletanolamina por una
serina.
Las fosfatidilcolinas proporcionan ácidos
grasos para la síntesis de los ésteres de colesterol de
las HDL por la reacción de LCAT, mientras que la
dipalmitoilfosfa-tidilcolina es el principal componente
del surfactante pulmonar.
Degradación de fosfoglicéridos
Los fosfoglicéridos son hidrolizados por diversos
tipos de fosfolipasas que se clasifican según su sitio
67
de acción: la fosfolipasa A1 libera los ácidos grasos
de la posición de 1; la fosfolipasa A2 los libera de la
posición 2. La fosfolipasa C libera la cabeza polar
fosforilada que se encuentra en la posición 3 del
glicerol, mientras que, la fosfolipasa D libera la
cabeza polar.
Síntesis de esfingolípidos
Los esfingolípidos contienen una molécula de
esfingosina en lugar del glicerol. Sus precursores son
serina y palmitoil CoA. Los ácidos grasos activados
(acil CoA) reaccionan con el grupo amino de la
esfingosina para formar las ceramidas, quienes son
las precursoras de esfingomielinas, cerebrósidos y
gangliósidos.
Las esfingomielinas se obtienen de la reacción de la
ceramida con CDP-colina.
Los cerebrósidos se obtienen por la unión
directa de galactosa o glucosa a la ceramida. El
donador del azúcar es UDP-galactosa o UDPglucosa.
Los gangliósidos se forman por la adición
secuencial y ordenada de residuos de azúcar a la
ceramida. Los donadores de estos azúcares son
UDP-azúcares o el CMP-NeuAc (ácido Nacetilneuramínico o ácido siálico).
Los esfingolípidos son degradados por
enzimas
lisosomales
(hexosaminidasas,
galactosidasa, la sialidasa o la esfingomielinasa)
hasta
dar
ceramidas
y
los
azúcares
correspondientes. Existen una serie de defectos
genéticos en los que faltan estas enzimas lo que
conduce a una acumulación de gangliósidos que
causan graves consecuencias a la salud.
F.6
Metabolismo del colesterol.
F.6.1
F.6.2
F.6.3
Mencionará la importancia fisiológica
del colesterol.
Describirá la vía de síntesis del
colesterol
e
identificará
sus
sustratos, intermediarios y enzimas.
Conocerá la regulación de la
colesterogénesis a nivel enzimático,
a nivel de la síntesis de las enzimas,
así como por modificación covalente
F.6.4
inducida por hormonas (glucagon,
insulina y ACTH).
Describirá las modificaciones que
sufre el colesterol para la síntesis de
sales biliares, hormonas esteroidales
y vitamina D.
El colesterol es una molécula muy importante por su
interés clínico y el gran número de compuestos que a
partir de él se sintetizan, como las hormonas
esteroidales, las sales biliares y la vitamina D.
La síntesis del colesterol (colesterogénesis)
es una vía citoplásmica que se inicia a partir de la
unión de tres moléculas de acetil CoA, las que
forman el ß-hidroxi-ß-metilglutaril-CoA, precursor del
mevalonato. La enzima que produce este último
compuesto en la colesterogénesis es la ß-hidroxi-ßmetil glutaril-CoA reductasa, dependiente de NADPH.
Después de tres fosforilaciones para activar la
molécula, el mevalonato se descarboxila para formar
el isopentenil pirofosfato, unidad isoprenoide de
todos los terpenos. El isopentenil pirofosfato se une
con uno de sus isómeros para formar el geranil
pirofosfato, de 10 átomos de carbono que, por
combinación con otra molécula de isopentenil
pirofosfato, forma el farnesil pirofosfato, de 15
carbonos. Dos moléculas de farnesil pirofosfato se
unen por un enlace especial (cabeza-cabeza) para
formar el escualeno, de 30 carbonos.
El escualeno se cicliza y, por cambios
sucesivos de oxidación, descarboxilación y
reacomodo de electrones y grupos químicos, forma el
lanosterol, el zimosterol y finalmente el colesterol. La
vía de la colesterogénesis se regula principalmente
por colesterol endógeno o el que se obtiene a partir
de la dieta a nivel de la enzima ß-hidroxi-ßmetilglutaril-CoA reductasa.
El colesterol puede seguir diversos caminos:
a) Migra a la membrana, donde regula la fluidez de la
misma; b) Se transforma químicamente para producir
ácidos biliares por oxidación de su cadena lateral; c)
Pierde una cadena de seis átomos de carbono para
producir la pregnenolona, el precursor de todas las
hormonas esteroidales, sean progestágenos (como la
progesterona),
mineralcorticoides
(como
la
aldosterona), glucocorticoides (como el cortisol),
68
andrógenos (testosterona) y estrógenos (estrona y
estradiol); d) El colesterol también es precursor de la
vitamina D, que se obtiene por la ruptura del anillo B.
El colesterol se excreta principalmente como
sales biliares, aunque una parte puede eliminarse en
las heces como coprostanol, producto de la
degradación bacteriana del colesterol en el intestino
grueso.
F.7
Estructura
y
metabolismo
de
las
lipoproteínas.
F.7.1 Describirá los mecanismos de
transporte de los ácidos grasos
provenientes de la lipólisis y el de los
otros lípidos (TAG, ésteres de
colesterol y fosfolípidos) en el
organismo.
F.7.2 Conocerá la composición y la función
de las lipoproteínas (quilomicrones,
LDL, VLDL, HDL y Lp[a]).
F.7.3 Describirá el metabolismo de las
diferentes lipoproteínas.
Los lípidos son compuestos prácticamente insolubles
en agua que se transportan en el torrente circulatorio
mediante las lipoproteínas.
Las lipoproteínas son partículas globulares
de alto peso molecular con un núcleo formado por
lípidos hidrofóbicos –TAG y ésteres de colesterol–,
los cuales aportan la mayor parte de la masa de la
partícula, y por una sola capa superficial de
moléculas de fosfolípidos, colesterol y proteínas o
polipéptidos que rodean al núcleo y estabilizan la
partícula para que permanezca en solución dentro
del plasma.
La fracción proteica de las lipoproteínas se
conoce como apolipoproteína o apoproteína, de las
que se han aislado y caracterizado seis clases
principales: A, B, C, D, E y (a). Algunas de éstas son
integrales y no pueden ser removidas, en tanto que
otras pueden ser transferidas a otras lipoproteínas.
Las lipoproteínas principales que circulan en
el plasma humano se clasifican con base en su
densidad en quilomicrones, lipoproteínas de muy
baja densidad (LMBD o –según la sigla inglesa–
VLDL), las lipoproteínas de baja densidad (LBD o
LDL) y las lipoproteínas de alta densidad (LAD o
HDL). La densidad de las lipoproteínas refleja la
relación existente entre la cantidad de lípidos y de
proteínas.
Los quilomicrones transportan los lípidos de
la dieta desde el enterocito al tejido adiposo, la
glándula mamaria, el músculo y el hígado. Los lípidos
endógenos, principalmente los triacilglicéridos y el
colesterol se transportan desde el hígado a los
tejidos mediante las lipoproteínas VLDL. Las
apoproteínas características de las VLDL son la apo
B-100, apo-C y apo-E, de las cuales las dos últimas
son compartidas con los quilomicrones, los que
tienen además la apo-B48 y la apo-A. Tanto los
quilomicrones como las VLDL son llevados hasta los
capilares de los tejidos en donde su apo-CII activa a
la lipoproteína lipasa, quien hidroliza la mayor parte
de los triacilgliceroles de estas lipoproteínas hasta
glicerol y ácidos grasos, los que son tomados por los
tejidos para ser oxidados o almacenados en el tejido
adiposo.
Los restos de VLDL, que han perdido la
mayor parte de sus triacilgliceroles y algunas
apoproteínas y fosfolípidos, se convierten en LDL.
Las LDL contienen apo B-100 y transportan
colesterol a los tejidos.
Las lipoproteínas más pequeñas son las
HDL; éstas son ricas en fosfolípidos y proteínas y
dentro de sus funciones se cuenta el intercambio de
apoproteínas A, C y E con las demás lipoproteínas y
el transporte del colesterol extrahepático al hígado
(transporte inverso del colesterol).
El colesterol es transportado en la sangre por
tres diferentes lipoproteínas: las LDL (60 a 75%), las
HDL (15 a 35%) y las VLDL (10%). Las LDL y las
HDL tienen una función combinada en la
conservación del equilibrio del colesterol; las LDL
llevan el colesterol hacia las células y regulan la
síntesis de novo del colesterol en ellas; las HDL lo
eliminan de las células, es decir, captan el colesterol
liberado en el plasma procedente del recambio de
membranas y de células que mueren y lo llevan al
hígado para su metabolismo o excreción.
Además de las clases ya mencionadas de
lipoproteínas existe la lipoproteína (a) [Lp(a)], la cual
tiene una composición lipídica muy similar a la LDL,
69
contiene apoB-100 y una glucoproteína llamada
apo(a). La apo(a) es polimórfica (de longitud y
secuencia) y tiene una gran homología con el
plasminógeno. Esta homología es importante porque
la Lp(a) se asocia con el bloqueo de la activación del
plasminógeno y la consiguiente lisis de los coágulos
de fibrina, así como con la estimulación de la
proliferación de células musculares lisas, procesos
que pueden estar en el origen de lesiones
ateroscleróticas. Además, la apo(a) dificulta el
catabolismo mediado por el receptor de LDL al que
se fija e interfiere, de esta manera, con el
metabolismo y transporte del colesterol. La
concentración de Lp(a) en sujetos normales es de ~5
mg/dl; las cifras >30 mg/dl constituyen otro valor de
predicción de un alto riesgo de aterosclerosis y
trombosis.
F.8
Regulación y alteraciones del metabolismo
de lípidos.
F.8.1 Describirá el estado del metabolismo
lipídico y sus alteraciones en el
estrés,
obesidad,
dislipoproteinemias,
hígado
graso
e
hipercolesterolemias, quienes son
factores de riesgo de aterosclerosis.
F.8.2 Identificará el papel de la leptina en
la regulación del peso corporal y del
apetito.
Realización de la práctica 10 "Determinación de
lípidos y lipoproteínas plasmáticas" (ver pág.162).
Discusión de los casos clínicos 4 “Cetosis por
inanición. Obesidad” y 5 “Hipercolesterolemia y
aterosclerosis” ver pág. (199 y 200).
Lecturas recomendadas
1.
Libby P. Atherosclerosis the new view.
Scientific American. 2002; 286( 5): 28-37.
2.
NIH (National Institutes of Health) consensus
conference. Triglyceride, HDL, and coronary
heart disease. JAMA. 1993; 269 (4): 505-510.
3.
Alba ZayasL, Pereira RG, Aguilar BA.
Lipoproteína (a): estructura, metabolismo,
genética y mecanismos patogénicos. Rev
Cub Invest Biomed. 2003; 22(1): 32-40.
4.
5.
6.
Martínez AE, González MO. La leptina, una
hormona novedosa. Investigadores Médicos.
2003; IV (5):1097-1103.
Sabath EFS. Leptina. Rev Inv Clín. 2002; 54
(2): 161-165.
Villaseñor A. El papel de la leptina en el
desarrollo de la obesidad. Rev Endocrin
Nutr. 2002; 10 (3):135-139.
Los lípidos son compuestos que se han relacionado
con varias patologías.
La regulación del metabolismo lipídico se
ejerce en respuesta a las diferentes necesidades
energéticas y los estados de la dieta de un
organismo (ayuno-alimentación). La síntesis y la
degradación de los TAG y del colesterol son
procesos que afectan a todo el organismo, con sus
órganos y tejidos formando una red interdependiente
conectada por la corriente sanguínea. La sangre
transporta los TAG en forma de quilomicrones y
VLDL, los ácidos grasos en forma de complejos con
albúmina y el colesterol asociado a VLDL, LDL y
HDL. Las células pancreáticas perciben los estados
de la dieta del organismo y responden liberando
hormonas (insulina o glucagon) que regulan la
velocidad de las rutas opuestas del metabolismo de
lípidos y controlan si se han de degradar o sintetizar
los ácidos grasos, los TAG, los fosfolípidos o el
colesterol.
La regulación metabólica se puede ejercer a
corto plazo (disponibilidad de sustratos, interacciones
alostéricas y modificaciones covalentes) o a largo
plazo (control de la síntesis y degradación de las
enzimas). Otro nivel de regulación se relaciona con el
transporte de los lípidos de un tejido a otro.
Los lípidos más abundantes del organismo
son los TAG almacenados en el tejido adiposo, los
cuales se hidrolizan por la acción de una lipasa
sensible a hormonas como el glucagon, la epinefrina
y los glucocorticoides, obteniendo glicerol y ácidos
grasos que salen a la circulación. Estos últimos se
asocian a albúmina y se transportan al hígado,
corazón y músculo para ser oxidados hasta CO2 y
H2O, con la producción consecuente de ATP. Las
condiciones
fisiológicas
y
metabólicas
que
determinan la movilización de grasas del tejido
70
adiposo pueden ser alteradas por situaciones de
estrés (dolor, fiebre, infecciones, miedo, hemorragia,
hipoglucemia) en las que se estimula la
adenohipófisis, que secreta ACTH, induciendo la
secreción de glucocorticoides. La ACTH y los
glucocorticoides aceleran la hidrólisis de los TAG.
La concentración de los TAG almacenados
en los adipocitos depende de la velocidad de su
recambio (síntesis e hidrólisis). Cuando el
almacenamiento de energía en forma de TAG en el
tejido adiposo es excesivo, se establece una
condición llamada obesidad, la cual correlaciona con
un promedio de vida menor y con un aumento en
problemas de salud, principalmente de tipo
cardiovascular. Muchos factores conducen a ella,
pero la causa básica es una ingesta calórica por
encima de los requerimientos energéticos estándar.
El apetito se regula por la presencia de
compuestos antianoréxicos. La síntesis de estos
compuestos se ve afectada por la presencia de una
proteína pequeña que se libera por las células
adiposas: la leptina. La ausencia de esta proteína o
de su receptor en las células del hipotálamo
implicadas en la regulación del apetito se asocia con
la aparición de obesidad en ratones. Su papel está
actualmente en estudio en humanos.
Existen otras alteraciones de los lípidos
asociadas al metabolismo de las lipoproteínas. Estas
alteraciones se conocen en general como
dislipoproteinemias, en las que hay modificaciones
de los niveles de colesterol y/o TAG en sangre.
En las hipercolesterolemias familiares, los
receptores celulares para lipoproteínas de baja
densidad (LDL) son deficientes. Por lo tanto las LDL
no pueden ser captadas por las células y degradadas
por las enzimas lisosomales. El consecuente
incremento de LDL en sangre se asocia con
xantomas (depósitos de lípidos, frecuentemente
encontrados bajo la piel) y enfermedades de arterias
coronarias. En las hipertriacilgliceridemias se
encuentran bajos niveles de lipoproteína lipasa (LPL)
o apo CII (el activador de LPL) y TAG aumentados.
Estas deficiencias se asocian con xantomas
característicos e intolerancia a comidas ricas en
grasas. El tratamiento involucra dietas bajas en
ácidos grasos saturados y colesterol y el uso de
agentes
hipolipemiantes
como
las
resinas
secuestradoras de ácidos biliares, la niacina y los
inhibidores de la 3-hidroxi-3 metilglutaril- CoA (HMGCoA) reductasa.
En condiciones de estrés metabólico, la
capacidad para secretar VLDL no es suficiente para
la síntesis aumentada de TAG. Esto ocasiona que el
depósito de AG y TAG en el tejido hepático se vuelva
excesivo
estableciéndose una condición tóxica
llamada hígado graso. Sin embargo, el hígado graso
ocurre especialmente en condiciones tóxicas graves,
cuando la síntesis de las apolipoproteínas,
requeridas para la formación de VLDL, es inferior a la
disponibilidad de ácidos grasos, ocasionando su
acumulación.
Esta
situación
se
observa
frecuentemente en las personas que ingieren
constantemente grandes cantidades de etanol y una
dieta hipoproteica. La oxidación del etanol
proporciona la energía necesaria para mantener las
funciones celulares, pero también favorece la síntesis
de ácidos grasos debido a un aumento en la
disponibilidad de NADH y al aumento en la actividad
de la fosfatidato fosfohidrolasa.
Finalmente la obesidad, sobre todo el patrón
masculino de depósito centrípeto o visceral de la
grasa, favorece una dislipidemia aterogénica que se
caracteriza por el aumento de los TAG plasmáticos,
la disminución de HDL y la intolerancia a la glucosa.
La aterosclerosis involucra la formación de placas
ricas en lípidos en la íntima de las arterias. Las
placas empiezan como rayas grasas conteniendo
células espumosas, las cuales son inicialmente
macrófagos llenos de lípidos, particularmente ésteres
de colesterol. Estas lesiones primarias desarrollan
placas fibrosas que pueden ocluir la arteria y causar
un infarto cerebral o al miocardio. La formación de
estas placas está frecuentemente asociada como se
mencionó anteriormente, con anormalidades en el
metabolismo
de lipoproteínas plasmáticas. En
contraste con estas lipoproteínas, las lipoproteínas
de alta densidad (HDL) tienen un efecto protector.
Como parte de la estrategia general para limitar la
aterosclerosis hay que controlar la hipertensión, si
fuera necesario con farmacoterapia. La mayoría de
los enfermos con diabetes mellitus fallece a
consecuencia
de
aterosclerosis
o
sus
71
complicaciones. El control riguroso de la glucemia en
estos enfermos disminuye las complicaciones
microvasculares de la diabetes, por lo que se
recomienda prestar atención al control de la
glucemia.
La leptina es una hormona de naturaleza
proteica constituida por 167 aminoácidos que circula
en el plasma sanguíneo y regula el peso corporal y
los depósitos de grasa, a través de sus efectos en el
metabolismo y el apetito. En general, induce una
disminución en el apetito y un incremento en el gasto
energético.
La leptina es producida y liberada por el
tejido adiposo blanco fundamentalmente como una
señal de saciedad, aunque se ha visto también que
se produce en tejido adiposo marrón, en la placenta y
en algunos tejidos fetales, como el corazón, hueso y
cartílago.
La síntesis y la secreción de leptina están
directamente relacionadas con la cantidad de grasa
corporal y el tamaño del adipocito. Aunque factores
como la edad, el sexo, el índice de masa corporal, la
actividad física, el fumar, la hipertensión, el colesterol
en HDL, la concentración plasmática en ayuno de
triacilgliceroles, de glucosa y de insulina también
afectan la secreción de leptina. Así por ejemplo, la
concentración de la hormona es hasta cuatro veces
mayor en mujeres que en hombres. El fumar puede
traer cambios en el peso corporal, al modificar la
sensibilidad de los receptores del hipotálamo a la
leptina y en consecuencia modular la síntesis de
hormona, reduciendo el peso corporal.
El hipotálamo es el sitio de mayor acción de
leptina. La acción más importante de la leptina en
este órgano es la disminución en la producción del
neuropéptido Y (NPY). Las implicaciones de estos
cambios son las siguientes:
Incremento en el NPY
Incremento en la leptina
(disminución de leptina)
(diminución en el NPY)
Se presenta hiperfagia
Hipofagia
Aumento en la secreción de
Incremento
insulina mayor respuesta a la
energético
en
insulina en tejido adiposo
Aumento de peso
Pérdida de peso
el
gasto
En general podemos decir que la concentración de la
leptina aumenta después de la ingesta de alimento y
disminuye durante el ayuno y la diabetes. La insulina
y los glucocorticoides aumentan la síntesis de esta
hormona, mientras que las catecolaminas, los
andrógenos y los ácidos grasos de cadena larga la
inhiben.
G. Metabolismo
nitrogenados
de
los
compuestos
Al finalizar esta subunidad, el alumno describirá los
procesos más importantes del metabolismo de los
compuestos nitrogenados.
G.1
Aminoácidos y proteínas.
G.1.1 Conocerá de manera general cómo
se realiza en el organismo la
digestión de las proteínas y la
absorción de los aminoácidos.
G.1.2 Identificará las fuentes nutricionales
de los aminoácidos.
G.1.3 Describirá
las
reacciones
de
transaminación y desaminación e
identificará la localización subcelular,
sustratos, enzimas y productos de la
actividad de estas enzimas.
G.1.4 Identificará el papel de la glutamina y
del
ácido
glutámico
en
el
metabolismo de los compuestos
nitrogenados. Describirá el papel de
la glutamino sintetasa, de la
glutamato deshidrogenasa, de las
transaminasas y de la glutaminasa
en
el
metabolismo
de
los
compuestos nitrogenados.
G.1.5 Señalará las causas de la toxicidad
del ión amonio y los mecanismos del
organismo para combatirla.
G.1.6 Describirá el proceso de síntesis de
la urea e indicará la localización
subcelular, sustratos, enzimas y
productos de la vía. Describirá la
regulación de la síntesis de urea, así
como los defectos en el metabolismo
que producen alteraciones en este
72
proceso;
señalará
sus
consecuencias fisiológicas.
G.1.7 Identificará a los aminoácidos
precursores
de
Į-cetoglutarato,
piruvato, acetoacetato, fumarato y
oxaloacetato.
G.1.8 Identificará a los aminoácidos
precursores de las siguientes
aminas: acetilcolina, catecolaminas,
serotonina, carnitina, poliaminas y
creatinina.
G.1.9 Conocerá las bases metabólicas de las
siguientes alteraciones congénitas
del
metabolismo:
acidemia
propiónica, acidemia metilmalónica,
hipervalinemia,
fenilcetonuria
y
alcaptonuria.
Realización de la práctica 11 "El efecto del
tetracloruro de carbono sobre las transaminasas” (ver
pág. 170).
Los aminoácidos son el sustrato más importante del
metabolismo nitrogenado en los organismos
superiores pues de ellos derivan proteínas, purinas,
pirimidinas, porfirinas, péptidos y hormonas, entre
otros compuestos y, además, sus esqueletos
carbonados se oxidan para liberar energía.
Todos los aminoácidos de los sistemas vivos
se encuentran como parte de un “pool” o poza
(reserva) metabólica cuya magnitud se mantiene
constante mediante un equilibrio entre la entrada y la
salida de aminoácidos. Desde la poza, los
aminoácidos son llamados hacia sus diferentes
destinos metabólicos:
1. Participar en el proceso de la nutrición por medio
de la síntesis de nuevas proteínas.
2. La síntesis de compuestos nitrogenados no
proteicos.
3. Su entrada a la gluconeogénesis para sintetizar
glucosa.
4. Su degradación oxidativa para la producción de
energía.
1.
Nutrición. Los aminoácidos son oxidados
constantemente en los animales y el nitrógeno
excretado tiene que ser repuesto para mantener un
balance nitrogenado que, en los adultos normales,
se encuentra en equilibrio; en los jóvenes, las
embarazadas y los convalecientes es positivo y en
los ancianos, los enfermos y los desnutridos el
balance nitrogenado es negativo.
Los aminoácidos ingresan al organismo
humano formando parte de las proteínas de la
dieta que, por lo general, aportan alrededor de 10%
de las kilocalorías diarias; sin embargo, el valor
principal de los aminoácidos recibidos reside en el
aporte de las estructuras moleculares que el
organismo humano no puede sintetizar por sí
mismo y que son los aminoácidos indispensables o
esenciales cuya presencia determina en gran parte
la calidad de la dieta; ellos son: ARGinina, LISina,
METionina,
HIStidina,
TREonina,
VALina,
FENilalanina, LEUcina, IsoLEucina y TRIptofano
(ALM-HTV-FLIT).
2.
Compuestos nitrogenados. Los aminoácidos
participan en la síntesis de numerosos compuestos
nitrogenados que no son proteínas, por ejemplo,
los oligopéptidos glutatión y carnosina; las bases
nitrogenadas de los ácidos nucleicos y los
fosfolípidos;
las
hormonas
derivadas
de
aminoácidos como la epinefrina, tiroxina y
serotonina; las hormonas peptídicas como el
glucagón, la ACTH y la oxitocina; los
neurotransmisores como la dopamina y el
aminobutirato gamma; los neuropéptidos como las
endorfinas y los factores liberadores; las porfirinas
como el grupo hemo; los pigmentos como la
melanina; las aminas como la histamina y varios
compuestos más.
3. Gluconeogénesis. Una porción considerable de la
síntesis diaria de glucosa que se realiza en el
hígado se hace a partir de los aminoácidos que
reciben, por esto, el nombre de aminoácidos
glucogénicos. Con la excepción de la leucina y la
lisina, todos los aminoácidos tienen la capacidad
de aportar todo o parte de su esqueleto carbonado
para que se incorpore a la síntesis de la glucosa y
esto se logra, en un primer paso, mediante la
pérdida del grupo amino por transaminación, lo
73
cual deja libre la cadena carbonada bajo la forma
de un cetoácido.
Los cetoácidos mitocondriales resultantes:
alfa-cetoglutarato,
succinil-CoA,
fumarato,
oxaloacetato y piruvato confluyen hacia la
formación del oxaloacetato citoplásmico que
ingresa al eje central del metabolismo y se
transforman en fosfoenol piruvato que alimenta la
gluconeogénesis. Dos moléculas de este último
siguen el reverso de la vía glucolítica hasta su
transformación en glucosa.
4. Oxidación. Para la oxidación de su esqueleto
carbonado los aminoácidos pierden primero al
grupo amino, lo cual se lleva comúnmente a cabo
mediante la transaminación acoplada a la
desaminación
oxidativa
(transdesaminación),
proceso reversible en el cual un aminoácido
transamina primero con el alfa-cetoglutarato y le
transfiere su grupo amino para formar glutamato y
éste es desaminado enseguida por la glutamato
deshidrogenasa con producción de NADH y
liberación de amonio. El metabolismo del esqueleto
de carbono se aparta entonces de la ruta seguida
por el grupo amino ya que, para el primer caso, los
carbonos pueden ser llevados hacia la oxidación
en el ciclo de Krebs y la cadena respiratoria, o
bien, incorporarse a la gluconeogénesis en el
hígado para la síntesis de glucosa; en tanto que el
ion amonio será transportado hasta el hígado en
donde será tomado por la vía metabólica del ciclo
de la urea.
La oxidación del esqueleto carbonado de
los aminoácidos procede mediante su agrupación
en “familias” o grupos de aminoácidos que, al
transformarse en el metabolismo, confluyen hacia
alguno de los intermediarios de la glucólisis, la
descarboxilación del piruvato o del ciclo de Krebs.
Los glucogénicos son de la familia del:
Piruvato:Tre, Gli, Ser, Ala, Met, Cis y Tri
Alfa-cetoglutarato: Pro, His, Arg, Gln y Glu
Succinil-CoA: Ile, Val, Met
Fumarato: Tir, Fen, Asp
Oxaloacetato: Asn, Asp
Acetoacetil-CoA: Tri, Lis
Acetil-CoA: Tre, Leu, Ile
El ciclo de la urea
El mecanismo de la transdesaminación permite el
acopio de los grupos amino de los diferentes
aminoácidos en la molécula del glutamato, la cual, al
ser
desaminada
oxidativamente
por
la
deshidrogenasa del glutamato, libera el ion amonio.
Dado que este compuesto es muy tóxico para el
sistema nervioso central, se elimina mediante la
síntesis de urea. Esta síntesis se lleva a cabo en el
hígado mediante un proceso metabólico denominado
el ciclo de la urea, la primera parte del cual se realiza
en la mitocondria y el resto en el citoplasma de la
célula hepática.
El ciclo de la urea (fig. III.2) que permite
mantener una muy baja concentración de amonio
libre, se inicia con la síntesis del carbamil fosfato a
partir del amonio y el CO2 con un gasto de 2 enlaces
de alta energía. El carbamil fosfato entrega el grupo
carbamino a la molécula de ornitina, la cual actúa
como portadora de grupos en las cuatro reacciones
del ciclo:
1. Transferencia del carbamino a la ornitina para
formar citrulina: ornitina transcarbamilasa.
2. Condensación de la citrulina con el aspartato. Se
forma el arginino-succinato con gasto de 2ATP:
arginino-succinato sintetasa.
3. Ruptura del arginino-succinato. Se desprende
fumarato y se produce arginina: arginino-succinato
liasa.
4. Hidrólisis de la arginina para regenerar a la ornitina
y liberar urea: arginasa.
En resumen, para formar una molécula de urea se
requiere de un ion amonio, un CO2 y un aspartato. Se
produce una molécula de fumarato y una de urea,
con gasto de cuatro enlaces de alta energía
provenientes del ATP.
G.2
Nucleótidos.
G.2.1
Y los cetogénicos son de la familia del:
Acetoacetato:Leu, Tir, Fen
Conocerá
las
características
generales de las bases nitrogenadas,
74
los nucleósidos y nucleótidos:
estructura química y funciones.
Discusión del caso clínico 6 "Gota" (ver pág. 202).
Los nucleótidos están formados por ribosa o
desoxirribosa, una base nitrogenada que puede ser
una purina o una pirimidina, y una, dos o tres
moléculas de ácido fosfórico. Dependiendo del
número de grupos de fosfato presentes, los
nucleótidos pueden ser mono, di, o trifosforilados.
Ácido fosfórico—Ribosa—Base nitrogenada
Los nucleósidos se diferencian de los
nucleótidos en que no tienen ácido fosfórico.
Ribosa — Base nitrogenada
G.2.2 Con base en un esquema general de
la síntesis de las bases púricas y
pirimídicas
describirá
sus
mecanismos de regulación.
G.2.3 Identificará los sustratos y productos
de las vías de ahorro en la síntesis
de purinas.
G.2.4 Identificará
las
causas
y
consecuencias fisiológicas de la
sobreproducción de ácido úrico.
G.2.5 Describirá el efecto del alopurinol
sobre la xantina oxidasa y el que
ejercen
algunas
drogas
anticancerígenas,
como
la
mercaptopurina, el 5-fluorouracilo, el
metotrexato y la tioguanosina sobre
la síntesis de purinas y pirimidinas.
Realización de la práctica 12 "Estudio de los
productos finales del metabolismo nitrogenado" (ver
pág. 171).
Las bases nitrogenadas pueden ser purinas o
pirimidinas. Las purinas están formadas por dos
anillos heterocíclicos (formados por diferentes tipos
de átomos), uno con seis miembros y otro con cinco
miembros, y son la adenina y la guanina. Las
pirimidinas están formadas por un anillo heterocíclico
de seis miembros y las más importantes son: uracilo,
timina y citosina.
Los nucleótidos y nucleósidos púricos tienen
funciones muy variadas en los seres vivos; entre las
más importantes están la de servir como sustratos
acarreadores de energía, segundos mensajeros,
neurotransmisores, coenzimas, etcétera.
Los nucleótidos pirimídicos intervienen como
acarreadores en la biosíntesis de polisacáridos y de
fosfolípidos. Los nucleótidos púricos y pirimídicos
forman parte de los ácidos nucleicos y
desoxirribonucleicos.
La síntesis de purinas se lleva a cabo en el
citoplasma celular y comprende las siguientes tres
fases:
1. Activación, en la que la ribosa 5 fosfato adquiere
dos moléculas de fosfato que se asocian al
carbono 1 de la molécula; esta reacción es llevada
a cabo por la fosforribosil pirofosfato sintetasa, la
cual es una de las enzimas reguladoras de la
síntesis de purinas y de pirimidinas.
2. Formación de los anillos heterocíclicos, en donde
varias enzimas intervienen añadiendo los
75
diferentes átomos que componen al anillo purínico
hasta formar inosina monofosfato.
La primera reacción, catalizada por la enzima
fosforribosilglicinamida sintetasa, es reguladora de la
síntesis de purinas y su velocidad depende de las
concentraciones de sus sustratos.
3. A partir de la inosina monofosfato se sintetizan la
guanosina monofosfato y la adenosina monofosfato
por medio de dos vías metabólicas que se regulan
mutuamente. Las altas concentraciones de GTP
estimulan la síntesis de AMP y las altas
concentraciones de ATP estimulan la síntesis de
GMP.
La síntesis de pirimidinas también se lleva a
cabo en el citoplasma y se inicia con la síntesis de
carbamilfosfato a partir de glutamina, CO2 y ATP en
una reacción catalizada por la enzima carbamilfosfato
sintetasa citoplasmática que es una reacción
parecida a la que ocurre en la mitocondria para la
biosíntesis de la urea; posteriormente, se adiciona
ácido aspártico para producir ácido orótico al cual se
une una molécula de fosforribosilpirofosfato y se
descarboxila para dar la uridina monofosfato. A partir
de ésta se sintetizan la citidina monofosfato y la
timidina monofosfato.
Las purinas se catabolizan por dos caminos
metabólicos:
1. En la vía del ahorro de las purinas, la adenina, la
hipoxantina o la guanina son reaprovechadas y,
por medio de la enzima fosforribosiltransferasa
correspondiente, se vuelve a formar el AMP, IMP o
GMP.
2. En una secuencia de reacciones cuyo producto
final es el ácido úrico, que es la forma en la que se
excretan las bases púricas.
El catabolismo de las pirimidinas se lleva a
cabo por una serie de reacciones cuyos productos
finales son la malonil-CoA y la metilmalonil CoA;
estos dos productos se catabolizan hasta CO2 y
agua. El exceso en el catabolismo de purinas genera
una sobreproducción de ácido úrico que tiende a
acumularse en las articulaciones distales, lo que
produce el síndrome de gota. Esto se debe a que el
ácido úrico es insoluble en ambientes con un pH
menor a 6.0, lo que hace que no se pueda eliminar
por la orina. Este síndrome se produce cuando las
concentraciones de purinas son altas, ya sea por
aporte elevado o por exceso en el catabolismo de las
mismas.
Los análogos de los nucleótidos se han
utilizado como inhibidores de algunas enzimas; por
ejemplo, la azaserina y la acivicina, análogos de la
glutamina, se usan como inhibidores de la enzima
glutamina amino transferasa que interviene en la
síntesis de purinas. El metotrexato y el 5-fluorouracilo
se usan como inhibidores de la síntesis de dTMP. La
aplicación de estos inhibidores en pacientes con
procesos neoplásicos da como resultado la
disminución de la síntesis del DNA y del crecimiento
celular.
El alopurinol se usa en el tratamiento del
síndrome de gota porque es un análogo de la
hipoxantina y actúa como inhibidor de la enzima
xantina oxidasa y de la producción de ácido úrico.
H.
Regulación e integración metabólica
Al finalizar esta subunidad, el alumno será capaz de
analizar los mecanismos de regulación del
metabolismo y de su integración en algunas
condiciones fisiológicas.
H.1
H.2
H.3
Conocerá cómo se lleva a cabo la regulación
del metabolismo.
Analizará los cambios adaptativos que
ocurren en las siguientes condiciones
normales y patológicas: ejercicio intenso,
embarazo-lactancia, vejez, ayuno, obesidad,
desnutrición, diabetes mellitus y gota.
Conocerá los mecanismos de acción
hormonal e identificará los receptores
membranales
y
las
cascadas
de
amplificación: la adenilato ciclasa (AMP
cíclico), la fosfolipasa C (fosfoinosítidos,
calcio) y la GMPc fosfodiesterasa (GMP
cíclico).
Lecturas recomendadas
1.
Scott JD, Pawson T. Cell communication the
inside story. Scientific American. 2000; 282
(6): 54-61.
76
2.
Kholodenko BN, Westerhoff HU. The
macroworld
versus
microworld
of
biochemical regulation and control. TIBS.
1995; 20: 52-54.
Las células y los organismos son sistemas
relativamente aislados en un estado casi
estacionario. Las funciones de los organismos vivos
como un todo o como sus partes están reguladas con
el objetivo de asegurar un máximo de supervivencia.
Ya que los sistemas vivos reaccionan en el espacio y
el tiempo, se emplea tanto una regulación en el
espacio y en el tiempo.
La regulación espacial se expresa a través
del grado de organización de las estructuras; el
mantenimiento de la estabilidad estructural de las
proteínas, en la asociación de las enzimas que
cooperan en los complejos multienzimáticos, su
localización
en
compartimentos
definidos
(mitocondria, retículo endoplásmico) y por la
especialización de células y tejidos mediante
procesos de diferenciación.
El tiempo está involucrado en la regulación
principalmente en términos de modificación de las
velocidades de reacción (metabólica, de transporte y
otras). En la práctica, se utilizan ambas dimensiones
simultáneamente.
En bioquímica una de las principales señales
para regular los procesos metabólicos es la
concentración de moléculas. Los mecanismos
regulatorios son efectivos a diferentes niveles de
organización pero sus bases son siempre
moleculares. Las funciones de un organismo pueden
regularse a través de reacciones que se realizan en
las células (regulación metabólica) y a nivel de todo
el organismo (control hormonal y nervioso). En una
célula, los procesos metabólicos están controlados
principalmente por regulación de la actividad de las
enzimas individuales.
Las enzimas pueden regularse de varias
maneras:
1. Cambiando la concentración de los sustratos
(como una señal metabólica) lo que resulta en
cambios en la actividad enzimática, permaneciendo
constante la cantidad de enzima involucrada. Los
cambios en la concentración de un compuesto
señal se logran muchas veces a través de la
compartimentalización, es decir, a través de
membranas que separan la célula del medio
extracelular y por los pequeños compartimentos en
el interior de la célula, éstas siendo separadas
espacialmente (por membranas) o funcionalmente
(por acarreadores).
2. Cambiando la concentración de los efectores
(activadores o inhibidores) en las enzimas
alostéricas. Al interactuar con el sitio alostérico de
la enzima, estos efectores pueden aumentar o
disminuir la actividad enzimática con base en los
cambios cooperativos de la conformación de las
subunidades que componen a la enzima. La
cantidad de la enzima alostérica no cambia durante
el proceso.
3.
Por inducción o por represión cuando, en
contraste con los dos mecanismos anteriores, la
cantidad de enzima y, por tanto, su actividad total
en el sistema cambian. La cantidad de enzima por
célula depende de la presencia de una proteína
represora que es codificada por un gen regulador y
que, en su forma activa, se une a una región del
DNA (operador) e impide la unión de la RNA
polimerasa al promotor. De esta manera, inhibe la
síntesis de algunas enzimas (represión). Algunos
compuestos de bajo peso molecular (inductores)
pueden interactuar con el represor y cambiarlo a
una forma inactiva que no puede inhibir la síntesis
de una enzima dada ; esto es la inducción de su
síntesis; Fundamentalmente, no se abren nuevas
vías metabólicas, simplemente se liberan o se
bloquean las ya existentes, principalmente por el
principio de retroalimentación, en el que la
regulación se ejerce sobre la actividad de la
enzima en una forma prácticamente instantánea y
reversible.
Los sistemas multienzimáticos son aquellos
en los cuales las enzimas individuales están
organizadas de tal manera que el producto de una
reacción sirva como sustrato de la siguiente enzima.
Aquí, la regulación por retroalimentación juega un
papel importante, ya que el producto de una
secuencia de reacciones controla la actividad de una
de las enzimas precedentes, generalmente la primera
de la secuencia. El control por retroalimentación
77
generalmente es negativo, es decir, un aumento en la
concentración del producto inhibe a la enzima
regulatoria. En los sistemas multienzimáticos, una de
las reacciones parece ser la reacción limitante de la
velocidad, es decir, procede a su velocidad máxima
posible. Otra manera de regular los procesos es a
través de isoenzimas.
La regulación al nivel de un organismo
requiere la existencia de células y de estructuras
diferenciadas especiales con una función de control
(células nerviosas, glándulas endócrinas). Se sabe
que estas células producen ciertos compuestos que
pueden ser considerados como portadores de
información, señales que se transportan de una parte
del organismo a otra.
La regulación del metabolismo celular puede
llevarse a cabo por las hormonas, moléculas de
diversa naturaleza química que pueden alcanzar a
algunas células del organismo ; quienes presentan
receptores para ellas (tejidos blanco); y afectar su
función, Para aumentar la eficiencia de la regulación,
las hormonas se transportan a menudo de la célula
que las origina hasta el tejido blanco en asociación
con una proteína específica. Se ha asumido que el
proceso básico de la regulación hormonal es la unión
de la hormona a su receptor, el que puede
encontrarse en la superficie celular o en el
citoplasma.
En el primer caso la hormona no penetra en
la célula sino que, en algunos casos, reacciona con
una proteína asociada a la adenilato ciclasa, que a
su vez cataliza la formación de AMP cíclico a partir
de ATP. Por eso el AMP cíclico se conoce a menudo
como el "segundo mensajero" porque afecta a un
gran número de reacciones intracelulares (por
ejemplo, la activación de la proteína cinasa A). La
fosforilación de proteínas produce cambios en la
actividad de algunas enzimas claves en el
metabolismo de los carbohidratos y de los lípidos.
Otras hormonas, al interactuar con su receptor
extracelular activan a la fosfolipasa C, produciendo
los «segundos mensajeros» Inositol trifosfato y
diacilglicerol, los cuales regulan la concentración de
calcio citoplásmico, quien es una nueva señal de
regulación metabólica. Una tercera molécula que
actúa como segundo mensajero intracelular es el
GMP cíclico.
Existe otro mecanismo por el que actúan las
hormonas cuyo receptor se encuentra en la
membrana. En este caso, la interacción de la
hormona con el receptor, provoca que éste se
autofosforile y una vez ocurrido este evento, el
receptor fosforila a otras proteínas blanco. El proceso
secuencial fosforilación de proteínas, se convierte en
la manera en la que la señal se transmite a las
moléculas implicadas en la regulación de algunas
vías. La hormona insulina actúa mediante este
mecanismo.
Otras hormonas –como las esteroidales y las
tiroideas– cruzan la membrana celular y reaccionan
con una proteína receptora en el citoplasma. El
complejo viaja entonces hasta el núcleo donde, a
nivel del DNA, aumenta la producción del RNAm y
del RNAr específicos. Éstos controlan entonces la
síntesis de las enzimas que intervienen en la
regulación de los procesos metabólicos.
78
CONTENIDO TEMÁTICO
Tercera Unidad Temática
BIOLOGÍA MOLECULAR
79
IV
Biología molecular
Al finalizar esta unidad, el alumno será capaz de identificar las diferentes moléculas
informacionales de la célula y su organización; los mecanismos por los que fluye la
información genética; los mecanismos por los que se regula la expresión genética en los
diferentes estadios del ciclo celular, y el empleo de algunas técnicas de manipulación del
DNA útiles en medicina. La unidad se divide en:
A. Organización del genoma.
B. Flujo de la información genética.
C. Mutaciones y reparación del DNA.
D. Niveles de regulación de la expresión genética.
E. Virus, oncogenes y transformación.
F. Técnicas de manipulación del DNA.
A. Organización del genoma
Al finalizar esta unidad el alumno conocerá la
estructura de los ácidos nucleicos y sus
diferentes niveles de organización.
A.1 Estructura de los ácidos nucleicos.
A.1.1 Identificará
los
diversos
componentes de los ácidos
nucleicos
y
señalará
las
diferencias que existen entre el
DNA y los diversos tipos de RNA.
Conocerá el significado de los
patrones de metilación del DNA
como
mecanismo
de
identificación de su origen.
A.1.2 Reconocerá
las
diferentes
conformaciones del DNA (A, B y
Z).
A.1.3 Describirá
las
estructuras
primaria, secundaria y terciaria
de los ácidos nucleicos y hará
énfasis en lo dinámico de estas
moléculas.
La información genética es el conjunto de
datos que determinan la estructura y
propiedades funcionales en las células. La
información genética es almacenada en el
núcleo de los eucariotos en estructuras
llamadas cromosomas. En el caso de los
procariotos, el cromosoma se encuentra
disperso en el citosol. El núcleo es un
orgánulo separado del citoplasma por la
membrana nuclear, que de hecho, es una
doble membrana que presenta poros con un
diámetro de 30 a 100 nm, a través de los
cuales
las
macromoléculas
pueden
intercambiarse entre el citoplasma y el
núcleo. La membrana nuclear, además,
participa directamente en la duplicación del
80
DNA y permite la comunicación directa del
núcleo con el medio que lo rodea. La mayoría
del material nuclear está formado por
nucleoproteínas cuyo principal componente
es el ácido desoxirribonucleico (DNA); en un
núcleo en interfase las nucleoproteínas
forman filamentos de grosor variable (30 nm
en promedio). El grosor de estos filamentos
depende de la presencia o la ausencia de
proteínas que interactúan con la doble hélice
del DNA, mientras que su longitud depende
del peso molecular de las cadenas del DNA.
Así, un cromosoma contiene oléculas del
DNA de varios centímetros de longitud y
10
tiene aproximadamente 10
de peso
molecular.
Además
del
ácido
desoxirribonucleico, existe otro tipo de ácido
nucleico: el RNA. Se conocen tres tipos
diferentes del RNA: los RNA mensajeros
(RNAm), que llevan la información para una
cadena polipeptídica; los RNA ribosomales
(RNAr), que forman parte de la estructura de
los ribosomas y que son de diferente tamaño
(16S, 5S y 23S, en el caso de procariotos;
18S, 5S, 5.8S y 28S, en el caso de
eucariotos; los RNA 16S y 18S se
encuentran en la subunidad pequeña de los
ribosomas, mientras que los otros se
encuentran en la subunidad grande de los
mismos) y los RNA de transferencia (RNAt),
que sirven de adaptadores en el proceso de
síntesis de proteínas porque traducen el
mensaje codificado en nucleótidos a un
lenguaje de aminoácidos. En los organismos
eucariotos, los ácidos ribonucleicos (RNA) se
sintetizan en el núcleo.
Las moléculas del DNA son
polinucleótidos, o sea, cadenas compuestas
de mononucleótidos en las que la parte
externa de la estructura está constituida por
los esqueletos de desoxirribosa fosfato
unidos entre sí por enlaces fosfodiéster, de
tal manera que el grupo 5'-fosfato de la
desoxirribosa de un nucleótido está
esterificado con el grupo 3'-OH de la
desoxirribosa del nucleótido vecino. Las
moléculas de DNA contienen dos tipos de
bases nitrogenadas, dos bases pirimídicas
(timina T y citosina C) y dos bases púricas
(adenina A y guanina G). Estas bases se
1
1
unen entre el C de la desoxirribosa y el N
9
de las pirimidinas o el N de las purinas por
enlaces N-glucosídicos. La secuencia de
bases es altamente específica para cada
molécula del DNA.
Las moléculas del DNA en solución
presentan la estructura de una doble hélice
que gira a la derecha alrededor de un eje
común.
Las
dos
cadenas
son
complementarias,
corren
de
manera
antiparalela entre ellas. Se conectan entre sí
a través de puentes de hidrógeno que se
forman entre bases yuxtapuestas A-T (dos
puentes de hidrógeno) y C-G (tres puentes
de hidrógeno); las bases se mantienen
perpendicularmente al eje longitudinal de la
molécula del DNA. Además, se estabilizan
por interacciones hidrofóbicas entre bases
vecinas de la misma hebra.
Las bases son hidrofóbicas y están
colocadas en forma muy empaquetada y
prácticamente no entran en contacto con el
agua. El agua interacciona con la parte
hidrofílica de la molécula formada por
residuos de azúcar y grupos fosfato cargados
negativamente. Dependiendo del contenido
de agua del medio, las moléculas de DNA
pueden existir en tres formas: A, B y Z. Las
diferentes formas difieren en el número de
nucleótidos
por
vuelta
y
en
sus
características estructurales. Se supone que
la forma B es la predominante de las
moléculas del DNA in vivo.
Aparte del DNA lineal, existen
moléculas de DNA en forma de círculos
cerrados que pueden arreglarse en
estructuras similares a eslabones de una
cadena (en mitocondrias, bacterias y virus).
A.2
Organización del DNA.
81
A.2.1 Identificará los distintos niveles
de organización del DNA;
reconocerá al nucleosoma, la
fibra de 30 nm (solenoide), el superenrollamiento de 300 nm
(dominios estructurales en bucle)
y el cromosoma en metafase.
A.2.2 Reconocerá a las histonas y a
otras proteínas no histonas como
responsables
del
empaquetamiento
del
DNA.
Reconocerá la importancia de los
siguientes dominios proteicos:
hélice-vuelta-hélice, cremalleras
de leucina, dedos de cinc, en su
interacción con el DNA y entre
proteínas que interactúan con el
DNA.
A.2.3 Relacionará los cambios en el
empaquetamiento
del
cromosoma con la función del
DNA. Definirá el significado de
los
siguientes
conceptos:
cromatina, centrómero, telómero,
eucromatina y heterocromatina.
Lecturas recomendadas
1.
Collins
FS,
Jegalian
KG.
Deciphering the code of the life.
Scientific
American.
1999;
281(6): 86-91.
2.
Kornberg RD, Lorch Y. Twentyfive years of the nucleosome,
fundamental particle of the
eukaryote chomosome. Cell.
1999; 98: 285-294.
Dado que el tamaño del núcleo impediría la
existencia de los cromosomas en forma
extendida, el DNA se compacta formando
estructuras superenrolladas que se asocian
a proteínas básicas (histonas) para formar
superestructuras cada vez más complejas
como son: los nucleosomas, el solenoide o
fibra de 30 nm, las fibras de 300, 700 y 1
400 nm y, finalmente, las macroestructuras
de los cromosomas mitóticos en donde se
alcanza la máxima condensación posible,
como se ve en el microscopio electrónico.
Las proteínas nucleares pueden
dividirse, en general, en proteínas del tipo de
las histonas y proteínas no histonas. Las
histonas son proteínas de peso molecular
entre 10 000 y 25 000 con un alto contenido
de aminoácidos básicos como arginina y
lisina, los cuales pueden representar de 23 a
30% de todos los aminoácidos que
componen a la proteína.
Las histonas pueden clasificarse en
cinco diferentes grupos según su tamaño y
su composición de aminoácidos. La función
de las histonas consiste en organizar los
largos filamentos de DNA en formas más
compactas
que
permitan
su
empaquetamiento en el núcleo. Esto se lleva
a cabo a través de las interacciones
electrostáticas de las histonas con las cargas
negativas de los grupos fosfato del DNA.
Además de las histonas existen proteínas no
histonas que interactúan con el DNA.
Las no histonas son una gran
variedad de proteínas que difieren en
abundancia, tamaño y composición de
aminoácidos. Algunas de ellas presentan
dominios que son muy comunes como los
dedos de cinc y los zippers o cremalleras de
leucina. Estas proteínas son responsables de
la selectividad e inhibición transitoria en la
transcripción del RNA a través de su unión a
ciertos segmentos de DNA implicados en su
regulación o a través de la modificación de la
organización del DNA. Además, regulan la
transcripción de los genes de las mismas
histonas.
A.3
Organización del genoma.
A.3.1 Discutirá el concepto de gen y
señalará el número aproximado
de genes contenidos en el
genoma humano.
A.3.2 Señalará las características más
importantes de los genes únicos
82
y redundantes, de mantenimiento
y tejido específicos, estructurales
y
reguladores,
dominantes,
recesivos y ligados al sexo
(conocerá las Leyes de Mendel).
A.3.3 Señalará
las
regiones
hiperconservadas y las regiones
hipervariables del DNA (intrones
y exones).
A.3.4 Conocerá las diferentes clases
de DNA: genes que codifican
proteínas, genes que codifican
para RNA de transferencia y
ribosomales, seudogenes, DNA
repetitivo y DNA espaciador.
A.3.5 Señalará las características del
DNA
mito-condrial
y
la
información contenida en él.
celular. Este DNA es de origen materno y
constituye la llamada "herencia de Eva".
La mayoría de los genes para
preRNA (RNAhn) son genes únicos, pero
pueden ser transcritos miles de veces. Los
RNAm resultantes de la maduración de estos
preRNA pueden traducirse cientos de veces,
lo que provoca la aparición de una gran
cantidad de proteína codificada en dichos
genes.
B. Flujo de la información genética
Al finalizar esta subunidad el alumno
conocerá los procesos inv olucrados
en el f lujo de la inf ormación genética.
B.1. Flujo de la información genética.
B.1.1 Conocerá las funciones de los
ácidos nucleicos y los flujos de la
información genética (dogma
central de la Biología Molecular).
Realización de la práctica 13 “Huella génica”
(ver pág. 183).
Cuando se analiza el contenido del DNA que
se expresa como preRNAm, RNAr, RNAt y
otros tipos de RNA, se observa que éste
constituye sólo 10% del DNA total (este DNA
se conoce como DNA informativo); el
restante 90% contiene seudogenes, DNA
espaciador y DNA repetitivo. Todo esto
constituye el genoma. De todo el DNA, el
repetitivo constituye 30 a 40% y está
compuesto de secuencias de longitud
variable que pueden estar repetidas diez, mil
o más veces. Las secuencias repetidas
pueden agruparse, como el caso del DNA
satélite asociado al centrómero del
cromosoma, o presentarse disperso, como la
secuencia ALU, de la cual existen ± 500 000
copias dispersas en todos los cromosomas y
que está posiblemente relacionada con los
orígenes de la duplicación.
Del DNA celular, 0.1% es mitocondrial. En él
hay 13 genes que codifican para proteínas
de gran importancia para la bioenergética
B.2 Síntesis del DNA (duplicación).
B.2.1 Describirá el ciclo celular con sus
fases y conocerá las diferentes
moléculas que se generan en
cada una de éstas.
B.2.2 Examinará qué es la duplicación
del DNA y en qué fase del ciclo
celular ocurre.
B.2.3 Identificará los sucesos más
importantes catalizados por el
“replicosoma”.
1.
2-
Lecturas recomendadas
Hübscher U. Eukaryotic DNA
polymerases a growing family.
TIBS. 2000; 25 (3): 143-147.
Collins
FS,
Jegalian
KG.
Deciphering the code of the life.
Scientific American. 1999; 281
(6): 86-91.
83
Las moléculas del DNA son
sintetizadas a partir de desoxirribonucleótidos
en presencia de un molde de DNA y de
varios tipos de enzimas, entre las que se
encuentran dos DNA polimerasas, con
diferente función en el proceso: una RNA
polimerasa (primasa), una topoisomerasa de
tipo II denominada DNA girasa y una serie de
proteínas que catalizan la separación de las
dos hebras del DNA, entre las que destacan
las helicasas.
Las DNA polimerasas son enzimas
que pueden unir desoxirribonucleótidos sólo
en la dirección 5´
3´, aunque también
tienen actividad de exonucleasas en la
dirección
5 ´
3´y en la dirección
3´
5´. Esta capacidad de polimerización
sólo en la dirección 5´
3´ se conoce
como direccionalidad de la duplicación y es la
responsable de algunas peculiaridades del
proceso.
Dado que las DNA polimerasas no
pueden iniciar la síntesis del DNA a menos
que posean un extremo 3´OH terminal al que
puedan añadir el desoxirribonucleótido
entrante, se hace necesaria la actividad de
una RNA polimerasa (primasa) que genere
dicho extremo 3´ OH terminal. Tomando
como molde una de las hebras, la primasa
cataliza la formación de un pequeño
segmento (5-20 ribonucleótidos) de RNA que
sirve como “cebador" para la síntesis de la
nueva cadena de DNA por la DNA
polimerasa III. Las cadenas formadas de
novo son antiparalelas a la cadena que les
sirve de molde. Después de la sustitución del
"cebador" del RNA a cargo de la DNA
polimerasa I, los segmentos de la cadena
formada de DNA son unidos por la DNA
ligasa. El papel de la DNA polimerasa I,
además de la función de sustitución de los
"cebadores" del RNA, se encarga de la
reparación de las hebras del DNA.
Diversos
experimentos
han
demostrado que una de las cadenas del DNA
resultante provienen del progenitor y la otra
es la que se sintetizó de novo, la cual indica
que
la
duplicación
del
DNA
es
semiconservativa. Este mecanismo permite
la transmisión de la información genética de
una generación a la siguiente.
A consecuencia de la direccionalidad
de la actividad de la DNA polimerasa III se
descubrió que hay una diferencia en la
velocidad de síntesis entre las dos cadenas
del DNA, encontrándose que hay una cadena
líder y una retardada. Esto permitió
determinar que la duplicación de la cadena
retardada se realiza en forma discontinua,
apareciendo una serie de secciones
pequeñas de DNA (entre 100 y 1 000 pares
de bases), conocidas como fragmentos de
Okazaki, y que son posteriormente unidas
por la DNA ligasa para formar la hebra
completa.
Durante su vida, las células realizan
diversas funciones, a veces se dedican
principalmente a crecer, otras a dividir su
material genético, o a repartirlo en lo que
serán, dos nuevas células hijas. Estas
diferentes etapas constituyen lo que se
conoce como el ciclo celular, integrado por 4
fases bien definidas: M (mitosis), G1 (unión
1), S (síntesis) y G2 (unión 2).
Morfológicamente sólo se han definido dos
etapas de división e interfase, en esta última
están incluidas G1, S y G2.
Durante la etapa G1, la célula crece,
lo que implica un gran gasto energético y
síntesis de sus componentes. El paso a la
etapa S, requiere de señales precisas para
que se inicie la síntesis del DNA, de tal forma
que, al terminar esta etapa, la célula tiene ya
un contenido equivalente al doble de DNA.
Para poder distribuir este DNA entre dos
células hijas y dividirse (fase M), la célula
pasa por una etapa de preparación para la
mitosis llamada G2. Numerosos genes se
prenden y apagan durante cada etapa del
ciclo celular en forma específica y altamente
precisa.
84
Cuando una célula se diferencia,
como es el caso de las neuronas, al llegar a
la etapa G1, la célula toma un camino
alternativo a S, dejando de dividirse para
estacionarse en una etapa llamada G0.
Durante esta etapa, un gran número de
genes tejido-específico se prenden dando a
la célula la identidad de acuerdo a la estirpe
a la cual pertenece.
B.3
Transcripción.
B.3.1 Identificará en qué consiste, en
qué compartimiento subcelular y
en qué fase del ciclo celular se
lleva a cabo la transcripción.
B.3.2 Identificará
las
enzimas,
sustratos y los sucesos más
importantes del proceso de
transcripción.
B.3.3 Describirá en qué consisten los
procesos
de
modificación
postranscripcional que sufren el
RNAm, el RNAt y el RNAr y hará
énfasis en el papel de las
ribozimas.
B.3.4 Revisará el efecto de la
rifamicina, de la actinomicina D y
de la Į-amanitina sobre la
transcripción.
Lectura recomendada
1Proudfoot
N.
Connecting
transcription to messenger RNA
processing. TIBS 2000; 25 (6):
290-293.
Todas las moléculas del RNA son
sintetizadas en el
núcleo mediante
transcripción de la información genética
codificada en la secuencia de las bases del
DNA mediante la acción de una RNA
polimerasa dependiente de DNA.
La RNA polimerasa dependiente del
DNA es una enzima que está compuesta de
6 subunidades: 2, ß, ß´, y una proteína
acídica designada como que se requiere
para la identificación y unión al promotor, es
decir, el sitio donde debe iniciarse la
transcripción. Esta enzima utiliza un molde
de DNA para sintetizar una cadena de RNA,
la cual crece en la dirección 5´
3' hasta
llegar a una señal de terminación en el DNA,
lo que provoca la entrada de la proteína rho
la cual separa la RNA polimerasa de la
cadena molde del DNA.
En el caso de los organismos
eucariotos, sus RNA polimerasas son
diferentes,
aunque
el
proceso
es
básicamente el mismo. Una de las
diferencias en la transcripción entre
procariotos y eucariotos es que los RNAm de
los procariotos suelen ser policistrónicos, es
decir, llevan la información para más de una
cadena polipeptídica, mientras que los de
eucariotos son monocistrónicos.
Los productos de la transcripción en
eucariotos sufren, a su vez, una serie de
modificaciones postranscripcionales. Los
RNA mensajeros adquieren en su extremo 5´
terminal un "casquete", es decir, un
nucleótido poco común con un enlace
especial (7 metilguanosina unida por un
enlace 5´
5´) que lo protege de la
acción de las nucleasas. Asimismo,
adquieren una cola de poli A en el extremo 3´
terminal y pierden algunas secuencias que
no llevan información para ninguna cadena
polipeptídica (intrones). El producto de este
proceso de edición es el que será leído en
los ribosomas durante la traducción o síntesis
de proteínas.
Los RNA ribosomales se sintetizan
principalmente en el nucleolo, se asocian a
las
proteínas
ribosomales
y
las
nucleoproteínas formadas son transportadas
al citoplasma donde llevan a cabo su función.
Los RNA de transferencia también
son editados, es decir, se modifican hasta
adquirir la estructura funcional. Pierden
secuencias o algunas de sus bases sufren
modificaciones (por ejemplo, se reducen para
producir dihidrouridina, se metilan para
85
producir ribotimina, etcétera) lo que les
confiere resistencia a las nucleasas.
B.4 Traducción.
B.4.1 Proceso de la traducción.
B.4.1.1 Describirá en qué consiste
y en qué compartimiento
subcelular se realiza la
B.4.1.2
B.4.1.3
B.4.1.4
B.4.1.5
traducción,
tanto
de
proteínas
intracelulares,
como de proteínas de
secreción.
Conocerá el alfabeto del
código genético y el
concepto de codón y
anticodón.
Identificará las moléculas
que intervienen en el
proceso de traducción.
Conocerá las fases del
proceso y la función que
desempeña el ribosoma
en el mismo.
Conocerá el efecto de los
siguientes
inhibidores
sobre la síntesis de
proteínas:
tetraciclinas,
estreptomicina,
cloranfenicol, eritromicina,
puromicina,
dehidroemetina,
cicloheximida y la toxina
diftérica.
La síntesis de proteínas es un proceso
complejo en el que intervienen de manera
coordinada más de cien macromoléculas
para unir los residuos de los 20 aminoácidos
en una secuencia codificada en el RNA
mensajero. Asimismo, la síntesis de
proteínas requiere de grandes cantidades de
energía y se regula rigurosamente. En este
proceso participan los tres diferentes tipos de
RNA (el mensajero, el ribosomal y el de
transferencia); cada uno contribuye, de
manera específica, a la obtención de una
proteína funcional.
El lenguaje codificado en nucleótidos
en los ácidos nucleicos es traducido a un
lenguaje de aminoácidos mediante una serie
de RNAs de transferencia (RNAt) cargados
cada uno con un aminoácido determinado, el
que es especificado por el asa del anticodón,
según un código de lectura: el código
genético. Este código presenta cuatro
características:
1. Está basado en tripletas, es decir, una
secuencia de 3 nucleótidos determina un
aminoácido.
2. El código no se sobrepone y no tiene
espacios, es decir, que la información se
almacena en tripletas de bases seguidas.
3. El código es universal. Es el mismo para
todos los organismos.
4. El código es degenerado. Esto significa
que más de una tripleta puede codificar
para un aminoácido. Sin embargo, los
primeros dos nucleótidos de una tripleta
son generalmente los mismos para un
aminoácido determinado.
El proceso de la síntesis de
proteínas puede dividirse en diferentes
etapas:
a) La activación de los aminoácidos, es
decir, la formación de los aminoacil RNAt
por sintetasas específicas.
b) La iniciación es la primera fase del
proceso; en ella se requiere la presencia
de tres proteínas conocidas como
factores de iniciación necesarios para
disociar
los
ribosomas
en
sus
subunidades y para acarrear el aminoacil
RNAt inicial (generalmente metionil RNAt
o su análogo formilado). Además, se
necesita la asociación del RNA
mensajero con la señal de inicio de la
traducción (generalmente la tripleta
AUG) a la subunidad pequeña del
86
ribosoma y del aminoacil RNAt inicial al
sitio peptidilo (P) del ribosoma. Todo este
complejo de proteínas, de RNAs y de la
subunidad pequeña del ribosoma
constituye el complejo de iniciación, al
que se une la subunidad grande para
formar el ribosoma activo.
c) El
alargamiento
de
la
cadena
polipeptídica se realiza a partir de este
momento por la llegada del siguiente
aminoacil RNAt al sitio aminoacilo (A) del
ribosoma con la ayuda de un factor de
alargamiento asociado a GTP, que lo
coloca en el sitio adecuado con gasto de
un enlace de alta energía. Enseguida se
forma el enlace peptídico por la acción
de la peptidil transferasa que se
encuentra asociada a la subunidad
grande del ribosoma y el movimiento del
ribosoma sobre la molécula de RNAm
para colocar al nuevo peptidil RNAt en el
sitio P y dejar libre el sitio A del ribosoma
y continuar el alargamiento de la cadena.
El movimiento del ribosoma se realiza
por la acción de otro factor de
alargamiento (factor G) con hidrólisis de
una nueva molécula de GTP.
d) La terminación se realiza cuando los
factores de terminación (factores R)
encuentran una tripleta sin sentido (UAA,
UGA, UAG), lo que provoca la activación
de la peptidil transferasa que hidroliza el
enlace peptidil RNAt y libera a la cadena
polipeptídica. El RNAt y el RNAm se
liberan al igual que el ribosoma, que
ahora puede volver a disociarse para
iniciar un nuevo ciclo de traducción. El
polipéptido liberado
adquiere
sus
estructuras
secundaria y
terciaria
correspondientes.
Esta descripción de la síntesis de
proteínas corresponde a proteínas que
permanecerán intracelularmente. En el caso
de los organismos eucarióticos, las proteínas
que serán excretadas, o que forman parte de
la membrana plasmática, del retículo
endoplásmico, del aparato de Golgi o de los
lisosomas, se forman en ribosomas
firmemente unidos al retículo endoplásmico.
Conforme el polipéptido se va sintetizando,
entra en cisternas endoplásmicas y es
transportado al aparato de Golgi donde se
concentra y se modifica, por ejemplo, con
adición de azúcares. Más tarde estas
proteínas son englobadas en vesículas que
viajan a la superficie celular y se fusionan
con la membrana para verter su contenido al
espacio extracelular. Las proteínas cuyo
destino son los organelos intracelulares se
sintetizan en retículo endoplásmico y se
transportan a su destino mediante una señal
interna que es reconocida en dicho organelo.
B.4.2 Modificación postraduccional y
degradación de proteínas.
B.4.2.1 Mencionará
en
qué
consisten
las
modificaciones
postraduccionales:
plegamiento,
modificaciones
covalentes
reversibles
(fosforilación, acetilación y
ADP
ribosilación)
e
irreversibles
(glucosilación,
hidroxilación,
proteólisis
controlada, unión a grupos
prostéticos) y cuál es su
posible función.
B.4.2.2 Comprenderá el concepto
de vida media de una
proteína.
B.4.2.3 Describirá cuáles son los
procesos lisosomal y no
lisosomal, mediante los
que se degradan las
proteínas.
87
Lectura recomendada
1.
Goldberg AL. The cellular
chamber of pomm. Scientific
American. 2001; 284 (1): 56-61.
Las modificaciones postraduccionales de las
proteínas
pueden
incluir
desde
el
plegamiento de los polipéptidos con la ayuda
de proteínas como las chaperonas y
chaperoninas, cambios en el extremo aminoterminal y en aminoácidos específicos,
procesamiento proteolítico, formación de
puentes disulfuro y otras como la unión de
carbohidratos, metales, grupos prostéticos,
etcétera.
Una de las modificaciones más
comunes en el extremo amino terminal que
se da en las células eucarióticas es el de
remover los residuos de metionina, con las
que se inicia la síntesis de la misma; en las
células bacterianas se remueve la formilación
presente en la metionina y, en algunos
casos, ésta también es recortada. Además
de este tipo de modificaciones que ocurren
en la secuencia del extremo amino terminal
de una proteína, los aminoácidos presentes
en la proteína también se pueden modificar;
por ejemplo, los aminoácidos serina, treonina
y tirosina pueden unir grupos fosfatos a sus
cadenas laterales, es decir, son susceptibles
de ser fosforilados en sus cadenas laterales.
Este tipo de transformaciones se usa por la
célula para comunicar cambios en el medio
ambiente que tienen como respuesta
modificaciones en la regulación de vías
metabólicas. Algunos aminoácidos, como la
lisina, puede metilarse, otros como la
cisteína, añadir grupos isoprenílicos u otros
lípidos a su cadena lateral, lo cual facilita la
unión de la proteína con la membrana. Los
residuos de cisteína pueden formar de
manera
específica
puentes
disulfuro.
Finalmente, muchas de las proteínas son
sintetizadas de tal forma que requieren que
se les realice un corte de tipo proteolítico
para que adquieran su forma activa, como es
el caso de los zimógenos y las prohormonas.
El corte de la preproteína hacia su forma
biológicamente activa se realiza por una
proteasa específica y se encuentra regulado
por los diferentes eventos celulares.
¿Qué determina la estabilidad de las
proteínas?
Todas las células contienen gran cantidad
de proteasas con diferente especificidad.
Estas las podemos dividir en tres grupos
generales:
1.
Algunas proteasas cortan a la
proteína en sitios específicos dando origen
a proteínas maduras que son de menor
tamaño que su proteína precursora. Estas
proteasas
participan
en
diferentes
procesos que incluyen el corte de la
secuencia señal de una proteína de
exportación y el procesamiento de
proteínas citosólicas para dar origen a sus
formas maduras.
2.
La internalizacion de proteínas de
membrana
(algunos
receptores)
en
respuesta a la unión del ligando genera
como primer evento la unión de clatrina
alrededor de la membrana; ésta se
invagina al citoplasma y forma vesículas
rodeadas de clatrina. El destino de estas
vesículas son los endosomas temprano,
tardío y finalmente el lisosoma que es el
responsable de la degradación de
macromoléculas por medio de enzimas
hidrolíticas.
3. Finalmente, la vida media de las proteínas
varía entre algunos segundos, días y
excepcionalmente toda la vida (cristalino).
Para ser degradadas, las proteínas son
marcadas para ser reconocidas por el
proteosoma, el cual es un complejo de alto
peso molecular que se encarga de la
degradación de proteínas citosólicas. Los
sustratos
de
este
sistema
son
88
principalmente
proteínas
que
están
alteradas en su plegamiento, por lo que el
proteosoma actúa como un sistema de
control
de calidad.
También está
involucrado en la degradación de proteínas
como un mecanismo de regulación, por
ejemplo en el caso de las ciclinas para que
se complete el ciclo celular. El primer paso
en este sistema es el marcar a la proteína
alterada (proteína blanco) para que sea
degradada. La marca es una pequeña
proteína llamada ubiquitina, la cual se
une covalentemente a la proteína blanco.
Son tres los componentes del sistema de
ubiquitinación:
a) E1 enzima activadora de la ubiquitina,
dependiente de ATP
b) E2 enzima que conjuga a la ubiquitina
con la proteína blanco
c) E3 ligasa de ubiquitina, selecciona a la
proteína blanco
d) El complejo multiproteico del proteosoma
(20S) degrada rápidamente a las
proteínas unidas a la ubiquitina. Este
complejo
está
formado
por
14
subunidades apiladas una sobre otra y
que son las responsables de la actividad
proteolítica.
Para que la proteína sea degradada
necesita tener varias ubiquitinas unidas.
C.2
Efecto de mutaciones en promotores,
operadores,
genes
reguladores,
intrones, exones y genes estructurales
y dará ejemplos: talasemias, anemia
de células falciformes, etcétera.
C.3
Identificará los mecanismos que
existen para la reparación del DNA:
uvr, fotoliasa, excinucleasa, sistema
SOS, entre otros.
Durante
la
duplicación
puede
ocurrir
C. Mutaciones y reparación del dna
espontáneamente un número pequeño de
errores en el orden o tipo de las bases
nitrogenadas. La probabilidad de uno de
estos errores puede incrementarse bajo la
influencia de diferentes agentes mutágenos
(químicos o físicos). Estos cambios en la
secuencia de bases nitrogenadas en el DNA
se conocen con el nombre de mutaciones.
Existen varios tipos de mutaciones:
las que cambian una base por otra
(sustitución) y pueden ser de una base púrica
por otra base púrica o de una pirimidina por
otra pirimidina; lo que se conoce como
transición. Si el cambio es de una purina por
una pirimidina, o viceversa, la mutación se
conoce como transversión. Existe otro tipo de
mutaciones en las que hay un cambio de
marco de lectura para la traducción. Hay dos
Al finalizar esta subunidad el alumno
conocerá los diferentes cambios que puede
sufrir el DNA y sus consecuencias. Conocerá
tipos de mutaciones de este tipo: la inserción,
en la que la entrada de uno o dos nucleótidos
modifica el marco en que se leerá el mensaje
por los ribosomas, y la supresión (deleción),
también los mecanismos de reparación del
DNA.
C.1
Conocerá los diferentes tipos de
mutaciones y la acción de algunos
agentes
mutágenos:
luz
UV,
radiaciones, naranja de acridina,
bromuro de etidio, 5 bromouracilo.
en la que la pérdida de uno o dos nucleótidos
provoca el mismo efecto.
En el caso de las mutaciones
puntuales, en las que sólo hay cambio de
una base, la información genética es
cambiada casi imperceptiblemente y las
mutantes pueden sobrevivir. Cuando cambia
un mayor número de bases, ocurren
alteraciones importantes en la secuencia de
89
D.3.3 Control de modificaciones del
transcrito primario.
D.3.4 Control de la traducción por la
presencia del casquete, de
secuencias
especiales,
vida
media del RNAm.
D.3.5 Regulación del proceso de
síntesis proteica.
un gen, lo que puede ser incompatible con la
existencia de esa mutante.
Con el fin de sobrevivir, la célula tiene
mecanismos para reparar el DNA dañado. En
ese sentido la actividad exonucleasa
3’
; 5’ de las DNA polimerasas, la de los
productos de algunos genes, como los uvr
ABC, los de la fotoliasa y la de la uracilo-DNA
glucosidasa
desempeñan
un
papel
importante.
D.4
Revisará un modelo de regulación en
procariotos y otro en eucariotos
(operón de lactosa y regulación de la
expresión de los genes de las
inmunoglobulinas).
D.5
Conocerá la relación que existe entre
el ciclo celular, el tipo de célula y los
procesos antes descritos, y el proceso
de diferenciación celular.
D. Niveles de regulación de la
expresión genética
Al finalizar esta subunidad el alumno
conocerá los diferentes niveles de regulación
genética (en procariotos y en eucariotos), así
como los diversos mecanismos implicados en
ella.
D.1
Describirá los niveles de posible control
de la expresión de la información
genética
(transcripcionales,
traduccionales,
modificaciones
postranscripcionales
y
postraduccionales).
D.2
Conocerá cómo la información que el
organismo recibe del medio exterior se
transforma en señales que se traducen
en diferentes acciones.
D.3
Conocerá los posibles mecanismos
que operan en los diferentes niveles de
regulación:
D.3.1 Cambios en la molécula del
DNA: pérdida amplificación y
rearreglo de genes.
D.3.2 Control de la transcripción en
eucariotos (a nivel del rearreglo
de la cromatina, de la iniciación y
a nivel de los mecanismos de
acción
de
los
receptores
intracelulares).
Lecturas recomendadas
1.
Etchergary P. Rhytmic histone
acetylation
underlies
transcription in the mammalian
circadian clock. Nature. 2003;
421: 177-182.
2.
Pombo A. Cellular genomics:
which genes are transcribed,
when and where? TIBS. 2003;
28 (1): 6-9.
3.
Konberg
RD.
Eucaryotic
transcriptional control. TIBS.
Millenium Issue 1999; M46-M48.
4.
Papin JA. Metabolic pathways in
the post genome era. TIBS.
2003; 28(5): 250-258.
5.
Le Hir H, Nott A, Moore M. How
introns influence and enhance
eukaryotic gene expression.
TIBS. 2003; 28(4): 215-220.
Las bacterias son capaces de controlar la
expresión de las enzimas necesarias para
utilizar nutrientes del medio, o bien, aquellas
enzimas requeridas para la síntesis de
biomoléculas que intervienen en su
funcionamiento
y
proliferación.
Estos
cambios de expresión ocurren con gran
rapidez y precisión y fueron el primer ejemplo
claro de la manera en que se regula la
90
expresión génica. Cuando una enzima se
expresa en respuesta a una necesidad
bacteriana se habla de un proceso de
inducción génica, mientras que, cuando su
expresión se apaga, se habla de represión
génica.
Los cambios en la expresión de un
gen están controlados por la interacción de
su región reguladora con diversas proteínas
nucleares que favorecen o interfieren con la
unión de la RNA polimerasa al sitio de
iniciación de la transcripción. El ejemplo más
sencillo de esta regulación es la manera
como se controla la expresión de un conjunto
de genes, llamado operón de lactosa, cuya
expresión depende de la presencia de
lactosa en el medio; normalmente, la
expresión de este operón se encuentra
reprimida. El gen regulador codifica para una
proteína que se une con gran afinidad a la
región del DNA que controla la expresión del
operón y que previene que la RNA
polimerasa pueda iniciar la transcripción. Por
su función, a esta proteína se le denomina el
represor del operón de lactosa. La presencia
de lactosa, en ausencia de otros nutrientes,
favorece que una pequeña porción de dicha
lactosa sea transformada enzimáticamente a
un metabolito que puede unirse al represor
con gran afinidad; el resultado de esta unión
es una inactivación alostérica del represor. A
este metabolito de la lactosa se le denomina
inductor del operón ya que, al disminuir la
cantidad de represor funcional, favorece de
manera indirecta la iniciación de la
transcripción de los otros genes del operón.
Un nivel más de control queda de manifiesto
cuando las bacterias reprimen la expresión
del operón de lactosa cuando en el medio
aparecen otros nutrientes como la glucosa. A
este efecto represor de la glucosa se le
conoce como represión catabólica y ocurre
gracias a que la presencia de glucosa reduce
los niveles intracelulares de AMP cíclico
(cAMP). Normalmente, el cAMP se une a una
proteína denominada proteína receptora de
cAMP (CRP, también denominada CAP) y
forma un complejo que se une a la región
reguladora de los operones y favorece su
transcripción. Por tanto, cuando la glucosa
reduce los niveles de cAMP, la proteína CRP
pierde su afinidad por la región reguladora
del operón y se interrumpe la expresión.
Una forma alternativa de regular la
expresión génica es acoplar la transcripción a
la traducción lo cual favorece la terminación
temprana de la transcripción. Este proceso
se conoce como atenuación y el operón de
triptofano constituye un buen ejemplo.
Cuando hay triptofano en el medio se
favorece la terminación de la transcripción y
el operón nunca logra expresarse; sin
embargo, cuando el triptofano se agota, la
transcripción continúa y se expresan las
enzimas necesarias para su síntesis. La
expresión de otros operones necesarios para
la síntesis de aminoácidos, como histidina,
fenilalanina, leucina, treonina e isoleucina, es
controlada por atenuación.
Mientras que en las bacterias
cualquier individuo puede expresar todos sus
genes, en las células animales esto no
siempre es cierto. Por ejemplo, todas las
células del cuerpo humano poseen la misma
información
genética
codificada
5
aproximadamente en 10 genes distintos; sin
embargo, no hay ningún tipo celular que
exprese todos estos genes simultáneamente.
De hecho, cualquier célula expresa sólo un
número reducido de estos genes, la gran
mayoría de los cuales codifica para proteínas
necesarias para las funciones generales de
cualquier tipo celular. La expresión de estos
genes es lo que hace similares a los distintos
tipos celulares; un ejemplo claro de este tipo
de genes lo constituye los que codifican para
las enzimas glucolíticas, proteínas que se
expresan de manera constitutiva como
resultado de que las regiones reguladoras de
estos genes responden a factores de
transcripción presentes en todas las células.
Los transcritos primarios son editados
91
inmediatamente para dar origen al RNA
mensajero maduro que es traducido por
ribosomas libres para sintetizar un péptido
que, al adquirir su conformación nativa,
posee actividad enzimática. Así como la
expresión de los genes constitutivos confiere
similitudes a los distintos tipos celulares, la
expresión de genes tejido específico es la
que le da a cada tipo celular sus
características. Los hepatocitos, por ejemplo,
expresan albúmina, pero no miosina, como lo
hacen las células musculares, ni tampoco
expresan las enzimas que permiten la
síntesis de neurotransmisores como lo hacen
las neuronas. La expresión de estos genes
tejido-específico está controlada por sus
regiones reguladoras las cuales requieren de
factores de transcripción especiales que
aparecen en dos etapas. En la primera, la
expresión de estos factores ocurre en
respuesta a estímulos hormonales o de
factores
de
crecimiento
durante
la
diferenciación celular. En la segunda, la
presencia de estos factores de transcripción
se hace independiente del estímulo hormonal
y de factores de crecimiento o diferenciación
y se convierte en proteínas que se expresan
de manera permanente en la célula
diferenciada. Muchas de las hormonas que
activan este proceso requieren de receptores
de membrana y sistemas de transducción
que llevan la señal al núcleo a través del
citoplasma. Otros, como las hormonas
esteroides, se unen a receptores nucleares
que sirven como factores de transcripción.
En algunas ocasiones la regulación
implica un cambio de la secuencia del DNA,
como se ejemplifica a continuación. En el
humano, como en todos los organismos
diploides, la mayoría de los genes está
presente en dos copias, una de origen
paterno y una de origen materno. Algunas
veces, el origen paterno o materno del gen
determina que este gen pueda ser transcrito
o no, fenómeno al que se le denomina
“impronta genética”. El resultado de esta
inactivación es que la expresión del gen se
reduce a la mitad, ya que sólo una de las dos
copias es activa, como es el caso de los
genes localizados en el cromosoma X. En
contraposición, existen genes que pueden
estar presentes en un mayor número de
copias como resultado de una amplificación;
tal es el caso de los genes que codifican para
los RNA ribosomales, de los cuales las
células requieren muchas copias. En genes
que codifican para los anticuerpos en células
B y los receptores de las células T ocurre un
rearreglo de las secuencias primarias del
DNA, lo que es responsable de la gran
diversidad de antígenos naturales y
artificiales que pueden ser reconocidos por el
sistema inmune. Este proceso es controlado
por los distintos factores que regulan la
maduración de las células B y las células T.
Además de la capacidad de
transcribir o no ciertos genes con mayor o
menor eficiencia, existen otros niveles en los
que se puede regular la función del producto
final por medio de la modulación tanto en
cantidad como en calidad. El primer nivel de
regulación se refiere al control de la vida
media de los RNA mensajeros determinada
por la existencia de secuencias en los
extremos no codificantes que regulan su
velocidad de degradación. Durante el
proceso de maduración de los mensajeros,
en el cual se eliminan intrones, también
pueden eliminarse uno o varios exones y dar
lugar a una mayor diversidad de proteínas; a
este proceso se le denomina edición
alternativa. Una vez que el mensajero ha
madurado, existen varios mecanismos que
pueden aumentar o disminuir la eficiencia
con la que los ribosomas traducen la
información a un péptido.
En muchas
ocasiones la proteína tiene un destino final
diferente al citoplasma, el cual puede ser
mitocondrial, lisosomal, de membrana celular
o una proteína de secreción; esta información
se encuentra codificada en el extremo amino
terminal del péptido naciente y puede
92
constituir un punto más de control. El último
punto de regulación consiste en aumentar o
disminuir la velocidad de degradación de las
proteínas por el sistema de la ubiquitina; este
mecanismo nuevamente contribuye a
controlar la cantidad del producto génico. A
pesar de la diversidad de los niveles de
regulación de la expresión génica, los
mecanismos más comunes son los que
modulan la eficiencia de la transcripción y los
que modulan la actividad biológica por
modificaciones postraduccionales, entre los
que destacan la fosforilación y la
desfosforilación.
Hemos mencionado los rasgos más
sobresalientes de la manera en que las
células regulan la expresión génica, pero aún
es poco lo que se sabe con respecto a cómo
se integran e interaccionan. Por ejemplo, aún
resulta difícil explicar cómo distintos factores
de crecimiento, con diferentes receptores de
membrana y sistemas de transducción,
estimulan a los mismos factores de
transcripción, pero conducen a respuestas
celulares diversas. El gran número de niveles
a los cuales se puede regular la expresión
génica y las múltiples combinaciones y
secuencias en las que pueden presentarse
sugiere una gran complejidad. El resultado
final de esta complejidad determina al tipo de
genes que participan y la secuencia en la que
se expresan para dar origen a los diferentes
tipos celulares.
F.
Virus, oncogenes y
transformación
Al finalizar esta subunidad el alumno
conocerá la estructura general de los virus,
su clasificación y su posible implicación en la
transformación celular. Conocerá la relación
entre la función de los productos de los
oncogenes y la transformación celular.
E.1
Describirá la estructura general de los
virus.
E.2
Conocerá la clasificación de los virus
con base en su ácido nucleico y dará
ejemplos de cada uno.
E.3
Definirá los conceptos de oncogén y
protooncogén.
E.4
Revisará algunos mecanismos por los
cuales un protooncogén se transforma
en oncogén, como:
E.4.1 Inserción de un promotor o de un
intensificador (amplificador).
E.4.2 Mutación puntual.
E.4.3 Traslocaciones cromosómicas.
E.4.4 Amplificación.
E.5
Estudiará el producto de algunos
oncogenes como son: src, sis, erb B,
ras y myc y establecerá la relación
entre la función de dichos productos y
la transformación celular.
Los virus son partículas subcelulares
constituidas por ácidos nucleicos en forma de
DNA o de RNA de cadena doble o sencilla,
proteínas y, en ocasiones, membranas
lipídicas. Su genoma compacto está
constituido por un reducido número de genes
que codifican para proteínas estructurales de
la cápside, enzimas de duplicación, así como
enzimas y secuencias de DNA que permiten
la inserción del genoma viral al genoma de la
célula huésped, entre otros.
Los virus son incapaces de
multiplicarse de manera autónoma, pero
pueden hacerlo cuando se encuentran en el
interior de una célula. En la mayoría de los
casos la infección viral conduce a la
multiplicación viral a expensas de la célula
infectada. El daño ocasionado al destruir las
células es responsable de una gran variedad
de enfermedades de menor gravedad, como
la influenza, o enfermedades más serias,
como la viruela, e incluso enfermedades
mortales,
como
el
síndrome
de
inmunodeficiencia adquirida. En algunos
93
casos la infección viral se asocia a una
mayor frecuencia en el desarrollo de tumores
y cáncer, como es el caso del virus del
papiloma y el cáncer cervicouterino. Es
interesante notar que un tipo de virus sólo
puede infectar a un restringido tipo de células
y a ninguna otra, por ejemplo, el virus del
herpes infecta las células de los nervios
periféricos. A este fenómeno de especificidad
de infección se le denomina tropismo y se
debe a que el virus y su célula blanco
interactúan por la unión de una proteína de la
envoltura viral con un antígeno presente en la
membrana celular.
Las enfermedades por virus son
difíciles de tratar debido a que, fuera del
momento en que las partículas virales viajan
hasta sus células blanco y penetran en su
interior, no pueden ser neutralizadas por
anticuerpos.
El problema del reconocimiento de
antígenos virales por anticuerpos se dificulta
si uno considera que en poco tiempo emerge
un gran número de partículas virales de una
célula infectada y que el tiempo en que se
logran títulos protectores de anticuerpos es
relativamente largo. A estas dificultades se
suma una característica genética de los virus
que les permite tolerar cambios de
secuencias o incluso eliminar o adquirir
nuevos genes a lo largo de su multiplicación,
lo que les confiere una gran diversidad
genética. Estos cambios en secuencias son
particularmente nocivos cuando ocurren en
regiones del DNA que codifican para los
antígenos que son reconocidos por
anticuerpos.
Las proteínas virales que se
seleccionan son aquellas que continúan
teniendo la función requerida por el virus,
pero que no pueden ser reconocidas por los
anticuerpos. La velocidad con la que estos
cambios se propagan a toda la población
viral es sorprendentemente rápida y
previenen el uso eficaz de vacunas contra
varias enfermedades virales. Además de los
anticuerpos, el organismo produce factores
proteicos solubles llamados interferones que
aceleran la muerte de la célula infectada e
interrumpen la expresión de proteínas virales.
El que los virus se aíslen del sistema inmune,
su ciclo de vida y su gran diversidad
genética, son responsables de que no haya
medidas eficaces para su eliminación y son
la causa de su gran impacto, tanto en la
salud pública, como en la economía
agropecuaria y agrícola.
En su mayoría, los virus son capaces
de activar la maquinaria de síntesis del DNA
de la célula infectada, evento ligado al ciclo
celular y al control mismo de la proliferación;
al interferir con este aspecto de la vida
celular los virus aseguran su multiplicación.
No es sorprendente entonces que en
ocasiones los virus hayan incorporado a su
reducido genoma versiones de genes
celulares que controlan la proliferación
celular. Un ejemplo de este tipo de genes es
ras, que codifica para una proteína G
monomérica que transduce la señal
proliferativa de diversos factores de
crecimiento. La versión celular de ras (c-ras)
posee homólogos virales (v-ras), la mayoría
de los cuales presenta alteraciones que dan
lugar a una proteína permanentemente activa
y que no está sujeta a la regulación celular.
Así, mientras que c-ras sólo entra en función
cuando los receptores o factores de
crecimiento
son
activados,
v-ras
constantemente obliga a la célula a proliferar.
Cuando los virus, en lugar de lisar a una
célula, integran su genoma al material
genético de ésta, los genes virales pueden
expresarse de manera constitutiva; si esto
ocurre con genes como v-ras, se favorece
una proliferación celular descontrolada y se
dice que la célula ha sido transformada. Hay
proteínas virales que pueden interferir con la
proliferación celular, como el antígeno grande
T del adenovirus o las proteínas E7 del virus
del papiloma.
94
No sólo la integración viral puede dar
origen a la expresión de genes que
promueven la proliferación celular, también la
aparición de mutaciones espontáneas puede
dar origen a versiones de c-ras que al igual
que v-ras estimulan continuamente la
proliferación. A estas versiones mutadas se
les denomina oncogenes, ya que están
asociadas al desarrollo de neoplasias,
tumores y diversos tipos de cáncer. A los
genes celulares que al ser mutados pueden
dar origen a oncogenes se les denomina
protooncogenes; a éstos pertenece una larga
lista de receptores y proteínas de
transducción de diferentes factores de
crecimiento y proteínas que controlan el ciclo
celular. Mientras que los protooncogenes son
todos parte de las señales que activan la
proliferación, también existen genes cuyos
productos sirven para frenarla. A estos frenos
de la proliferación se les denomina genes
supresores de tumores o antioncogenes. Si
un gen supresor de tumores se muta y pierde
su función, el resultado puede compararse
con la pérdida de un freno de la proliferación
celular. Cuando esto ocurre también puede
presentarse un crecimiento descontrolado,
ahora como resultado de la falta de un
mecanismo de freno.
Las células transformadas poseen
mutaciones, tanto en protooncogenes como
en genes supresores de tumores, lo que da
como resultado una señal permanente de
proliferación, por un lado, y la falta de
mecanismos de freno, por el otro. Esta
combinación hace que estas células
presenten una duplicación descontrolada y
mucho más veloz que las células normales,
lo que, en parte, es responsable del
F.6
crecimiento desmesurado de las masas
tumorales.
G.
Técnicas de manipulación
del DNA
Al finalizar esta subunidad el alumno
conocerá las diferentes técnicas de
manipulación del DNA y sus posibles
aplicaciones.
F.1
Señalará la importancia de la
tecnología del DNA recombinante en el
campo de la medicina.
F.2
Definirá qué son las enzimas de
restricción y conocerá cuál es su
utilidad y función en el estudio y la
manipulación del DNA.
F.3
Definirá qué es un vector de clonación
y un vector de expresión; tomará como
ejemplo los plásmidos.
F.4
Conocerá en qué consiste el
procedimiento
básico
de
la
metodología de clonación y cuál es su
utilidad, al tomar en cuenta:
F.4.1 Cómo se fragmenta el DNA.
F.4.2 Cómo se unen los fragmentos de
DNA a los vectores.
F.4.3 Cómo se introduce el DNA
recombinante en las células
hospederas (transfección).
F.4.4 Cómo se seleccionan las células
que
contienen
DNA
recombinante.
F.4.5 Cuál es la utilidad del DNA
recombinante.
F.5
Conocerá
los
mecanismos
de
recombinación in vitro (ingeniería
genética).
Conocerá el significado de los téminos:
transgen, sobreexpresión, knock out, huella
digital del DNA y polimorfismo.
Las técnicas modernas de biología molecular
han permitido un gran control sobre la
caracterización y manipulación del material
95
genético tanto de DNA como de los distintos
tipos de RNA. Debido a su especificidad y
gran capacidad de detección, estas técnicas
han tenido un gran impacto en la medicina.
Inicialmente, la biología molecular se ha
aplicado al diagnóstico de entidades
patológicas y para determinar la presencia de
agentes infecciosos como microorganismos y
virus. En la actualidad se estudia con gran
interés la posibilidad de una terapéutica
génica que pueda corregir alteraciones
fisiopatológicas derivadas de la pérdida de la
función parcial o total de un gen; esto abre
una nueva era en las aplicaciones de la
biología molecular en la medicina.
La biología molecular recibió un gran
impulso con el descubrimiento de entidades
circulares de DNA llamadas plásmidos que,
además de poseer genes que confieren
resistencia a los antimicrobianos, pueden
contener y expresar muchos otros genes.
Dos herramientas cruciales de la biología
molecular son la posibilidad de cortar el DNA
con enzimas de restricción, endonucleasas
que sólo cortan secuencias específicas, y el
uso de ligasas, que generan un enlace
covalente entre los extremos obtenidos por la
acción de las enzimas de restricción. Estos
dos principios básicos permiten remover o
insertar cualquier porción de DNA contenida
entre dos sitios de restricción y se dice que
se ha clonado esta secuencia de DNA. La
clonación hace posible introducir en un
plásmido, no sólo secuencias de DNA de
otros plásmidos, sino también de cualquier
origen: viral, bacteriano, animal o vegetal. La
reciente aplicación de transcriptasas reversas
de origen viral, enzimas que sintetizan DNA
complementario mediante RNA como molde,
y de polimerasas termostables que permiten
“amplificar” un segmento de DNA, ha
simplificado aún más el uso de técnicas de
biología molecular.
El tener secuencias de DNA o DNA
complementario al RNA mensajero ha
resultado de gran utilidad para el estudio de
genes y RNA mensajeros. Los fragmentos de
DNA obtenidos de la clonación en plásmidos,
o por transcripción reversa y amplificación,
pueden unirse a nucleótidos marcados con el
isótopo radiactivo del fósforo 32P, o
"derivatizados" con moléculas fluorescentes;
la marca permite seguir a estas moléculas
que sirven como sondas para localizar a sus
secuencias complementarias. La gran
especificidad y elevada capacidad de
detección de la hibridación de la sonda con
su secuencia complementaria permite el
análisis de DNA para detectar la presencia y
número de copias de un gen (técnica
denominada Southern); también se aplica en
la identificación y la cuantificación de RNA
mensajeros (técnica a la que se le denomina
Northern).
Los segmentos de DNA cuyo estudio
ha resultado de mayor interés son aquellos
que contienen toda la información de un gen
o de las regiones reguladoras. Sin embargo,
introducir un gen o un promotor a unas
cuantas moléculas de plásmido sería
problemático para estudios bioquímicos,
genéticos y estructurales por la reducida
cantidad de material. Esta limitación había
sido resuelta previamente, ya que los
plásmidos pueden ser introducidos a
bacterias a través del proceso de
transformación. Normalmente los plásmidos
contienen secuencias que les permiten
multiplicarse una vez que están dentro de
una bacteria; a estas secuencias se les
denomina origen de duplicación. Gracias a
que los plásmidos contienen genes que
confieren resistencia a los antimicrobianos,
las bacterias que han sido transformadas con
un plásmido pueden distinguirse de las que
no lo han sido al hacerlas crecer en medio de
cultivo que contiene al antimicrobiano en
cuestión; los antimicrobianos más utilizados
son la ampicilina y la kanamicina. Este simple
proceso de selección logra dos resultados
prácticos: por una parte, elimina a las
bacterias no transformadas y, por otra,
96
asegura la multiplicación masiva del plásmido
que se duplica junto con el genoma
bacteriano. El resultado es un cultivo de
bacterias con un alto contenido de plásmidos
y, por tanto, del segmento de DNA que se
desea estudiar. La multiplicación del
segmento de DNA por estudiar asegura
suficiente material para cualquier otro
propósito.
A los plásmidos que sirven para
insertar DNA ajeno al plásmido y permiten su
multiplicación se les denomina vectores de
clonación, pero existen también plásmidos
más complejos en los que el sitio en el que
se puede insertar el DNA exógeno se
encuentra frente a una región reguladora que
permite la síntesis de RNA mensajero. A
estos plásmidos se les llama vectores de
expresión, ya que permiten que el DNA sea
transcrito a RNA; estos plásmidos pueden
presentar regiones reguladoras reconocidas
por bacterias o por células de animales.
Hemos dicho que la transformación consiste
en introducir el DNA a una bacteria y
expresarlo; cuando esto ocurre en una célula
eucariótica: levadura, célula animal o vegetal,
el proceso se denomina transfección. Una
aplicación particularmente útil de la biología
molecular se ha derivado del uso de vectores
de expresión en bacterias y células animales.
La expresión de proteínas exógenas por
bacterias y levaduras ha permitido obtener
cantidades
suficientes
para
estudios
bioquímicos, estructurales e, incluso, ha sido
la principal fuente para la cristalización. La
transfección y la expresión de proteínas
exógenas en células de mamíferos y en
células vegetales ha permitido identificar
versiones de
genes
que
contienen
alteraciones en sus secuencias que dan
como resultado proteínas con una función
alterada. Con esta aproximación se han
identificado mutaciones responsables de
enfermedades como el cáncer y la diabetes.
Una aplicación sorprendente ha sido la de
identificar la función de genes recién
descubiertos que al ser insertados en
vectores de expresión no sólo han permitido
obtener proteínas puras en cantidades
suficientes
para
su
caracterización
bioquímica, sino también han dado la
oportunidad de conocer su función, al
expresarlas en un ambiente celular normal.
97
MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO
I
CONCEPTOS TEÓRICOS INICIALES
98
EL MÉTODO CIENTÍFICO
Observación
La cultura no puede comprenderse sin hacer
referencia al método científico. La ciencia no
es un sector de la civilización que pueda
separarse del resto de ella, sino un esfuerzo
El método científico se inicia con la
observación. Lo que no puede observarse,
directa o indirectamente por medio de
instrumentos o de modificaciones de la
conducta, no puede ser investigado por la
ciencia.
La observación debe ser repetida en
forma independiente por observadores
diversos. Las observaciones únicas, que no
se repiten ni actual ni potencialmente, no
creativo con su propio sistema de valores
que, poco a poco, ha llegado a formar parte
de los valores generales en la sociedad
moderna.
La ciencia está basada en el método
científico; su capacidad y limitaciones están
definidas por él y dondequiera que el método
científico sea aplicable, puede haber ciencia.
El origen de la ciencia se pierde en
el más remoto pasado. Mucho antes de que
existieran los registros históricos de la
humanidad, la magia primitiva dio origen
también a la religión y, mucho antes, al arte.
Ciencia, religión y arte difieren en métodos,
pero coinciden en metas: comprender e
interpretar al universo y la interacción de sus
partes para promover el progreso material y
espiritual de la humanidad.
El objetivo de la ciencia es hacer
teorías. Las teorías científicas explican los
hechos y predicen con alto grado de
probabilidad la ocurrencia de hechos
similares.
La secuencia del método científico
es: observar, plantear problemas, hacer
hipótesis, experimentar y formular teorías.
Cada uno de los procesos del método
científico, tomado aisladamente, forma parte
de la actuación cotidiana de todos los seres
humanos, pero, en su conjunto, utilizados
sistemáticamente, constituyen la más
poderosa herramienta que ha diseñado la
humanidad para conocer y controlar a la
naturaleza.
pueden ser objeto de estudio científico.
Problema
Después de que una observación se hace y
se repite, el segundo tiempo del método
científico es plantear un problema; en otras
palabras, se hacen preguntas sobre la
observación: ¿Cómo es que los hechos
ocurren de esta manera? ¿Qué es lo que
determina su desarrollo, evolución y término?
Es en este punto donde el científico difiere
del
hombre
común;
ambos
hacen
observaciones pero sólo el primero muestra
curiosidad científica sobre ellas.
Plantear un problema es hacer
preguntas, pero, hacer “buenas preguntas” al
igual que hacer “buenas observaciones” es
un arte muy preciado. Para que tengan valor
científico
los
problemas
deben
ser
significativos
y
tener
respuestas
comprobables por técnicas apropiadas.
Las preguntas que se inician por
¿cómo? o ¿qué? se resuelven mejor,
científicamente, que las que comienzan con
¿por qué?, pero los investigadores pueden
formular los problemas para que adopten la
forma adecuada.
99
Hipótesis
Teoría
Una vez planteado un problema adecuado, el
científico procede al tercer tiempo del
método: formular una explicación o hipótesis.
Por supuesto que un problema puede tener
varias explicaciones posibles, pero sólo una
de ellas es la verdadera. Las respuestas
casuales a un problema son generalmente
erróneas; pero el científico con su intuición,
su experiencia y, a veces por incidentes
afortunados, acierta en la hipótesis. Esto se
sabe al emplear el cuarto tiempo del método
científico.
Experimentación
El objetivo de la experimentación es
comprobar la validez de la hipótesis. Si los
experimentos demuestran que la hipótesis es
errónea, se hace una nueva y se la sujeta a
comprobación. El procedimiento puede
prolongarse por mucho tiempo al formular
nuevas hipótesis y tratar de comprobarlas
experimentalmente.
La
situación
ideal
en
la
experimentación consiste en reducir el
problema a dos alternativas posibles que
puedan contestarse con claridad, afirmativa o
negativamente; pero en muchas ocasiones
los resultados del experimento sólo conducen
a soluciones parciales.
La experimentación es la parte más
ardua
del
método
científico.
Cada
experimento es un caso en sí mismo; el
conocimiento anterior y la experiencia
ayudan técnicamente para decidir la forma en
que una hipótesis puede ser comprobada
experimentalmente. La elección correcta del
experimento y su interpretación es lo que
separa al genio
investigación.
del
aficionado
a
la
Las pruebas experimentales son la base del
quinto peldaño, final del método científico: la
formulación de una teoría. Cuando una
hipótesis se ha sostenido por pruebas
convincentes,
obtenidas
por
muchos
laboratorios e investigadores independientes,
se propone una teoría que consiste en una
afirmación con límites mucho más amplios
que los experimentos en que se basa y que
expresa la creencia o probabilidad de que
sea valedera en cualquier combinación de
sujeto, tiempo y lugar en donde se reúnan
condiciones similares.
Desde este punto de vista una buena
teoría permite hacer “predicciones.” Las
predicciones científicas tienen siempre un
soporte experimental muy sólido y aun
cuando no afirman que un hecho ocurrirá con
certidumbre, sí plantean que tiene una gran
probabilidad de ocurrir.
Unas pocas teorías han probado su
validez tan universalmente, y expresan tan
alto grado de probabilidad, que se las conoce
con el nombre de leyes naturales. Por
ejemplo, ninguna excepción se conoce al
hecho de que una manzana desprendida de
su árbol caerá al suelo si no es sostenida de
alguna manera. La ley de gravitación se basa
en esta observación.
Las leyes naturales orientan la
investigación científica. Si en el análisis de un
hecho se elimina lo imposible, aquello que es
contrario a las leyes naturales, lo que resta,
aunque sea muy raro y poco probable, debe
ser la verdad. La verdad son los hechos que
nos rodean. Aunque acontecen sin cesar a
nuestro alrededor, muy pocas personas y
muy pocas veces se hace un análisis
científico de ellas.
100
Si se emplean las leyes naturales
comunidad y en especial en medicina. El SI
para marcar lo imposible, con el resto posible
se hacen nuevas hipótesis, se comprueban
por experimentos, se formulan nuevas
teorías y se acumula el conocimiento
es esencialmente una versión ampliada del
sistema métrico decimal.
El SI comprende tres tipos de
unidades: las unidades de base, las unidades
derivadas, las unidades suplementarias y una
serie de prefijos que permiten tomar múltiplos
científico que ha permitido al hombre situarse
en un Universo observable que tiene un radio
(r) de millares de millones de años luz y que
incluye un microcosmos tan pequeño que se
expresa en órdenes de magnitud menores de
–20
10 m y adquirir un dominio incuestionable
sobre su ambiente.
SISTEMA INTERNACIONAL DE UNIDADES
(SI)
Los resultados de todos los experimentos en
que se basan las teorías científicas y las
leyes naturales derivan de las mediciones de
objetos o de sus propiedades.
Medir es comparar magnitudes; toda
medición comprende un número y una
unidad. La unidad identifica la clase de
dimensión y el número expresa las veces que
la unidad está contenida en el objeto o la
propiedad medida. La medición es un arte
muy refinado; en la actualidad emplea
instrumentos muy complejos y alcanza una
precisión extraordinaria.
Un sistema de medidas preciso
requiere unidades bien definidas. La Oficina
Internacional de Pesas y Medidas revisa
periódicamente el sistema para incorporar los
adelantos tecnológicos y mejorar la exactitud
y precisión de las medidas.
Se han hecho muchos esfuerzos
para desarrollar un sistema de unidades
y submúltiplos decimales de las unidades
utilizadas.
Unidades de base
El SI consta de siete unidades básicas que
son dimensionalmente independientes. Las
unidades básicas están anotadas en el
cuadro I.1, junto con los símbolos que hay
que utilizar para indicar estas cantidades.
Unidades SI derivadas
Al multiplicar una unidad de base por sí
misma o al asociar dos o más unidades de
base por una simple multiplicación o división,
se puede formar un amplio grupo de
unidades llamadas SI derivadas (cuadro I.2).
Ejemplo: la unidad derivada de volumen es el
metro elevado al cubo, o metro cúbico.
La combinación de unidades de base
para formar las unidades derivadas es una
de las grandes ventajas del SI. En el SI no es
preciso memorizar factores de conversión; el
factor a que se recurre para formar las
unidades derivadas es 1 (unidad), cualidad
que hace al SI coherente.
universalmente aceptable. El producto de
estos esfuerzos es el Sistema Internacional
de Unidades (cuya abreviatura es SI en todos
los idiomas). A partir del creciente
intercambio de información científica este
sistema ha sido aceptado por toda la
101
Cuadro I.1. Unidades básicas del SI.
signo
Magnitud
Longitud
Masa
Tiempo
Cantidad de
sustancia
Temperatura
termodinámica
Intensidad luminosa
Nombre
metro
kilogramo
segundo
mol
Símbolo
m
kg
s
mol
kelvin
K
candela
cd
nanómetro y no nano-metro).
El símbolo del prefijo se antepone
también directamente al símbolo de la
unidad, sin espacios intermedios ni signos de
puntuación (ejemplo: mm, milímetros; nmol,
–9
nanomol que equivale 10 moles).
Cuadro I.3. Unidades SI derivadas con
nombres especiales
Intensidad de
corriente eléctrica
ampere
A
Cuadro I.2. Algunas unidades derivadas
simples
Magnitud
Superficie
Volumen
Concentración
de sustancia
Velocidad
Nombre
metro
cuadrado
metro
cúbico
mol/metro
cúbico
metro
por
segundo
Símbolo
2
m
m
3
mol/m
3
m/s
A cierto número de unidades SI derivadas se
les ha dado nombres especiales, en su
mayor parte tomados de los hombres de
ciencia que han hecho contribuciones
notables al conocimiento del tema de estudio
correspondiente (cuadro I.3).
de
(ejemplo:
Definición
Nombre
Símbolo
Fuerza
Newton
Nm.
kgm/s
Presión
Pascal
Pa
N/m2
Trabajo; energía; cantidad
Joule
J
Nm
Coulomb
C
Potencia; flujo energético
Watt
W
J/s
Tensión eléctrica;
Volt
V
W/A
Grado
°C
2
de calor
Carga eléctrica; cantidad
A.s
de electricidad
potencial eléctrico
Temperatura Celsius
K–273,16
Celsius
Cuadro I.4. Prefijos SI.
Factor
18
10
15
10
12
10
9
10
6
3
10
–3
10
Cuando las unidades SI derivadas resultan
demasiado grandes o demasiado pequeñas
para
determinados
fines
(sería
desproporcionado, por ejemplo, utilizar el
metro cúbico para expresar el volumen de
sangre del cuerpo humano), el SI contiene
alguno
Magnitud
10
Prefijos SI
puntuación
–6
10
–9
10
–12
10
–15
10
–18
10
Prefijo
Símbolo
exa
E
Peta
P
Tera
T
Giga
G
Mega
M
Kilo
k
Mili
m
Micro
µ
Nano
n
Pico
p
Femo
F
ato
q
una serie de prefijos que permiten formar
múltiplos y submúltiplos decimales de las
Unidades no pertenecientes al SI
unidades SI (cuadro I.4).
Los prefijos SI se anteponen
directamente al nombre de la unidad, sin
Ciertas unidades ajenas al SI son de uso tan
frecuente que en cierto modo forman parte
102
de nuestra vida cotidiana y se acordó
utilizarlas juntamente con el SI (cuadro I.5).
Algunas de estas unidades, en
especial el litro y las unidades de tiempo, son
de gran importancia en las profesiones de la
salud. Conviene señalar que el litro es un
nombre especial que se da al submúltiplo,
decímetro cúbico, de la unidad SI de
volumen.
La multiplicación de las unidades se
indica con un punto a nivel o elevado
(newton.metro=N.m) o un espacio (N m). La
división se puede indicar mediante una barra
oblicua o por exponentes negativos:
–1
1/s = s
mol por metro cúbico puede expresarse por:
3
mol/m o mol.m
Cuadro I.5.
Algunas
pertenecientes al SI.
unidades
no
Magnitud
Unidad
Símbolo
Valor en
SI
Tiempo
minuto
min
60 s
hora
H
3 600 s
Día
D
86 400 s
Volumen
Litro
loL
10-3 m3
Energía
caloría
cal
4.185J
–3
El SI tiene muchas ventajas y
algunas desventajas, pero se reconoce la
realidad del esfuerzo para implantarlo como
una forma de expresar los datos científicos,
comprensible para todos. Se recomienda
desechar las unidades que no pertenecen al
SI a la mayor brevedad posible, pero la
realidad del uso de otras unidades en textos
y comunicaciones científicas no se puede
negar. En este Manual las unidades SI se
anotarán entre paréntesis cuando se juzgue
conveniente.
Reglas de escritura de símbolos y cifras
Los símbolos de las unidades no toman la
terminación del plural (ejemplo: dos mililitros
se escribe 2 ml, y no 2 mls).
Los símbolos de las unidades jamás
van seguidos de un punto, salvo si están al
final de una frase (ejemplo: 5 ml y no 5 ml.).
Cuando se escriben cifras, la coma
sólo se puede utilizar para indicar los
decimales; las cifras deben agruparse en
tríos, dispuestos a la derecha y a la izquierda
de la coma, y separados entre sí por un
pequeño espacio. Ejemplo:
forma correcta: 1 000 000
0,003 278
0.003 278
forma incorrecta: 1,000,000
0.003,278
Algunas recomendaciones para utilizar
el SI en bioquímica
PARA EXPRESAR CONCENTRACIONES
La concentración de sustancias cuya masa
molecular se conoce se expresa en forma de
cantidad de sustancia, es decir, en moles (o
en submúltiplos como el milimol o el
nanomol) por litro. Ejemplo:
Ácido úrico en el suero o plasma:
Varones: 0.18 a 0.53 mmol/l.
Mujeres: 0.15 a 0.45 mmol/l.
Colesterol en el suero o plasma: 3.9 a 7.2
mmol/l.
Glucosa en el suero o plasma: 3.6 a 6.1
mmol/l.
Vitamina A en el suero: 0.53 a 2.1 µmol/l.
La concentración en
cantidad de sustancia no
forma de
debe ser
103
denominada
“concentración
molar”
o
molaridad, ni utilizar el símbolo M en vez de
mol/l (como tampoco mM, nM, etcétera, en
vez de mmol/l, nmol/l, etcétera).
La concentración de sustancias cuya
masa molecular se desconoce o es dudosa
se expresa en kg/l, g/l, mg/l, etcétera.
Ejemplo:
Proteína sérica total: 60 a 80 g/l.
Albúmina sérica: 33 a 55 g/l.
Globulina sérica: 20 a 36 g/l.
Fibrinógeno en el plasma: 2 a 6 g/l.
Hormona antidiurética en plasma: 2 a 12
pg/ml
Concentración de sustancias en tejidos.
Se expresa en unidades de masa (si no se
conoce la masa molecular) o en moles (si se
conoce la masa molecular) por kilogramo de
tejido seco o húmedo. Ejemplo:
g/kg, mg/kg o mol/kg, mmol/kg, etcétera.
No se recomienda expresarla en unidades
de volumen, es decir en mg/ml, g/l, etcétera.
Concentración de iones hidrógeno.
La concentración de hidrogeniones en los
líquidos biológicos se expresa en nmol/l, así
como en unidades de pH. El valor del pH se
define como el logaritmo negativo de la
actividad de los iones hidrógeno (pH = -log
+
H ), esta actividad puede determinarse
potenciométricamente con la ayuda de un
pH-metro.
Actividad enzimática. La unidad SI de
actividad catalítica es mol por segundo: mol/s
(también llamado katal, símbolo: kat) y
corresponde a la cantidad de sustrato
transformado por segundo como resultado de
la catálisis. La velocidad medida es
proporcional a la cantidad de enzima
presente.
La actividad también puede ser
expresada en términos de unidades (símbolo:
U). Por definición, una unidad es igual a la
concentración de enzima necesaria para la
formación de un micromol de producto por
minuto (µmol/min). La actividad específica de
una enzima se define como la concentración
de producto que se forma por 1 miligramo de
enzima por minuto.
MATEMÁTICAS PARA EL LABORATORIO
Notación científica o exponencial
Cuando se expresan cantidades muy
grandes o muy pequeñas, como es el caso
frecuente en bioquímica, la dificultad de
escribir y manipular muchos ceros se evita
con el uso de la notación exponencial o
científica.
En la notación exponencial todo
número puede expresarse como una
potencia entera de 10, o como un producto
de dos números, uno de los cuales es una
potencia entera de 10. Ejemplo: el número de
Avogadro seiscientos dos sextillones se
escribe:
602 000 000 000 000 000 000 000
y en la notación exponencial como una
cantidad decimal multiplicada por 10 elevada
23
a la potencia apropiada = 6.02 x 10 . Como
ejercicio, examine las cantidades siguientes:
2
200 = 2 x 10 x 10 = 2 x 10
2
205 = 2.05 x 10
5
205 000 = 2.05 x 10
–1
0.205 = 2.05 x 10
–4
0.000 205 = 2.05 x 10
–7
0.000 000 1= 1/10 000 000 = 1 x 10
El exponente de la base 10 para
números mayores de la unidad es el número
de lugares desde la coma o punto decimal
separada de la primera cifra significativa:
104
2
2
205 = 2.05 x 10 = 2 lugares
3
3
(5.1 x 10 ) + (3.4 x 10 ) = (0.51 x 10 ) + (3.4 x
3
3
10 ) = 3.91 x 10
Para fracciones decimales menores
de la unidad se separa la primera cifra
distinta de cero después de la coma decimal
y se cuentan los lugares hacia la izquierda
hasta la coma decimal, incluso la cifra
separada y el número es el exponente
negativo:
0.000 205 = 0.000 “2”05
del 2 a la coma decimal son 4 lugares; por lo
4
tanto, es 2.05 x 10– .
Las operaciones de multiplicar y
dividir, elevar a potencias o extraer raíces se
facilitan manipulando los exponentes según
reglas muy sencillas. La porción decimal no
exponencial se opera en forma ordinaria, lo
que reduce el manejo a tres cifras
significativas como máximo; los exponentes
se suman algebraicamente para multiplicar,
se restan para dividir, se multiplican por una
potencia deseada para tener el exponente de
la misma y para encontrar raíces se divide el
exponente entre el índice de la raíz.
Ejemplos:
6
3
9
10
6 x 10 por 3 x 10 = 18 x 10 = 1.8 x 10
6+3
9
ya que 6 x 3 = 18 y 10 = 10
6
3
3
6 x 10 entre 3 x 10 = 2 x 10
6–3
3
ya que 6/3 = 2 y 10 = 10
Para la adición y la sustracción usando
notación científica, primero se escribe cada
cantidad con el mismo exponente n. Luego
se realiza la operación deseada entre los
valores N1 y N2, donde N1 y N2 son los
El método del factor unitario en los
cálculos
El procedimiento que se utilizará para
resolver problemas que incluyan conversión
de unidades se denomina método del factor
unitario. Esta técnica se basa en las
propiedades del número 1, es decir:
• Cualquier número al ser multiplicado por
uno, sigue siendo el mismo número (1 x 5 =
5).
• El número 1 puede ser escrito como el
cociente de cualquier número dividido por si
mismo (3/3 ó 6/6).
• Se puede tomar cualquier ecuación y
dividirla por uno de los miembros para
obtener una razón igual al número 1.
Por ejemplo, dada la ecuación:
1 minuto = 60 segundos, obtener la razón
igual al número 1.
1 minuto
1 minuto
1=
=
60 segundos
1 minuto
60 segundos ó
1 minuto
1=
1 minuto
60 segundos
Estas razones o factores que son
equivalentes al número 1 se conocen como
factores unitarios, factores de conversión o
coeficientes de conversión.
El recíproco de cualquier factor
unitario es también un factor unitario.
En ambos casos el numerador y el
denominador describen la misma cantidad,
por lo que se puede efectuar conversiones
entre diferentes unidades que miden la
misma cantidad.
números obtenidos con el mismo exponente;
estos últimos permanecen iguales. Ejemplo:
105
El método del factor unitario consiste en:
1. Tomar una relación entre unidades y
expresarla en forma de una ecuación,
2. Luego expresar la relación en forma de
una
fracción
(llamada factor
de
conversión) y, por último;
3. Multiplicar la cantidad dada por ese factor.
En esta multiplicación, las unidades
idénticas se multiplican o cancelan como
si fueran números.
Ejemplo: ¿Cuántos µl hay en 0.00005 L (5 x
-5
10 L)?
-6
6
6
10 —O
1L
-5
3) 5 x 10
[-5+ 6]
L x= 5 x 10
para manejar los datos bioquímicos; constan
de dos partes que se separan por una coma
o punto decimal; a la izquierda, la
característica corresponde al orden de
magnitud y puede ser positiva o negativa
según sea la cantidad mayor o menor de la
unidad. El exponente de la base 10 para
números mayores de la unidad es siempre
positivo. Cuando es negativo se indica con el
signo menos arriba del número que la
representa:
0.001 = 10 -3 característica 3
-3
1 000 = 10 característica 3
1) 1 µl = 10 L ó 1 L = 10 µl
2)
Los logaritmos son indispensables
1
= 5 x 10 µl =
50µl.
En este método las unidades se
acarrean en todo el proceso del cálculo, por
lo tanto si la ecuación se establece en forma
correcta, todas las unidades se cancelan
excepto la deseada.
Logaritmos
El logaritmo de un número es el exponente o
potencia de una base determinada que se
requiere para obtener el número. Si el
n
número “a” elevado a la potencia “n” (a ) es
igual al número “N”, entonces “n” es el
logaritmo de base “a” del número “N.” Es
decir:
n
si a = N entonces n = loga de N
La base “a” puede ser cualquier
número; en la práctica médica se usa como
base el número 10 y los logaritmos
resultantes se conocen como logaritmos
“comunes” o de Briggs. Su símbolo es: log o
log.10
A la derecha, la mantisa es la
fracción decimal de exponente que
corresponde a los dígitos que ocupan el
orden de magnitud; se obtiene de tablas o de
calculadoras electrónicas y siempre tiene
valor positivo:
0.3010
log 2 = 0,3010 esto es 10
=2
Cuando la característica y la mantisa
son de diferente signo (+ o –) se opera con el
cologaritmo que se obtiene por la suma
algebraica de la mantisa positiva con la
característica negativa es un número todo
negativo, ver el siguiente ejemplo:
Log 0.002 = 3.3010 = -2.6990
3.000
+0.3010
-2.6990 cologaritmo
La característica indica la posición del punto
decimal en la cifra representada por la
mantisa y se determina por inspección del
número.
Para un número mayor que 1, la
característica es uno menos que el número
106
de cifras antes del punto decimal; así: la
ejemplo el antilogaritmo de 1.6747 es 47.29:
característica de 100 es 2 porque el número
cien tiene 3 dígitos a la izquierda del punto
decimal. Para un número menor que 1, la
característica es numéricamente uno más
la característica es 1 (hay dos dígitos a la
izquierda del punto decimal) y la mantisa es
0.6747, que se buscaría en la tabla de
logaritmos
donde
se
hallaría
que
que el número de ceros que siguen al punto
decimal; así: la característica de 0.000 000 1
corresponde a 4 729.
Los estudiantes deben familiarizarse
es 7 con signo negativo.
Para encontrar el logaritmo de
número, por ejemplo: 0.000 809, se busca
la tabla las dos primeras cifras distintas
cero de izquierda a derecha (80) en
primera columna vertical de las tablas
con el uso de logaritmos en las operaciones
comunes.
El logaritmo del producto de dos
números es igual a la suma de sus
logaritmos:
un
en
de
la
se
sigue la horizontal correspondiente hasta la
columna 9, que es el otro número, en donde
se lee 9 079, que es la mantisa requerida. La
mantisa para 809, 8.09, 0.0809, etcétera; es
la misma (9 079), pero difiere la
característica. Así:
log a x b = log a + log b
El logaritmo del cociente de dos
números es igual al logaritmo del dividendo
menos el logaritmo del divisor:
log a/b = log a – log b
El logaritmo de la potencia “n” de un
número es igual a "n" veces el logaritmo del
número:
Log 0.000 809 = 4.9079 = -3.0921
Si el número del cual se requiere el
logaritmo tiene cuatro cifras, la cuarta se
busca en la misma columna horizontal en la
parte de la tabla que dice “partes
proporcionales” y debe agregarse a la
mantisa como diez milésimos.
Por ejemplo, para el número 8 091:
Mantisa para 809 = 9 079
parte proporcional para 1 = 1
0.9079
+ 0.0001
0.9080; log 8091 = 3.9080
El antilogaritmo es el número que
corresponde a un logaritmo dado. Para
encontrarlo se busca la mantisa en la tabla
de antilogaritmos, se determina el número a
que corresponde y se fija la posición del
punto decimal según la característica. Por
3
log a = 3 x log a
Gráficas
"Una figura equivale a mil datos en una tabla
numérica" y así como se construye un
modelo para visualizar un conjunto complejo
de hechos, se utiliza una gráfica para
presentar los datos experimentales en tal
forma que fácilmente se asimilen y aprecien
sus relaciones cuantitativas.
Se llama gráfica a la representación
esquemática de las variaciones que sufren
las distintas magnitudes que intervienen en
los fenómenos físicos, químicos, biológicos,
sociales o de cualquier otra índole. Tiene por
objeto mostrar rápida e intuitivamente la
relación que guardan las magnitudes
comparadas.
Entre las diferentes clases de
gráficas que existen las más importantes son:
Gráfica poligonal. Consiste en
expresar las variaciones de un fenómeno
107
continuo
por
medio
de
puntos
y
de
fenómeno discontinuo se emplean las barras,
representar la marcha de dicho fenómeno por
medio de una línea que une esos puntos.
Para elaborar una gráfica poligonal
se trazan en un papel, de preferencia
que pueden ser horizontales o verticales.
Barras verticales. Las magnitudes se
representan por medio de rectángulos, barras
de base igual que descansan en el eje de las
milimétrico, dos rectas perpendiculares entre
sí que se corten en cero. En cada una de
abscisas y cuya altura es proporcional a la
intensidad del fenómeno y se mide en el eje
ellas se representará una de las magnitudes
que se van a relacionar. El punto cero (0) se
llama origen y la rectas son los ejes; 0X es el
eje X y 0Y es el eje Y. Para referirse al eje X
generalmente se dice: eje horizontal o eje de
las abscisas (variable independiente) y para
de las ordenadas.
Barras horizontales.
el eje Y: eje vertical o eje de las ordenadas
(variable dependiente).
Los ejes dividen su propio plano en
cuatro regiones llamadas cuadrantes que se
numeran I, II, III y IV. En el laboratorio
utilizamos habitualmente sólo el primer
cuadrante (figura I.1).
Las distancias a la derecha de 0, a lo
largo del eje X, se consideran como positivas
y las de la izquierda como negativas.
Similarmente, hacia arriba de 0, a lo largo del
eje Y, se miden las distancias positivas y
hacia abajo de 0 las negativas.
Después se trazan los puntos cuyas
distancias a uno de los ejes sean
proporcionales a la magnitud que se va a
representar y, finalmente, al unir estos puntos
por medio de segmentos de recta, se tiene la
gráfica poligonal.
Nota: por lo general, es mejor que la
Las
barras
descansan sus bases en el eje de las
ordenadas y el fenómeno se mide en el eje
de las abscisas.
Gráfica de sectores circulares. Para
hacer una gráfica de este tipo hay que tener
en cuenta que el círculo debe tener el total de
las magnitudes que se van a representar.
Los
sectores
circulares
son
proporcionales a las magnitudes que
representan; magnitud que se mide en
grados de circunferencia. Para determinar el
número de grados que deben tener dichas
partes se plantearán una serie de reglas de
tres para cada una de ellas en las cuales se
consideran:
como 100% a la suma total de las
magnitudes que se quieren graficar, para
obtener en cada caso el porcentaje
correspon diente; una vez obtenido
curva llene una parte considerable de la
página. Muy bien puede usarse la misma
unidad de medida sobre los dos ejes, pero a
menudo los valores tienen un campo de
variabilidad muy amplio, lo cual hace
necesario usar diferente escala para cada
uno de los ejes.
Diagrama en barras. Cuando se
quieren expresar simples comparaciones de
medidas entre sí o para representar un
éste, se pasará a grados, considerando
108
360o como 100% y procediendo entonces a
f = 0.01096 x n2mr = 717 g
980
hacer la gráfica.
ALGUNOS MÉTODOS UTILIZADOS EN
BIOQUÍMICA
Centrifugación
Un método muy útil en el laboratorio para
separar sustancias de diferente densidad
suspendidas en
un
líquido
es
la
centrifugación; en ella, la acción de la fuerza
centrífuga (fuerza necesaria para desplazar
hacia afuera un determinado peso en
dirección radial) da como resultado que las
partículas más pesadas se sedimenten más
rápido que las partículas ligeras.
La fuerza centrífuga depende de la
cantidad de materia (m) que se desplaza
hacia afuera cuando está rotando a una
velocidad por minuto de (n) veces a una
distancia radial (r) y se expresa por la
fórmula:
2
f (en dinas) = 0.01096 n m r
En el sistema métrico decimal, la unidad de f
es la dina, la de m es el gramo y la de r es el
centímetro. Ejemplo: si se coloca un gramo
de agua en un tubo de centrífuga y se rota a
2 000 rpm (revoluciones por minuto) a una
distancia radial de 16 cm, la fuerza es:
2
f = 0.01096 x 2000 x 1 x 16 = 701 440 dinas
Si transformamos las dinas a peso,
entonces el gramo de agua tiene peso
porque es atraído al centro de la Tierra de
acuerdo con la ley de la gravitación y es
atraído en estado normal, con 980 dinas de
fuerza. Si usamos, por lo tanto, peso en vez
de dinas como la unidad de nuestro problema
tendremos:
o sea, interpretando la fórmula, la fuerza de
contención para sostener la unidad masa (el
gramo) e impedir que se vaya del centro de
rotación es la fuerza que la gravedad ejercía
sobre 716 g o, dicho de otra manera, el
gramo a esa velocidad pesa en el fondo del
tubo de la centrífuga 716 gramos comparado
con el tubo en reposo o 716 veces la fuerza
de la gravedad (g).
La
centrifugación
y
ultracentrifugación son operaciones que se
basan en el principio anterior y que permiten
separar los componentes de una mezcla.
Las centrífugas ordinarias operan a
rotaciones menores de 10 000 revoluciones
por minuto (rpm). Las condiciones que limitan
esta velocidad son la resistencia de la parte
de la centrífuga que sostiene el rotor (brazo),
la fricción con el aire y el calentamiento.
Las ultracentrífugas operan en
cámaras refrigeradas, evacuadas de aire, y el
rotor no gira sostenido por un “brazo” sino
impulsado por chorros de aceite o aire
comprimido que se aplica a una porción
externa del rotor sostenido por una pared
muy gruesa de una cámara cilíndrica de
rotación. Se alcanzan velocidades de 20 000
a 70 000 rpm.
La
sedimentación
en
la
ultracentrífuga se expresa en unidades
Svedberg (símbolo: S) y se aplica a la
comparación
práctica
de
tamaños
moleculares que no sólo dependen de la
masa de las moléculas implicadas sino
también de su forma. Es importante
considerar que los valores de Svedberg no
son aditivos, es decir, dos partículas 5S no
crean una partícula 10S. Sin embargo, hay
109
una correspondencia tosca que para las
proteínas esféricas es de:
2 S = 10 kdal
4 S = 50 kdal
8 S = 160 kdal
16 S = 400 kdal
–13
La unidad Svedberg es igual a 10
segundos; no pertenece al SI y puede
suplirse por 0,1 picosegundo (ps) o 100
femtosegundo (fs). En las moléculas menos
densas que el medio de suspensión, como
las lipoproteínas, el desplazamiento es hacia
la superficie y se expresa en Svedberg de
flotación (Sf) y permite la clasificación en:
LDL, HDL y VHDL (low density, high density
y very high density) con Sf de 0 a 10, 10 a
400 y las muy densas que no flotan y tienen
una densidad mayor de 1.
El peligro del mal uso de la centrífuga deriva
de la enorme fuerza que alcanza en el radio
de rotación y el “peso” de las sustancias
colocadas en el campo gravitacional del
aparato.
Se debe tener cuidado con los
siguientes puntos:
1. Los tubos en las centrífugas deberán
colocarse por pares para que no haya
diferencia de peso en un lado de la
centrífuga. Enfrente de un tubo de un
peso determinado debe estar otro, en la
misma posición, con el mismo peso. El
descuido de esta regla implica un desnivel
que, a las velocidades y fuerzas
señaladas, puede romper los tubos y
dañar el aparato. Para balancear por
pares los tubos lo mejor es usar una
balanza de dos brazos y ajustar el peso
hasta que sea idéntico.
2. Para no forzar el motor arránquese
gradualmente la centrífuga hasta alcanzar
la velocidad requerida.
3. Nunca se frene una centrífuga; déjese
parar por su propia inercia; el no hacer
esto conduce a que se agite el contenido
de los tubos y se eche a perder el trabajo.
4. No alzar las tapas de la centrífuga cuando
está en movimiento.
5. Ante cualquier dificultad o duda consulte
al profesor.
Potenciometría
Muchas de las reacciones que se realizan en
las células son reacciones de oxidación y de
reducción, es decir, en las que se transfieren
electrones.
La
electroquímica
estudia
las
reacciones químicas en las que hay
transferencia de uno o más electrones.
La oxidación es la pérdida o liberación de
electrones y la molécula que los cede se
denomina agente reductor.
La reducción es la ganancia de electrones y
la molécula que los acepta se denomina
agente oxidante.
Cuando se oxida un agente reductor,
se transforma en su forma oxidada y como la
reacción es reversible las formas oxidada y
reducida del compuesto constituyen un par
conjugado llamado par redox o par de
oxidorreducción.
El proceso de oxidación siempre va
acompañado del proceso de reducción ya
que los electrones que cede una molécula
reductora son aceptados por una molécula
oxidante, lo cual constituye las reacciones de
oxidorreducción o reacciones redox.
La determinación cuantitativa de la
concentración de las moléculas oxidantes y
reductoras en una solución es el objeto de
estudio de la potenciometría. En esta técnica
se determina el potencial eléctrico generado
por la transferencia de electrones en una
reacción redox en la cual estén involucradas
las moléculas a estudiar. Este potencial se
mide en una celda electroquímica. La celda
más común es la de Daniell (Fig. I.2), en la
110
que en dos compartimientos separados que
contienen ZnSO4 y CuSO4 se colocan cinc y
cobre metálico, respectivamente; las dos
soluciones se conectan por un puente salino
(un tubo que contiene agar embebido en una
presión del gas de una atmósfera. Sin
embargo, en la práctica es inconveniente
porque se trata de un electrodo gaseoso.
solución de un electrolito como el KCl).
Cuando los dos electrolitos se conectan por
un alambre metálico, ocurre un flujo de
electrones del electrodo de cinc al electrodo
de cobre, el cual puede ser medido por
medio de un voltímetro. Cuando el cinc cede
los electrones se convierte en ion soluble,
mientras que el cobre disuelto, al aceptar los
electrones, se convierte en cobre metálico
que se deposita en el electrodo. El puente
salino cierra el circuito eléctrico entre las dos
soluciones.
El hecho de que fluya una corriente
eléctrica del polo positivo (ánodo, que en
este caso es el electrodo de cinc) al polo
negativo (cátodo, que en este caso es el
electrodo de cobre), significa que hay una
diferencia de potencial entre los electrodos
denominada fuerza electromotriz (fem) de la
celda. Dado que el potencial de un electrodo
está relacionado con la magnitud de cargas
positivas existentes, la diferencia de potencial
compara las cargas relativas existentes en
dos puntos. Se denomina potencial de
electrodo (E) a la diferencia de potencial
respecto a un electrodo de referencia
arbitrario y depende de la concentración de
las moléculas en la solución y de la
temperatura.
En general, el potencial de los
electrodos se mide con referencia al
electrodo de hidrógeno al que se le ha
asignado
En general, el potencial de los electrodos se
mide con referencia al electrodo de
hidrógeno al que se le ha asignado
arbitrariamente un potencial de cero a 25o C
a una concentración de 1 mmol/L y una
Fig. 1.2 Celda de Daniell
Es por ello, que se usan otros
electrodos de referencia, como el de calomel,
en el cual el sistema de medición es mercurio
y cloruro mercuroso. En el caso de este
electrodo, como sucede con todos los pares
redox, debe calibrarse con respecto al
electrodo de hidrógeno.
Los pares redox de interés para el
bioquímico incluyen a menudo al ion
hidrógeno como reactivo o como producto,
por lo que tales sistemas están en función del
pH del medio.
Hay diferentes tipos de electrodos:
los metálicos (como los de la celda de
Daniell), los metálicos-sal insoluble (como el
de plata/cloruro de plata), los gaseosos
(como el de hidrógeno, que se adsorbe sobre
platino), los electrodos selectivos de iones
(que pueden ser para aniones o para
cationes) y los de vidrio (que son electrodos
selectivos de iones, especiales para
+
determinar H ). Estos últimos son los más
utilizados ya que una de las aplicaciones
prácticas
más
importantes
de
la
potenciometría es la determinación del pH.
111
Dentro del electrodo de vidrio hay un
El
esquema del
circuito de un
alambre de plata con un extremo sumergido
en una solución de HCl 0.1M. El bulbo de la
parte inferior es de un vidrio especial,
+
permeable a los iones H . La superficie
interior de esta membrana de vidrio está en
contacto con la solución de HCl y la exterior
potenciómetro típico se encuentra en la figura
I.3. La sensibilidad del medidor se puede
ajustar para cambios de acuerdo a la
temperatura
(botón
de
control
de
temperatura). Con el botón de calibración a
cero se introduce un voltaje lateral en el
con la solución cuyo pH se quiere determinar.
En las dos superficies la membrana de vidrio
circuito que permite que la lectura
corresponda al pH de la solución reguladora
absorbe agua y forma una capa de gel a
través de la cual difunden los iones
hidrógeno y desplazan a otros iones de la
estructura del vidrio (como sodio) y esto
provoca el establecimiento de un potencial.
En una solución amortiguadora que contenga
Cl– se sumerge un electrodo de Ag/AgCl.
Cuando el electrodo se coloca en una
solución cuyo pH es diferente al de la
solución
amortiguadora,
aparece
una
diferencia de potencial entre los dos
extremos, lo cual es una medida de la
diferencia de los dos valores de pH.
La determinación más precisa del pH
se realiza en un pH-metro que consiste,
fundamentalmente, en un potenciómetro
diseñado para emplearse con un sistema de
electrodo de vidrio. Como una unidad de pH
corresponde a 59 milivoltios a 25º C, el
mismo medidor se puede usar con dos
escalas para hacer lecturas en mv o en pH.
El electrodo de vidrio consiste en una
membrana de vidrio situada al final de un
tubo de vidrio o plástico de paredes más
gruesas. En el tubo se encuentra ácido
clorhídrico diluido saturado de cloruro de
tipo. Los medidores de pH se construyen de
tal manera que el cero de la escala del
potenciómetro corresponda a un pH de 7. El
medidor se calibra antes de usarlo, primero
plata y un hilo de plata que conecta a la
terminal del voltímetro con un electrodo de
referencia. El pH se determina midiendo la
diferencia de potencial a través de la
membrana de vidrio que separa la solución a
la cual se quiere determinar el pH, de la
solución de referencia cuya concentración de
hidrogeniones se conoce.
con una solución reguladora de pH 7,
ajustando el cero para que dé la lectura
exacta; se lava el electrodo con agua
destilada o desionizada y se calibra con una
segunda solución reguladora de pH 4 ó 10;
se ajusta nuevamente el medidor, ahora con
el control de temperatura, para que dé la
lectura exacta; luego se determina el pH de
la solución problema.
Electroforesis
Una partícula coloidal o un ion provistos de
carga eléctrica emigran hacia el ánodo o el
cátodo bajo la influencia de un campo
eléctrico externo. Si las partículas de una
mezcla tienen diferentes velocidades de
112
desplazamiento, puede aprovecharse esta
se realiza en un canal vertical y la densidad
propiedad para separarlas. El empleo de
fuerzas eléctricas para lograr esta separación
se
llama
electroforesis
y
depende
fundamentalmente de la carga y no de la
de la solución por debajo del frente debe ser
mayor que la de arriba, ya que en caso
contrario el sistema de frentes se destruiría.
En el método, la solución a separar se coloca
masa molar de las partículas cargadas. Esta
técnica
se
ha
empleado
en
la
encima del medio amortiguador conductor.
La técnica es difícil y costosa, aunque puede
separación
de
proteínas,
péptidos,
nucleótidos, ácidos orgánicos y porfirinas,
entre otros compuestos. Es importante
considerar que en el caso de una proteína su
carga depende del pH del medio, por lo que
es posible emplear la técnica para determinar
presentar la ventaja de que se evitan las
interacciones de los solutos con cualquier
superficie y se eliminan así los efectos
adsorbentes y desnaturalizantes. Además,
puede operarse en medios acuosos, a baja
temperatura y bajo condiciones favorables de
el punto isoeléctrico de la misma.
Si se aplica un campo eléctrico a
través de una solución, la fuerza que actúa
sobre las moléculas cargadas de soluto
depende de la carga eléctrica (e); del número
de cargas en la molécula (z), y de la fuerza
del campo eléctrico (E). Inmediatamente
después de poner a funcionar el campo, las
partículas cargadas se aceleran hasta que
alcanzan un equilibrio, o sea, cuando la
carga electrostática queda equilibrada por la
fuerza de fricción que ejerce el medio
disolvente; entonces, se mueven a una
velocidad constante. La velocidad por unidad
de campo eléctrico se denomina movilidad
electroforética. Dado que la fricción depende
del tamaño de la partícula y de la viscosidad
del medio en que se mueve, la facilidad con
la que se mueve una partícula cargada
depende directamente de su carga e
inversamente de su tamaño y de la
viscosidad del medio.
pH y fuerza iónica.
Electroforesis zonal. Uno de los
problemas que presenta la técnica anterior es
la necesidad de estabilizar las zonas de
soluto contra la convección gravitacional y la
difusión. Esto originó el empleo de otra
técnica de electroforesis: la electroforesis
zonal. En ella, el empleo de gradientes de
densidad, sólidos porosos o fibrosos y geles
permite resolver el problema de la difusión y
de la convección gravitacional.
En este tipo de electroforesis la
mezcla de solutos a separar se aplica como
una mancha o una banda delgada en un
punto del canal electroforético. Los solutos
migran con distintas velocidades (de acuerdo
a su movilidad) y se separan en zonas
discretas. La distancia de migración es
directamente proporcional al voltaje aplicado
y al tiempo. Los solutos migran a través del
solvente que baña un soporte sólido. Este
soporte puede ser de diversa naturaleza y
cada uno presenta algunas ventajas y
desventajas en su uso. Los soportes más
comunes son papel, acetato de celulosa,
almidón, agar, agarosa y poliacrilamida.
Dado que en el caso de los geles es posible
un manejo del tamaño del tamizado para
lograr una máxima eficiencia en la
Existen dos tipos de electroforesis: la
frontal y la zonal.
Electroforesis frontal o en medio
líquido. Es el método clásico de Tiselius en el
que la separación de los componentes de
una mezcla se realiza en varios frentes o
límites que se traslapan a lo largo del
procedimiento. El movimiento de los frentes
113
separación, este método es el más usado en
bioquímica.
En la técnica hay que cuidar algunos
aspectos que pueden afectar la separación
como: la selección adecuada del soporte, del
amortiguador, vigilar la temperatura de la
cámara, la intensidad del campo eléctrico, el
tiempo, etcétera.
Electroforesis en papel y en acetato
de celulosa. La electroforesis en papel fue el
primer método de separación en zonas en un
campo eléctrico. Es una técnica sencilla y
rápida, que requiere pequeñas cantidades de
muestra y que es especialmente útil en las
electroforesis de alto voltaje para separar
moléculas de bajo peso molecular como
aminoácidos, péptidos, oligonucleótidos y
otros compuestos orgánicos con grupos
cargados. Ha sido muy utilizada en el mapeo
bidimensional de proteínas (fingerprinting),
para identificar diferencias entre proteínas
similares, probar que una proteína es
producto de otra de mayor tamaño, etcétera.
Dado que el papel tiene una alta
actividad endosmótica*, lo que causa algunos
problemas en la electroforesis, ha sido
sustituido por el acetato de celulosa, que
tiene una estructura microporosa uniforme,
actividad endosmótica baja y en el que la
adsorción de las proteínas ha sido eliminada.
En los aparatos en que se realizan
estas técnicas el soporte se humedece al
sumergirlo en el amortiguador y colocarlo de
tal manera que se establezca el contacto con
las soluciones en que están los electrodos.
Los aparatos se tapan para evitar la
evaporación y para mantener una atmósfera
húmeda dentro del aparato.
Electroforesis en geles de agar y
agarosa. El agar es una mezcla de
polisacáridos que se obtiene de ciertas
especies de algas marinas. Está constituido
de dos componentes principales: uno lineal o
agarosa y uno ramificado y muy ácido
llamado agar o pectina. El agar y la agarosa
son solubles en soluciones acuosas a 100oC
y solidifican a temperatura ambiente; forman
geles de buena firmeza cuando se usan a
una concentración de 0.5 a 2%. Su estructura
se mantiene por numerosos puentes de
hidrógeno entre cadenas adyacentes de
polisacáridos. El gel de agarosa ofrece
ciertas ventajas sobre otros soportes; posee
una porosidad elevada y uniforme, lo que
favorece la migración regular de las
sustancias cargadas, lo cual se traduce en
una mayor resolución.
Para realizar la electroforesis en
estos medios se prepara el gel sobre una
superficie de vidrio. Una vez solidificado el
gel, se hacen pocillos en él para aplicar en
ellos la muestra. Se lleva a cabo, o se
"corre", la electroforesis y, al final, se fija la
preparación, se tiñe y se seca. La técnica se
ha usado en combinación con la
inmunodifusión en el análisis inmunológico
de proteínas y en la cuantificación de
proteínas inmunoprecipitables.
La electroforesis en agarosa ha
permitido el estudio de las moléculas del
DNA, cuyo tamaño impide que puedan
penetrar en los geles de poliacrilamida, pero
que penetran fácilmente en geles de agarosa
6
a 0.2%, si tienen un peso hasta de 150 x 10 ,
6
o a 0.8% si pesan hasta 50 x 10 .
Es posible separar moléculas de
DNA que difieren sólo 1% de peso molecular
según sea la concentración de la agarosa.
Para detectar las bandas, se sumerge el gel
en una solución de bromuro de etidio el cual
se pega al DNA y fluoresce cuando se excita
con luz ultravioleta. El peso molecular se
determina por la distancia de migración.
También se han usado estos geles de
agarosa para la obtención de mapas de
restricción, los que permiten ver diferencias
114
entre dos moléculas de DNA, localizar
en la determinación de los pesos moleculares
mutaciones, detectar recombinaciones de
fagos, aislar fragmentos de DNA deseados,
distinguir entre el DNA lineal, circular o
superenrollado.
Electroforesis
en
geles
de
poliacrilamida. Los geles de poliacrilamida
de proteínas.
Electroenfoque. Si se coloca una proteína en
son geles totalmente sintéticos que han
sustituido a los geles de almidón en el
estudio rutinario de proteínas por métodos
electroforéticos. Esto ha sido posible gracias
a la gran facilidad con que puede variarse
según el contenido total del monómero y su
como electroenfoque. Para formar un
gradiente estable y continuo de pH se usan
anfolitos sintéticos de una gran variedad de
pesos moleculares y rangos de pH. Cuando
se establece el campo eléctrico, los anfolitos
migran y generan el gradiente de pH según
grado de entrecruzamiento. Dada su
capacidad de filtrador molecular, se ha
empleado para separar compuestos con
base en su peso molecular para lo que se
usa lauril sulfato de sodio (SDS) con el objeto
de evitar las diferencias individuales en las
cargas de las proteínas.
Los amortiguadores que se usan pueden ser
continuos (en los que se utiliza el mismo
amortiguador en los tanques de los
electrodos y los sistemas electroforéticos) y
discontinuos, en los que hay dos tipos de
geles: el de separación, o de poro cerrado,
en el cual se resuelven los componentes de
una mezcla (aquí es importante el uso del
amortiguador
adecuado)
y
el
gel
concentrador, o de poro abierto, que sirve
para concentrar la muestra. A los geles se les
puede incorporar sustancias disociantes
como la urea y el SDS sin que sean
afectados. También pueden emplearse
agentes
reductores
como
el
2
sus propios puntos isoeléctricos. Esta técnica
ha sido utilizada en combinación con la
separación por pesos moleculares en la
electroforesis bidimensional como método de
análisis de proteínas.
*Nota: Cuando se aplica un potencial
eléctrico a un líquido contenido en un soporte
no conductor el líquido se moverá hacia uno
u otro electrodo, en favor o en contra del
movimiento electroforético, alterando la
movilidad electroforética de las partículas
cargadas. Este fenómeno se conoce como
endosmosis. Si el soporte está cargado,
induce la orientación de las cargas con signo
opuesto en el líquido, lo que ocasionará al
aplicar la corriente eléctrica que ocurra un
flujo
del líquido
dentro
del
canal
electroforético. Este fenómeno es lo que se
conoce como actividad endosmótica y puede
causar problemas en las separaciones
electroforéticas.
mercaptoetanol o ditiotreitol para romper los
puentes disulfuro de las proteínas.
Las dos aplicaciones principales de
la
electroforesis discontinua
son
la
SOLUCIONES
determinación de la pureza de proteínas y el
análisis de los componentes de una mezcla.
disuelve), y una dispersora que constituye el
solvente o disolvente (la sustancia que
La electroforesis en gel de poliacrilamida en
presencia de SDS también se ha empleado
disuelve al soluto) y que, generalmente, se
encuentra en mayor proporción. Las
un gradiente de pH sujeto a un campo
eléctrico, se moverá hasta alcanzar su punto
isoeléctrico,
donde
permanecerá
sin
moverse. Esta técnica es lo que se conoce
Una solución es una mezcla homogénea de
por lo menos dos componentes: una fase
dispersa, que es el soluto (sustancia que se
115
soluciones más utilizadas en bioquímica son
relación es peso a peso (p/p), peso a
las que tienen agua como solvente.
La solubilidad de un soluto en un
solvente depende de la naturaleza de éstos,
de la temperatura y, en el caso de un gas, de
volumen (p/v) o volumen a volumen (v/v).
Ejemplos:
la presión. La solubilidad generalmente está
dada en gramos de soluto por 100 g de
solvente.
Se llaman soluciones diluidas las que
contienen una proporción relativamente
pequeña de soluto; se llaman soluciones
concentradas las que contienen una gran
cantidad de soluto. Sólo son posibles
soluciones concentradas cuando el soluto es
muy soluble.
Una solución saturada contiene la
cantidad de soluto disuelto necesaria para la
existencia de un equilibrio entre las
moléculas disueltas y las moléculas en
exceso que no están disueltas. Esta solución
se forma por medio de una vigorosa agitación
con exceso de soluto. Existe una solución
sobresaturada cuando en la solución hay
presente más soluto que en una solución
saturada. Para prepararla se forma una
solución saturada a temperatura elevada y se
enfría cuidadosamente para evitar la
cristalización. Las soluciones sobresaturadas
son inestables y con facilidad se convierten
en soluciones saturadas.
Las mencionadas soluciones son
poco precisas y no indican, de manera
cuantitativa, el soluto ni el solvente; los
métodos cuantitativos más comunes, que
sirven para expresar la concentración (la
medida numérica de la cantidad relativa de
soluto en la solución) de las soluciones, son
las porcentuales, las molares y las normales.
Soluciones porcentuales
En las soluciones porcentuales no se toma
en cuenta el peso fórmula del soluto. En este
tipo de soluciones se debe especificar si la
Solución porcentual p/p. Solución al
10% de NaCl contiene 10 g de la sal por 100
g de solución. El peso/peso porcentual
expresa el número de gramos del soluto en
100 gramos de la solución final.
%p/p = g de soluto
100 g de solución
x 100
Solución porcentual p/v. Solución de NaCl
a 10% p/v: 10 g de NaCl en 100 ml de
solución. Esto expresa el número de gramos
de soluto en 100 ml de la solución final. En
bioquímica, si no se especifica otra situación,
las
soluciones
porcentuales
deben
entenderse como p/v.
%p/p = g de soluto
100 ml de solución
x 100
Solución porcentual v/v. Se utiliza
cuando el soluto y el solvente son líquidos. El
v/v indica el número de volúmenes de soluto
por 100 volúmenes de solución. Solución de
etanol a 30% v/v: 30 ml de éste en 100 ml de
solución. Esto quiere decir que por cada 100
ml de solución, 30 ml corresponden al soluto
y el resto, hasta completar 100 ml, al agua
destilada o al solvente empleado.
%v/v = volumen de soluto
x 100
100 volúmenes de solución
Es importante insistir que los
términos porcentuales expresan siempre una
relación, es decir, podemos variar los
volúmenes siempre y cuando no perdamos
dicha relación. Por ejemplo, si nos pidieran
preparar 50 ml de una solución de alcohol
etílico a 20%, seguiríamos el siguiente
planteamiento:
116
100 ml de sol. tienen 20 ml de alcohol puro
Soluciones molares
50 ml de sol. tienen x ml de alcohol puro
Una solución molar se define como el
número de moles de soluto en un litro de
solución:
M= No. de moles
litro de solución
X = 20 x 50 x 10
100
Resultado: necesitamos 10 ml de
alcohol puro y completar un volumen de 50
ml.
donde un mol es igual al peso atómico o
molecular expresado en gramos (átomo
El alcohol etílico común es de 96%
de pureza (v/v). Por lo tanto, si no contamos
con alcohol puro y quisiéramos preparar una
solución de alcohol a 20%, seguiríamos el
siguiente planteamiento:
gramo o molécula gramo). Un mol contiene el
23
número de Avogadro (6.023x10 ) de
partículas, átomos o moléculas.
100 ml de sol. tienen 96 ml de alcohol puro
X ml de sol. tienen 20 ml de alcohol puro
X= 20 x 100 = ml de solución
96
Resultado: necesitamos 20.83 ml de
solución de alcohol a 96% y completar un
volumen de 100 ml.
Si tan sólo queremos 50 ml de esta
nueva solución, entonces:
100 ml de sol. de alcohol a 20% tienen
20.83 ml de alcohol a 96%
50 ml de sol. de alcohol a 20% tienen X ml
de alcohol a 96%
X= 50 x 20.83 = 10.41ml
100
Si un mol de una sustancia se
disuelve en agua hasta un volumen de un
litro, se obtiene una solución 1 molar (1M).
Por ejemplo, si quisiéramos preparar
una solución 1 molar de NaCl, tendríamos
que considerar, primero, su peso molecular
(Na:23 + Cl:35.5 = 58.5) y este valor en
gramos disolverlo en agua, hasta completar
un litro.
Ahora bien, si nos piden preparar 400
ml de una solución 0.5 M de NaCl: ¿cuántos
gramos de NaCl deben pesarse?
1. Sabemos que un mol de NaCl es de 58.5
g.
2. Haremos el siguiente planteamiento:
Una sol. 1M tiene 58.5g de NaCl.
Una sol. 0.5M tiene X g de NaCl.
X= 0.5 x 58.5 = 29.25 g de NaCl
100
Resultado: necesitamos 10.41 ml de
alcohol de 96% y completar con agua
destilada hasta un volumen final de 50 ml.
3. De acuerdo con la definición de solución
molar, los 29.25 g de NaCl los
consideramos en un litro de solución, pero
como nos piden preparar 400 ml haremos
el siguiente planteamiento:
En 1000 ml de sol. hay: 29.25g de NaCl
En 400 ml de sol. hay: X g de NaCl
117
X= 400 x 29.25 = 11.7 g de NaCl
1000
NaCl
entre el número de átomos de hidrógeno
sustituibles en la molécula. El ácido sulfúrico
(H2SO4), de peso molecular 98, tiene dos
Resultado: necesitamos 11.7 g de
y disolverlo hasta completar un
volumen de 400 ml.
En este ejemplo, como podemos ver,
hemos multiplicado la molaridad del
problema (0.5 mol/L) por el peso molecular
de NaCl (58.5 g) y por el volumen del problema (400 ml). Posteriormente dividiremos
entre 1 litro (1 000 ml). Para simplificar el
procedimiento podemos aplicar la siguiente
fórmula:
V x PM x M = gramos de la sustancia
1000
En donde:
V=
Volumen del problema en ml.
PM = Peso molecular de la sustancia en g.
M=
Molaridad del problema.
Soluciones normales
Son las que contienen el peso equivalente de
una sustancia en gramos por litro de
solución:
N = peso equivalente
litro de solución
donde el peso equivalente de una sustancia
es el número de unidades de esta sustancia
que puede combinarse con una unidad de
hidrógeno:
Peso equivalente = peso molecular
n
n = número de hidrógenos sustituibles.
Ejemplo: el peso equivalente de un
ácido se calcula dividiendo el peso molecular
átomos de hidrógeno sustituibles en cada
molécula; por lo tanto, su peso equivalente
es: 98/2 = 49.
El peso equivalente de un hidróxido
se calcula dividiendo el peso molecular entre
–
el número de grupos hidroxilo (OH ) de la
molécula. El hidróxido de aluminio Al (OH)3
–
contiene tres grupos OH por molécula; su
peso molecular es de 78; por lo tanto, su
peso equivalente es 78/3 = 26.
El peso equivalente de una sal se
calcula dividiendo el peso molecular entre la
valencia total de los cationes (cargas
positivas) que contenga la fórmula. La
valencia del sodio es 1, y el sulfato de sodio
Na2SO4 (peso mo-lecular 144) tiene dos
iones de sodio en cada molécula; por lo
tanto, el peso equivalente del sulfato de sodio
será 144/2 = 72.
El peso equivalente de un oxidante
(reductor) se calcula dividiendo el peso
molecular entre el número de electrones
ganados (o perdidos) que puedan aportar por
molécula.
Recordemos la fórmula utilizada para
calcular la cantidad de sustancia necesaria
para preparar cualquier cantidad de una
solución determinada:
Para calcular la cantidad de una sustancia
que se necesita pesar para preparar un
volumen determinado de una solución de
cualquier normalidad, se aplica una fórmula
semejante:
V x Eq x N = gramos de la sustancia
1000
Ejemplo: preparar una solución 0.1 N
de cloruro de calcio (CaCl2) para obtener un
volumen de 300 ml:
118
V =
300 ml
N =
Eq =
0.1
peso molecular del CaCl2
111/2 = 55.5
sustituyendo=300 ml x 55.5 g x 0.01 N= 1.67
1000
Resultado: necesitamos 1.67 g de
CaCl2 para preparar 300 ml de una solución
0.1 N.
Soluciones osmolares
El fenómeno de la ósmosis se presenta
cuando una solución está separada de su
solvente por una membrana semipermeable.
La ósmosis es la difusión de solvente a
través de la membrana desde la parte de
menor a la de mayor concentración. La
presión osmótica es la presión que debe
aplicarse sobre la solución de mayor
concentración a fin de impedir el paso del
solvente (ósmosis) a través de la membrana.
Las membranas biológicas tienen
permeabilidades dis-tintas y se dice que son
semipermeables, es decir, que son
permeables de forma selectiva para las
moléculas del solvente o pequeñas
moléculas, pero no permiten el paso libre de
todas las moléculas disueltas.
Las
mediciones
cuantitativas
demuestran que la presión osmótica es
proporcional a la concentración molar (para
sustancias no disociables) del soluto, por lo
que una solución osmolar es aquella que
contiene un mol de la sustancia en gramos
en un litro de solución; el osmol es una
medida del número total de partículas en
solución. La concentración expresada en
osmol por litro se llama osmolaridad; el osmol
por kilogramo de disolvente se denomina
osmolalidad; en las soluciones muy diluidas,
como son las del cuerpo humano, las dos
medidas son tan cercanas que con gran
frecuencia se utilizan indistintamente.
La presión osmótica depende del
número de partículas y no de su carga, ni de
su masa; la misma fuerza osmótica es
ejercida por una molécula grande, como una
proteína, con peso molecular de varios miles
y muchas cargas, como por una molécula de
+
–
glucosa o un ion de Na o de Cl . Así para
determinar el efecto osmótico de una
solución hay que sumar los efectos de todas
las partículas incapaces de atravesar la
membrana independientemente de su peso
molecular.
Por ejemplo: el cloruro de sodio en
solución
acuosa
se
disocia
casi
+
completamente en iones sodio (Na ) y cloruro
–
(Cl ). Por lo tanto, cada molécula da origen a
dos partículas osmóticamente activas, y una
solución osmolar contiene media molécula
gramo (peso molecular expresado en
gramos) por litro, o sea:
1 osm/l = 58.5/2 = 29.25 g/l ó también
1 mol de NaCl = 2 osm/l
En cambio, la glucosa en solución no
se disocia y para esta sustancia la solución
osmolar contiene un mol en gramos por litro:
1 mol de glucosa = 180 g/l = 1 osm/l
La mayoría de los líquidos corporales
tiene una presión osmótica que concuerda
con la de una solución de cloruro de sodio a
0.9 % y se dice que esta solución es
isosmótica con los líquidos fisiológicos.
Soluciones isotónicas
Las soluciones isotónicas con respecto unas
a otras ejercen la misma presión osmótica;
es decir, contienen la misma concentración
de partículas osmóticamente activas. Cuando
se
el
habla de soluciones isotónicas en
laboratorio, suele tratarse de las que
119
tienen la misma presión osmótica que el
plasma
sanguíneo,
que
es
aproximadamente
de
0.3
osmolar
(300
miliosmoles). Las soluciones fisiológicas de
concentración menor a 300 mosm/l se llaman
hipotónicas; cuando su concentración es
mayor de 300 mosm/l se denominan
hipertónicas.
Una solución es isotónica con
respecto a una célula viva cuando no ocurre
ganancia ni pérdida neta de agua en la
célula, ni se produce ningún otro cambio en
ésta cuando entra en contacto con la
solución.
El término isotónico, que significa:
igualdad de tono, se emplea en medicina
como sinónimo de isosmótico; pero los
términos isotónico y tonicidad sólo deben
emplearse en relación con un líquido
fisiológico. Por ejemplo, una solución de
ácido bórico que es isosmótica con la sangre
y el líquido lagrimal, sólo es isotónica con el
líquido lagrimal, ya que esta solución
ocasiona hemólisis de los eritrocitos porque
las moléculas de ácido bórico atraviesan
libremente la membrana eritrocitaria a
cualquier concentración. En consecuencia,
isotonicidad
connota
compatibilidad
fisiológica, mientras que isoosmoticidad, no
necesariamente. En otras palabras, la
tonicidad es una fracción de la presión
osmótica total de la solución; por tanto, la
tonicidad de una solución no se puede
predecir únicamente por su composición ya
que intervienen también las propiedades
distintivas de la membrana limitante.
Cálculo y expresión de diluciones
La dilución consiste en preparar una solución
menos concentrada a partir de una solución
inicial más concentrada. Las diluciones se
expresan usualmente como una razón
matemática, como 1:10. Esto significa una
unidad de solución original diluida a un
volumen final de 10, esto es, 1 volumen de
solución original con 9 volúmenes de
solvente (volumen final = 10).
Para calcular la concentración de la
solución diluida se multiplica la concentración
de la solución original por la dilución
expresada como fracción.
Ejemplo: una solución de 300 mg/100
ml se diluye en la razón 1:10. La
concentración de la solución final es:
300 x 1/10 = 30 mg /100 ml.
Si se hace más de una dilución, a
partir
de una misma solución,
la
concentración de la solución final se obtiene
al multiplicar la concentración original por el
producto de las diluciones. Ejemplo: la
solución anterior se diluye a su vez en la
razón 1:100. La concentración de la solución
será: 300 x 1/10 x 1/100 = 0.3 mg/100 ml.
La dilución y redilución sistemáticas
de una solución se llaman diluciones
seriadas. Para encontrar la concentración en
un tubo dado de la serie, se multiplica la
dilución en ese tubo por cada una de las
diluciones precedentes, incluida la del tubo
original.
Ejemplo: hacer una dilución seriada
1:2, 1:4, 1:8, etcétera, a un volumen final de
1 ml.
Paso 1: a 0.5 ml de la solución a
diluir, añadirle 0.5 ml del diluyente y
etiquetarlo como tubo 1 (dilución 1:2,
volumen 1 ml).
Paso 2: transferir a otro tubo 0.5 ml
de la dilución anterior y agregarle 0.5 ml de
diluyente (dilución 1:2). La dilución final
obtenida se calcula al multiplicar la dilución
del tubo 1 (o anterior) con la nueva dilución
(1/2 x 1/2), igual a 1:4. Los pasos siguientes
se hacen igual que para el paso 2. En el
120
siguiente cuadro se muestra un resumen de
lo anterior.
Tubo
Dilución
= 0.5 ml (1) = 1:2(4)
1. 0.5 ml(1)
1 ml (3)
0.5 ml (1) + 0.5 ml (2)
2. 0.5 ml(1)
= 0.5 ml (1) = 1:4 (4)
1 ml (3)
0.5 ml (1) + 0.5 ml (2)
es decir:
1/2 ; x 1/2
= 1:4
3.
4.
5.
1/4 x 1/2
1/8 x 1/2
1/16; ; x 1/2
= 1:8
= 1:16
= 1:32
(1) Volumen de la solución original a diluir.
(2) Volumen del agua necesaria para la
dilución.
(3) Volumen final.
(4) Dilución obtenida.
(5) Volumen de la solución diluida 1:2 (o
anterior).
MANEJO DE MATERIAL BIOLÓGICO
Se le llama material biológico al conjunto de
seres vivos o sus productos utilizado en el
desarrollo del trabajo en el laboratorio. La
utilidad e importancia de este material es
muy grande ya que muchos fenómenos de
los seres vivos sólo pueden estudiarse en
ellos
mismos,
por
ejemplo,
la
experimentación de nuevos fármacos o los
mecanismos que se presentan en entidades
patológicas y la producción de las mismas en
forma experimental. Del correcto manejo
dependerá en gran parte el éxito de la
experimentación y la veracidad de los
resultados obtenidos. A continuación se
darán algunas generalidades sobre el manejo
del material biológico utilizado en las
prácticas de este Manual.
Animales
El animal utilizado más comúnmente en el
laboratorio de bioquímica es la rata. Para su
correcto manejo es importante la forma cómo
se sujeta, lo cual se hará con firmeza, pero a
la vez, en forma suave para no lesionarla; no
debe demostrársele miedo o repugnancia
para evitar que se ponga nerviosa e
intranquila, lo que puede ocasionar que
muerda.
La palma de la mano se coloca sobre
el dorso del animal; la cabeza de éste entre
el dedo pulgar y el dedo índice; de esta
manera se logra su inmovilidad y es posible
levantar el animal y moverlo de lugar.
Muchas veces es necesaria la
inyección intraperitoneal de alguna sustancia,
para lo cual se sostendrá al animal con una
mano, como se indicó antes, mientras con la
otra se introduce la aguja de la jeringa
formando un ángulo de 10º con la pared
abdominal en el cuadrante inferior izquierdo,
ligeramente a la izquierda de la línea media;
es importante mantener el ángulo de la aguja
porque, si éste se abre, la aguja puede llegar
a la vejiga o al intestino. Para tener la
seguridad de estar en la cavidad peritoneal,
hay que jalar el émbolo de la jeringa para que
se haga el vacío; si el vacío no se hace y, por
el contrario, se extrae líquido, es probable
que se haya puncionado la vejiga.
Para la extracción de vísceras, como el
hígado, es necesario sacrificar al animal, lo
cual se logra fácilmente y con menor
sufrimiento para la rata anestesiándola o
descerebrándola, o sea, seccionando la
médula espinal a nivel del cuello mediante un
golpe certero en este lugar contra el borde de
una mesa. Después se prosigue a la
extracción de la víscera y se abre la pared
abdominal con unas tijeras o bisturí.
Extracción de sangre para análisis
El profesor a cargo del grupo deberá estar
presente en el momento de la extracción; de
lo contrario, por ningún motivo, el alumno
podrá hacerla por su cuenta.
121
Procedimiento para obtener una muestra
de sangre venosa:
1. Para que un alumno sea considerado
como voluntario deberán tomarse en
cuenta algunos antecedentes como: no
padecer o haber padecido hepatitis o
alguna
otra
enfermedad
infectocontagiosa; no tener problemas de
coagulación y no ser muy aprensivo. El
donador (de preferencia con las venas
visibles), estará sentado con el brazo
sobre la mesa.
2. Con una ligadura elástica, aplicar un
torniquete en el brazo por encima del sitio
de la punción (esto causa congestión
venosa y evita el retorno de la sangre). El
uso prolongado del torniquete causa
estasis
de
la
sangre
y
hemoconcentración. Si las venas no se
hacen prominentes, pedir al donador que
cierre y abra la mano varias veces.
Escoger una vena fija y de buen calibre,
localizarla y palparla con el dedo para
sentir su consistencia y trayectoria; antes
de puncionar, asegurarse de que la
jeringa no contenga aire y que el émbolo
se deslice suavemente. Las dimensiones
de la aguja y la jeringa dependen de la
cantidad de sangre que se necesita así
como del tamaño e integridad de la vena
que se usa. También se puede usar el
sistema Vacutainer que consiste en un
tubo al vacío, un mango y una aguja
recolectora de muestras múltiples.
3. Limpiar minuciosamente la zona con una
torunda humedecida con alcohol de 70º y
dejar secar espontáneamente. Sujetar la
piel con el pulgar izquierdo; puncionar
primero la piel y luego penetrar la vena
con el bisel de la aguja hacia arriba
siguiendo el trayecto de la vena.
4. Después que se ha entrado a la vena, la
sangre llenará los tubos vacíos del
sistema vacutainer. Si se usa jeringa, se
necesita una ligera succión con ésta para
obtener la muestra (por lo general,
aparece una gota de sangre en la base de
la aguja). Una succión excesiva puede
causar colapso de la vena. Tirar del
émbolo de la jeringa hasta que se haya
extraído la cantidad de sangre deseada.
5. Soltar la ligadura antes de extraer la aguja
con un movimiento rápido y uniforme
mientras que se ejerce una presión sobre
la herida con una torunda.
6. Mantener la presión por un momento o
hasta que se haya detenido el sangrado.
Cubrir la punción con una cinta adhesiva.
7. Retirar la aguja de la jeringa en el
contenedor de punzocortantes y vaciar lo
más pronto posible la muestra de sangre
en un tubo de centrífuga procurando
deslizar la sangre suavemente por la
pared del tubo (si es que no se utilizó el
sistema Vacutainer).
Alerta clínica
Si es difícil detener el sangrado de la
punción, elevar la zona y aplicar una cubierta
que presione. Los hematomas se pueden
evitar:
• Usando una buena técnica.
• Aflojando el torniquete antes de retirar la
aguja.
• Aplicando la presión suficiente sobre el
sitio de punción después de completar el
procedimiento.
La sangre obtenida puede tratarse de
diferentes maneras según el empleo que se
le vaya a dar.
Para obtener suero. La sangre se
recibe en un tubo de ensayo o de centrífuga
seco y se deja coagular a temperatura
ambiente o en una estufa o baño de agua a
122
37º C. Si se va a trabajar inmediatamente
clasificación, manejo y disposición final de
con el suero, separar con un aplicador de
madera el coágulo y centrifugar el resto del
tubo. Si se desea la separación espontánea
del suero, se deja a temperatura ambiente
estas sustancias, lo cual nos permite
identificar los peligros y disminuir los riesgos.
por unas horas para que el coágulo se
retraiga. Debe evitarse que el suero se
biológico infecciosos
Precauciones generales: Se refieren a las
mezcle con porciones de coágulo; si esto
sucede, es necesario centrifugar y volver a
separar el suero con una pipeta Pasteur.
Para obtener plasma. Hay que evitar
medidas para minimizar la difusión de
enfermedades transmisibles, especialmente
hepatitis B o SIDA y para evitar incendios,
cortaduras o exposiciones simples, de corta
duración o accidentales a sustancias
químicas peligrosas.
la
coagulación
por
medio
de
un
anticoagulante (heparina, citrato de sodio o
EDTA) en el tubo que recibe la sangre.
Mezclar suavemente por inversión.
Centrifugar a 2 500 rpm durante 5 minutos y
extraer enseguida el plasma sobrenadante
con una pipeta Pasteur; pasarlo a otro tubo.
La sangre, el plasma o el suero y
todos los recipientes que los contengan
deben
considerarse
como
material
potencialmente infectante, por lo que
(torundas, agujas, tubos, etcétera) deberán
depositarse, de acuerdo a su clasificación,
en envases que tengan impreso el símbolo
de riesgo biológico y entregarse a la
coordinación del laboratorio para su
desinfección y desecho.
MEDIDAS DE SEGURIDAD
Durante el desarrollo del curso de
bioquímica, en el laboratorio se pueden llegar
a utilizar sustancias o muestras biológicas
que, en ocasiones representan riesgos
potenciales a la salud, debido a que pueden
ser: corrosivas, reactivas, explosivas, tóxicas,
inflamables o biológico infecciosas.
Aunque
los
laboratorios
se
consideran en general lugares de trabajo
seguros, esto es así sólo cuando conocemos
y seguimos las normas de seguridad
existentes en la materia acerca de la
Manejo
de
materiales
peligrosos
y/o
1. Manejar cualquier líquido corporal,
sangre, plasma, suero, orina, tejido,
cadáver o cultivo como potencialmente
infeccioso. Todas las sustancias químicas
proporcionadas, equipos y materiales del
laboratorio deberán ser utilizados con el
máximo cuidado, atendiendo a las
indicaciones de peligrosidad y cuidados
específicos, según el caso.
2. Se debe conocer los símbolos y los
códigos de color sobre las precauciones y
los peligros en el laboratorio. Asegurarse
de
conocer
la
localización
de
extinguidores, del botiquín y de las salidas
de emergencia.
3. Usar bata en el laboratorio, la cual deberá
estar cerrada durante todo el tiempo que
se permanezca en el laboratorio.
4. Lavar las manos y usar guantes. Los
guantes deben usarse para efectuar
punciones vasculares y para manipular
sangre, líquidos corporales, cultivos de
microorganismos, sustancias o superficies
contaminadas. Después del uso de
cualquier material biológico, se procede al
lavado de manos con los guantes
puestos. Después de quitarse los guantes
debemos lavarnos nuevamente las
manos.
123
5. Todos los materiales desechables y no
evitar la contaminación de alimentos,
desechables se deben descontaminar en
una solución 1:10 de hipoclorito de sodio
de 4 a 7 % de concentración, durante más
de 20 minutos antes de ser desechados.
cigarros o manos que después se llevarán
a la boca o con las que se tocarán
alimentos (nunca ingerir alimentos en el
laboratorio). Por último, nunca pipetear
6. Los elementos punzocortantes deben
desecharse en recipientes especiales
destinados para ello, los cuales deben
estar etiquetados con la leyenda que
indique "Peligro, residuos punzocortantes
biológico-infecciosos" y marcados con el
símbolo universal de riesgo biológico.
Nunca reencapuchar las agujas
7. Limpiar las superficies potencialmente
contaminadas con hipoclorito de sodio al
1%, con alcohol al 70% o con agua
oxigenada.
8. Todas las sustancias químicas son
potencialmente tóxicas y peligrosas, por
lo que se deberá:
a) Conocer las propiedades (venenosas,
cáusticas o corrosivas) y el uso correcto
de las mismas.
b) Nunca probar, así como tampoco inhalar,
directamente las sustancias.
Para
determinar el olor se acerca la tapa del
frasco cuidadosamente a la nariz, o bien,
si se trata de sustancias volátiles o
vapores acercar éstos con la mano a la
nariz.
c) Evitar el contacto de sustancias con la
piel, especialmente la cara; usar bata y
guantes para proteger la ropa y el cuerpo;
nunca dirigir un tubo de ensayo o la boca
de un matraz con líquidos en ebullición o
material de reacción hacia el vecino, o a
sí mismo, ya que puede proyectarse el
contenido; para las sustancias que no
tienen un efecto pronunciado sobre la
con la boca, especialmente los ácidos
fuertes, productos cáusticos, oxidantes
fuertes y compuestos venenosos.
9. Seguir las indicaciones del profesor y del
personal a cargo del área de prácticas. Es
una regla de laboratorio que todos los
accidentes personales, por triviales que
sean, se comuniquen inmediatamente al
profesor. Nunca realizar actividades
experimentales sin la supervisión del
responsable del grupo.
10. Manejar adecuadamente los residuos
peligrosos derivados de las prácticas,
identifique su nivel de riesgo y el
mecanismo para su desecho. Queda
prohibido desechar sustancias a la tarja o
por cualquier otro medio, sin autorización
del responsable del grupo. Las hojas de
seguridad correspondientes incluyen qué
hacer en caso de accidentes y la forma
correcta de desechar los residuos.
11. Indicaciones generales para evitar
incendios o explosiones al utilizar
solventes
inflamables. Los solventes inflamables (alcohol,
éter, cloroformo, acetona, tolueno, xilol,
etcétera) se utilizan en todos los
laboratorios, por lo que se recomiendan
las siguientes precauciones:
a) No fumar en el interior del laboratorio.
b) No utilizar la llama del mechero sin
cerciorarse de que no hay cerca líquidos
inflamables. No mantener el mechero
encendido cuando esté fuera de uso.
piel, pero cuya ingestión es peligrosa,
124
c) Si se vierten accidentalmente sobre las
parado sobre un piso húmedo. Siempre
mesas, secar de inmediato con un trapo
húmedo y enjuagar éste en el chorro de
agua, exprimiéndolo.
apagar y desconectar los aparatos antes
de cualquier manipulación.
d) Nunca calentar un líquido orgánico sobre
una flama. Para calentar, usar baño de
agua o parrilla eléctrica.
En caso de incendio debe hacerse lo
siguiente: para un incendio pequeño en un
vaso, un matraz, etcétera, éste se cubrirá con
un recipiente mayor o se ahogará el fuego
con un trapo mojado o se combatirá con un
extinguidor.
Cuando el fuego sea de un solvente
derramado sobre la mesa o el piso, se
utilizará un extinguidor de bióxido de
carbono. Si el fuego no puede vencerse de
inmediato, se evacuará el laboratorio y se
avisará al departamento contra incendios de
la institución.
12. Los accidentes más frecuentes que
ocurren en el laboratorio son las lesiones
debidas a cortes, laceraciones, etcétera,
por cristalería rota.
En caso de heridas pequeñas dejar
que sangre unos segundos; tener cuidado de
no dejar partículas de vidrio en la herida y
aplicar un desinfectante.
Las heridas de mayor importancia
deben ser atendidas por un médico. Mientras
tanto, evitar el sangrado aplicando presión en
un punto más arriba la herida o antes de ella
(no mantener la presión por más de 5
Pictogramas de seguridad
En las etiquetas de productos químicos de
uso en el laboratorio además de la
identificación del contenido, calidad y límite
de pureza de lo que contiene, podemos
encontrar
pictogramas
(símbolos
internacionalmente aceptados y reconocidos)
que indican los riesgos principales. Los
pictogramas de seguridad son:
RIESGO BIOLÓGICO
Todo aquello que pueda contener
bacterias, virus u otros microorganismos con
capacidad de infección o cuando contiene
toxinas producidas por microorganismos que
causen efectos nocivos a los seres vivos.
Ejemplo: jeringas, sangre.
Medidas de prevención: evitar el
contacto con los ojos, la piel y las vías
respiratorias. Utilizar elementos de protección
personal.
E = EXPLOSIVO
minutos).
13. Casi siempre, los choques eléctricos en
el laboratorio son de poca importancia;
las precauciones de seguridad se
deducen de la naturaleza del peligro.
Nunca tocar un aparato eléctrico con las
manos húmedas o cuando se esté
Es toda sustancia sólida o líquida o
mezcla
de
sustancias
que
pueden
desprender gases a una temperatura, presión
y velocidad tales que pueden detonar,
125
producir violentas deflagraciones, o explotar
al exponerse al calor cuando están
parcialmente confinadas. Ejemplo: azida de
plomo, fluoruro de carbono.
Medidas
de
prevención:
almacenarlas alejadas de otros productos,
evitar todo
choque, fricción y mantener alejadas de
fuentes de calor, chispas o fuego.
O = OXIDANTE
Sustancias capaces de aportar
oxígeno cuando reaccionan con otra
sustancia, por lo que cuando entran en
contacto con combustibles o inflamables
avivan la reacción pudiendo desarrollar
reacciones violentas. Ejemplo: nitrito de
sodio, hiposulfito de sodio.
Medidas de prevención: mantener
alejadas de las sustancias combustibles o
inflamables, ya que pueden favorecer los
incendios y dificultar su extinción.
Sustancias
que
pueden
causar
irritación a la piel, mucosas, o los ojos, por
contacto inmediato, prolongado o repetido,
pudiendo también provocar inflamación.
Ejemplo: cloroformo, SDS, hipoclorito de
sodio, aminoantipirina.
Medidas de prevención: evitar el
contacto con los ojos, la piel y las vías
respiratorias. Utilizar elementos de protección
personal.
F+ = EXTREMADAMENTE INFLAMABLE
Sustancias cuyo punto de ignición es menor
de 0°C y su punto de ebullición máximo de
35°C.
F = INFLAMABLE
Sustancias líquidas cuyo punto de ignición es
menor a 40°C. Ejemplo: etanol, tolueno, éter
dietílico.
Medidas de prevención: mantener
alejado de fuentes de calor, de ignición o
eventuales
chispas,
de
materiales
combustibles y oxidantes.
Xn = NOCIVO
N = NOCIVO PARA EL MEDIO
Sustancias de menor toxicidad pero
pueden causar daños a la salud. También se
incluyen aquellas mezclas o preparados que
tienen alguna sustancia que puede ser tóxica
pero que se encuentra a una baja
concentración en la mezcla.
AMBIENTE
Aquellas sustancias o preparados que
cuando son liberados al medio ambiente
pueden presentar un efecto inmediato o
diferido, poniendo en peligro a alguna
especie. Ejemplo: tiourea, o-toluidina.
Xi = IRRITANTE
Medidas de prevención: evitar que
los derrames alcancen los desagües, tratar
126
los residuos en condiciones ambientalmente
riesgos específicos en frases cortas que son
adecuadas.
adaptables a las distintas sustancias.
Las frases "S" brindan los consejos
de prudencia o las medidas de prevención
más importantes relacionadas con el riesgo
asignado a esa sustancia química y que
permitirán
su
manipulación
y
T+ = ALTAMENTE TÓXICO, T TÓXICO
Sustancias que pueden causar daño en
forma aguda o crónica a la salud o causar la
muerte si son inhaladas, ingeridas o se
absorben por la piel, aún en pequeñas
cantidades. Ejemplo: azida de sodio,
dinitrofenol, bromuro de etidio.
Medidas de prevención: evitar todo
contacto directo. Utilizar elementos de
protección personal. Emplear estrictas
medidas de higiene personal y del ambiente
del laboratorio.
C = CORROSIVO
Sustancias capaces de atacar y destruir los
tejidos orgánicos si entran en contacto con
ellos o bien atacar ciertos metales o
materiales. Ejemplo: hidróxido de sodio,
ácido clorhídrico, ácido acético.
Medidas de prevención: evitar el
contacto con los ojos, la piel y las vías
respiratorias. Utilizar elementos de protección
personal.
Identificación
sobre
los
riesgos
específicos y los consejos de prudencia
Frases "R" éstas advierten acerca del riesgo
más común asignado a esa sustancia
química, por medio de la enumeración de
almacenamiento en forma segura. En
algunos casos se mencionan combinaciones
de frases R o de frases S, cuando dos o más
riesgos tienen relación entre sí (cuadro I.6).
El símbolo de la N.F.P.A. (National Fire
Protection Association)
El símbolo de la N.F.P.A. es un sistema de
identificación de riesgos de un producto
químico, en tres categorías principales:
"salud", "inflamabilidad" y "reactividad"
indicando el grado de severidad por medio de
una escala numérica desde (4) que indica el
riesgo mayor, (3) riesgo severo, (2) riesgo
moderado, (1) riesgo menor, hasta (0) que
representa ausencia de riesgo.
Este símbolo es útil para alertar
acerca del riesgo de ese producto y, a su
vez, puede ayudar a determinar los cuidados
a tener en cuenta en el almacenamiento y en
caso de emergencias, de derrames o
salpicaduras.
La información se presenta por
medio de una estructura espacial en forma
de rombo principal, dividido a su vez en otros
cuatro.
El rombo azul a la izquierda identifica
el riesgo para la salud. El rombo rojo en la
parte superior indica el riesgo por
inflamabilidad. El rombo amarillo a la derecha
señala el riesgo por reactividad o
inestabilidad. El rombo blanco en la parte
inferior indica riesgos especiales tales como:
W reactivo al agua, COR corrosivo, AIR
reactivo al aire, OXY oxidante. Ejemplo:
127
de microorganismos, se clasifican en: sangre,
cultivos, patológicos (tejidos, órganos, partes
y fluidos corporales, etcétera), no anatómicos
3
a
(gasas, algodones, jeringas, etcétera) y
punzocortantes (lancetas, agujas, pipetas
C
o
n
Pasteur, etcétera).
Residuos municipales: son aquellos
que no representan peligro para la salud y
sus características son similares a los
residuos domésticos comunes.
Residuos especiales CRETI: son
Ácido clorhídrico
Hojas de seguridad
Cada práctica cuenta con las hojas de
seguridad para cada reactivo o sustancia que
se utilice en el laboratorio.
Las hojas de seguridad proveen
información sobre (cuadro I.7, pág. 100):
• Los componentes de un producto, su
reactividad, las medidas precautorias
principales o las advertencias más
importantes.
• Los elementos de protección personal que
se recomienda emplear en la manipulación.
• Las vías de ingreso y los órganos blanco.
• Las medidas por derrame accidental y de
primeros auxilios.
• La información toxicológica.
• Las
recomendaciones
para
su
almacenamiento.
• Las condiciones para la disposición de los
residuos.
Clasificación de los residuos
Los residuos que se generan en laboratorios
de
instituciones
de
enseñanza
investigación así como en hospitales
clínicas contienen residuos no peligrosos
municipales, residuos biológico infecciosos
o
y
o
y
residuos especiales.
Residuos
peligrosos
biológico
infecciosos (RPBI): es todo aquello que ha
entrado en contacto con pacientes o
animales, sus muestras biológicas y/o cepas
aquellos residuos que constituyen un peligro
para la salud por sus características
agresivas
tales
como:
Corrosividad,
Reactividad, Explosividad, Toxicidad e
Inflamabilidad Es importante no olvidar que,
la mezcla de residuos municipales con
residuos biológico infecciosos hace que se
consideren en su totalidad como biológico
infecciosos, mientras que la mezcla de
residuos biológico infecciosos con peligrosos
CRETI se deben consideran como peligrosos
CRETI.
Envasado y etiquetado de RPBI para su
desecho.
Los residuos RPBI deben ser envasados de
acuerdo con sus características físicas y
biológico infecciosas conforme la norma
oficial mexicana 087-ECOL-95 (cuadro I.8).
Es importante destacar que todos los
envases tengan impreso el símbolo universal
de riesgo biológico y leyendas que indiquen
la peligrosidad de los residuos y el tipo de
residuos que contienen.
Los
contenedores
para
punzocortantes deben de ser: • De color rojo.
• De paredes rígidas.
• De polipropileno.
• Resistentes a fracturas y pérdida
contenido al caerse.
• Destruibles por métodos fisicoquímicos.
del
128
Las hojas de seguridad serán proporcionadas
• Esterilizables y con tapa, la que puede tener
para cada práctica en el laboratorio.
o no separador de agujas.
Precauciones: depositar los RPBI, de
acuerdo a su clasificación, inmediatamente
después de su generación.
No compactar los residuos durante el
envasado y no mezclar residuos de diferente
De manera general, los envases
destinados a los residuos CRETI deben
ser de cristal de color ámbar, con
capacidad de uno a cuatro litros, latas de
aluminio para solventes (capacidad
máxima de 20 litros) y, en algunos casos
recipientes de plástico, siempre y cuando
las características fisicoquímicas de la
sustancia a envasar lo permita. Cada
residuo debe envasarse en forma
individual y colocar en el frasco
respectivo el pictograma de seguridad
correspondiente.
clasificación.
Una vez identificados, separados y
envasados correctamente los residuos
peligrosos, el personal responsable del
laboratorio se encargará de su recolección,
tratamiento y disposición final así como de
las medidas necesarias para la desinfección,
esterilización y limpieza del material y equipo
utilizado en el laboratorio.
Frases R
Frases S
Combinación de frases
R7
Puede provocar incendios
S3
Conservar en sitio fresco R 20/21
Nocivo por inhalación y contacto por la piel
R 23
Tóxico por inhalación
S 20
No comer ni beber
durante la manipulación
R 39/25
Tóxico: peligro de efectos irreversibles graves por
ingestión
R 36
Irrita los ojos
S 29
No tirar los residuos por
los desagües
S 3/7
Mantenga el contenedor bien cerrado y en un lugar
fresco
R 45
Puede ser cancerígeno
S 37
Llevar guantes de
protección adecuados
S 36/37/39
Utilice ropa protectora adecuada, guantes y
protección facial o gafas
Cuadro I.6 Ejemplos de frases S y R
Manejo de residuos CRETI
El manejo, consistente en la separación,
envasado y almacenamiento de cada uno de
los reactivos peligrosos CRETI utilizados en
las prácticas deberá realizarse de acuerdo a
cada reactivo en cuestión según lo indicado
en las hojas de seguridad.
El manejo de accidentes, tales como
derrames, ingestión o salpicaduras, así como
la aplicación de primeros auxilios deberán de
realizarse de acuerdo al reactivo en cuestión
según lo indicado en la hoja de seguridad.
129
Ácido clorhídrico
Identificación
Fórmula química: HCl
Apariencia y olor: solución de color ligeramente
amarillo o incolora
con olor característico muy penetrante.
Marcaje liquído corrosivo
Sinónimos: ácido muriático, cloruro de hidrógeno.
Generalidades
Está presente en el sistema digestivo de muchos
mamiferos y una deficiencia de éste provoca
problemas en la digestión; un exceso provoca
úlceras gastricas. La disolución acuosa grado
reactivo contiene aproximadamente 38% de HCl.
Propiedades física y químicas
PM: 36.46
Solubilidad: soluble en agua
pH de disoluciones acuosas: 0.1 (1.0N), 4.0(0.001N).
Reacciona con la mayorÍa de los metales
desprendiendo hidrógeno.
Con agentes oxidantes como peróxido de hidrogeno
genera cloro, el cual es muy peligroso.
Niveles de toxicidad.
DL50 (oral en conejos): 900 mg/Kg, inhalación en
ratas): 3124 ppm/1 h.
CLMo
(concentración
(inhalación
en
letal
humanos)
minima
1300
publicada):
ppm/30
min;
3000ppm/5 min.
Riesgos
Produce gas inflamable cuando se encuentra en
contacto con metales. Se generan v apores tóxicos e
irritantes de cloruro de hidrógeno cuando se calienta.
Inhalación: elgas causa dificultad para respirar, tos,
inflamación y ulceración de nariz, tráquea y laringe.
Exposiciones severas causan espasmo de la laringe
y edema en los pulmones.
Contaco con los ojos y piel: es un irritante severo de
ojos y piel, puede causar quemaduras serias,
dermatitis, reducir la visión o, incluso, la pérdida total
de ésta.
Ingestión: produce corrosión de las membranas
Primeros auxilios
Ojos: lavar inmediatamente con agua corriente
durante 15 mi nutos.
Piel: quitar ropa y zapatos contaminados, lavar
inmediatamente la zona dañada con abundante
agua.
Inhalación: mover a la persona al aire fresco; si se
dificulta la respiración proporcionar oxigeno y
mantenerlo caliente y en reposo, no dar a ingerir
nada.
Ingestión: no provocar vómito y dar a beber agua
continuamente, por ejemplo, una cucharada cada 10
minutos o dar a beber leche de magnesia.
En todos los casos de exposición, el afectado debe
ser transportado al hospital tan pronto como sea
posible.
Manejo y almacenamiento
Peligro: corrosivo y venenoManténgase en envase
de vidrio, en lugares secos, bien ventilados, alejados
de materiales oxidantes y fuentes de ignición o calor.
Tratamiento en caso de accidente
Control de fuego: en caso de accidente utilizar CO2,
polvo químico seco o arena seca. Los extinguidotes
de fuego se eligen dependiendo de los alrededores,
ya que el HCl no arde.
Fugas y derrames: ventilar el área y protegerse con
el equipo de seguridad necesario. Cubrir el derrame
con bicarbonato de sodio o una mezcla de 50:50 de
hidroxido de calcio y cal
sodada, mezclar
cuidadosamente. Mantener el materil lejos de fuentes
de agua y drenajes hasta no ser neutralizado como
se indicó anteriormente.
Desechos
Neutralizar las soluciones concentradas de ácido
clorhídrico con carbonato de calcio o cal y diluir con
agua cuidadosamente. La disolución resultante
puede verterse al drenaje, con abundante agua. En
caso de soluciones diluidas,
mucosas de la boca, esófago y estómago, causa
náusea, vómito, disfagia, sed intensa y diarrea
Cuadro I.7. Hoja de seguridad para el ácido Clorhídrico.
130
Cuadro I.8 Envasado y etiquetado de RPBI para su desecho.
TIPO DE RESIDUO
ESTADO FÍSICO
ENVASADO
COLOR
Sangre
Sólido
Líquido
Bolsa de plástico
Recipiente hermético
Rojo
Cultivos y cepas de
agentes infecciosos
Sólidos
Líquidos
Bolsa de plástico
Recipiente hermético
Rojo
Residuos
anatómicos
Sólidos
Líquidos
Bolsa de plástico
Recipiente hermético
Rojo
Sólidos
Líquidos
Bolsa de plástico
Recipiente hermético
Amarillo
Sólidos
Recipientes rígidos
Rojo
Patológicos
Objetos
punzocortantes
usados y sin usar
no
131
MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO
II
EXPERIMENTOS
132
Práctica 1
Soluciones
Tiempo de la práctica 3 horas
Material
Objetivos
Por equipo:
• 3 vasos de precipitado de 10 ml
• 3 pipetas de 1.0 ml
• 3 pipetas de 5.0 ml
• 3 pipetas de 10.0 ml
• Gradilla con 6 tubos de ensayo
• Eritrocitos humanos lavados en
solución
• Salina isotónica
• Solución de azul de metileno al 1.0%
• Cloruro de sodio en cristales (NaCl)
• Balanza granataria
Que el alumno:
1. Identifique la existencia de soluciones
en los sistemas biológicos.
2. Explique los cálculos y procedimientos
para preparar soluciones porcentuales,
molares y normales, así como las
diferentes diluciones de éstas.
3. Presente ejemplos de soluciones
utilizadas
en
medicina
(solución
isotónica, Ringer, Darrow y Hartman).
Responda a las siguientes preguntas:
1. ¿Qué es una solución?
2. ¿Cuántas clases de soluciones
existen?
3. ¿Qué significan los siguientes
términos: mol, solución molar y solución
normal?
4. ¿Qué significan: v/v, p/v, p/p y ppm?
5. ¿Cuál es la composición de las
siguientes soluciones: solución isotónica
de cloruro de sodio, suero glucosado a
5%, Ringer-lactato?
6. ¿Cuáles son los tipos de soluciones
que existen in vivo? Mencionar ejemplos.
7. ¿Qué es una solución isotónica?
8. ¿Qué es una solución osmolar?
9. ¿Cómo se calcula la osmolaridad de
una solución?
10. ¿Qué les pasa a los eritrocitos
cuando se ponen en contacto con
soluciones
salinas
de
diferente
osmolaridad?
11. ¿Qué se entiende por dilución y
dilución seriada de las soluciones?
Por grupo:
• 1 Microscopio marca Leica.
Procedimiento
1. Hacer los cálculos correspondientes
para comprobar que la solución a 0.9%
de NaCl es isotónica con respecto al
plasma (ver pag. 121). Considerar que:
a) El cloruro de sodio se disocia en
solución acuosa en los iones sodio y
cloruro, por lo que la concentración
iónica se duplica (1 mmol/l = 2 mosm/l).
b) La presión osmótica normal del
plasma es de 290-310 mosm/l.
2. Preparar 20 ml de una solución de
NaCl a 4.5% (etiquetar como solución 1).
3. A partir de la solución anterior,
preparar 25 ml a 0.9% (solución 2) y 50
ml a 0.045% (solución 3).
4. Colocar en tres tubos de ensayo 2 ml
de las diferentes soluciones de cloruro
de sodio preparadas en los puntos 2 y 3.
Con la ayuda de un gotero (dejando caer
lentamente por las paredes del tubo) 2
gotas de eritrocitos lavados. Mezclar con
cuidado y dejar reposar a temperatura
ambiente unos minutos. Valorar el grado
de hemólisis que sufren los eritrocitos
133
cuando se ponen en contacto con las
diferentes soluciones.
5. De las 3 soluciones prepradas con los
eritrocitos tomar una gota de cada una y
por separado colocarlas en un portaobjetos, colocar un cubre-objetos y
observarlas al microscopio
Ver las intrucciones para el uso del
microscopio
6. Hacer la dilución y redilución (dilución
seriada) de la solución de azul de
metileno como se muestra en el
siguiente cuadro:
DILUCIÓN SERIADA DE AZUL DE
METILENO
Tubo H2O (ml) Sol de azul Volumen de
de metileno transferencia
1
2
3
4
5
6
2
2
2
2
2
2
0.5 ml*
-
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
*Nota: para mezclar al hacer las
diluciones se debe succionar y soplar
con cuidado la pipeta en cada tubo
varias veces antes de transferir la
dilución al siguiente tubo.
Resultados
1. Expresar en forma ordenada los
cálculos efectuados para cada uno de los
ejercicios.
2. Deducir el movimiento o no del
solvente cuando se ponen en contacto
eritrocitos con soluciones hipo, hiper e
isoosmóticas.
3. Calcular la dilución y la concentración
de azul de metileno en cada uno de los
seis tubos de la dilución seriada (ver pág.
93). Asegúrese que la coloración
obtenida
disminuya
gradualmente
conforme avanza la dilución.
Problemas
1. Hacer los cálculos para preparar una
solución de KCl al 3%.
2. Hacer los cálculos para prepara una
solución de CaCl2 0.25 M se requieren
15 ml.
3. Calcular el volumen de H2SO4 se
requiere para preparar una solución 3N
40 ml volumen final.
4.- Prepare 500 ml de una solución
0.125 M de NaHC03
5.- 250 ml de H2SO4 0.1 M
6.-100 ml de glucosa 0.5 M
7.-Cuantos mililitros de HCl 0.1M se
requieren para preparar una solución
contiene 0.025 M de HCl
8.-Cuantos gramos de soluto se
requieren para preparar las siguientes
soluciones
125 ml de NaCl al 10%
50 ml de Ca(NO3)2 al 3.35 %
750 ml de CaCl2 al1.5%
9.-Cual presenta la osmolaridad más alta
NaCl 0.1M o Na2SO4 0.08 M
10.- A un enfermo hay que inyectarle 15
g de KCl y 126 g de glucosa ¿Cuánta
agua habrá que añadirles para que
resulte un suero 0.4 osmolar?
11.Expresar
en
meq/l
concentración de Ca2+ de 11 mg/dl.
una
12.- Una solución 14 g de glucosa en 25
ml ¿Cuál es la concentración molar de la
solución?
13.- Calcular la osmolaridad a partir de la
composición de algunas soluciones
como Dextrosa a 10 % en solución salina
a 0.45%.
134
14.- Dextrosa a 5 % en solución salina a
0.2 %.
15.- Describir la composición de las
siguientes soluciones Hartman, Ringer y
Darrow y demostrar su osmolaridad con
respecto al plasma.
Referencias
1. Villazón SA, Cárdenas CO,Villazón
DO, Sierra UA. Fluidos y electrólitos.
México: JGH Editores; 2000.
2. Peña-Díaz A, Arroyo BA, Gómez PA,
Tapia IR, Gómez EC. Bioquímica.
Undécima reimpresión de la 2a. ed.
México: Editorial Limusa; 2004.
3. Laguna J, Piña E. Bioquímica de
Laguna. 5a.ed. México: Editorial El
Manual Moderno; 2002: p. 41-56.
4. Holum JR. Fundamentos de química
general, orgánica y bioquímica para
ciencias de la salud. México: Editorial
Limusa Wiley; 2001.
5. Farias GM. Química clínica. Décima
edición México: Editorial El Manual
Moderno; 1999.
6. Bloomfield MM.Química
organismos vivos. México:
Limusa; 1997.
de los
Editorial
135
INSTRUCCIONES PARA EL USO DEL MICROSCOPIO MARCA LEICA
1. Nunca use un adaptador entre el
cable y la fuente de alimentación.
11. Ajuste los tubos oculares a la
distancia de los ojos.
2. Use siempre el microscopio sobre una
superficie dura y estable.
12. Al término del uso del microscopio
retirar la muestra de la platina.
3. Conecte el cable de alimentación del
microscopio a una toma de corriente con
conexión a tierra. Se suministra un cable
de tres terminales con toma a tierra.
13. Bajar la platina hasta el tope y
regresarla a su posición original si es
necesario.
4. Encienda el microscopio girando el
interruptor de control de la iluminación
situado en la parte inferior izquierda del
instrumento.
5. Coloque el interruptor de control de la
iluminación en el nivel más bajo. El
control de iluminación le permite ajustar
la intensidad de luz.
14. Colocar el revolver de los objetivos
de manera que el objetivo de 4X sea el
que quede en dirección de la lámpara.
15. Desconectar el equipo y enrollar el
cable.
16. Limpiar la platina y oculares con un
paño humedecido con metanol o con un
limpia cristal comercial.
6. Abra completamente el diafragma de
apertura del condensador girando el
anillo hacia el extremo derecho.
17. Colocar al microscopio la funda
contra el polvo para mantenerlo en
buenas condiciones físicas y mecánicas.
7. Usando el botón de enfoque del
condensador, suba el condensador hasta
el
extremo
superior
de
su
desplazamiento.
Iluminación
critica
únicamente: si el desplazamiento del
condensador es excesivo, limítelo con
el tornillo situado debajo de la platina
hasta que la lente superior del
condensador se encuentre debajo de la
superficie de la platina.
Partes del microscopio:
1) Oculares.
2) Revolver con 4 objetivos 4X, 10X, 40X
y 100X.
3) Platina.
4) Diafragma.
5) Lámpara.
Tornillo de la platina para desplazar la
muestra.
Interruptor de control de la iluminación.
Tornillo macrométrico.
Tornillo micrométrico.
8. Coloque la preparación de la muestra
con la muestra en la platina.
1
9. Gire el revólver hasta situar el
objetivo 4X en la posición de trabajo.
(pag X)
6
10. Suba la platina girando el mando de
enfoque macrométrico
hasta que
observe la preparación y, finalmente,
enfoque
la muestra con precisión
utilizando el mando de enfoque
micrométrico.
9
3
4
8
5
7
136
Práctica 2
Regulación del equilibrio ácido-base
después del ejercicio muscular intenso
y de la ingestión de bicarbonato de sodio
TIEMPO DE PRÁCTICA: 3 HORAS
Objetivos
1. Al finalizar la práctica, el alumno
constatará las actividades reguladoras
del pulmón y el riñón para mantener el
equilibrio ácido-base en condiciones que
tienden a romperlo.
2. Mediante la determinación del pH
observará
la
variación
de
la
concentración de hidrogeniones en la
orina de un individuo que ha realizado
ejercicio muscular intenso.
3. Relacionará los resultados obtenidos
con los cambios metabólicos originados
por el ejercicio muscular intenso.
Conteste las siguientes preguntas:
1. ¿Por qué es importante que se
mantenga constante, dentro de ciertos
límites, el pH en el organismo?
2. ¿Cuáles son las fuentes de iones H+
en el organismo?
3. ¿Cuáles son los sistemas reguladores
que facilitan la eliminación del H+
producido en el organismo con el fin de
mantener constante el pH sanguíneo?
4. ¿Cuáles son las reacciones de
formación del ácido carbónico (H2CO3) a
partir de CO2 y H2O, y de su disociación
para formar el ion bicarbonato?
Escríbalas.
5. ¿Qué sistemas amortiguadores
participan directamente en la regulación
del pH sanguíneo?
6.
¿Cuáles
son
los
sistemas
extrasanguíneos que tienden a mantener
el pH extracelular?
Escriba la ecuación de Henderson y
Hasselbalch aplicada al sistema HCO3–
/H2CO3 y, con base en ella, conteste la
siguiente pregunta:
a).¿Cómo
participan
el
aparato
respiratorio y el riñón en el control del pH
sanguíneo?
INTRODUCCIÓN
Dentro de los mecanismos de regulación
de que dispone el organismo para
mantener la integridad fisiológica,
aquellos involucrados en la homeostasis
del pH en los fluidos extracelulares
desempeñan un papel crucial para la
supervivencia del individuo. En este
sentido cabe señalar que, como
resultado de la oxidación de los
alimentos, un humano adulto promedio
produce alrededor de 20 moles de CO2
al día, Al difundir a la sangre, gran parte
de dicho gas se combina con al agua en
el interior de los eritrocitos, produciendo
ácido carbónico (H2CO3), reacción que
es seguida por la disociación del H2CO3
para producir el anión bicarbonato HCO3y un ión hidrógeno (H+). Dado el carácter
de ácido débil del H2CO3, la fracción
disociada del mismo es pequeña; sin
embargo, considerando la gran cantidad
de CO2 que produce el organismo, la
acidificación de los fluidos extracelulares
sería importante en ausencia de
mecanismos reguladores. En el hombre,
137
la intervención de los pulmones y los
riñones evita que ocurra tal acidificación
manteniendo en un nivel constante la
concentración de H+ y, por consiguiente,
del pH.
Para entender el papel que
juegan
ambos
órganos
en
la
homeostasis del equilibrio ácido-base,
debe tenerse presente que el sistema del
ácido carbónico implica la participación
de un componente gaseoso o volátil (el
CO2) y dos componentes no volátiles (el
HCO3- y el H+). En la sangre, el equilibrio
entre dichos componentes determina el
valor del pH sanguíneo, que puede
evaluarse mediante la bien conocida
ecuación de Henderson-Hasselbach. En
el individuo normal, dicho valor fluctua en
un promedio 7.4, siendo la sangre
venosa –enriquecida en CO2 ligeramente
más ácida en relación con la sangre
arterial. Ahora bien, ya que a
temperatura ambiente el CO2 existe en
estado gaseoso, la cantidad de CO2
disuelto en la sangre dependerá de la
presión parcial (PCO2) ejercida por el
mismo a nivel de los alvéolos
pulmonares. En el mundo, la magnitud
de dicha PCO2 es de aproximadamente 40
mmHg , lo que se traduce en una
concentración de CO2 sanguíneo de
aproximadamente 25 mM; este último
valor incluye no solo el CO2 como tal,
sino también el bicarbonato y el ácido
carbónico.
Considerando
el
pH
sanguíneo normal y el pKa del sistema
bicarbonato-ácido carbónico, la relación
+ CO2] es de
[HCO3-] / [H2CO3
aproximadamente 20. Es precisamente
la PCO2 la que es controlada por los
pulmones, ya que durante el proceso de
la
exhalación
se
elimina
CO2,
manteniendo constante la PCO2 en los
alvéolos y evitando así que que aumente
el nivel de CO2, disuelto en la sangre.
Todo proceso o patología que se
Por lo que respecta a los riñones,
su participación en el mantenimiento de
un pH extracelular constante se da a
través de dos mecanismos: la excreción
de equivalentes ácidos (H+) hacia la orina
y la regulación de la cantidad de HCO3reabsorbido hacia la sangre desde el
filtrado glomerular. A diferencia del
intercambio gaseoso en los pulmones,
los mecanismos de regulación renal son
de situaciones patológicas donde se
altera el intercambio de gases pulmonar
(es decir, en la acidosis y alcalosis
respiratorias), en cuyo caso es necesario
aumentar o disminuir la tasa de
reabsorción del HCO3- , o bien en
estados fisiológicos que producen
cantidades importantes de ácidos
orgánicos (por ejemplo, en la diabetes no
controlada o durante el ejercicio intenso)
donde se incrementa la excreción de H+
Gran parte de este último aparece en la
orina acomplejado con el amoniaco en
forma de ión amonio (NH4+) o asociado
con el fosfato en forma de fosfato
monobásico de sodio (NaH2PO4),
representando este último la llamada
acidez titulable. En general, el pH de la
orina será un reflejo de la producción de
ácidos no volátiles por el organismo.
El resultado final de los
mecanismos fisiológicos que participan
en el mantenimiento del equilibrio ácidobase es el de mantener el pH
extracelular en un rango compatible con
el
funcionamiento
adecuado
del
organismo manifieste en una alteración
en la frecuencia y/o profundidad del
proceso de inhalación-exhalación, dará
como resultado una alteración de la PCO2
alveolar
–
aumentandola
o
disminuyéndole
-con
la
siguiente
modificación del del nivel de CO2]
Material
• Diez probetas o vasos de precipitado.
• Orina.
• Solución de bicarbonato de sodio a 3%.
• Potenciómetro.
Método
Un alumno por equipo desayunará o
comerá normalmente (evitar ingestión de
jugos ácidos); después hará lo que se
indica a continuación.
138
1. Tomar 250 ml de agua una hora antes
de la clase práctica. Vaciar la vejiga y
descartar esa orina.
2.
Tomar
250
ml
de
inmediatamente antes de la
práctica.
agua
clase
3. Orinar en un vaso de precipitado de
100 ml. Anotar el volumen de la muestra.
4. Ingerir 250 ml de agua.
5. Realizar ejercicio muscular intenso,
como subir y bajar varias veces las
escaleras de tres o cuatro pisos u otro
ejercicio sugerido por el profesor.
6. Obtener muestras de orina cada 15
minutos, como en el inciso 3, hasta
completar por lo menos cinco muestras.
7. A cada muestra se le determinará el
pH inmediatamente después de haber
sido obtenida ya que con el tiempo el pH
tiende a aumentar debido a la pérdida de
dióxido de carbono y a que el
crecimiento
bacteriano
produce
amoniaco a partir de la urea.
Análisis de resultados
Análisis de resultados
Una vez obtenido el valor del pH para
cada una de las 5 muestras de orina,
trazar una gráfica de pH contra tiempo;
interpretar los resultados y discutirlos en
grupo.
Objetivos (Segunda parte)
1. El alumno constatará el papel del riñón
en el mantenimiento del equilibrio ácidobase en una situación de alcalosis
metabólica provocada por la ingestión de
bicarbonato de sodio.
2. Mediante la medición del pH, observar
la variación de la concentración de
hidrogeniones en la orina de un individuo
que ha ingerido una carga de
bicarbonato de sodio.
Hipótesis
Elabore la hipótesis apropiada.
Material
Orina
Solución de bicarbonato de sodi al 3%
Potenciómetro
Método
1. Tomar 250 ml de agua una hora antes
de la clase práctica. Vaciar la vejiga y
descartar esa orina.
2.
Tomar
250
ml
de
inmediatamente antes de la
práctica.
agua
clase
3. Orinar en una probeta de 100 ml.
Anotar el volumen de la muestra.
4. Ingerir 250 ml de agua con 7.5 g de
bicarbonato de sodio.
5. Obtener muestras de orina cada 15
minutos, hasta completar por lo menos 5
muestras.
6. A cada muestra se le determinará el
pH inmediatamente después de haber
sido obtenida.
Análisis de resultados
Una vez obtenido el valor del pH para
cada una de las cinco muestras de orina,
trazar una gráfica de pH contra tiempo;
interpretar los resultados y discutirlos en
grupo.
Referencias
1. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto
con aplicaciones clínicas. 4a. ed.
Barcelona: Editorial Reverte; 2004.
2. Montgomery R. Bioquímica: casos y
texto. 6a. ed. Editorial Harcourt-Brace;
1998: cap.4.
3. Villazón SA, Cárdenas CO,Villazón
139
Práctica 3
Titulación de un aminoácido
con una base y la aplicación
de la ecuación de Henderson y Hasselbalch.
Determinación del pK1 y del pK2
Tiempo de práctica: 3 horas
Objetivo
Que el alumno:
1. Experimente y entienda cómo se
comporta un sistema amortiguador de
pH.
2. Aprenda el uso de la ecuación de
Henderson-Hasselbalch.
3. Aprenda a calcular el pK de un par
ácido-base.
4. Mida el pH de diferentes sustancias y
calcule su concentración de H+.
5. Aplique estos conocimientos al estudio
de las propiedades de los aminoácidos.
Para lograr lo anterior conteste las
siguientes
preguntas
y
planteamientos:
1. ¿Qué es el pH de una solución?
2. ¿Qué es un sistema amortiguador
ácido-base y para qué sirve?
3.
¿Cuáles
son
los
sistemas
amortiguadores más importantes en
biología?
4. Escribir la ecuación de HendersonHasselbalch.
5. ¿Qué es el pK de un par ácido base?
6. ¿Por qué es importante la
concentración de H+ en los seres vivos?
7. Dibujar la fórmula de la glicina, de la
lisina, de la histidina y del ácido aspártico
e identificar a los grupos α-amino y αcarboxilo de estos aminoácidos, así
como su radical, e indicar la naturaleza
del mismo.
8. ¿Qué les pasa a estos grupos
funcionales cuando se someten a pH
ácido o básico?
9. ¿Se pueden usar los aminoácidos
como amortiguadores de pH?
10. ¿Son los aminoácidos buenos
amortiguadores a pH de 7.0?
11. ¿Cuál es el punto isoeléctrico de los
aminoácidos que tienen un grupo amino
y un grupo carboxilo?
12. ¿Cuál es la carga eléctrica de los
aminoácidos que tienen dos grupos
carboxilo a pH de 7.0?
13. ¿Cuál es la carga eléctrica de los
aminoácidos que tienen dos grupos
amino a pH de 7.0?
Material
• Cuatro vasos de precipitado de 100 ml.
• Pipeta de 1 ml (para el NaOH).
• Potenciómetro.
• Piceta para enjuagar el electrodo.
• Glicina 0.025 mol/l pH 2.
• Lisina 0.025 mol/l pH 2.
• Ácido aspártico 0.025 mol/l pH 2.
• Histidina 0.025 mol/l pH 2.
• NaOH 1.0 mol/l.
Método
1. Poner 20 ml de la solución de glicina
en un vaso de precipitado de 100 ml.
2. Proceder a la medición del pH.
140
3. Añadir 0.1 ml de NaOH 1.0 mol/l.
Agitar el vaso y volver a medir el pH;
anotar los resultados.
Método
5. Hacer lo mismo (pasos 1 a 4) para los
otros tres aminoácidos.
1. Pedir a los alumnos desde la clase
anterior que traigan diferentes muestras,
tales como leche, café, refresco, orina,
saliva, jugo de frutas, etcétera.
2. Colocar los líquidos en un vaso de
precipitado y medir el pH en el
potenciómetro.
Análisis de resultados
Análisis de resultados
4. Repetir el paso 3 hasta llegar a un pH
aproximado de 12.
1. Hacer una gráfica de pH vs volumen
en ml de NaOH gastados luego de tomar
en cuenta que cada 0.1 ml de NaOH
diluido
en
20
ml aumenta
la
concentración de OH en 5 mM.
2. Localizar en la gráfica el pI y los
diferentes pK de los aminoácidos.
3. Mediante la ecuación de HendersonHasselbalch cuantificar la relación entre
cada par de especies ionizables de los
aminoácidos a diferentes pH.
Calcular la concentración molar de H+ en
cada uno de las muestras estudiadas.
Referencias
1. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto
con aplicaciones clínicas. 4a. ed.
Barcelona: Editorial Reverte; 2004.
2. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios
de bioquímica. 4a. ed. Barcelona:
Ediciones Omega; 2005
4. Identificar a qué pH tienen poder
amortiguador.
Medición del pH y cálculo de la
concentración de H+ en diferentes
líquidos
141
Práctica 4
Estudio de las proteínas corporales
TIEMPO DE PRÁCTICA: 2 HORAS
Objetivos
1. Aplicar los conocimientos generales
sobre las proteínas al estudio de las
proteínas corporales.
2. Conocer
las
alteraciones
más
frecuentes de las proteínas plasmáticas y
sus consecuencias.
3. Conocer los métodos generales para el
estudio de las proteínas plasmáticas.
4. Determinar la concentración sérica de
proteína total y de albúmina e interpretar
los resultados obtenidos.
INTRODUCCIÓN
Las proteínas son polímeros lineales
constituidos por los aminoácidos, que se
unen entre sí por medio de enlaces tipo
amida denominados enlaces peptídicos.
Los polímeros compuestos por dos
aminoácidos forman un dipéptido, por tres,
un tripéptido; cuando el número de
aminoácidos es mayor, oligopéptidos y
polipéptidos o simplemente se denominan
péptidos. Las proteínas son moléculas
constituidas por una o más cadenas
polipéptidicas.
Las proteínas pueden ser clasificadas en
función de aspectos tan diversos como su
composición, su disposición espacial, su
función biológica y su localización.
Atendiendo a su localización dentro del
organismo humano, las proteínas pueden
clasificarse en:
• Hísticas o tisulares, son las proteínas de
los tejidos.
• Plasmáticas o hemáticas, son las
proteínas de la sangre.
Aunque las proteínas tisulares son de gran
importancia en el organismo, las localizadas
en la sangre (la hemoglobina en los
eritrocitos y las proteínas plasmáticas), por
su gran accesibilidad, proporcionan con
facilidad información importante y, por lo
tanto, son las más utilizadas en el
laboratorio clínico.
Proteínas plasmáticas
La sangre está constituida por formas
celulares
en
suspensión
(eritrocitos,
leucocitos y plaquetas) en un medio líquido
llamado plasma. El plasma se obtiene
cuando, inmediatamente después de extraer
la sangre, se le agregan anticoagulantes
como oxalato, citrato, EDTA o heparina y se
centrifuga. Si se recoge sangre sin
anticoagulante y se deja que ésta coagule,
el líquido que se separa se llama suero. El
suero carece de células y de factores de la
coagulación
incluyendo
la
proteína
fibrinógeno, pues ésta ha sido transformada
en fibrina insoluble en el proceso de la
coagulación. El fibrinógeno constituye sólo
de 3 a 6% del total de las proteínas en
plasma.
El agua constituye 92 a 93% del plasma o
suero y en ella encontramos electrólitos,
metabolitos,
nutrientes,
hormonas
y
proteínas en una proporción de 7 a 8%; de
estos solutos presentes, las proteínas son
las que están en máxima proporción,
aproximadamente 6 a 8 g/dl de suero y este
valor es 0.2 a 0.4 g/dl mayor en plasma por
la presencia de fibrinógeno.
Las proteínas plasmáticas son un grupo de
más de 100 moléculas distintas con
características y funciones muy diversas,
142
aunque para fines prácticos el término
"proteína plasmática" se usa para todas
aquellas proteínas cuya concentración en
el plasma sea mayor a 10 mg/dl y que
cumplan con alguna función específica
dentro de él. Aproximadamente son 20 las
proteínas que cumplen con ambas
definiciones. Todas estas proteínas, a
excepción del fibrinógeno, se encuentran
tanto en plasma como en suero.
La mayoría de las proteínas plasmáticas
son sintetizadas por el hígado. Las
proteínas del plasma, al igual que otras
proteínas del organismo, son destruídas y
reemplazadas constantemente, con una
vida media de aproximadamente 10 días.
Las funciones de las proteínas plasmáticas
pueden agruparse en tres grandes grupos:
de transporte como la transferrina,
lipoproteínas y la albúmina; de defensa del
organismo en el ataque a agentes extraños
o para limitar la respuesta inflamatoria,
como las inmunoglobulinas, la a1antitripsina,
la
haptoglobina
y
el
complemento. Por último, para mantener la
presión oncótica de la sangre, necesaria
para prevenir pérdidas de líquido del
espacio vascular al intersticial: la albúmina
es el ejemplo más importante de este
grupo.
Métodos para el estudio de las proteínas
plasmáticas
El laboratorio clínico cuantifica en una
muestra de suero las concentraciones de
proteína total y de albúmina. A partir de
estos datos, se calcula la fracción globulina
como la diferencia entre los dos resultados
anteriores y la relación albúmina/globulina
se calcula a partir de estos últimos. La
concentración de otras proteínas se
determina por grupos (por ejemplo, las
gamma-globulinas) o individualmente por
métodos inmunoquímicos (por ejemplo
algunas
hormonas
o
marcadores
tumorales).
Las enzimas se estudian evaluando su
actividad catalítica o su concentración de
masa mediante métodos inmunoquímicos.
También es posible el estudio fraccionado
de las proteínas, para lo que se recurre a
otros procedimientos más precisos de gran
ayuda clínica, como la electroforesis, la
inmunoelectroforesis y la inmunodifusión
radial de proteínas plasmáticas.
Proteína total
La suma de las concentraciones de todas y
cada una de las proteínas presentes en el
plasma se conoce como proteínas totales y
la cifra normal, en promedio, es de 7.1 g/dl,
siendo las cifras límite entre 6 y 8 g/dl.
Las proteínas totales están integradas por
albúmina (más de la mitad) y las globulinas;
estas últimas agrupan a todas las proteínas
que no son albúmina.
La concentración de las proteínas
plasmáticas en un momento determinado es
el resultado de tres procesos: la velocidad
de síntesis, el volumen del líquido en que se
distribuyen y la velocidad de degradación.
En diversos estados patológicos, estos
procesos pueden superponerse. En la
práctica,
la
determinación
de
la
concentración de la proteína total es un
parámetro que sólo refleja los cambios de
las proteínas más abundantes, como la
albúmina y las inmunoglobulinas.
La determinación de proteína total es útil en
el diagnóstico de enfermedades del hígado,
de los riñones y de la médula ósea.
En clínica se puede observar hiper o
hipoproteinemias, pero tanto en unas como
en otras, frecuentemente existe disminución
de la albúmina ; casi nunca, aumento; y
generalmente aumento de globulinas, en
alguna de sus fracciones.
La determinación de las proteínas totales
suele realizarse en el suero que carece de
fibrinógeno y de cualquier anticoagulante
143
que pueda diluir levemente las proteínas en
el plasma.
Albúmina
La albúmina es la principal proteína
plasmática y es sintetizada y secretada por
el hígado a razón de 12 g al día. Supone
alrededor de 25% de la producción proteica
hepática total y la mitad de toda su proteína
secretada. La albúmina es una proteína
globular compuesta por 585 aminoácidos
en una sola cadena polipeptídica con 50%
de -hélice y 15% de estructura , posee
17 puentes disulfuro y tiene una vida media
entre 14 y 20 días.
En el adulto normal se degradan
diariamente 12 g de albúmina que pueden
proveer de aminoácidos para la síntesis de
otras proteínas. Además de esta función
nutritiva, la albúmina ayuda a conservar la
distribución normal de agua ya que produce
cerca de 80% del efecto osmótico de las
proteínas plasmáticas totales, debido a su
alta concentración y bajo peso molecular.
La albúmina interviene en el equilibrio
ácido-básico y se encarga también del
transporte de varias sustancias como son
los ácidos grasos, la bilirrubina, varias
hormonas e incluso algunos fármacos
(sulfonamidas, penicilina G, aspirina, entre
otras).
Alteraciones en la concentración de
albúmina. La más común es la disminución
en su concentración o hipoalbuminemia. En
general, la disminución de 1 g de albúmina
sérica equivale a una pérdida de 30 g de
proteína tisular. Las principales causas de
hipoalbuminemia son las enfermedades
renales, la desnutrición por baja ingestión
de proteínas y la síntesis deficiente como
consecuencia de la insuficiencia hepática,
sobre todo en casos de cirrosis. La
manifestación clínica más llamativa de la
hipoalbuminemia es el edema.
Las cifras normales de albúmina son de 4.5
g/dl y las cifras límite entre 3.5 y 5 g/dl. La
relación normal A/G es mayor de uno y es
un indicador importante en algunos estados
patológicos. Una relación A/G baja puede
obtenerse porque existe hiperglobulinemia,
hipoalbuminemia o ambas.
Separación
electroforética
de
las
proteínas del suero
Las técnicas de electroforesis, enfoque
isoeléctrico y cromatografía de intercambio
iónico son algunas de las más importantes
para el estudio de las proteínas basadas en
su carga eléctrica.
En la electroforesis, si se colocan las
proteínas en un soporte (geles poliméricos,
almidón o papel) inmersas en una solución
amortiguadora a un pH determinado dentro
de un campo eléctrico, las proteínas se
desplazan hacia un polo cargado. En
función de la relación entre el pH del
amortiguador y el pI de la molécula, ésta se
moverá hacia el cátodo, hacia el ánodo, o
permanecerá estacionaria (pH=pI), por
influencia del campo eléctrico externo.
Cuando se realiza la electroforesis en papel
o acetato de celulosa a pH 8.6, que es un
pH significativamente superior al pI de las
principales proteínas plasmáticas cuyo peso
molecular oscila entre 66 000 y 700 000, las
proteínas están cargadas negativamente y
se mueven hacia el polo eléctrico positivo.
En
función
de
su
velocidad
de
desplazamiento, las proteínas del suero se
separan en cinco fracciones principales:
albúmina, globulina -1, globulina -2,
globulina , fibrinógeno (para plasma
solamente) y globulina (Fig. 5.1). La
electroforesis no separa los componentes
proteicos en sustancias químicamente
puras: algunas de estas fracciones
representan decenas a cientos de proteínas
individuales y diferentes que sólo tienen en
común
la
misma
velocidad
de
desplazamiento electroforético. Hay que
144
tener en cuenta que la migración a distinta
velocidad en el campo eléctrico, obedece a
la forma y carga de la molécula y menos a
su tamaño o peso molecular.
Las membranas de acetato de celulosa
tienen la ventaja de ser químicamente
homogéneas y poder transparentarse, con
lo que las sustancias que se separan
pueden cuantificarse por densitometría,
una vez teñidas. Este aparato condujo
históricamente
a
la
separación
y
clasificación operacional de las proteínas
del plasma humano (Fig. 5.1). El área de
cada pico determina la concentración de la
proteína que posee esa movilidad
particular.
La electroforesis separa las proteínas del
suero en patrones que pueden ser
altamente
específicos
para
ciertas
enfermedades como sucede en el mieloma,
el síndrome nefrótico,
la cirrosis o las quemaduras corporales
extensas (Fig. 5.1).
Proteínas específicas
realiza mediante métodos como la
nefelometría,
la
turbidimetría
y
la
inmunodifusión radial y métodos de
inmunoanálisis con reactivos marcados,
como
el
radioinmunoanálisis,
el
enzimoinmunoanálisis,
el
fluoroinmunoanálisis
y
el
luminoinmunoanálisis.
Tabla 5.1 Algunas proteínas cuya
concentración se determina en el
suero
NOMBRE DE LA
PROTEÍNA
g/L
PROPIEDADES Y
FUNCIÓN
MOTIVO PARA LA
PRUEBA
Albúmina
35-50
Transporte de
múltiples
sustancias
Desnutrición
Hepatopatía
Neoplasias
Ig G
8-17
Inmunidad
humoral
Inmunodeficiencias
Mieloma
C3
0.50.9
Proteína del
complemento
Obstrucción biliar
Lupus eritematoso
Proteína C
reactiva
<0.005
Implicada en la
respuesta
inmune
Infecciones agudas
Proteína fijadora 0.2de vitamina D
0.55
Une y
transporta
vitamina D3
Daño hepático
grave
Haptoglobina
0.53.2
Fija la
hemoglobina
Hemólisis
Síndrome nefrótico
Fibronectina
0.250.4
Promueve la
adhesión
celular, une
fibrina
Sepsis
Leucemia
Pancreatitis aguda
Transferrina
2.34.3
Transporte de
hierro
Hemocromatosis
malnutrición
Ceruloplasmina
0.20.55
Transporte de
cobre
Daño hepático
grave
Síndrome nefrótico
La tabla 5.1 describe algunas de las
proteínas cuya cuantificación es de utilidad
clínica.
Las proteínas plasmáticas de interés clínico
pueden determinarse por procedimientos
cuantitativos específicos que proporcionan
una información clinica más precisa que los
métodos anteriores. La cuantificación se
145
Alteraciones
plasmáticas
de
las
proteínas
Dada la gran diversidad de funciones
desempeñadas
por
las
proteínas
plasmáticas en el organismo, son también
muchas las alteraciones o disfunciones que
pueden aparecer.
Las alteraciones pueden clasificarse en:
• Alteraciones en la cantidad de proteínas
totales.
• Alteraciones en las fracciones obtenidas
tras una electroforesis, disproteinemias.
• Presencia en el plasma de alguna Ig
anormal y/o de alguno de sus fragmentos,
paraproteinemias.
• Circulación en plasma de Ig que
precipitan al descender la temperatura.
Crioglobulinemia.
• Defectos aislados de alguna fracción.
Material
• Gradilla con 6 tubos de ensayo
• 2 Pipetas de 5 ml,
• Pipetas automáticas
• Puntas para pipetas automáticas
• Reactivo de Biuret para determinación de
proteína: tartrato de K-Na 15 mmol/l,
yoduro de sodio 100 mmol/l, ioduro de
potasio 15 mmol/l y sulfato de cobre 5
mmol/l.
• Espectrofotómetro a 540 nm.
• Solución reactiva para albúmina: verde de
bromocresol a pH 4.2
• Espectrofotómetro a 630 nm.
• Suero problema.
• Solución estándar de proteínas 7 g/dl.
• Solución estándar de albúmina 5 g/dl.
• Jeringa*, ligadura y torundas con alcohol.
Precauciones. Evítese la hemólisis. La
concentración de las proteínas del plasma
se modifica por la postura, de forma que
existe un incremento de entre un 10% y un
20% tras 30 minutos de pasar de la
posición acostada a la ortostática. Además
la aplicación de la ligadura para extraer la
sangre puede producir un aumento
significativo al cabo de unos minutos. En
ambos casos, la modificación se debe a un
aumento del paso de líquido desde el
compartimiento vascular hacia el intersticial.
Método
Para la determinación de proteína total se
utiliza el método de Biuret modificado, el
cual es de gran especificidad y precisión.
Los polipéptidos que contengan, por lo
menos, dos enlaces peptídicos reaccionan
con las sales de cobre en medio alcalino
para formar un quelato coloreado (violeta)
entre el ion Cu2+ y los átomos de oxígeno
del carbonilo y de nitrógeno de la amida del
enlace peptídico. La concentración de este
complejo es proporcional a la concentración
de proteína total en la muestra. La
absorbencia se determina a 540 nm con un
blanco de reactivos.
Preparar la siguiente serie de tubos:
No.
de
1. Blanco
2. Estándar
Estándar
-
25 —l
-
Suero
-
-
25 —l
1 ml
1 ml
1 ml
tubo
3. Suero
problema
problema
Reactivo
de Biuret
Mezclar e incubar 15 min a temperatura
ambiente.
Leer frente al blanco de reactivos a 540 nm.
El color es estable durante 30 min.
Cálculo:
ASuero
X [ Estándar .g / dl ] = [Pr oteína .total . g / dl ]
AEstándar
Donde A es la absorbencia.
El resultado se obtiene en g/dl.
146
El método es lineal hasta valores de 15 g/dl
(150 g/l).
Valores esperados:
Recién nacidos
5.2 - 9.1 g/dl
Niños (hasta 3 años) 5.4 - 8.7 g/dl
Adultos
6.0 - 8.0 g/dl
Para la determinación de albúmina se
requiere de la fijación específica del verde
de bromocresol a esta proteína a
determinado pH produciéndose un cambio
de coloración, de amarillo verdoso a verde
azulado. El cambio en la coloración es
directamente
proporcional
a
la
concentración de albúmina en la muestra.
La absorbencia se determina a 630 nm con
un blanco de reactivos.
Referencias
1. Peters TJ. Clin Chem. 1968; 14: 1147.
2.
Murray KR, Granner DK, Mayes PA,
Rodwell VW. Bioquímica de Harper. 16a.
ed. México: Editorial El Manual Moderno;
2004.
3. González de Buitrago JM. Bioquímica
clínica. Madrid: McGraw-Hill Interamericana;
1999.
4. Laguna-Piña.
Bioquímica. 4a. ed.
México: Salvat; 1990. Cap. 4.
5. Pacheco Leal D. Bioquímica médica.
México: Editorial Limusa; 2004.
Preparar la siguiente serie de tubos:
No. de tubo
1. Blanco
2. Estándar
3.
Suero
problema
Estándar
-
10 —l
-
Suero
-
-
10 —l
2 ml
2 ml
2 ml
problema
Reactivo de
albúmina
Mezclar e incubar 10 min a temperatura
ambiente.
Leer frente al blanco de reactivos a 630
nm.
El color es estable durante 60 min.
Cálculo:
ASuero
X [Estándar.g / dl] = [ Albúmin a.g / dl]
AEstándar
Donde A es la absorbencia.
El resultado se obtiene en g/dl.
El método es lineal hasta valores de 6 g/dl
(60 g/l).
Los valores mayores de 6 deben diluirse
1:2 con solución salina.
Valores esperado de 3.5 a 5 g/dl (50 g/l).
147
Práctica 5
Cinética enzimática.
Efecto de la concentración del sustrato
sobre la velocidad de reacción enzimática
TIEMPO DE PRÁCTICA: 2 HORAS
Objetivo
La enzima que sirve de modelo en esta
práctica es la glucosa oxidasa acoplada a la
peroxidasa.
El alumno:
1. Explicará el efecto de la concentración
de sustrato sobre la velocidad de una
reacción enzimática.
2. Calculará por métodos gráficos la
velocidad máxima y la constante de
Michaelis de una reacción enzimática.
3. Conocerá los diferentes tipos de
inhibidores que existen y estudiará su efecto
sobre la Km y V máx.
4. Conocerá
aspectos
básicos
de
fotocolorimetría (ver pág, 115).
Para lograr los objetivos de esta práctica
contestar las siguientes preguntas:
1. ¿Qué es la velocidad de una reacción
enzimática?
2. ¿Cómo se define la constante de
Michaelis (Km) de una reacción enzimática?
3. ¿Cómo se define la velocidad máxima (V
máx) de una reacción?
4. ¿Para qué le sirve a un médico la
determinación de la actividad de algunas
enzimas?
5. ¿Cuáles son
las enzimas cuya
determinación tiene valor diagnóstico?
Hipótesis
Si la velocidad de una reacción enzimática
es proporcional a la concentración del
sustrato; cuando la concentración del
sustrato es muy alta, por lo tanto la enzima
se satura y alcanza su velocidad máxima.
INTRODUCCIÓN
Las enzimas son las proteínas más
notables de la naturaleza; sin ellas, la vida
como la conocemos no sería posible. Las
enzimas son catalizadores, esto es,
aceleran la velocidad de las reacciones
sobre las que actúan sin consumirse en el
proceso. El poder catalítico de las enzimas
es mucho mayor que el de los catalizadores
inorgánicos, algunas de ellas están
limitadas solo por la velocidad con que
colisionan
con
sus
sustratos;
son
catalizadores perfectos.
Aunque las reacciones que ocurren
en la célula son termodinámicamente
favorables, la velocidad a la cual transcurren
la mayoría de ellas es extremadamente
lenta; sin la presencia de las enzimas, las
reacciones necesarias para sostener la vida
ocurrirían a una velocidad incompatible con
ésta. Además de su enorme poder
catalítico, las enzimas son altamente
específicas por sus sustratos y tienen la
capacidad de regular su velocidad en
respuesta a las concentraciones de sustrato
y la presencia de inhibidores, activadores,
reguladores alostéricos, etc. Así pues, las
enzimas desempeñan un papel central en
los
procesos
biológicos,
son
las
responsables de degradar y sintetizar las
moléculas que nos forman y de extraer,
transformar y utilizar toda la energía
relacionada con estos procesos. Por último,
las enzimas son las responsables de regular
y coordinar todas las reacciones que
148
ocurren en un organismo para lograr el
delicado balance que representa la vida.
El primer modelo matemático que
explicó de manera general la cinética de las
enzimas no alostéricas, donde la velocidad
de
la
reacción
se
incrementa
hiperbólicamente conforme aumenta la
concentración de sustrato, fue propuesto en
1913 por Leonor Michaelis y Maud Menten a
partir de los trabajos previos de Victor Henri
y Archibald Hill. Este modelo postula la idea
central de que la enzima y el sustrato libres
establecen un equilibrio rápido con el
complejo enzima-sustrato; en un segundo
paso más lento, este complejo se rompe
liberando el producto y regenerando la
enzima libre. La ecuación de MichelisMenten explica la relación entre la velocidad
de la reacción catalizada por una enzima y
la concentración de sustrato a través de los
dos parámetros de la ecuación, Vmax y Km.
La ecuación de Michaelis-Menten puede ser
re-arreglada matemáticamente para obtener
su forma lineal, permitiendo determinar de
manera sencilla los parámetros cinéticos de
una enzima a través del grafico de
Lineweaver-Burk. Este mismo gráfico
permite inspeccionar rápida y visualmente
las diferentes formas de inhibición
enzimática.
El estudio de las enzimas es de
suma importancia dentro de las ciencias
médicas; las enzimas están implicadas en el
origen, diagnostico y tratamiento de una
gran cantidad de patologías y es claro que
en el futuro, su preponderancia será cada
vez mayor. Por ejemplo, la deficiencia de
algunas enzimas, como las proteasas de la
coagulación en la hemofilia, es causa de
enfermedades hereditarias. La presencia
anormal de algunas enzimas en el torrente
sanguíneo ayuda a diagnosticar el daño
específico de tejidos, este es el caso de la
amilasa y lipasa en las patologías
pancreáticas y las transaminasas en las
enfermedades hepáticas. Las enzimas son
también el blanco de varios fármacos: la
aspirina inhibe a la ciclooxigenasa, el
omeprazol a la ATPasa de protones y el
captopril a la enzima convertidora de
angiotensina; estas inhibiciones redundan
en un efecto terapéutico. La capacidad de
producir enzimas recombinantes abrió la
posibilidad de utilizarlas rutinariamente con
fines terapéuticos, tal es el caso de la
estreptocinasa para la terapia fibrinolítica en
el infarto agudo al miocardio. Es claro que
todas estas aplicaciones no serian posibles
sin la previa y profunda comprensión de la
estructura y función de estas fascinantes
moléculas.
Fundamento
El método se basa en el hecho de que la
glucosa, en presencia del oxígeno del aire y
con la participación de la glucosa oxidasa,
se oxida hasta ácido glucónico. El peróxido
de hidrógeno que se forma en el curso del
proceso se descompone mediante la
peroxidasa. El oxígeno atómico que se
desprende en esta última reacción se
combina con un cromógeno que se colorea
al oxidarse. La intensidad de la coloración
del cromógeno oxidado es proporcional a la
concentración de glucosa.
La glucosa oxidasa (ß-D-glucosa: oxígeno
óxidorreductasa, EC1.1.2.4) tiene un peso
molecular de 160 000. Existe en forma
dimérica y contiene dos moles de FAD
como grupo prostético por mol de enzima.
La glucosa oxidasa es altamente específica,
hecho que ha permitido su empleo para el
análisis cuantitativo de glucosa. La reacción
consiste de dos pasos:
1. Glucosa + glucosa oxidasa-FAD
gluconolactona + glucosa oxidasa-FADH2
2. Glucosa oxidasa-FADH2 + O2
oxidasa-FAD + H2O2
-
glucosa
La
4-gluconolactona
se
hidrata
espontáneamente dando ácido glucónico.
La reacción global se expresa:
Glucosa oxidasa
Glucosa + O2
Acido glucónico +
H2O2
La peroxidasa cataliza la transferencia de
oxígeno del peróxido a un aceptor que es
149
Método II (sin inhibidor)
1.- Preparar nuevamente una serie de tubos
como lo indica la tabla 1.
cromógeno como la ortotoluidina, la
ortodianisidina,
la
2,2-azino-bis
(3etilbencentiazolin-6-sulfónico) o la 4-aminoantipirina (y fenol) que se colorean al
oxidarse. La reacción se expresa:
E+S
ES
2.- Repetir los paos 3 y 4 del Método I
Leer ambas series de tubos en el
fotocolorímetro; utilizar como blanco el tubo
1.
E+P
Material y reactivos
• 2 Gradillas con 8 tubos de ensaye cada
una.
• 1 Pipeta de 5 ml.
• 2 Pipetas de 5 ml.
• 1 Matraz Erlemeyer de 100 ml.
• Fotocolorímetro con filtro azul.
• Solución estándar de glucosa 40 mmol/l y
una dilución 1:10 de ésta para los tubos 2, 3
y 4.
• 2 frascos con solución de enzimas: 41.6
Uml–1 de glucosa oxidasa, 4.6 Uml–1 de
peroxidasa, ortodianisidina 0.21 mmol/l.
• Solución de azida de sodio 400 mmol/l
como inhibidor.
• Gotero con HCl.
Resultados (cuadro 5.2)
1. Cálculo de la concentración inicial de
sustrato en cada tubo; tomar en cuenta que
la solución de glucosa contiene 40 µmolas
ml–1.
2. La velocidad será igual a las unidades
Klett por .5 min-1 de incubación.
3. Con los datos obtenidos completar el
cuadro 5.2 y hacer las dos gráficas en papel
milimétrico.
4. Hacer una segunda gráfica con los
valores de 1/v vs 1/[S].
5. Calcular el valor de la velocidad máxima
(Vmáx) y de la constante de Michaelis (Km)
con y sin inhibidor.
6. Determinar el tipo de inhibidor de
acuerdo con las gráficas del punto anterior.
7. Analizar si los resultados obtenidos están
de acuerdo con la hipótesis planteada.
Método I (con azida de sodio)
1. En un matraz Erlenmeyer de 100 ml
preincubar 20 minutos la solución de
enzimas con 0.3 ml del inhibidor.
2. Preparar la siguiente serie de tubos (tabla
1).
3.- Considerar un intervalo de 30 segundos
para cada tubo al agregar la enzima.
4.- Agitar cada tubo e incubar 5 minutos
temperatura ambiente y de inmediato
detener la reacción agregando 3 gotas de
HCl concentrado Considerar un intervalo de
30 segundos para cada tubo al agregar el
HCl.
Tubo Solución
No.
glucosa (ml)
1
2
3
4
5
6
7
8
dil 1:10
dil 1:10
dil 1:10
de H2O
(ml)
0.0
0.1
0.25
0.5
0.1
0.25
05.
1.0
1.0
0.9
0.75
0.5
0.9
0.75
0.5
0.0
Soución
de
enzimas
(ml)
3
3
3
3
3
3
3
3
150
Referencias
1. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con
aplicaciones clínicas. 4a. ed. Barcelona:
Editorial Reverté; 2004.
2. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de
bioquímica. 4a. ed. Barcelona: Ediciones
Omega; 2005.
3. Mathews CK, van Holde KE. Bioquímica.
3a.
ed.
España:
McGraw-Hill
Interamericana; 2003.
4. Voet D, Voet JG, Pratt C. Fundamentals
of biochemistry. USA: John Wiley and
Tubo
No.
Concentración de
sustrato µmolas
de glucosa inicial
ml-1
ABCISAS (X)
Velocidad de la
reacción unidades
Klett 5 min-1 1/V
ORDENADAS (Y)
1
2
3
4
5
6
7
8
Velocidad de la
reacción con
INHIBIDOR 1/V
Unidades Klett
5 min–1 (Y)
Sons; 1999.
Tubo
No.
Concentración de
sustrato µmolas
de glucosa inicial
ml-1
ABCISAS (X)
Velocidad de la
reacción
unidades Klett 5
min-1
ORDENADAS (y)
Velocidad de la
reacción con
INHIBIDOR
Unidades Klett
5 min -1
1
2
3
4
5
6
7
8
Cuadro 5.2 Resultados
Cuadro 5.3 Resultados (inverso)
151
Práctica 6
Efecto de la insulina sobre la glucemia de la rata
Tiempo de Práctica: 2 Horas
Esta
práctica
es
una
simulación
compuratizada de un fenómeno bioquímico;
tiene el propósito de que los alumnos se
ejerciten en el manejo de los datos
obtenidos por medio de experimentación
simulada estrictamente controlada.
Objetivos
1. Que el alumno compruebe el efecto de la
insulina sobre la glucemia de la rata.
2. Relacione sus conocimientos sobre el
metabolismo de la glucosa y los
mecanismos del control de la glucemia y los
mecanismos del control de la glucemia en
un modelo experimental sencillo.
Conteste a las siguientes preguntas:
1. ¿Qué es la insulina y cuál es su función?
2. ¿Dónde se sintetiza y cuántas cadenas
tiene?
3. ¿Qué se sabe del mecanismo por medio
del cual actúa?
4. ¿Por qué la insulina se tiene que inyectar
y no se debe administrar por vía bucal?
Hipótesis
Si la glucemia en la rata se modifica por la
acción de la insulina, la rata control
mostrará una glucemia diferente a la
experimental.
Analizar
la
hipótesis
apropiada.
Método
1. Encender la computadora y localizar el
icono del programa. El efecto de la insulina
sobre la glucemia de la rata. Hacer doble
clic sobre este icono.
2. Hacer clic sobre los botones que indican
cada de las partes de la práctica; empezar
por leer las
instrucciones, los objetivos y el fundamento
de la práctica para continuar con la parte
experimental.
3. Seguir todos los pasos de la práctica;
poner especial atención en la obtención de
los datos experimentales que dberán ser
anotados en papel como cualquier práctica
convencional.
4. Repetir el experimento las veces que el
usuario quiera, o las veces que sean
necesario, hasta obtener los datos
completos del experimento. Se sugiere
repetirlo por lo menos dos veces y hacer un
promedio de los datos obtenidos.
5. Hacer una tabla con dichos datos,
graficarlo, analizar el significado de los
mismos y, de acuerdo a lo anterior, validar o
rechazar la hipótesis del experimento.
Análisis de resultados
1. Analizar si los resultados obtenidos están
de acuerdo con la hipótesis planteada.
2. Plantear cuál sería el resultado esperado
si se hubiera trabajado con ratas diabéticas.
3. Relacionar los datos con el control
hormonal de la glucemia.
4. Hacer el informe de la práctica con los
resultados y las conclusiones que de éstos
se deriven.
Referencias
1. Stryer L. Bioquímica. 5a. ed. Barcelona:
Editorial Reverté; 2003.
2. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con
aplicaciones clínicas. 5a. ed. Barcelona:
Editorial Reverté; 2001.
3. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de
bioquímica. 4a. ed. Barcelona: Ediciones
Omega; 2005.
152
Práctica 7
Estudio del bombeo de protones por levaduras;
efecto de los inhibidores de la cadena de
transporte de electrones y de los desacoplantes
Tiempo de práctica: 2 horas
Objetivos
1. Que el alumno relacione el consumo de
glucosa con los cambios de pH producidos
por las levaduras.
2. Que el alumno describa las vías por las
cuales la glucosa genera los cambios de
pH.
3. Que el alumno interprete el efecto de
los inhibidores y los desacoplantes sobre
la salida de protones.
Responda a las siguientes preguntas:
1. ¿Cuáles son las fuentes de carbono
que usa la levadura?
2. ¿Cuáles son las vías metabólicas que
catabolizan a los carbohidratos?
3. ¿En qué consisten la glucólisis y la
fosforilación oxidativa?
4. ¿Cuáles son los productos finales del
catabolismo de los carbohidratos en las
levaduras?
5. ¿Cuáles son los inhibidores de la
cadena respiratoria de los sitios I, II y III?
Describa su efecto sobre el consumo de
O2 y la síntesis del ATP.
6. ¿Cuál es el mecanismo por medio del
cual los protonóforos desacoplan la
fosforilación oxidativa? Describa su efecto
sobre el consumo de O2 y la síntesis del
ATP.
Las levaduras Saccharomyces cerevisiae
son organismos unicelulares que se
dividen por gemación. En común con otras
células eucariontes, las levaduras tienen
un núcleo ; ; en donde reside la
información genética de la célula; ,
mitocondrias ; en donde se lleva a cabo la
síntesis de ATP;
y un retículo
endoplásmico y aparato de Golgi que se
encargan de la síntesis de proteínas cuya
localización final es la membrana
plasmática o el exterior.
A nivel de la membrana plasmática, las
levaduras tienen una ATPasa de H+ que
acopla la hidrólisis del ATP con el bombeo
de protones hacia afuera de la célula.
Esta proteína es semejante desde un
punto de vista estructural y funcional a la
ATPasa de Na+/K+ de las células
animales y, al igual que la bomba de
sodio/potasio,
se
inhibe
con
concentraciones
micromolares
de
vanadato. Como resultado de la actividad
de la ATPasa de H+ en la levadura, se
genera un gradiente electroquímico de
protones que se utiliza para impulsar el
transporte de nutrientes al interior de la
célula, proceso catalizado por sistemas de
transporte llamados simportadores o
uniportadores. Para darse una idea de la
importancia de esta enzima en la
economía celular y en la energización de
la membrana celular, basta decir que la
ATPasa de H+ consume hasta un 25 %
del ATP que se sintetiza en la célula.
Además de esta ATPasa de H+ de la
membrana plasmática, las levaduras
tienen otra bomba de protones en la
153
membrana interna de las mitocondrias, la
ATP sintasa, que se encarga de la síntesis
del ATP. En contraste con la enzima de
membrana plasmática, el flujo de protones
a través de la ATP sintasa induce la
síntesis de ATP. Uno de los inhibidores
más efectivos de esta enzima es la
oligomicina.
Así, se puede proponer uno de los
muchos ciclos en los que interviene el
ATP en la levadura: por un lado, el ATP se
sintetiza en la mitocondria por medio de la
ATP sintasa, y a nivel de la membrana
plasmática, la ATPasa de H+ lo hidroliza
para bombear protones al exterior de la
célula. El factor común en ambos casos es
un flujo de protones a través de la
membrana.
Hipótesis
Si las levaduras consumen glucosa, se
observará una disminución progresiva de
su concentración en el medio de cultivo
con el tiempo y cambios en el pH
extracelular.
Material
• Tres vasos de precipitado de 100 ml.
• Pipetas de 5 y 10 ml.
• Potenciómetro.
• Piceta para enjuagar el electrodo del
potenciómetro.
• Levadura (Saccharomyces cerevisiae)
200 mg/ml.
• Solución de glucosa (10%) para una
concentración final de 1%.
• Solución de dinitrofenol 40 mmol/l en
etanol.
• Solución de azida de sodio 400 mmol/l.
• Agua destilada.
Método
Experimento 1 (control)
1 .Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de
agua destilada.
2. Determinar el pH de la solución y repetir
la medición dos veces más con intervalos
de 3 minutos para obtener la línea basal.
3. Adicionar 5 ml de glucosa a 10 %, agitar
y medir el pH.
4. Determinar el pH de la solución cada 5
minutos 4 veces, y luego cada 10 minutos
2 veces más.
EXPERIMENTO 2 (DINITROFENOL)
1. Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de
agua destilada.
2. Añadir por decantación (no pipetear) 0.2
ml de la solución de dinitrofenol 40 mmol/l,
concentración final de 200 µmol/l.
3. Determinar el pH de la solución y repetir
la medición dos veces más con intervalos
de 3 minutos para obtener la línea basal.
4. Esperar 5 minutos.
5. Repetir los pasos 3 y 4 del experimento
control.
EXPERIMENTO 3 (AZIDA)
1. Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de
agua destilada.
2. Añadir por decantación (no pipetear) 0.5
ml de la solución de azida de sodio 400
mmol/l, concentración final de 5 mmol/l.
Agitar con cuidado.
3. Determinar el pH de la solución y repetir
la medición dos veces más con intervalos
de 3 minutos para obtener la línea basal.
4. Esperar 5 minutos.
5. Repetir los pasos 3 y 4 del experimento
control.
6. Registrar sus datos en la siguiente
tabla.
154
mamíferos
Tiempo
(min)
Glucosa
pH
Azida de
Dinitrofe
sodio
nol
0
5
10
15
20
30
40
Análisis de resultados
1. Hacer una gráfica de cada uno de los
experimentos; utilizar los valores de las
lecturas de pH contra tiempo.
2. Analizar el significado de los cambios
de pH en el experimento control, con
dinitrofenol como desacoplante y con
azida de sodio.
3. Hacer una relación de las vías que
producen estos cambios; tomar en cuenta
que las levaduras poseen una ATPasa de
protones en la membrana mitocondrial que
se encarga de sintetizar ATP y que tienen
otra ATPasa de protones en la membrana
plasmática cuya función es similar a la
bomba de Na+/K+ en las células de los
(ver
fig.
7.1).
Referencias
1. Peña A. Studies on the mechanism of
K+ transport in yeast. Arch Biochem
Biophys. 1975; 167:397-409.
2. Pardo JP. La ATPasa de H+ de la
membrana plasmática de los hongos.
Mensaje Bioquímico. 1990; 13: 119-172.
Glucosa
ADP + Pi
Glucosa
+
H
ATP
+
H
ADP
ATP
Etanol
+
H
+
+
H H
+
H
NAD NADH ADP + Pi
ATP
Acetaldehído
Mitocondria
ADP
ADP
155
Práctica 8
El efecto del etanol sobre la lipoperoxidación
Tiempo de Práctica: 2 Horas
Esta
práctica
es
una
simulación
compuratizada de un fenómeno bioquímica;
tiene el propósito de que los alumnos se
ejerciten en el manejo de los datos
obtenidos por medio de experimentación
simulada estrictamente controlada.
Método
1. Encender la computadora y localizar el
icono del programa. El efecto de la insulina
sobre la glucemia de la rata. Hacer doble
clic sobre este icono.
2. Hacer clic sobre los botones que indican
cada de las partes de la práctica; empezar
por leer las instrucciones, los objetivos y el
fundamento de la práctica para continuar
con la parte experimental.
3. Seguir todos los pasos de la práctica;
poner especial atención en la obtención de
los datos
experimentales que deberán ser anotados
en
papel
como
cualquier
práctica
convencional.
4. Repetir el experimento las veces que el
usuario quiera, o las veces que sean
necesario, hasta obtener los datos
completos del experimento. Se sugiere
repetirlo por lo menos dos veces y hacer un
promedio de los datos obtenidos.
5. Hacer una tabla con dichos datos,
graficarlo, analizar el significado de los
mismos y, de acuerdo a lo anterior, validar o
rechazar la hipótesis del experimento.
Referencias
1. Stryer L. Bioquímica. 5a. ed. Barcelona:
Editorial Reverté; 2003.
2. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con
aplicaciones clínicas. 5a. ed. Barcelona:
Editorial Reverté; 2001.
3. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de
bioquímica. 4a. ed. Barcelona: Ediciones
Omega; 2005.
156
Práctica 9
Estudio general del metabolismo
de los carbohidratos
Tiempo de práctica: 3 horas
Objetivos
1. Aplicar los conocimientos generales
sobre los carbohidratos a su estudio en los
tejidos o líquidos corporales.
2. Conocer el metabolismo de la glucosa.
3. Conocer las alteraciones más
frecuentes del metabolismo de los
carbohidratos.
4. Conocer los aspectos básicos de las
determinaciones del laboratorio clínico
para valorar el funcionamiento del
metabolismo de los carbohidratos.
5. Describir los principios analíticos para la
determinación de glucosa y fructosaminas,
llevar a cabo sus determinaciones y
correlacionar los valores obtenidos con
los valores normales de glucosa y
fructosaminas en suero o plasma.
Conteste las siguientes preguntas:
1. ¿Qué son los carbohidratos y cómo se
clasifican?
2. ¿Cuáles son las funciones que
desempeñan los carbohidratos en el
organismo humano?
3. ¿Cómo se lleva a cabo la digestión y
absorción de los carbohidratos?
4. ¿Cuáles son las vías metabólicas en las
que participan los carbohidratos?
5. ¿Qué es la glucemia y cómo se regula?
6. ¿Cuáles son las principales alteraciones
de la digestión, absorción y metabolismo
de
los
carbohidratos
(déficit
de
glucosidasas intestinales, malabsorción
intestinal de azúcares, enfermedades del
metabolismo de la fructosa y de la
galactosa, diabetes mellitus, secuelas de
la diabetes, glucogenosis, etcétera)?
7. ¿Cuál es el mecanismo por el cual la
glucosa puede causar daño a los tejidos
(glucosilación proteica: formación de
bases de Schiff, puentes glucosídicos
AGE).
8. ¿Cuáles son las pruebas de laboratorio
más utilizadas para el estudio de los
carbohidratos corporales?
INTRODUCCIÓN
La glucosa es cuantitativamente el
carbohidrato más importante del que
dispone el cuerpo, ya sea por absorción
de la dieta o por síntesis interna. Por
consiguiente, la mayoría de las pruebas
clínicas están basadas en el estudio del
metabolismo de la glucosa. Se conocen
varias alteraciones de este metabolismo,
clasificándolas como:
•Primarias, alteraciones en el metabolismo
de carbohidratos (diabetes mellitus,
hiperinsulinismo, entre otras).
•Secundarias,
manifestaciones
que
acompañan
a
otras
enfermedades
(síndrome
de
Cushing,
afecciones
hepáticas, hipofisiarias o tiroideas, entre
otras).
Entre los procedimientos diagnósticos
para valorar el funcionamiento del
metabolismo de los carbohidratos los más
importantes son los siguientes:
• Glucosa plasmática en ayunas.
• Glucosa en orina.
•
Cuerpos
cetónicos
en
sangre
(cetonemia) y en orina (cetonuria).
157
• Prueba oral de tolerancia a la glucosa.
• Hemoglobina glucosilada.
• Fructosaminas.
•
Determinación
de
hormonas
relacionadas con el metabolismo de
carbohidratos (insulina, péptido "C" y
glucagón).
• Determinaciones de enzimas y sustratos
hidrocarbonados en células y tejidos.
•
Otras
determinaciones
(microalbuminuria,
determinaciones
inmunológicas
y
determinación
de
receptores).
Para llevar a cabo la determinación de
glucosa plasmática en ayunas (basal)
utilizaremos un método enzimático
colorimétrico y para la determinación de
glucosa y cuerpos cetónicos en orina
utilizaremos tiras reactivas.
Material
• Gradilla con 3 tubos de ensayo.
• Pipetas de 0.1 y 1 ml.
• Solución reactiva para glucosa: TRIS 92
mmol/l, pH 7.4; fenol 0.3 mmol/l, glucosa
oxidasa 15 000 U/l, peroxidasa 1000 U/l y
4-aminofenazona 2.6 mmol/l.
• Solución reactiva para determinación de
fructosaminas 1: proteinasa K 786 U/ml,
peroxidasa 60 U/ml, amortiguador de pH y
diversos estabilizadores.
• Solución reactiva para determinación de
fructosaminas 2: cetoamina oxidasa 9
U/ml, 4-aminoantipirina 10.5 mmol/l, EDTA
50 mmol/l, amortiguador de pH y
estabilizadores.
•Solución estándar de glucosa 100 mg/dl.
•Solución estándar de fructosamina 150
µmol/l.
•Curva patrón de fructosaminas (DA
contra concentración) 50, 100, 200, 400
µmol/l. Gráfica proporcionada por la
coordinación.
•Suero o plasma problema (estable 3 días
a 2-8°C).
• Espectrofotómetro a 505 y 620 nm.
Método
DETERMINACIÓN DE LA GLUCEMIA BASAL
POR GOD-POD/TRINDER
El método más utilizado en el laboratorio
clínico es el de la glucosa oxidasa (GOD).
Esta enzima cataliza la reacción de la
glucosa presente en la muestra.
GOD
Glucosa + O2 + H2O
H2O2 +
Gluconato
La cuantificación de los resultados puede
llevarse a cabo de la siguiente manera:
Mediante polarografía, determinación del
consumo de oxígeno con la ayuda de un
electrodo de oxígeno. La cantidad de
glucosa en la muestra es directamente
proporcional a la cantidad de oxígeno
consumido. Método muy utilizado en
sistemas automatizados de análisis
clínico.
Enzimático
colorimétrico,
por
determinación de la quinona producida por
la acción de la peroxidasa (POD), en
donde un cromógeno pasa de su forma
reducida (incolora) a su forma oxidada
(coloreada). El método utilizado para esta
determinación es el de Trinder. En él la
intensidad del color es directamente
proporcional a la cantidad de glucosa
presente en la muestra.
POD
2H2O + Fenol + 4-AF
Quinona +
H2O
Preparar la siguiente serie de tubos:
No. de tubo
1. Blanco
2. Estándar
3. Suero
problema
Estándar
-
10 µl
-
Suero
-
-
10 µl
1 ml
1 ml
1 ml
problema
Solución
reactiva para
glucosa
Mezclar e incubar
temperatura ambiente.
15
minutos
a
158
La coloración es estable 30 minutos.
Medir la absorbencia (A) frente a blanco
de reactivos a 505 nm.
Cálculo:
ASuero
X [Estándar.g / dl] = [ Albúmin a.g / dl]
AEstándar
El resultado se obtiene en mg/dl (x 0.0555
= mmol/l).
El método es lineal hasta valores de 500
mg/dl.
Diluir el suero 1:2, si la concentración de
glucosa es mayor a 500 mg/dl con
solución salina.
La hemólisis hasta 0.3 g/dl de
hemoglobina no interfiere.
Los anticoagulantes como el EDTA,
oxalato, heparina o fluoruro no afectan a
los resultados.
La glucosa en suero o plasma es estable
tres días a 2-8°C. A temperatura
ambiente, la glucosa presente en una
muestra de sangre entera puede
desaparecer por completo al cabo de 6
horas debido a la glucólisis en los
eritrocitos. Además, la contaminación
bacteriana y la presencia de cantidades
elevadas de leucocitos, pueden también
aumentar
dicho
proceso,
por
consiguiente:
Siempre que la muestra sea sangre total,
la determinación de la glucosa debe
realizarse durante la media hora siguiente
a su recolección.
De lo contrario, añadir un conservador que
inhiba la glucólisis (fluoruro sódico).
libres de las proteínas, por un mecanismo
diferente al empleado en la reacción
catalizada
por
las
enzimas
glucosiltransferasas, por lo que la unión
que se establece entre el azúcar y la
proteína no es de naturaleza glucosídica.
Se prefiere el uso del término glicación en
lugar de glicosilación o glucosilación (para
el caso de la unión de glucosa con la
proteína) para este tipo de reacción. La
glicación
es
una
reacción
de
condensación entre la función aldehído o
cetona de un azúcar reductor y un grupo
amino libre de una proteína (residuo
amino terminal o épsilon amino de una
lisina) en la que se genera una base de
Schiff, que se transforma en una
cetoamina estable llamada producto de
Amadori o fructosamina.
Los productos de Amadori pueden sufrir
una serie de modificaciones como la
condensación entre dos de ellos para
formar productos complejos de estructura
química no del todo aclarada llamados
AGE (Advanced Glycation End products, o
productos de glicación avanzada) ver la
figura 10.1.
La glicación depende exclusivamente de
los niveles de glucosa en los líquidos
corporales y del tiempo de contacto entre
ésta y las proteínas. De ahí que, la
determinación de los productos de
glicación puede emplearse como medida
del nivel promedio de la glucosa
sanguínea durante un cierto período de
tiempo, el cual dependerá de la vida
media de la proteína que se analice.
GLICACIÓN NO ENZIMÁTICA DE PROTEÍNAS.
FRUCTOSAMINAS Y HEMOGLOBINA GLICADA
El término glicosilación no enzimático de
las proteínas se refiere a la reacción entre
los azúcares reductores con los grupos
amino
159
entre la determinación instantánea de la
glucemia y la valoración a largo plazo
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)
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,
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dada por la HbA1.
+
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La determinación de la Hb glicada puede
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diferenciar un proceso agudo que cursa
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con hiperglucemia, una
hiperglucemia
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transitoria
secundaria
al
estrés
y una
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diabetes mellitus.
La determinación del nivel de glicación de
Fig. 10.1. Productos de la glicación
la albúmina plasmática (glicoAlb), que
avanzada
tiene una vida media de 14 a 20 días,
refleja el promedio de la glucemia (y por
La hemoglobina glicada y las proteínas
tanto, el grado de control del paciente) en
séricas glicadas (fructosaminas) se utilizan
un periodo que va desde 1 a 3 semanas
como parámetros de medida a largo plazo
previas a la extracción de sangre. Aunque
de la evaluación del estado del
la albúmina es el componente sérico
metabolismo de los carbohidratos en el
glicado cuantitativamente más importante,
diagnóstico, control y tratamiento de la
otras proteínas séricas también sufren
diabetes (una enfermedad caracterizada
glicación. La vida media de estas
por los niveles de glucosa circulante
proteínas circulantes es de sólo unos
elevados). Hay un consenso general en
pocos días, por lo cual la determinación de
que las complicaciones crónicas de la
las proteínas séricas glicadas totales
diabetes
como
las
retinopatías,
(PSG) refleja la glucemia promedio de los
nefropatías,
neuropatías
y
la
15 días previos a la toma de muestra.
aterosclerosis acelerada, entre otras, son
La determinación de estos productos
consecuencia de los niveles altos de
glicados se lleva a cabo mediante las
glucosa en la sangre, los que pueden ser
siguientes reacciones: La proteinasa K
determinados midiendo la concentración
digiere las proteínas glucosiladas para dar
de proteínas glicadas.
fragmentos de proteínas, los cuales por
El primer indicador retrospectivo del curso
medio de la cetoamida oxidasa, oxidan
de la glicemia en el tiempo, que se puso al
sus enlaces cetoamida, dando como
alcance de los laboratorios clínicos fue la
resultado aminoácidos y peróxido de
hemoglobina glicada (HbA1 ó HbA1c).
hidrógeno. La peroxidasa cataliza la
Ésta refleja el promedio de la glucemia de
transferencia de oxígeno del peróxido a un
las 6 a 8 semanas previas a la toma de la
aceptor que es un cromógeno, que se
muestra. La hemoglobina tiene una
colorea al oxidarse. La absorbencia del
velocidad de recambio menor que las
cromógeno oxidado a 620 nm es
proteínas plasmáticas, por lo que, la
proporcional a la concentración de
determinación de fructosaminas puede
proteína glicada.
emplearse como índice del control de la
La reacción completa es la siguiente:
glucemia en un periodo más corto, de
alrededor de dos semanas previas a la
Proteinasa K
toma de sangre. Es decir, que cubre un
Proteína glicada
Fragmentos de proteína
periodo de tiempo intermedio
glicada
!"#$%&'
(
(
(*)
!"#$%&'
(
,
(
,
,
!
!"#$%&'
!
!"#$%&'
160
Cetoamina oxidasa
Fragmentos de proteína
+ H2O2
Aminoácidos
Peroxidasa
H2O2 + Cromógeno
oxidado + H2O
Procedimiento para
fructosaminas:
Cromógeno
la
determinación
de
1. Vaciar en un tubo de ensayo 0.5 ml (500 µl)
de reactivo 1 para fructosaminas.
2. Agregar 0.02 ml (20 µl) de suero o plasma
problema.
3. Incubar
ambiente.
10
minutos
a
temperatura
4. Agregar 0.1 ml (100 µl) de reactivo 2 para
fructosaminas.
5. Mezclar, leer la absorbencia inicial al cabo
de 30 segundos a 620 nm.
6. Leer nuevamente la absorbencia al cabo de
1 minuto.
Cálculo:
Anotar la A del tubo e interpolar en la gráfica
de A contra concentración de fructosamina
en µmol/l que será proporcionada en la
coordinación de prácticas.
Valores esperados 122 - 236 µmol/l.
El método es lineal hasta 1734 µmol/l.
Determinación de glucosa y de cuerpos
cetónicos en orina con tiras reactivas
Aunque los cuerpos cetónicos son productos
intermedios del metabolismo de los ácidos
grasos, la variación de sus niveles en sangre
y en orina informa indirectamente acerca del
metabolismo de los carbohidratos.
Colocar la tira reactiva horizontalmente
sobre un papel absorbente, en el
transcurso de 30 segundos a 2 minutos
interpretar los resultados para ello:
Comparar la tira reactiva con los bloques
de colores que aparecen en la caja de las
tiras reactivas (cambios en la coloración
después de 2 minutos no tienen
importancia clínica).
Composición de las tiras reactivas es la
siguiente:
Glucosa, 10.54% de glucosa oxidasa
(Aspergillus, 250 UI), 0.2% de peroxidasa
(rábano, 2500 UI) y 5% yoduro de potasio.
Cetonas, 4.5% de nitroprusiato de sodio.
Referencias
1.González de Buitrago JM. Bioquímica
clínica.
McGraw-Hill
Interamericana
Editores; 1999.
2.D’Ocon, C. Fundamentos y técnicas de
análisis bioquímico. Editorial Paraninfo;
1998.
3.Chernecky CC. Pruebas de Laboratorio
y Procedimientos Diagnósticos. 2a. ed.
McGraw-Hill
Interamericana Editores;
1999.
4.Gaw, A. Bioquímica clínica. 2a. ed.
Editorial Harcourt; 2001.
5.Anderson SC, Cockayne S. Química
clínica.
México:
McGraw-Hill
Interamericana Editores; 1995.
6.Actis SM, Rebolledo O. Avances en la
valoración de fructosamina: ventajas de un
nuevo equipo diagnóstico aplicado a
estudios poblacionales. Acta Bioquím Clín
Latinoamer. 1991; 25 (4): 391-402.
Recolectar una muestra de orina en un
recipiente de plástico o de vidrio limpios (si la
muestra no se procesa durante la primera
hora después de su obtención, deberá
refrigerarse).
Sumergir la tira reactiva en la orina y retirarla
inmediatamente.
161
Práctica 10
Determinación de lípidos
y lipoproteínas plasmáticas.
Tiempo de práctica: 2 horas
Objetivos
1. Recordar la estructura de los diferentes
lípidoscirculantes y sus funciones.
2. Describir las diferentes fuentes de colesterol,
su función y la dinámica del colesterol
plasmático.
3. Investigar el papel del colesterol y otros lípidos
en el desarrollo de la aterosclerosis.
4. Describir la composición y la función de las
lipoproteínas.
5. Describir los principios analíticos para la
determinación del colesterol total, colesterol de
HDL y de LDL, apolipoproteínas y triacilgliceroles
plasmáticos.
6. Calcular la concentración de colesterol de
VLDL y de LDL a partir de las concentraciones
de colesterol total, de colesterol de HDL y
triacilgliceroles.
INTRODUCCIÓN
Los dos lípidos de la sangre con un máximo
interés en el diagnóstico clínico son el
colesterol y los triacilgliceroles (TAG); ambos
se transportan en las lipoproteínas, que son
partículas globulares de alto peso molecular
con un núcleo formado por lípidos
hidrofóbicos ; TAG y ésteres de colesterol; ,
los cuales aportan la mayor parte de la masa
de la partícula, y por una sola capa
superficial de moléculas de fosfolípidos,
colesterol y proteínas o polipéptidos que
rodean al núcleo y estabilizan la partícula
para que permanezca en solución dentro del
plasma. Las lipoproteínas principales que
circulan en el plasma humano son los
quilomicrones, las lipoproteínas de muy
baja densidad (VLDL), las lipoproteínas
de baja
densidad (LDL) y las lipoproteínas de
alta densidad (HDL).
El colesterol es esencial para el
crecimiento y la viabilidad de las células
de los organismos superiores; sin
embargo, los altos niveles de colesterol
sérico son considerados como un
importante factor de riesgo de
enfermedad
y
muerte
porque
contribuyen a la formación de placas
ateroscleróticas. El colesterol se
transporta en la sangre por tres
diferentes lipoproteínas: LDL, HDL y
VLDL. Los estudios epidemiológicos
han establecido con claridad que
mientras mayor sea el valor del
colesterol-LDL mayor será el riesgo de
enfermedad cardiaca aterosclerótica;
por el contrario, mientras mayor sea la
concentración
del
colesterol-HDL
menor será el riesgo de enfermedad
cardiaca coronaria. En otras palabras,
las cifras elevadas de LDL son
aterógenas, en tanto que las de HDL
son protectoras, por lo que el cálculo
del cociente colesterol-HDL/colesterolLDL –que es normalmente de 0.34 ±
0.11– constituye un índice de
aterogenicidad.
En general, se cree que las
lipoproteínas que contienen apoB 100
son potencialmente aterógenas.
162
ALTERACIONES DE LAS LIPOPROTEÍNAS
PLASMÁTICAS Y ATEROGÉNESIS
Desde el punto de vista clínico se ha atribuido a
determinadas lipoproteínas el papel de factores
esenciales directos en el desarrollo o en la
prevención
de
ciertas
enfermedades,
principalmente de tipo vascular. Las anomalías
en el transporte de lípidos ocurren básicamente
en los sitios de producción o en los de utilización
de las lipoproteínas del plasma y provocan varios
tipos de hipo e hiperlipoproteinemias disminución
o elevación de los niveles plasmáticos de
lipoproteínas.
El análisis de las lipoproteínas plasmáticas tiene
valor diagnóstico,
ya
que
permite
el
reconocimiento
de
defectos
primarios
hipertrigliceridemia
e
hipercolesterolemia
familiares, deficiencia familiar de lipoproteína
lipasa o apoproteína CII, etcétera; y es de gran
valor para describir la alteración lipoproteica
subyacente a otro trastorno clínico, como la
diabetes, la obesidad, la hepatitis, el
hipotiroidismo, el consumo de alcohol, el uso de
anticonceptivos orales.
Cabe destacar que la mayor parte de las
hiperlipo-proteinemias, aquellas que consisten
en una elevación de la concentración de
colesterol de LDL, de VLDL y de Lp(a), conllevan
un alto riesgo de producir accidentes cardio y
cerebrovasculares, necrosis o pérdida de la
función en las extremidades, lo cual se debe a
que el colesterol es el agente causal de la
aterosclerosis
subyacente
en
dichos
padecimientos. De ahí el interés actual por el
diagnóstico temprano y el tratamiento de estas
hiperlipoproteinemias.
Se desconoce el mecanismo exacto por el cual
la
hipercolesterolemia
conduce
a
la
aterosclerosis. Sin embargo, se cree que al
alterarse la relación colesterol/fosfolípido que
lleva consigo un incremento en la viscosidad y
maleabilidad de las membranas se inducen
cambios en el endotelio y en los monocitos con
un aumento en su migración y adherencia
probablemente la primera anomalía celular
de la aterogénesis.
Según la hipótesis de respuesta a la
lesión, la más aceptada sobre la
patogénesis de la aterosclerosis,
cualquier lesión en el endotelio o
músculo liso de la pared vascular que
puede
ser
causada
por
la
hipercolesterolemia,
hipertrigliceridemia, el estrés mecánico
de la hipertensión arterial, agresiones
químicas como el
tabaquismo, etcétera altera la relación
existente entre el endotelio vascular, las
células del músculo liso, los monocitos,
los macrófagos, las plaquetas y los
componentes de la sangre circulante,
en particular los lípidos, y genera una
respuesta inflamatoria fibroproliferativa,
con la participación de un gran número
de factores de crecimiento, citocinas y
moléculas vasorreguladoras, que dan
origen a las placas ateroscleróticas.
Por otro lado, se ha observado que las
partículas LDL oxidadas por los
macrófagos lo cual ocurre normalmente
causan lesión al endotelio, lo que
puede ser, de manera particular,
aterógeno. La formación de anticuerpos
contra LDL oxidadas también puede ser
importante en la formación de la placa.
Por tanto, hay un interés clínico cada
vez mayor en la función de los
antioxidantes, como las vitaminas C, E
y el -caroteno. Los estrógenos
también
pueden
actuar
como
antioxidantes en la prevención de
aterosclerosis. Inclusive, se ha visto
que las lipoproteínas HDL tienen
efectos antioxidantes in vitro.
Tradicionalmente, las anomalías de los
lípidos sanguíneos se han valorado con
un examen global de colesterol y TAG.
En la actualidad estos datos son
insuficientes para valorar correctamente
una hiperlipemia, por lo que se deben
163
investigar también las diferentes fracciones
lipoproteicas.
FUNDAMENTO DE LAS DETERMINACIONES
La evaluación de pacientes en los que se
sospecha alguna alteración en los lípidos
plasmáticos puede incluir la medición de
colesterol total y TAG y de una o más
lipoproteínas. Además, la cuantificación de Lp(a),
apoAI y apoB, o la actividad de la lipoproteína
lipasa u otras enzimas, está siendo ampliamente
valorada para incluirla como procedimiento
clínico de rutina.
Determinación del colesterol total. El colesterol
total es igual a la suma del colesterol contenido
en las tres lipoproteínas que lo transportan:
Colesterol total = colesterol VLDL + colesterol
HDL + colesterol LDL
Además, el colesterol existe en el organismo en
dos fracciones: una en estado libre y otra
esterificado –60 a 75%–, por lo que, para la
determinación del colesterol total, se utiliza una
serie de reacciones enzimáticas en donde, en
una primera reacción, los ésteres se hidrolizan
dejando libre el grupo 3-OH del colesterol. En la
segunda reacción este grupo se oxida y se
obtiene, como
un producto, el peróxido de hidrógeno, el cual,
por efecto de la peroxidasa, transfiere uno de
sus oxígenos a un aceptor cromógeno. La
absorbencia del cromógeno 4-benzoquinonamonoimino-fenazona) se determina a 546 nm y
es proporcional a la concentración de colesterol.
La reacción global es la siguiente:
Colesterol esterasa
Ésteres de colesterol
colesterol + ácidos
grasos
Colesterol + O2
Colesterol oxidasa
4-colestoma + H2 O2
Peroxidasa
2 H2O2 + 4-aminoantipirina + fenol
H2O
cromógeno +
Determinación de triacilgliceroles. El
método utilizado se basa en la hidrólisis
de los TAG por una lipasa y la
determinación del glicerol liberado en la
reacción. Para ello, el glicerol es
fosforilado por la glicerol cinasa
formando glicerol-3-fosfato, el cual se
oxida por la glicerolfosfato oxidasa a
dihidroxiacetona fosfato generando en
la reacción peróxido de hidrógeno. La
peroxidasa cataliza la transferencia de
oxígeno del peróxido a un aceptor que
es
cromógeno,
como
la
4aminoantipirina (4-AAP) y el 3,5-dicloro2-hidroxibencensulfonato (DHBS), que
se colorean al oxidarse. La absorbencia
del cromógeno oxidado a 520 nm es
proporcional a la concentración de
TAG.
La reacción completa se expresa:
Lipasa
TAG
glicerol + ácidos grasos
Glicerol cinasa
Glicerol + ATP
glicerol-3-fosfato +
ADP
Glicerolfosfato oxidasa
Glicerol-3-fosfato
+
O2
dihidroxiacetona fosfato + H2O2
H2O2 + 4-AAP + DHBS
oxidado + H2O
Peroxidasa
cromógeno
Determinación de colesterol-HDL. Por regla
general, el análisis de las lipoproteínas del
plasma requiere, primero, la separación de
las clases de lipoproteínas y, segundo, la
medición de la lipoproteína o del
componente lipoproteico de interés.
La determinación es relativamente simple
si se precipitan todas las lipoproteínas que
contienen apoB100 –VLDL, IDL, LDL y
Lp(a)– a excepción de las HDL con un
polianión,
generalmente
glucosaminoglicanos con carga negativa –
164
heparina, dextran o fosfotungsteno– y un catión
bivalente–por lo común, Mn2+ o Mg2+ y se
determina el colesterol-HDL que queda en
solución por el método descrito para el colesterol
total.
La relación colesterol total/colesterol-HDL se
considera como un indicador de riesgo coronario.
Normalmente esta relación es menor de cinco;
mientras menor sea el valor, mejor será el
pronóstico para el paciente.
Determinación de colesterol-VLDL. En general,
la concentración de TAG en el plasma sanguíneo
proporciona un parámetro excelente de la
concentración de las lipoproteínas ricas en TAG
como las VLDL. Esta apreciación parte de que
en condiciones normales de ayuno no se
encuentran quilomicrones en el plasma y la
proporción TAG/colesterol de la VLDL es
invariable –de 5:1 en mg/dl o de 2.2:1 en mmol/l–
, de tal modo que la cuan-tificación de la
concentración de TAG es suficiente para calcular
la concentración de la VLDL con un porcentaje
de error pequeño en la estimación. Si la
concentración de colesterol-VLDL es la quinta
parte de la concentración de TAG cuando ésta
se expresa en mg/dl, entonces:
TAG
Colesterol- VLDL = ----------5
o si las concentraciones se expresan en mmol/l:
TAG
Colesterol- VLDL = ----------2.2
Esta fórmula no es apropiada para muestras con
una concentración de TAG mayor a 400 mg/dl
(10.390 mmol/l) o en muestras que tengan
quilomicrones.
Determinación
del
colesterol
LDL.
Aproximadamente las dos terceras partes del
colesterol plasmático total son transportadas en
las LDL de tal manera que, la concentración de
este lípido proporciona una medida bastante
precisa del nivel de LDL en la mayoría de
las personas. Por ello es posible estimar
con bastanteexactitud, en casi todos los
casos, la concentración de LDL sobre la
base del conocimiento de la concentración
de VLDL (estimada por los TAG) y la del
colesterol total. No obstante, para estimar
con mayor exactitud la concentración de
LDL debe cuantificarse la concentración de
colesterol de las HDL, lo cual es
relativamente simple.
Las LDL se estiman como sigue:
Colesterol LDL = colesterol-total –
(colesterol-HDL + colesterol-VLDL)
Si se determina la concentración de lípidos
en moles en lugar de en peso y se
sustituye el valor estimado de VLDL a partir
de la concentración de TAG, la fórmula
equivalente se transforma en la expresión
descrita por Fridewald (1972):
Colesterol LDL = colesterol
(colesterol HDL + TAG/2.2)
total
–
Otra forma sencilla de determinación
indirecta del colesterol-LDL es el método
del polivinilsulfato (PVS). El PVS provoca la
precipitación de las LDL y deja en el
sobrenadante las VLDL y las HDL. El valor
del colesterol-LDL se calcula restando al
valor del colesterol total (colesterol en
VLDL, LDL y HDL) el valor del colesterol en
el sobrenadante de la precipitación
(colesterol en VLDL y HDL).
Colesterol LDL = colesterol total –
colesterol en el sobrenadante (colesterolHDL y colesterol-VLDL)
La determinación de LDL se puede hacer
directamente
mediante
procesos
inmunoquímicos
que
requieren
una
especial destreza y un equipamiento
específico, por lo que resulta de difícil
adaptación a fines académicos. La técnica
consiste en hacer reaccionar esferas de
165
látex revestidas con anticuerpos contra
apolipoproteínas de las LDL. Estas partículas se
separan del resto y se determina el colesterol.
inmunoanálisis ligado a enzimas y de
fluorescencia (ELISA).
Quilomicrones. Cuando existen quilomicrones
pueden ser detectados si se deja el tubo de
ensayo que contiene el plasma sanguíneo en el
refrigerador
durante
una
noche.
Los
quilomicrones de mayor tamaño, pero no las
VLDL, se ubicarán en la superficie del tubo
formando una capa cremosa que puede
detectarse visualmente. La presencia de
quilomicrones en el plasma en ayunas se
considera anormal.
Material
Determinación de Lp(a). La Lp(a) se determina
directamente por métodos inmunoquímicos al
igual que las LDL y, como ya se dijo, su
concentración constituye un factor independiente
de riesgo coronario. Normalmente la Lp(a) se
precipita junto con las lipoproteínas que
contienen apoB, por lo que la medición del
colesterol de la LDL incluye la contribución de
colesterol de la Lp(a).
Determinación
de apoAI y apoB. La
determinación
de
apolipoproteínas,
particularmente la apoA y la apoB, es un dato
complementario para la cuantificación de otros
componentes lipoproteicos y ayuda a evaluar si
un individuo tiene un riesgo aumentado de
cardiopatía coronaria, sobre todo en los estados
hiperlipidémicos donde hay un aumento de TAG
en los quilomicrones o en las VLDL, y cuando las
LDL y HDL contienen menos cantidad de ésteres
de colesterol y más TAG en su núcleo debido al
intercambio de los componentes de éstos entre
las lipoproteínas. En tales circunstancias, la
cuantificación de las apoproteínas proporciona
cálculos más seguros y útiles de la
concentración de partículas lipoproteicas.
La mayoría de los métodos de
cuantificación, todos los cuales requieren un
equipamiento especial, se basan en la
identificación
inmunológica
de
las
apolipoproteínas. La técnica más usada es el
• Gradilla con 8 tubos de ensayo.
• Pipetas de 5 y 10 ml.
• Pipetas automáticas
• Puntas para pipetas automáticas
•Solución de enzimas para colesterol:
amortiguador Tris 100 mmol/l, pH 7.7;
MgCl2 50 mmol/l, 4-amino-antipirina 1
mmol/l, fenol 6 mmol/l; colesterol esterasa
; 160 U/l, colesterol oxidasa 100 U/l y
peroxidasa 2 000 U/l.
•Patrón de colesterol de 170 ó de 200
mg/dl (5.17 mmol/l) –para colesterol total.
•Solución
de
enzimas para
TAG:
amortiguador Tris 100 mmol/l, pH 6.7, ATP
0.7 mmol/l, MgCl2 4 mmol/l, 4aminoantipirina 0.4 mmol/l, 3,5-dicloro-2hidroxibencen-sulfonato 0.8 mmol/l, lipasa
1 000
U/l; glicerol cinasa 1000 U/l, glicerol
fosfato oxidasa 4000 U/l y peroxidasa 2000 U/l.
•Patrón de TAG (trioleína) de 250 mg/dl
(2.8 mmol/l) o de 100 mg/dl.
•Reactivo precipitante para HDL: sulfato de
dextrán 10g/l, MgCl2 0.5 mol/l.
•Espectrofotómetro a 520 y 540 nm.
•Jeringa, ligadura y torundas con alcohol.
•Gotero con anticoagulante.
Método
1.Obtener plasma de un voluntario. El
plasma
posprandial
contiene
quilomicrones, lo que puede aumentar
marcadamente la concentración plasmática
de TAG, por ello es importante permanecer
en ayunas durante 12 horas antes de la
punción venosa. La estabilidad del plasma
es de 3 días a 4o C.
166
Proceder a determinar colesterol total, TAG y
colesterol-HDL como se describe a continuación
2. A 0.5 ml de plasma agregarle 0.05 ml (50 µl)
de la solución precipitante –de VLDL y LDL–
para determinación de colesterol-HDL; mezclar
perfectamente y dejar reposar 10 minutos.
Centrifugar
10
minutos
a
3 000 rpm. El sobrenadante libre de
lipoproteínas, excepto HDL que continúa siendo
soluble, será utilizado para determinar el
colesterol.
3. Para la determinación de colesterol total y
colesterol-HDL preparar la siguiente serie de
tubos:
Preparación de los tubos (volumen en ml)
Tubo
1
2
3
4
H2O (blanco)
10 µl
-
-
-
Estándar de
-
10 µl
-
-
Plasma
-
-
10 µl
-
Sobrenadante
-
-
-
20 µl
colesterol
con HDL
Agregar a todos los tubos 1 ml de solución de
enzimas para colesterol. Mezclar e incubar a
temperatura ambiente durante 10 min.
4.
Leer
la
absorbencia
(A)
en
el
espectrofotómetro a 520 nm; calibrar a cero con
el blanco.
Para determinar los TAG preparar la siguiente
serie de tubos:
Preparación de los tubos (volumen en ml).
Tubo
1
2
3
Blanco
Estándar
10 µl
de TAG
Plasma
0.01 µl
Agregar a todos los tubos 1 ml de solución
de enzimas para TAG.
Mezclar e incubar a temperatura ambiente
durante 10 min.
4. Leer la absorbencia (A) en el
espectrofotómetro a 540 nm; calibrar a cero
con el blanco.
Resultados
1. De acuerdo al estándar de colesterol,
calcular la concentración de colesterol
correspondiente a los tubos 3 y 4 (tubos
que contienen el plasma y el sobrenadante)
de la siguiente manera:
Cs
[Colesterol] = ------ X Ap
As
Cs = Concentración del estándar en mg/dl
o mmol/l.
As = Absorbencia del estándar.
Ap = Absorbencia del problema.
2.
Calcular la concentración de TAG de
la siguiente manera:
Cs
[Triacilgliceroles] = ------ X Ap
As
Cs = Concentración del estándar en mg/dl
o mmol/l.
As = Absorbencia del estándar.
Ap = Absorbencia del problema.
3. Compare sus resultados con los valores
normales del colesterol total, del colesterolHDL y de los triacilglicéridos en el plasma.
4. Calcular la concentración de colesterol
VLDL por la fórmula: colesterol-VLDL=
TAG/5.
167
5. Calcular la concentración de colesterol LDL a
partir de las concentraciones de colesterol total,
HDL y VLDL.
6. Estimar el cociente colesterol-HDL/colesterolLDL y de colesterol total/colesterol-HDL (índices
aterogénicos).
7. Analizar el significado de los datos obtenidos y
hacer un informe de los resultados y de las
conclusiones que de éstos se deriven.
8.
A continuación se resumen dos casos
clínicos:
En enero de 1997, un hombre de 38 años
asistió a una evaluación médica. Pesó 93 kg,
tenía presión arterial alta –160/108–, realizaba
poco ejercicio, tomaba de 5 a 10 cervezas y
fumaba 2 a 3 cajetillas de cigarros a la semana.
El peso y las concentraciones de los lípidos
durante los meses siguientes están resumidos
en la tabla siguiente:
B) Una mujer de 23 años de edad solicita una
determinación de lípidos debido al
antecedente familiar importante de
cardiopatía. La paciente no fuma y pesa
55 kg. Los resultados de la determinación
de los lípidos iniciales después de un año
y tres meses de haber iniciado la
administración de anticonceptivos orales
–desogestrel–, son los siguientes:
Ene
97
55
total 285
Peso (kg)
Colesterol
mg/dl
TAG mg/dl
HDL mg/dl
Colesterol-VLDL
LDL mg/dl
Colesterol
total/colesterol-HDL
(indice aterógeno)
85
40
Ene
98
56
263
Abr
98
58
315
90
37
124
44
• Completar los datos que hacen falta en
los cuadros anteriores (tomar en cuenta
que no puede hacerse el cálculo de la
concentración de VLDL si los TAG son
mayores de 400 mg/dl).
• Constatar la evolución temporal de los
niveles de colesterol y TAG.
• Detectar la presencia de hábitos de alto
riesgo y hacer notar la importancia de las
modificaciones en esos hábitos.
• Al ser iguales todos los factores de riesgo
para ambas personas: ¿cuál tendría mayor
riesgo de enfermedad coronaria?
• Detectar cómo dos personas con el
mismo colesterol total tienen perfiles
lipídicos distintos.
Ene 97
Oct 97
Feb 98
Peso (Kg)
93
90
95
Colesterol total mg/dl
275
295
320
TAG mg/dl
490
470
550
HDL mg/dl
35
33
29
LDL directa mg/dl
-
-
259
Colesterol
-
-
-
total/
colsterol-HDL
(índice aterógeno)
Referencias
1.Allain CA, Poon LS, Chan CSG,
Richmond
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Fu
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Enzymatic
determination of total serum cholesterol.
Clin Chem. 1974; 20: 470-475.
2.Montgomery R. Bioquímica. Casos y
texto. 6a.ed. Barcelona: Editorial HarcourtBrace; 1998: 332-389.
3. Pennachio D. Lineamientos para la
detección de hipercolesterolemia. Atención
Médica. 1997; 10/2: 30-43.
4.Alba Zayas EL, Pereira RG, Aguilar BA.
Lipoproteína (a): estructura, metabolismo,
genética y mecanismos patogénicos. Rev
Cubana Invest Biomed. 2003; 22(1): 32-40.
5.
Masa-aki K, Rader JD. Gene therapy
for lipid disorders. Curr Control Trials
Cardiovasc Med. 2000; 1:120-127.
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6.
Russet
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Dextran
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precipitation procedure for quantitation of HDL
cholesterol. Clin Chem. 1982; 28(6): 1379-88.
7.Samaniego V, López D. Lípidos. Sinopsis del
informe del panel de expertos sobre niveles de
colesterol sanguíneo en niños y adolescentes.
Aterosclerosis. 1999; 2(1): 22-24.
8.Vogel AA. Coronary risk factors, endothelial
function, and atherosclerosis. Clin Cardiol. 1997;
20:426-432.
9. Velázquez CA. Papel de las especies
reactivas del oxígeno en la arterioesclerosis.
IATREIA. 2000; 13 (3) septiembre.
10. Mohammed HM, Frohlich J. Effects of dietary
phytosterols on cholesterol metabolism and
atherosclerosis:
clinical and experimental
evidence. Am J Med. 1999; 107: 588-592.
169
Práctica 11
El efecto del tetracloruro de carbono sobre
las transaminasas
Tiempo de Práctica: 2 Horas
Esta práctica es una simulación
compuratizada
de
un
fenómeno
bioquímica; tiene el propósito de que los
alumnos se ejerciten en el manejo de los
datos
obtenidos
por
medio
de
experimentación simulada estrictamente
controlada.
Método
1. Encender la computadora y localizar el
icono del programa. El efecto de la
insulina sobre la glucemia de la rata.
Hacer doble clic sobre este icono.
2. Hacer clic sobre los botones que
indican cada de las partes de la práctica;
empezar por leer las instrucciones, los
objetivos y el fundamento de la práctica
para continuar con la parte experimental.
3. Seguir todos los pasos de la práctica;
poner especial atención en la obtención
de los datos
experimentales
que
deberán
ser
anotados en papel como cualquier
práctica convencional.
4. Repetir el experimento las veces que
el usuario quiera, o las veces que sean
necesario, hasta obtener los datos
completos del experimento. Se sugiere
repetirlo por lo menos dos veces y hacer
un promedio de los datos obtenidos.
5. Hacer una tabla con dichos datos,
graficarlo, analizar el significado de los
mismos y, de acuerdo a lo anterior,
validar o rechazar la hipótesis del
experimento.
Referencias
1. Stryer L. Bioquímica. 5a. ed.
Barcelona: Editorial Reverté; 2003.
2. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto
con aplicaciones clínicas. 5a. ed.
Barcelona: Editorial Reverté; 2001.
3. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de
bioquímica. 4a. ed. Barcelona: Ediciones
170
Práctica 12
Estudio de los productos finales
del metabolismo nitrogenado
Tiempo de práctica: 2 horas
Objetivos
1. Identificar los sustratos, enzimas y
productos finales del catabolismo de los
compuestos nitrogenados.
2. Identificar al amoníaco y a la urea como
los productos finales del metabolismo de las
proteínas y los aminoácidos.
3. Identificar a la creatinina y al ácido úrico
como
productos
mayoritarios
del
metabolismo
de
otros
compuestos
nitrogenados.
4. Conocer las causas y consecuencias de la
sobreproducción de los productos finales del
metabolismo nitrogenado.
5. Conocer las técnicas analíticas y los
requerimientos para la determinación de los
principales
productos
finales
del
metabolismo nitrogenado en suero y/o orina.
6. Llevar a cabo las determinaciones
analíticas de urea, creatinina y ácido úrico en
suero o plasma e interpretar los resultados
obtenidos.
INTRODUCCIÓN
Las proteínas de la dieta son la fuente
primaria de nitrógeno en el cuerpo. Los
aminoácidos producidos por la digestión de
proteínas son absorbidos a través del
epitelio intestinal y entran a la circulación
portal.
Las
células
incorporan
los
aminoácidos, los cuales son usados para la
síntesis de proteínas y otros compuestos
nitrogenados o son oxidados para producir
energía.
Los compuestos derivados de aminoácidos,
además de las proteínas celulares, incluyen
hormonas (como la tiroxina, epinefrina e
insulina),
neurotransmisores,
creatina
fosfato, el hemo de la hemoglobina y de los
citocromos, el pigmento de la piel (la
melanina), las purinas y las pirimidinas,
etanolamina, colina, esfingosina, el glutatión,
los ácidos glicocólico y taurocólico, la
tioetanolamina de la CoA, el óxido nítrico y
las poliaminas entre muchos otros. Se puede
decir
que
todos
los
compuestos
nitrogenados del organismo son sintetizados
a partir de aminoácidos.
Los aminoácidos son fuente de energía, sus
esqueletos de carbono son directamente
oxidados o convertidos a glucosa y ésta es
oxidada o almacenada en forma de
glucógeno. Los aminoácidos también
pueden ser convertidos en triacilgliceroles
para ser almacenados en el tejido adiposo.
A pesar de la uniformidad de los
aminoácidos como bloques estructurales de
las proteínas, no existe un planteamiento
unitario en cuanto a su metabolismo, ya que
su estructura hidrocarbonada es diversa y,
aunque
algunos
de
ellos
pueden
interconvertirse
mediante reacciones
metabólicas, cada uno es un compuesto
único, con un metabolismo y funciones
biológicas individuales. Quizá la parte de su
metabolismo más uniforme sea el destino de
su parte nitrogenada. El nitrógeno se libera
como amoníaco, cuya mayor parte se
convierte en urea, un compuesto no tóxico,
muy soluble en agua, que se excreta
fácilmente por los riñones.
171
La síntesis se realiza principalmente en el
hígado, donde se lleva a cabo la mayor parte
de la biosíntesis de aminoácidos no
esenciales y
gran parte de la degradación de todos los
aminoácidos.
EL NITRÓGENO NO PROTEÍNICO EN LA
SANGRE
El nitrógeno no proteínico en la sangre se
encuentra en un grupo heterogéneo de
sustanciasque incluye la urea, la creatinina,
la creatina, el ácido úrico, los aminoácidos
no proteicos ornitina y citrulina, algunos
péptidos como el glutatión y otros, con una
concentración total de nitrógeno de 25 a 40
mg/dl. La urea es el principal compuesto
nitrogenado no proteico del plasma, otros
constituyentes
principales
en
orden
decreciente de contribución de nitrógeno son
los aminoácidos, el ácido úrico,
la
creatinina, la creatina y el amonio.
Las cantidades exactas de cada componente
varían según la ingesta de proteínas y el
estado fisiológico del organismo.
Aunque la urea es el mayor producto final
del metabolismo nitrogenado, el nitrógeno es
también excretado en otros compuestos: la
creatinina es producida a partir de la creatina
fosfato, el ácido úrico a partir de la
degradación de las bases púricas y el
amonio es liberado por la glutamina,
particularmente en el riñón como una vía de
excreción de H+ por la orina. Otros
productos nitrogenados derivados del
metabolismo
de
neurotransmisores,
hormonas
y
demás
compuestos
especializados son excretados también por
la orina aunque representan una mínima
parte del nitrógeno eliminado. Algunos de
estos productos, como la bilirrubina (formado
en la degradación del grupo hemo), son
excretados principalmente en las heces.
Azoemia es una designación bioquímica que
se refiere a cualquier aumento de la
Concentración
Cantidad
Nitrogenado
Compuesto
Plasmática
Excretada
Urea
20-30 mg/dl
Ácido úrico
3-6 mg/dl
12-20 g de
nitrógeno
ureíco
250-750 mg
Creatinina
1-2 mg/dl
En orina/dÍa
Hombres:14-26
mg/Kg
Mujeres:11-20
mg/Kg
NH4+
10-70 µl/dl
140-1500 mg de
nitrógeno de
amonio
concentración plasmática de compuestos
nitrogenados no proteicos, principalmente
urea y creatinina.
Material
• 3 Gradillas con 2 y 3 tubos.
• y Pipetas automáticas
• Puntas para pipetas automáticas
• 3 Pipetas de 1 ml.
• Suero y orina.
• Estándar de urea 50 mg/dl.
• Estándar de creatinina 2 mg/dl.
• Estándar de ácido úrico 5.3 mg/dl.
• Espectrofotómetro a 340, 492 y 520 nm.
UREA DE LA SANGRE O NITRÓGENO DE LA UREA
DE LA SANGRE (BUN-BLOOD UREIC NITROGEN)
La urea es el principal producto final del
catabolismo proteínico. Se forma en el
hígado y en el riñón a partir de bióxido de
carbono y amoniaco en el ciclo de la urea.
La expresión "nitrógeno ureico" surge del
hecho de que tradicionalmente la urea se
determina a partir del nitrógeno contenido en
el amoniaco que se forma por la acción de la
enzima ureasa sobre la urea. Aunque es un
término similar, no es equivalente al de urea,
172
y se puede establecer una correlación entre
ambos mediante la expresión: urea (mg) =
nitrógeno ureico (mg) x 2.14 (el peso
molecular de la urea es de 60 e incluye 2
átomos de nitrógeno por molécula. Por lo
tanto el BUN = 60/28= 2.14). Por ello un
valor de BUN de 20 mg/dl equivale a una
urea de 20 x 2.14 ó 42.8 mg/dl.
La concentración sérica de urea varía
bastante en los individuos normales y
depende de factores tan diversos como la
ingesta dietética de proteínas y el estado de
hidratación del organismo.
La elevación de sus valores en el torrente
circulatorio se denomina uremia. Los
síntomas clínicos pueden presentarse con
valores cercanos a 50 mg/dl (>8 mmol/l). El
catabolismo proteínico rápido y el deterioro
de la función renal son las principales
causas de su elevación.
La urea se filtra normalmente libre a través
de los glomérulos renales de modo que, una
pequeña cantidad se absorbe en los túbulos
y el resto se excreta en la orina. Sin
embargo, el cambio en la concentración de
la urea sanguínea no es indicativo de una
causa determinada ya que muchas
enfermedades pueden provocar alteraciones
en su concentración. Las modificaciones en
la concentración de urea sérica suelen
clasificarse por su origen en prerrenales,
renales o postrenales.
Las causas prerrenales pueden agruparse
en factores que resultan de perfusión renal
inadecuada y, por tanto, de una menor
filtración glomerular (deshidratación, shock,
disminución del volumen sanguíneo y fallo
cardiaco congestivo) o trastornos resultantes
de valores anormalmente altos de proteínas
sanguíneas. La ingestión excesiva de
proteínas y el incremento del catabolismo de
las proteínas (fiebre, estrés y quemaduras)
son otras causas adicionales del incremento
de urea sérica.
Las causas renales son aquellas con
alteración de la filtración glomerular y, por
tanto retención de urea como consecuencia
de una enfermedad renal crónica o aguda.
Por último, las causas posrenales se deben
a padecimientos que causan obstrucción de
las vías urinarias inferiores, con paso de la
urea de la orina estancada a la circulación
sanguínea.
También son significativos los valores bajos
de urea en la enfermedad hepática grave, ya
que un hígado lesionado es incapaz de
sintetizar urea, lo cual permite la
acumulación de amonio en la sangre
causando encefalopatía hepática (asterixis,
ataxia, coma, confusión, estupor, lenguaje
lento y somnolencia).
La determinación de urea, por sí sola, es de
poco valor diagnóstico, y deben realizarse
valoraciones comparativas a lo largo del
tiempo o utilizarse conjuntamente con otras
pruebas.
La determinación de urea se basa en la
acción de la enzima ureasa sobre la urea
para producir amoniaco y ácido carbónico. El
amonio formado se valora haciéndolo
reaccionar con ácido -cetoglutárico en
presencia de la glutamato deshidrogenasa.
La disminución de la absorbencia frente al
tiempo ( Absorbencia) a 340 nm,
correspondiente a la oxidación de NADH a
NAD+, es proporcional a la concentración de
urea.
Urea + H2O + 2 H+
2 NH4+ + CO2
2 NH4+ + 2 α-cetoglutarato + 2 NADH
H2O + 2 NAD+ + 2 glutamato
Método
Como la urea es degradada rápidamente por
acción bacteriana, las muestras tomadas
para proceder a su determinación deben ser
refrigeradas hasta su procesamiento.
173
Pipetear en los siguientes tubos:
Tubo
Muestra
(suero, plasma u
orina
Estándar
1
2
-
10 µl
-
10 µl
Solución reactiva
1 ml
1 ml
para urea
Mezclar y poner en marcha el cronómetro,
anotar las absorbencias a los 30 (A1) y a los
90 (A2) segundos, calcular: ∆ = A1 - A2.
Leer frente a agua destilada en el
espectrofotómetro a 340 nm.
Con las diferencias de absorbencia
anotadas (A), aplicar la siguiente ecuación:
∆A Muestra
X [Estándar] =
[Urea]
∆A Estándar
El resultado se obtiene en mg/dl (x 0.1665 =
mmol/l); mg/dl de urea x 0.466 = mg/dl de
urea /BUN.
El método es lineal hasta valores de 500
mg/dl.
Diluir la orina 1:50 con agua destilada.
No emplear suero o plasma turbios o
hemolizados.
AMONIO
La producción de urea es un medio de
destoxificación del amonio derivado del
catabolismo proteico, de la flora intestinal y
de la desaminación oxidativa de los
aminoácidos.
El intestino es una fuente importante de
amonio, en donde se forma por degradación
bacteriana de las proteínas de la dieta y de
la urea. La mayor parte de este amonio es
separado de la sangre de la vena porta por
el hígado para ser convertido en urea.
En otras condiciones, las pequeñas
cantidades de amonio que escapan a la
destoxificación y a la excreción renal, se
encuentran presentes en la sangre; la
concentración normal del nitrógeno del suero
debido al ion amonio suele ser menor de 70
mg/dl.
En vista de la toxicidad del amonio, una
elevación apreciable de los niveles de
amoníaco en sangre podría afectar
seriamente el equilibrio ácido-base y a la
función cerebral.
Las hepatopatías graves traen como
consecuencia
un
aumento
de
la
concentración del amonio en la sangre, el
plasma y el líquido cefalorraquídeo. Las
enfermedades hepáticas en las que se
encuentran tales elevaciones tienen muy mal
pronóstico, ya que indican lesión intensa del
hígado con inminente insuficiencia hepática,
la cual va acompañada de diversas
manifestaciones tóxicas, particularmente en
el cerebro.
Las deficiencias de cualquiera de las
enzimas del ciclo de la urea, aunque muy
poco frecuentes, son todas ellas causas
importantes de incremento de los niveles
plasmáticos de amoníaco y de las
manifestaciones tóxicas.
En las acidosis metabólicas, la excreción
renal del ión amonio (por la hidrólisis de
glutamina) aumenta porque el riñón lo
secreta para eliminar junto con él protones
en la orina.
Las muestras para la determinación del
amonio deben obtenerse de preferencia de
sangre arterial o de los capilares del lóbulo
auricular, ya que el metabolismo del amonio
en el músculo aumenta los valores de éste
en sangre venosa y, por lo tanto, también el
ejercicio puede causar un aumento en la
concentración de amoníaco. La muestra de
sangre recién obtenida se debe vaciar en un
tubo refrigerado, colocarse en agua helada y
enviarse de inmediato al laboratorio para su
análisis (el retraso en el procesamiento
puede ocasionar resultados falsamente
elevados).
174
Los niveles de amoníaco varían con la
ingestión de proteínas.
Este compuesto es principalmente excretado
por la orina pero también hay pérdidas
importantes por las heces y la piel.
La medición de amonio se basa en el mismo
principio que la determinación del nitrógeno
de la urea.
CREATINA Y CREATININA
Estas sustancias nitrogenadas no proteicas
junto con la urea pueden ser consideradas
en su conjunto porque las concentraciones
que
alcanzan
en
el
suero
muy
frecuentemente
se
ven
afectadas
simultáneamente en cualquiera de las dos
direcciones (aumento o disminución) por los
mismos factores.
La creatina es sintetizada en el hígado y en
el riñón a partir de tres aminoácidos:
arginina, glicina y metionina en forma de Sadenosilmetionina. La creatina así formada
es transportada a los músculos por la
sangre, donde es fosforilada hasta formar
fosfato de creatina, compuesto de gran
importancia como fuente de energía para la
contracción muscular intensa durante breves
periodos. Normalmente, la fosfocreatina se
desdobla en creatinina. En algunos
padecimientos,
en
particular
las
enfermedades musculares, se libera creatina
en cantidades mayores a la circulación y se
puede determinar en la orina.
La creatinina se forma de manera continua
en los músculos a partir del fosfato de
creatina; alrededor de 2% de la creatina se
convierte directamente en creatinina; posee
gran difusibilidad y es fundamentalmente
excretada por los riñones, además de las
pequeñas cantidades que se eliminan por
heces.
La concentración sérica de creatinina es
relativamente constante en virtud de su
relativa independencia de factores como la
dieta (ingesta de proteínas), grado de
hidratación o metabolismo de proteínas,
siendo la masa muscular el factor
condicionante más directo de su formación y
excreción total por día.
La depuración de la creatinina es una prueba
rutinaria de elección por la facilidad con que
se practica. No es, sin embargo, una medida
real de la filtración glomerular, ya que una
pequeña parte de la creatinina se secreta a
nivel tubular. A pesar de ello es una prueba
adecuada para seguir la evolución de los
padecimientos que afectan al glomérulo.
Debido a que el riñón la excreta continua y
fácilmente, los valores aumentados en suero
y disminuidos en orina indican disminución
en la velocidad de filtración glomerular.
Por consiguiente, la creatinina es un
indicador muy específico de la función renal.
La variación diurna de la creatinina puede
estar relacionada con los alimentos, con
valores mínimos que se presentan alrededor
de las 7:00 horas y valores máximos
alrededor de las 19:00 horas. Por tanto, esta
prueba realizada con un espécimen urinario
recolectado en 24 horas refleja tanto los
valores máximos como los mínimos de
creatinina. Las mediciones de creatinina se
hacen en suero y en orina de 24 horas.
La recolección de orina debe ser de
preferencia en un periodo de 24 horas, pero
esto no es necesario si se conoce el tiempo
de la recolección con exactitud, aún si es
menor, por ejemplo 22 ó 4 horas.
La medición se basa en la reacción de Jaffé,
en la que la creatinina se trata con solución
alcalina de picrato (17.5 mmol/l) para
producir un complejo de color naranja rojizo
brillante. Hay varias sustancias en el suero y
orina que actúan como cromógenos
inespecíficos (glucosa, proteínas y otros
cromógenos no derivados de la creatinina),
lo que representa un problema para la
determinación. Por este motivo se adapta la
reacción de Jaffé a un método, que consiste
en medir el cambio en la absorbancia
durante un breve período de tiempo. La
medida del incremento de color al inicio de la
175
reacción
valorará
principalmente
la
creatinina, ya que ésta reacciona más
rápidamente con el picrato alcalino que los
otros
cromógenos
inespecíficos.
El
incremento de color detectado al poco
tiempo de iniciarse la reacción será debido
únicamente a la concentración de la
creatinina presente y, por tanto, no valorará
las posibles interferencias.
Método
Pipetear en los siguientes tubos:
TUBO
MUESTRA
ESTANDAR
SOLUCION
REACTIVA DE
CREATININA
1
100 µl
1 ml
2
100 µl
1 ml
Mezclar y poner en marcha el cronómetro,
anotar las absorbancias a los 30 (A1) y a los
90 (A2) segundos, calcular: ∆ = A2 -A1.
Leer en el espectrofotómetro frente a blanco
de reactivos a 492 nm.
Cálculos:
Con las diferencias de absorbencia anotadas
(A), aplicar la siguiente ecuación:
∆A MUESTRA
------------------- X [ESTANDAR] = [CREATININA]
∆A ESTANDAR
El resultado se obtiene en mg/dl
mg/dl Creatinina x 88.4 = mmol/l.
No utilizar sueros lipémicos.
La creatinina tiene una estabilidad de menos
de 24 horas en refrigeración.
El método es lineal hasta valores de 15
mg/dl.
Diluir la orina 1:50 con agua destilada.
ÁCIDO ÚRICO
la xantina oxidasa en una reacción que
requiere de oxígeno molecular.
En animales inferiores, el ácido úrico es
oxidado por acción de la uricasa y se
transforma en alantoína, que es su producto
de excreción. Algunos peces excretan ácido
alantoico; los anfibios y peces, urea; y
finalmente, los invertebrados marinos,
amonio.
La cantidad de ácido úrico formado depende
de la velocidad del catabolismo de las
purinas endógenas y de la degradación de
las purinas provenientes de la dieta. El
aumento del nivel de ácido úrico en la
sangre puede deberse a un aumento en el
metabolismo de purinas endógenas, una
disminución en la eliminación de ácido úrico,
un aumento en la ingestión de purinas o a
una reutilización disminuida de purinas.
La medición del ácido úrico del suero es muy
útil para el diagnóstico de la gota, que es un
síndrome provocado por la acumulación de
cristales de ácido úrico en las articulaciones
y el riñón.
El método de determinación de ácido úrico
consiste en incubar el suero con uricasa, que
cataliza la hidrólisis específica de ácido úrico
a alantoína. En una reacción catalizada por
la peroxidasa (POD), el peróxido de
hidrógeno formado en la reacción anterior
oxida al indicador (ácido 2,4,6-tribromo-3ácido hidroxibenzoico y 4-aminoantipirina,
compuestos que son incoloros en su forma
reducida.) originando un derivado colorido
(quinoneimina). La intensidad del color es
proporcional a la concentración del ácido
úrico en la muestra; se mide en el
fotocolorímetro a 520 nm.
El ácido úrico es el producto final del
catabolismo de las purinas en el hombre y se
forma a partir de la xantina, por la acción de
176
Método
Pipetear en los siguientes tubos:
TUBO
MUESTRA
ESTANDAR
SOLUCION
REACTIVA DE
ACIDO URICO
1
100 µl
1 ml
2
100 µl
1 ml
Mezclar e incubar 10 min. a temperatura
ambiente.
Leer
la
absorbencia
(A)
en
el
espectrofotómetro frente a blanco de
reactivos a 520 nm.
La estabilidad del suero es de 3 días en
refrigeración.
Cálculo de la concentración de ácido úrico:
5. D’Ocon, C. Fundamentos y técnicas
de
análisis
bioquímico.
Editorial
Paraninfo; 1998.
6.
Chernecky CC. Pruebas de laboratorio
y procedimientos diagnósticos. 2a. ed.
México:
McGraw-Hill
Interamericana
Editores; 1999.
7. Gaw A. Bioquímica clínica. 2a. ed.
Editorial Harcourt; 2001.
MUESTRA
------------------- X [ESTANDAR] = [ACIDO URICO]
ESTANDAR
El método es lineal hasta valores de 25
mg/dl.
Expresar el resultado obtenido en mg/dl y
mmol/L (peso molecular del ácido úrico
168.1).
Compare sus resultados con los valores
normales de ácido úrico en suero.
Referencias
1.
González de Buitrago JM. Bioquímica
clínica. México: McGraw-Hill Interamericana
Editores, 1999.
2.
Fossati P. Use of 3,5-dichloro-2hydroxy-benzensulfonic
acid/4aminophenazone chromogenic system in
direct enzymic assay of uric acid in serum
and urine. Clin Chem. 1980;26:227.
3.
Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto
con aplicaciones clínicas. 4a. ed. Barcelona:
Editorial Reverté; 2004.
4.
Montgomery R. Bioquímica: Casos y
texto. 6a. ed. Barcelona: Editorial HarcourtBrace; 1998.
177
Práctica 13
Huella génica
Objetivos
1. Que el estudiante conozca la aplicación de
las técnicas de DNA recombinante.
2. Que el estudiante sea capaz de analizar e
interpretar los datos generados a partir de una
prueba de huella génica.
3. El alumno adquirirá la capacidad de
manejar muestras para análisis de ácidos
nucleicos.
4. El alumno desarrollará destreza en
la
interpretación
de
resultados
de
metodologías básicas de análisis molecular.
FUNDAMENTO
El DNA es un polímero lineal formado
por desoxirribonucleótidos que contienen a las
bases nitrogenadas
adenina,
guanina,
citosina, timidina. La interacción de las bases
nitrogenadas por puentes de hidrógeno
permite la formación de la doble cadena de
DNA. Cada grupo fosfato está unido al
carbono 5´ de una subunidad de azúcar y al
carbono 3´ de la subunidad de azúcar del
nucleótido contiguo.
Las cadenas se mantienen unidas por
puentes de hidrógeno entre las bases. Las
cuales son completamente lineales.
En la molécula de DNA que reside la
información genética de un organismo,
específicamente en la secuencia de los
nucleótidos, de tal manera que cada tres
bases forman un codón que corresponde a su
vez a uno de los 20 aminoácidos, teniendo un
total de 64 codones posibles, los cuales
conforman el código genético. En el DNA se
encuentran dos tipos de secuencia, la que es
capaz de ser leída para dar origen a una
proteína lo que permite que una célula u
organismo crezca desarrolle también la no
codificante una que codifica para las
funciones celulares y otra no codificante, que
participa en la regulación de su expresión.
Algunas de las secuencias de nucleótidos no
codificantes se caracterizan por ser cortas,
están alineadas en tándem y se repiten miles
de veces de manera constante a lo largo del
DNA. Un ejemplo de esta secuencia puede
ser
la
siguiente.
estas
ATTCGGTATTCGGTATTCGGT. A
secuencias se les denomina STR por sus
siglas en inglés (Short Tandem Repeat). El
genoma eucariótico contiene muchas de estas
secuencias de DNA, y se ha visto que el
número de unidades repetidas presenta
diferencias de individuo a individuo que con
las huellas digitales. En el caso de gemelos
idénticos estas secuencias son idénticas.
Estas regiones pueden ser aisladas del DNA
con enzimas de restricción apropiadas y
separadas de acuerdo a su longitud mediante
electroforesis en gel. Cuando se completa el
proceso de separación el resultado se parece
a un código de barras de un envase de
supermercado. Este código de barras de DNA
ha permitido esclarecer algunos hechos
criminales y pruebas de paternidad, a la cual
se denomina técnica de “Huella génica”
Es muy frecuente que en la escena de
un crimen se encuentren, en pequeñas
cantidades muestras de naturaleza biológica a
partir de las cuales se puede extraer el DNA
como son la sangre, la saliva, la piel, el
músculo, el cabello, el semen, los dientes y el
hueso, entre otros.
Un método que permite tomar una
pequeña cantidad de DNA y en pocas horas
sintetizar millones de copias de una porción,
es el método de amplificación conocido como
PCR (reacción en cadena de la polimerasa),
el cual se desarrollo por K. Mullis (1990), En
este método se requiere conocer la secuencia
de nucleótidos de los extremos del fragmento
que se desea amplificar. Estas secuencias se
usan para diseñar desoxioligonucleótidos
sintéticos de DNA complementarios a cada
uno de estos extremos de la cadena de la
doble hélice. La muestra de DNA se coloca en
una solución que contiene una DNA
polimerasa,
grandes
cantidades
de
desoxinucleótidos y los desoxioligonucleótidos
sintetizados previamente. El método se basa
en la repetición cíclica de tres reacciones
178
sucesivas: en la primera reacción, la solución
se calienta para que el molde de DNA se
separe en sus dos cadenas. En la segunda
reacción, la temperatura se reduce para
permitir que los desoxioligonucleótidos se
apareen por complementariedad de bases
con el DNA molde y en la tercera reacción, la
DNA
polimerasa
cataliza
la
síntesis
simultánea de las dos cadenas a partir de
cada desoxioligonucleótido que actúa como
cebador. Al cabo del primer ciclo de tres
reacciones, el fragmento de DNA elegido se
ha duplicado y por lo tanto, la cantidad de
DNA molde disponible para el segundo ciclo
es doble, lo mismo ocurre cada ciclo de
duplicación.
La obtención de múltiples copias requiere 20
a 40 veces la repetición de los ciclos. El éxito
de esta técnica radica en el uso de una DNA
polimerasa termoestable, que no se
desnaturaliza por los repetidos ciclos de
calentamiento. Esta enzima se aisló
originalmente de la bacteria termófila Thermus
aquaticus.
La base de la técnica conocida como
huella génica se basa en las diferencias
individuales de estas secuencias. Esto,
generalmente se trata de cambios en un solo
par de bases pertenecientes a diferentes
individuos, que se presentan una vez cada
500 a 1,000 pares de bases, como promedio.
forense. Acta Científica Venezolana. 50: 2428, 1999.
Andréa Carla de Souza Góes, Dayse
Aparecida da Silva, Cristiane Santana
Domingues, Joáo Marreiro Sobrinho, Elizeu
Fagundes de Carvalho. Identification of a
criminal by DNA typing in a rape case in Rio
de Janeiro, Brazil. Sáo Paulo Medical Journal.
Revista Paulista de Medicina. 120 (3): 77-80,
2002.
Centre for
Genetics Education. Genetic
Testing and Screening II –Forensic and Other
Applications. Directory of Genetics Support
Groups, Services and Information. Genetics.
235-239, 2004-2005.
Jeffreys Alec Genetic Fingerprinting Naure
Medicine Vol 11(10).1035-1039. 2005.
Mullis K.B the Unusual Origen of the
Polymerase Chain Reaction Science Am. 262
(4) 56-65. 1990.
Referencias
Curtis, H; Barnes, N; Biología. Sexta edición.
Editorial Médica Panamericana.
Lewin, B; Genes VI. Editorial Oxford.
Nelson, D; Cox, M; Lehninger. Principios de
Bioquímica. Tercera edición.
Ediciones
Omega.
Yuri Sivolap, Ph.D., G. Krivda, Ph.D., N.
Kozhuhova., S. Chebotar., and Mark Benecke,
PH.D. A Homicide in the Ukraine. DNA-based
identification of a Boiled, Skeletozined, and
Varnished Human Skull, and of Bone
Fragments Found in a Fireplace. The
American jouenal of Forensic Medicine and
Pathology. 22 (4): 412-414 ,2001.
Lennie Pineda Bernal. El análisis de DNA
para pruebas de paternidad e identificación
179
SESIÓN 1 DE LABORATORIO PARA LA
PRÁCTICA DE HUELLA GÉNICA
ESCENA DEL CRIMEN
El crimen se lleva a cabo en la calle Lago
Manitoba No. 520, Col. Ampliación Granada,
Delegación Miguel Hidalgo, en el sofá de la
sala se encuentra el cuerpo de la dueña de la
casa, una mujer de 42 años de edad. El
cadáver presenta signos de estrangulamiento
pero sin marcas de sogas o cinturones;
tampoco se encuentran huellas digitales en su
cuello. La víctima presenta una lesión
defensiva en el brazo derecho con arma
punzo cortante. En el sofá se observan varias
manchas de sangre, algunas de ellas secas.
Las más abundantes todavía están frescas.
Se ignora si la sangre pertenece a la víctima o
a sus agresores.
El laboratorio forense se encarga de recopilar
la información de la escena dando a conocer
los siguientes aspectos: el cuerpo de la
víctima se descubrió 20 minutos después del
asesinato. Presentaba con un golpe en la
cabeza, presenta señales de forcejeo en su
brazo y debajo de las uñas se encuentran
depositados restos de piel, sangre, y de
cabellos. Algunos de ellos presentan folículos.
Todo señala que la víctima forcejeó con su o
sus agresores.
En el lugar también se halló un florero con
restos de sangre, la cual no se sabe si
corresponde a la de la víctima o a los
agresores. En un extremo del sofá se
encuentra una pieza dental y, debido a que la
víctima conserva su dentadura completa, es
probable que el diente sea del victimario. En
el brazo izquierdo, la victima presenta varias
mordidas, algunas con sangre coagulada y
otras con restos de saliva mezclados con
sangre.
En el interior de la casa faltan algunas piezas
de valor, lo que sugiere que el móvil fué el
robo.
La policía cuenta con varios sospechosos,
entre los que se encuentra el esposo, con el
cual la víctima tuvo una discusión la noche
anterior. Se desconoce el tema de la
discusión y el paradero el esposo. Otros
sospechosos son los dos repartidores del gas
que una hora antes habían proporcionado el
servicio. Uno de ellos tiene problemas con la
dentadura y aclara que se encuentra en
tratamiento dental, ya que ha presentado
sangrado y pérdida de algunas piezas
dentales. Los otros sospechosos son los dos
empleados de la casa, el jardinero que tiene
una antigüedad de 4 años y presenta una
lesión en el brazo que confiesa se hizo
arreglando el jardín y la cocinera quien tiene
sólo 3 meses laborando en la casa.
Con esta evidencia se compara el DNA de
cada sospechoso para encontrar al culpable
o culpables del crimen, por lo que debe
determinar si las muestras de sangre,
cabellos, pieza dental y saliva sirven para
estudiar
el
DNA y establecer las
características que permiten utilizar alguna o
todas las muestras para el estudio.
Cada equipo debe escoger alguna de las
evidencias previamente descritas y justificar
su elección.
Para realizar la comparación entre el DNA
encontrado en la escena con el DNA de los
sospechosos deben contarse con muestras
proporcionadas por los mismos. Mencione de
dónde obtendría dicho material. En el caso del
esposo debe tenerse en cuenta que no se
conoce su paradero, por lo cual la muestra
debe ser extraída de algún objeto de uso
personal; defina cuál sería éste y justifique la
elección del mismo.
180
SESION 2 DE LABORATORIO PARA LA
PRÁCTICA FINGERPRINTING
MATERIAL
- DNA de la escena del crimen con
amortiguador.
- DNA del sospechoso 1 con amortiguador.
- DNA del sospechoso 2 con amortiguador.
- DNA del sospechoso 3 con amortiguador.
- DNA del sospechoso 4 con. Amortiguador.
- DNA del sospechoso 5 con amortiguador.
- Mezcla de enzimas de restricción EcoRI/Pstl,
1800 U.
- Agua estéril, 2.5 ml.
- Marcador de DNA de fago lambda digerido
con Hind III 0.2µg /µl, 100 µl.
1.- 23,130 pb
2.9,416 pb
3.6,557 pb
4.4,361 pb
5.2,322 pb
6.2,027 pb
- Colorante de DNA (Biorad biosafe).
- Microtubos de colores.
- Microtubos blancos.
- Geles de agarosa al 1.0%.
- Amortiguador de electroforesis TAE (TrisAcetato-EDTA). Tris-base 39 mM, ácido
acético glacial 18 mM, EDTA 10 mM.
- Gradillas para microtubos.
- Recipiente para teñir geles.
- Pipeta automática de 10-100 µl.
- Puntas para pipetas automáticas.
- Marcador indeleble.
- Fuente de poder.
- Cámara horizontal de electroforesis.
- Parrilla para baño maría.
- Vaso de precipitado de 300 ml.
- Recipiente con hielo.
- Microfuga.
3.-A cada tubo adicionar 10 µl de la muestra
correspondiente; utilizar una punta nueva para
cada muestra.
4.-Adicionar 10 µl de la mezcla de enzimas de
restricción a cada uno de los tubos que
contienen la muestra de DNA. Se debe tener
cuidado de no contaminar la mezcla de
enzimas, por lo cual se sugiere el empleo de
una punta nueva por cada tubo.
Muestra de
la escena
Sospechoso
1 azul
Sospechoso
2 naranja
Sospechoso
3 violeta
Sospechoso
4 rojo
Sospechoso
5 amarillo
Muestras
de DNA
Enzimas de
restricción
EcoRI y
PstI
Volumen
total de
la
reacción
10 µl
10 µl
20 µl
10 µl
10 µl
20 µl
10 µl
10 µl
20 µl
10 µl
10 µl
20 µl
10 µl
10 µl
20 µl
10 µl
10 µl
20 µl
5.-Cierre los microtubos y mezcle la muestra
golpeando suavemente los tubos con los
dedos. Si se cuenta con una microfuga
aplique un pulso de 2 segundos para
asegurarse que toda la muestra se quede en
el fondo del microtubo, permitiendo que se
mezcle adecuadamente y se lleve a cabo la
reacción.
6.-Coloque los tubos en la gradilla e incúbelos
a 37ºC por 45 minutos.
PROCEDIMIENTO
1.-Marcar los microtubos de la siguiente
forma:
a) Tubo verde (muestra de la escena)
b) Tubo azul (sospechoso 1)
c) Tubo naranja (sospechoso 2)
d) Tubo violeta (sospechoso 3)
e) Tubo rojo (sospechoso 4)
f) Tubo amarillo (sospechoso 5)
7.-Transcurrido el tiempo de incubación,
adicione 10 µl del amortiguador de carga a
cada tubo tápelos y agítelos suavemente con
los dedos.
2.-Colocar los tubos marcados en la gradilla.
9.-Adicione 275 ml del amortiguador de
corrida o lo que se requiera para que se
cubran los pozos.
8.-Coloque en la cámara de electroforesis el
gel de agarosa, teniendo cuidado que los
pozos se encuentren orientados hacia el
cátodo [polo negativo (terminal negra)].
181
10.-Coloque las muestras en el gel
empleando una punta nueva para cada
muestra, las cuales se depositan de izquierda
a derecha amortiguador en el siguiente orden:
a) Carril 1: marcador de peso
molecular, HindIII,10; µl
b) Carril 2: escena del crimen verde,
10 µl
c) Carril 3: sospechoso 1 azul, 10 µl
d) Carril 4: sospechoso 2 naranja, 10
µl
e) Carril 5: sospechoso 3 violeta, 20
µl
f) Carril 6: sospechoso 4 rojo, 10 µl
g) Carril 7: sospechoso 5 amarillo,
10 µl
11-Cierre la cámara de electroforesis y
asegúrese que concuerden las terminales rojo
con rojo y negro con negro. Conecte la
cámara a la fuente de poder, manteniendo la
orientación de las terminales.
del pozo y el centro de la banda de DNA. Con
los datos obtenidos se llena la siguiente tabla.
B. Estructura de los ácidos nucleicos y sus
funciones
Referncias
1.-Biotechnology Explorer DNA Fingerprinting
Kit
Instruction Manual BIORAD
12.-Encienda la fuente de poder. Ajuste el
voltaje a 100 V y realice la electroforesis por
40– 60 minutos.
13.-Detenga la electroforesis cuando la
muestra llegue a una distancia aproximada de
2 cm del final del gel. Apague la fuente de
poder, remueva la tapa y
retire
cuidadosamente el gel.
14.-Coloque en una charola 120 ml de la
solución teñidora 100X y el gel, asegurándose
que se encuentre sumergido en la solución.
Tiña los geles por 2 minutos.
15.- Después se deben colocar los geles en
una charola que contenga 500 – 700 ml de
agua limpia y caliente (40-55ºC), agite
suavemente el gel por aproximadamente 10
segundos y retire el agua, realizar los lavados
que sean necesarios con agua limpia hasta la
aparición de las bandas de DNA y hacer la
comparación de las muestras.
Cortar en pequeñas
piezas con enzimas
de restricción
DNA total
de
una
persona
-ve
Más
grandes
Fragmentos
de DNA en el
gel
+ve
Fragmentos separados y
transferidos a membrana
de nylon
Más
pequeñas
16.- Para realizar un análisis cuantitativo de
las muestras, se debe medir con una regla la
distancia que migró cada uno de los
fragmentos de las muestras (en mm),
Tomando como punto de partida la parte baja
182
Práctica 14
Determinación de glucosa en sangre total
Objetivos
1. Que el estudiante comprenda el metabolismo de
la glucosa en sujetos sanos en diferentes
condiciones metabólicas.
2. Que el estudiante corrobore los cambios de
glucosa que ocurren después de la ingesta de
alimentos.
4. Que el alumno sea capaz de analizar e
interpretar los resultados obtenidos a partir de la
determinación de glucosa en sangre total.
INTRODUCCIÓN
La glucosa es el proveedor de energía más
importante del organismo junto con los ácidos
grasos y los cuerpos cetónicos.
El principal aporte proviene del intestino (glucosa
alimentaria), el hígado y los riñones.
En los animales superiores el metabolismo de los
carbohidratos está sujeto a mecanismos de
regulación complejos en los que participan las
hormonas, los metabolitos y las coenzimas.
El cerebro, la médula suprarrenal y los eritrocitos
son los que más dependen del suministro continuo
de glucosa, por que no disponen de ninguna
reserva importante de la misma1.
El sistema nervioso requiere de aproximadamente
150 gr de glucosa al día para realizar sus funciones
normales2.
La principal función bioquímica de la glucosa
es la de proporcionar energía para los
procesos de la vida. El adenosín trifosfato
("ATP") es la fuente de energía universal para
las reacciones biológicas. La oxidación de la
glucosa por las vías glucolítica y del ácido
cítrico es la fuente principal de energía para la
biosíntesis del ATP.
El exceso de glucosa es almacenado en las
células como el polímero glucógeno para
demandas posteriores de energía.
El papel de la insulina es desviar la glucosa
extracelular a los sitios de almacenamiento
intracelular en la forma de macromoléculas
(como el glucógeno, lípidos y proteínas). Es así
que la glucosa es almacenada en tiempos de
abundancia para los momentos de necesidad.
Algunos minutos después de la ingesta de una
comida, los niveles de insulina sanguínea
aumentan. La glucosa y los aminoácidos de la
dieta tales como la leucina, isoleucina y lisina,
son estimulantes potentes de las células beta
del páncreas haciendo que éstas segreguen
insulina. La mayor parte de las células
periféricas responden al aumento de la
glucosa sanguínea con un aumento rápido del
transporte de la glucosa dentro de las células.
De esta manera, los niveles de glucosa
sanguínea aumentan solamente de un 20% a
un 40% en los individuos no-diabéticos. Sin
embargo, aproximadamente el 80% de la
entrada de glucosa no es insulino dependiente,
ya que el cerebro, los glóbulos rojos, el hígado
y los intestinos no requieren de insulina para la
entrada creciente de glucosa cuando está
presente glucosa sanguínea elevada. El
músculo es el tejido dependiente de insulina
más importante. Los niveles crecientes de
insulina y glucosa sanguíneas inhiben la
lipólisis así como a aproximadamente el 60%
de la liberación normal de glucosa hepática3.
Se han realizado estudios del comportamiento
de la glucosa en sangre en sujetos normales
en la cual se puede observar que a los 30 a 60
minutos posteriores a la ingesta de alimentos
la concentración de glucosa alcanza su
concentración máxima y a las dos horas
vuelve a su estado basal6.
Algunos minutos después de la ingesta
de una comida, los niveles de insulina
sanguínea aumentan6.
Las concentraciones de glucosa en el suero
son aproximadamente 15% más altas que las
concentraciones de glucosa en la sangre total
esto es debido a que la glucólisis continúa en
los eritrocitos.
El uso del glucómetro es de mucha utilidad en
el autocontrol de pacientes diabéticos, lo que
ayuda a medir una glucosa en sangre casual.
El valor calórico total diario de los alimentos
deberá ser entre 25 y 30 Kcal/Kg/día, para las
personas sedentarias y de 30 a 40 Kcal/Kg/día
para una persona físicamente activa o que
realiza ejercicio de manera regular4,5.
183
Referencias
1.-Koolman J, Roehm KH (2004). Bioquímica
Texto y Atlas: 3ª Edición, Ed. Médica
Panamericana, pp.: 158, 308-310
2.-Smith, C; Marks, A. D. & Lieberman, M. (2005).
Marks’ Basic Madical Biochemestry. 2a Edición.
Ed. Lippincott Williams & Wilkins. Pag. 24-26
3.-Kaplan LA, Pesce AJ. (2002). Química Clínica.
Teoría, análisis y correlación. 3ª Edición. Ed.
Pesce Kaplan Publicaciones, Capítulo: 32.
4.- NORMA OFICIAL MEXICANA, NOM-015SSA2-1994, “Para la prevención, tratamiento y
control de la diabetes mellitus en la atención
primaria”. Listado de Normas Oficiales Mexicanas
de la Secretaría de Salud.
5.-MODIFICACIÓN a la Norma Oficial Mexicana
NOM-015-SSA2-1994,
Para
la
prevención,
tratamiento y control de la diabetes. Listado de
Normas Oficiales Mexicanas de la Secretaría de
Salud.
6.- Manual para el manejo de las insulinas 2001.
2ª Edición. Subsecretaría de Prevención y
Protección de la Salud. Centro Nacional de
Vigilancia Epidemiológica. SSA. Mexico.
Material
•
Dietas:
a).-Rica en carbohidratos (X gr. spaghetti).
b).- Dieta rica en lípidos (hamburguesa).
•
Dos sujetos sanos sedentarios y dos horas
mínimas de ayuno.
Dos sujetos con actividad física constante y dos
horas mínimas de ayuno.
Glucómetros One Touch Ultra.
Tiras reactivas One Touch Ultra [Glucosa oxidasa
(Aspergillus níger)].
Dispositivo de punción.
Lancetas estériles con discos protectores One
Touch UltraSoft.
Recipiente para material punzo cortante.
Recipiente para material biológico-infeccioso.
Jabón para manos.
Torundas de algodón con alcohol.
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Método
1.- Dos sujetos sedentarios, uno de los cuales
consumirá una dieta rica en carbohidratos y el otro
una dieta rica en proteínas.
2.- Dos sujetos con actividad física constante, uno
de los cuales consumirá una dieta rica en
carbohidratos y el otro una dieta rica en lípidos.
3.- A cada uno de los sujetos en cualquiera de
las condiciones y consumo de dietas se les
determinará la concentración de glucosa en
sangre total por medio de un glucómetro en los
siguientes tiempos:
0 minutos (antes de ingerir los alimentos).
30 minutos, 60 minutos y 120 minutos,
después de ingerir los alimentos
Para realizar la determinación de glucosa en
sangre total seguir los siguientes pasos:
4.-Para Insertar la lanceta
a) Gire la tapa One Touch
UltraSoft hacia la izquierda
para quitarla
b) Inserte una lanceta en el
portalancetas
y
empújela
firmemente hasta que quede
bien asentada
5.- Cargue el dispositivo de
punción. Deslice el botón
cargador hacia atrás hasta que
haga clic. El dispositivo de
punción ya esta preparado
para su uso.
6.- Lave sus manos y limpie
con una torunda de algodón
con alcohol la zona donde se
realizará la punción.
7.- Coloque el dispositivo
de punción en posición.
Sostenga el dispositivo
firmemente
contra
el
costado de su dedo.
Presione el botón de
liberación
8.- Aplique masaje a
punta de su dedo.
la
184
Un suave masaje en la punta del dedo le ayudará
a obtener
una gota de sangre adecuada.
No exprima en exceso el área de punción.
9.- Inserte la tira reactiva en el puerto de análisis,
con el extremo de las barras de contacto de
primero y mirando hacia arriba.
Empújela hasta que no
14.-Es importante desechar con mucho
cuidado la lanceta usada luego de cada uso,
con el fin de evitar que se produzcan lesiones
accidentales con las
puntas de la lancetas.
Para el desecho de
las lancetas siga los
siguientes pasos:
10.-Acerque y mantenga la
gota de sangre en el canal
estrecho del borde superior de
la tira reactiva
15.- Gire la tapa One
Touch Ultra Soft en
dirección contraria a
las manecillas del
reloj.
11.- Hasta que la ventana de
confirmación
este
completamente
llena
de
sangre, antes que el medidor
comience la cuenta regresiva.
16.Apunte
el
dispositivo de punción hacia a hacia usted.
Presione el botón de liberación
para asegurarse que el dispositivo de punción
no esté en posición de cargado. Deslice el
botón cargador hacia delante y deposite la
lanceta en un recipiente para material punzo
cortante
a) Muestra adecuada
b) Muestra insuficiente
b
12.- Inserte la tira reactiva en
el puerto de análisis, con el
extremo de las barras de
contacto de primero y
mirando hacia arriba.
Empújela hasta que no
avance más.
13.-Lectura
El resultado de la prueba de
glucosa
de
su
sangre
aparecerá después de que el
medidor cuente en forma
regresiva de 5 a 1.
Anotar el resultado en la
tabla correspondiente Tabla
14.1.
17.- Desechar las tiras reactivas en una bolsa
para material biológico-infeccioso junto con las
torundas de algodón empleadas en la práctica.
18.-Con los datos obtenidos completar el
cuadro 14.1 y hacer una gráfica de todas las
variantes en papel milimétrico.
Tabla 14.1 Resultados
Fecha:_________________
Nombre:
Edad:
Sexo:
Sedentario:
Actividad física constante:
Tipo de dieta
Tiempo
(min.)
[Glucosa mg/dl]
0
30
60
120
185
Práctica 15
Integración Metabólica
15
Integración Metabólica
Objetivos
1.-Que el alumno pueda integrar las vías
metabólicas de los carbohidratos, de los
lípidos y proteínas en (condiciones
normales) en un paciente sano.
2.-Que el alumno reconozca los sitios
denominados encrucijadas metabólicas y
las enzimas de las vías reguladoras.
3.-Que el alumno pueda correlacionar el
papel que tienen las hormonas en la
regulación de las vías.
4.-Que el alumno sea capaz de analizar
los datos de las pruebas clínicas en un
sujeto normal.
5.-Que el alumno relacione que vías se
encuentran alteradas en un paciente
diabético.
Los alimentos que ingerimos deben estar
constituidos por los 6 componentes
básicos que son proteínas, carbohidratos,
lípidos, vitaminas, minerales y agua, la
cantidad que se requiere ingerir de cada
uno de los componentes varía de acuerdo
a la constitución y la actividad física que se
realiza, tanto la falta como en el exceso de
consumo de alguno de los componentes
básicos conlleva a diversos trastornos
metabólicos.
Aproximadamente del 40 al 45% de
nuestra ingesta calórica proviene del
consumo
diario
de
carbohidratos
complejos los cuales al ser digeridos dan
lugar a los diferentes monosacáridos entre
los que se encuentra la glucosa, la cuál se
distribuye por la sangre a las células para
poder captar la glucosa, siendo la principal
fuente de energía. Algunos tipos celulares
son dependientes de la liberación de
insulina por el páncreas como es el caso
de las células musculares. Si la insulina no
funciona adecuadamente, la glucosa se
queda en el flujo sanguíneo causando
elevación de los niveles de glucosa en la
sangre y a esto se le denomina
hiperglucemia; una de las enfermedades
que se caracteriza por la hiperglucemia en
sus primeras etapas es la diabetes
mellitus.
La diabetes mellitus esta caracterizada por
una hiperglucemia resultante de defectos
en la secreción de insulina, en la acción de
la insulina o en ambas. La hiperglucemia
crónica de la diabetes está asociada a
lesiones, disfunción y fallo de varios
órganos, especialmente de los ojos, los
riñones, el corazón y los vasos
sanguíneos.
Varios procesos patogénicos están
implicados en el desarrollo de la diabetes.
Estos van desde una destrucción
autoinmunológica de las células del
páncreas, con la consiguiente deficiencia
de insulina, hasta anormalidades, en las
que el páncreas no produce suficiente
insulina o la que produce no es eficiente.
La acción deficiente de la insulina en los
tejidos diana es la responsable del
metabolismo anómalo de los carbohidratos
de carbono, grasas y proteínas en la
diabetes.
La acción deficiente de la insulina
ocasiona una respuesta inadecuada en
uno o más puntos de la compleja trama
186
metabólica en la que esta hormona tiene
papel regulatorio.
Frecuentemente coexisten en el mismo
paciente una inadecuada secreción de
insulina así como defectos de la acción de
ésta, en la actualidad no se sabe si una de
estas anormalidades es la consecuencia o
la causa de la otra. En cualquier caso, el
resultado es la hiperglucemia.
La gran mayoría de los casos de diabetes
pueden incluirse en dos amplias
categorías etiopatogénicas. En el primer
caso (diabetes de tipo I) la causa es una
deficiencia absoluta en la secreción de
insulina. Los individuos con alto riesgo de
desarrollar este tipo de diabetes pueden
ser a menudo identificados mediante
evidencias serológicas de un proceso
autoinmune que se produce en los islotes
pancreáticos
y
también
mediante
marcadores genéticos. En la segunda
categoría (diabetes de tipo II), mucho más
prevalente, la causa es una combinación
de una resistencia a la acción de la
insulina y de una inadecuada respuesta
secretora compensadora. La diabetes tipo
II se caracteriza por estar presente
muchos años antes de ser detectada una
hiperglucemia sin síntomas clínicos (sed,
perdida de peso), pero suficiente para
ocasionar
cambios
patológicos
y
funcionales sobre los órganos blanco.
Durante este período asintomático, es
posible demostrar trastornos en el
metabolismo
de
los
carbohidratos
midiendo la glucosa plasmática en ayunas
o después de una sobrecarga de glucosa
por vía oral.
El exceso en la ingesta de carbohidratos
no solamente mantiene la reserva de
energía en forma de glucógeno sino que
también el exceso de carbohidratos es
convertido en triacilgliceroles. En el hígado
los triacilgliceroles se sintetizan a partir de
acil CoA y glicerol 3-fosfato siendo
empaquetados con apoproteínas y en
lipoproteínas de muy baja densidad
(VLDL), secretados al torrente sanguíneo
siendo almacenados en tejido adiposo.
Para su consumo los triacilgliceroles son
hidrolizados a glicerol y ácidos grasos. En
la dieta es importante la presencia de
lípidos ya que son precursores de
diferentes componentes de la célula como
los fosfolipidos, uno de los lípidos que
tiene una gran importancia en la célula es
el colesterol, ya que proporciona rigidez a
las membranas celulares y es precursor de
las sales biliares así como de hormonas
esteroideas. El colesterol se puede
obtener por la alimentación y por síntesis
del propio organismo, siendo las células
hepáticas y las suprarrenales las de mayor
síntesis. Para llevar a cabo la síntesis de
colesterol se requiere la presencia de
acetil-CoA el cual proviene de la
degradación de glucosa, ácidos grasos y
aminoácidos por lo cual se denomina a la
acetil-CoA la encrucijada metabólica.
El colesterol es insoluble en agua por lo
que transportado en la sangre por tres
lipoproteínas que son de muy baja
densidad (VLDL), de baja densidad (LDL)
y las de alta densidad (HDL). Los niveles
normales de colesterol total en sangre en
un adulto son de < 200 mg/dl y cuando
estos valores se ven aumentados se
asocian a la formación de placas
ateroscleroticas que pueden ocluir los
vasos sanguíneos y como consecuencia
provocar infarto al miocardio y alteraciones
cardiovasculares.
La cuantificación de las LDL representa un
papel clave en la esclerosis coronaria ya
que concentraciones elevadas indican
desarrollo de la aterosclerosis.
En el caso de las HDL al dismunuir su
concentración aumenta el riesgo de
desarrollar aterosclerosis.
Las proteínas constituyen la fuente
primaria del metabolismo del nitrógeno en
el organismo,
187
Los aminoácidos producto de la digestión
de las proteínas que se consumen en los
alimentos, son utilizados para la síntesis
de
proteínas
y
de
compuestos
nitrogenados o se puede oxidar para
producir energía.
El hígado es el órgano principal en donde
se realiza la oxidación de los aminoácidos.
El nitrógeno de los aminoácidos forma
amoniaco el cual es toxico para el
organismo. El amoniaco y los grupos
amino se convierten en urea en el hígado,
que no es toxica y se elimina fácilmente
por la orina ya que es hidrosoluble.
Otro de los componentes del metabolismo
nitrogenado son los nucleotidos. Las
purinas y las pirimidinas, que son
esenciales para la síntesis de nucleótidos
y ácidos nucleicos.
Los nucleótidos son precursores del DNA
y el RNA, así como también forman parte
de la estructura de muchas coenzimas
además de ser componentes del
metabolismo energético.
La degradación de las purinas no genera
energía y el producto de la degradación
del anillo purínico es el ácido úrico, que se
elimina por la orina, tiene una solubilidad
limitada por lo que su exceso da como
resultado la formación de cristales en
regiones del organismo como pueden ser
los dedos gordos del pie, trastorno que se
conoce como gota.
Los valores elevados de ácido úrico se
presentan en: ingestión de alimentos ricos
en nucleoproteínas, insuficiencia renal,
azoemias prerrenales.
Otro de los componentes del metabolismo
nitrogenado es la creatinina que en el
músculo en su forma fosorilada sirve como
almacén de alta energía y se transforma
con facilidad en ATP por la enzima
creatina fosfocinasa. La creatina fosfato es
inestable y se cicla espontáneamente
forma la creatinina que se elimina en la
orina. La producción de creatinina es
proporcional a la masa muscular corporal.
La cantidad de creatinina que se elimina
diariamente
puede
utilizarse
como
indicador de la normalidad de la función
renal
Material.
Dietas:
Dos sujetos sanos sedentarios y dos horas
mínimas de ayuno.
Dos sujetos con actividad física constante
y dos horas mínimas de ayuno.
a).-Dieta rica en carbohidratos (g
spaghetti).
b).-Dieta rica en lípidos (Hamburguesa).
Determinación de glucosa
Glucómetros One Touch Ultra.
Tiras reactivas One Touch Ultra [Glucosa
oxidasa (Aspergillus níger)].
Dispositivo de punción.
Lancetas estériles con discos protectores
One Touch UltraSoft.
Recipiente para material punzo cortante.
Recipiente
para
material
biológicoinfeccioso.
Jabón para manos.
Torundas de algodón con alcohol.
Glucómetros.
Determinación
de
colesterol
y
triacilgliceroles
Accutrend Roche para determinación de
colesterol y triacilgliceroles.
Tiras reactivas para determinación de
colesterol.
Tiras reactivas para determinación de
triacilgliceroles.
Lancetas estériles.
Determinación
de
hemoglobina
glicosilada.
Micromat
HbA1c
BIO-RAD
para
determinación de hemoglobina glicosilada
en sangre total.
Lancetas estériles.
Las determinaciones de urea, creatinina y
ácido úrico, se realizaran en orina.
188
La muestra de orina deberá ser del alumno
a quien se le haya determinado glucosa,
colesterol y triacilgliceroles para poder
discutir todos los valores en conjunto y
poder enlazar en un mismo individuo el
efecto que tiene la dieta sobre el
metabolismo.
Determinación de urea
Pipetas automáticas (10 a 200µl)
Puntas para micropipetas
Propipetas.
Reactivo para urea.
Estándar de urea (50 mg/dl).
Espectrofotómetro.
Celdas.
Agua destilada.
Pipetas Pasteur de plástico.
Determinación de creatinina
Reactivo para creatinina.
Estándar de creatinina (2 mg/dl).
Determinación de ácido úrico
Pipetas de 5 ml.
Gradilla con 2 tubos de ensaye.
Reactivo para ácido úrico.
Estándar de ácido úrico (6 mg/dl).
Método
Determinación de glucosa
1.-Dos sujetos sedentarios, uno de los
cuales consumirá una dieta rica en
carbohidratos y el otro una dieta rica en
lípidos.
2.-Dos sujetos con actividad física
constante, uno de los cuales consumirá
una dieta rica en carbohidratos y el otro
una dieta rica en lípidos.
3.-A cada uno de los sujetos en cualquiera
de las condiciones y consumo de dietas se
les determinará la concentración de
glucosa en sangre total por medio de un
glucómetro en los siguientes tiempos:
0 minutos (antes de ingerir los alimentos).
30 minutos, 60 minutos y 120 minutos,
después de ingerir los alimentos. Para
realizar la determinación de glucosa en
sangre
total
seguir
los
siguientes pasos:
4.-Para Insertar la lanceta
a) Gire la tapa One Touch
UltraSoft hacia la izquierda
para quitarla.
b) Inserte una lanceta en el
portalancetas
y
empújela
firmemente hasta que quede
bien asentada.
5.- Cargue el dispositivo de
punción. Deslice el botón
cargador hacia atrás hasta
que haga clic. El dispositivo de
punción ya esta preparado para
su uso.
6.- Lave sus manos y limpie
con una torunda de algodón
con alcohol la zona donde se
realizará la punción.
7.- Coloque el dispositivo de
punción en posición. Sostenga
el dispositivo firmemente contra
el costado de su dedo.
Presione el botón de liberación.
8.- Aplique un suave masaje a
la punta de su dedo que le
ayudará a obtener una gota de
sangre adecuada No exprima
en exceso el área de punción.
9.-Acerque y mantenga la gota
de sangre en el canal estrecho
del borde superior de la tira
reactiva
189
a
b
10 a) Muestra adecuada b)
Muestra insuficiente
11.- Inserte la tira reactiva
en el puerto de análisis,
con el extremo de las
barras de contacto de
primero y mirando hacia
arriba. Empújela hasta que
no avance más.
12.- Hasta que la ventana
de confirmación este
completamente llena de
sangre, antes que el
medidor comience la
cuenta regresiva.
13.-Lectura el resultado de la prueba de
glucosa de su sangre aparecerá después
de
que el medidor cuente en forma regresiva
de 5 a 1.
Anotar el resultado en la
tabla correspondiente Tabla 15.1
14.-Es importante desechar con mucho
cuidado la lanceta usada luego de cada
uso, con el fin de evitar que se produzcan
lesiones
accidentales con las puntas de la
lancetas.
Para el desecho de las lancetas siga los
siguientes pasos:
15.- Gire la tapa One
Touch Ultra Sofá en
dirección contraria a las
manecillas del reloj.
16.- Apunte el dispositivo de punción hacia
el recipiente para el material punzo
cortante Presione el botón de liberación
para asegurarse que el dispositivo de
punción no esté en posición de cargado.
Deslice el botón cargador hacia delante
y deposite la lanceta en un recipiente
para material punzo cortante.
b17.- Desechar las tiras reactivas en una
bolsa para material biológico-infeccioso
junto con las torundas de algodón
empleadas en la práctica.
18.-Con los datos obtenidos
completar el cuadro 15.1 y hacer
una gráfica de todas las variantes
en papel milimétrico.
Cuadro 15.1 Resultados
Fecha:_________________
Nombre:
Edad:
Sexo:
Sedentario:
Actividad física constante:
Tipo de dieta
Tiempo
(min.)
0
30
60
120
[Glucosa mg/dl]
Determinación
de
colesterol
y
triacilgliceroles
Accutrend®GCT.
1.-Lavarse las manos cuidadosamente
esto es con la finalidad de retirar residuos
de crema o grasa en las manos para
evitar
determinaciones
erróneas
principalmente cuando se realiza la
determinación de triacilgliceroles.
190
2.- Con la ayuda de unas pinzas extraer
una tira reactiva del envase y taparlo
inmediatamente para evitar que las tiras se
sequen.
3.-Con la tapa cerrada D inserte en la
ranura F, en la dirección indicada por la
flecha, la tira reactiva con el cuadrado
amarillo hacia arriba hasta que encaje y
deje verse la marca TG o CHOL impresa
en la tira reactiva.
4.-Frote y masajee la yema del dedo para
facilitar la extracción y aplicación de la
sangre.
5.-Con la lanceta introduzca para hacer la
punción y realice la toma de muestra.
6.-Aplicar directamente la gota de sangre a
la tira reactiva y proceder a la lectura de la
concentración
de
colesterol
y
triacilgliceroles según sea el caso, si no se
llena completamente el equipo le marca R5.
7.-Realice la lectura.
8.-Anote la lectura.
9.-Si esto llegara a suceder volver a tomar
otra tira reactiva para proceder a iniciar
completamente desde el paso uno.
Determinación
de
hemoglobina
glicosilada
Guía rápida Micromat II. (Detección de
hemoglobina glicosilada).
1.-Insertar el cartucho de análisis.
2.-Girar el cartucho a la posición 1.
3.-Extracción de muestra capilar o venosa.
4.-Comenzar la incubación, presionar
enter
5.-Invertir 3 veces.
6.-Dispensar la muestra en el embudo
central.
7.-Girar el cartucho a la posición 2, sacar
el tubo de la solución de lavado (tapón
azul).
8.-Verter la solución de lavado al embudo
central.
9.-Girar el cartucho a la posición 3, sacar
el tubo de la solución eluyente (tapón
transparente).
10.-Verter el eluyente al embudo central.
11.-Girar el cartucho a la posición de
partida.
12.-Extraer el cartucho de análisis, el
resultado se observará en la pantalla.
13.-Presionar enter para un nuevo análisis.
Determinación de urea en orina
La urea presente en la muestra reacciona
con el o-ftaldehído en medio ácido
originando un complejo coloreado puede
identificarse espectrofotométricamente.
Urea + o-ftaldehído
Isoindolina
La urea es estable 5 días a 2-8 °C.
1.-Diluir la muestra 1:50 con agua
destilada mezclar y multiplicar el resultado
por el factor de dilución (50).
2.-Para realizar la dilución 1:50 recupere la
orina con la pipeta
Celda
Orina
Estándar
Solución
reactiva
de creatinina
1
100
µl
1 ml
2
100
µl
1 ml
Pasteur de plástico hasta la marca (lo que
corresponde a 0.5 ml) y colóquelo en un
tubo Falcón que ya contiene 24.5 ml de
agua, con ello se tendrá una dilución 1:50,
de ahí tomar la muestra como se
esquematiza en el cuadro.
La determinación se realiza directamente
en las celdas con la finalidad de tomar la
lectura de las absorbancias exactamente
al minuto (A1) y a los dos minutos (A2).
191
Celda
Muestra
Estándar
Solución reactiva
para urea
1
25 µl
-1 ml
2
-25 µl
1 ml
Mezclar y poner en marcha el cronómetro,
anotar las absorbancias a los 60 (A1) y 120
(A2) segundos.
Leer frente blanco de reactivos en el
espectrofotómetro a 520 nm.
Calcular el incremento de la absorbencia
A = A2 – A1.
Con las diferencias de absorbancias
anotadas A, aplicar la siguiente ecuación:
A Muestra X [Estándar] = [Urea]
A Estándar
El resultado se obtiene en mg/dl.
Determinación de creatinina en orina
1.-Diluir la muestra 1:50 con agua
destilada mezclar y multiplicar el resultado
por el factor de dilución (50).
2.-Para realizar la dilución 1:50 recupere la
orina con la pipeta Pasteur de plástico
hasta la marca (lo que corresponde a 0.5
ml) y colóquelo en un tubo Falcón que ya
contiene 24.5 ml de agua, con ello se
tendrá una dilución 1:50, de ahí tomar la
muestra como se esquematiza en el
cuadro.
La determinación se realiza directamente
en las celdas con la finalidad de tomar la
lectura de las absorbancias exactamente a
los 30 (A1) y a los 90 (A2) segundos.
Mezclar y poner en marcha el cronómetro,
anotar las absorbancias a los 30 (A1) y a
los 90 (A2) segundos.
Leer frente blanco de reactivos en el
espectrofotómetro a 492 nm.
Calcular el incremento de la absorbencia
A = A2 – A1.
Con las diferencias de absorbancias
anotadas A, aplicar la siguiente ecuación:
A Muestra X [Estándar] = [Creatinina]
A Estándar
El resultado se obtiene en mg/dl.
Determinación de ácido úrico en orina.
1.-Diluir la muestra 1:10 con agua
destilada, mezclar y multiplicar el resultado
por el factor de dilución (10).
2.-Para realizar la dilución 1:10 recupere la
orina con la pipeta Pasteur de plástico
hasta la marca (lo que corresponde a 0.5
ml) y colóquelo en un tubo Falcón que ya
contiene 9.5 ml de agua, con ello agregue
agua hasta la marca de 5 ml con ello
tendrá una dilución 1:10 de ahí tomar la
muestra como se esquematiza en el
cuadro.
La determinación se realiza en tubos de
ensaye.
Mezclar e incubar 10 minutos a
temperatura ambiente.
Leer
la
absorbancia
(A)
en
el
espectrofotómetro frente a blanco de
reactivos a 520 mn.
Cálculo de la concentración de ácido úrico.
A Muestra X [Estándar] = [Ácido úrico]
A Estándar
El resultado se obtiene en mg/dl.
Tubo
Orina
Estándar
Solución reactiva
de ácido úrico
1
100 µl
1 ml
2
100 µl
1 ml
192
Referencias
1.-Koolman J, Roehm KH (2004).
Bioquímica Texto y Atlas: 3ª Edición, Ed.
Médica Panamericana, pp.: 158, 308-310
2.-Smith, C; Marks, A. D. & Lieberman, M.
(2005). Marks’ Basic Madical
Biochemestry. 2a Edición. Ed. Lippincott
Williams & Wilkins. Pag. 24-26
3.-Kaplan LA, Pesce AJ. (2002). Química
Clínica. Teoría, análisis y correlación. 3ª
Edición. Ed. Pesce Kaplan Publicaciones,
Capítulo: 32.
4.- NORMA OFICIAL MEXICANA, NOM015-SSA2-1994, “Para la prevención,
tratamiento y control de la diabetes
mellitus en la atención primaria”. Listado
de Normas Oficiales Mexicanas de la
Secretaría de Salud.
5.-MODIFICACIÓN a la Norma Oficial
Mexicana NOM-015-SSA2-1994, Para la
prevención, tratamiento y control de la
diabetes. Listado de Normas Oficiales
Mexicanas de la Secretaría de Salud.
6.- Manual para el manejo de las insulinas
2001. 2ª Edición. Subsecretaría de
Prevención y Protección de la Salud.
Centro
Nacional
de
Vigilancia
Epidemiológica. SSA. México.
7.- NORMA OFICIAL MEXICANA NOM030-SSA2-1999, Para la prevención,
tratamiento
y
control
de
la
hipertensión arterial. Listado de Normas
Oficiales Mexicanas de la Secretaría de
Salud.
193
III
Casos de correlación bioquímica
y práctica médica
194
Caso 1
Cólera
Un hombre de 38 años de edad con peso
de 71 kg relata que su padecimiento actual
se inició con anorexia, dolor abdominal y
diarrea. Un día después siguió con náusea
intensa, vómito y diarrea muy abundante y
líquida. Ingresó al hospital con hipotensión
postural y deshidratación. Se pudo aislar
Vibrio cholerae toxígeno de sus heces. El
paciente mejoró rápidamente al reponerle
agua, electrólitos y administrarle tetraciclina
por vía oral.
Preguntas de bioquímica
1. ¿Qué procesos de la membrana
resultan afectados por Vibrio cholerae
en un caso de cólera?
2. ¿Qué valores de laboratorio clínico
podrían estar alterados en este
paciente?
3. ¿Cuáles serían los datos de laboratorio
que permitirían precisar el tratamiento
hidroelectrolítico?
4. ¿Por qué en este caso hay que añadir
glucosa al tratamiento hidroelectrolítico
por vía oral?
5. ¿Cuáles
son
los
signos
de
deshidratación?
6. ¿Cuál fue la situación ácido-base del
paciente al momento de su ingreso al
hospital?
Conceptos y áreas de aprendizaje
1. Describir
la
composición,
las
propiedades y las funciones de las
membranas biológicas.
2. Estudiar la base bioquímica de algunos
trastornos que afectan la función de las
membranas.
3. Modelos de transporte transepitelial.
4. Describir los mecanismos por los cuales
los
organismos
enteropatógenos
ocasionan pérdida intestinal de agua y
electrolitos.
5. Control del agua y de la osmolaridad.
6. Equilibrio ácido-base.
7. Deshidratación
y
tratamiento
de
reposición hidroelectrolítica.
REFERENCIAS
1. Villazón SA, Cárdenas CO, Villazón DO,
Sierra UA. Fluidos y electrólitos. México:
JGH Editores; 2000.
2. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto
con aplicaciones clínicas. 4a. ed.
Barcelona: Editorial Reverté; 2004.
3. Montgomery R. Bioquímica: Casos y
texto. 6a. ed. Barcelona: Editorial
Harcourt-Brace; 1998: cap. 4 y 12.
195
Caso 2
Oclusión intestinal. Acidosis metabólica.
Deshidratación grave
Se trata de un paciente masculino de 35
años de edad quien acude al servicio de
urgencias de un hospital por presentar
dolor abdominal intenso acompañado de
vómitos frecuentes y abundantes de
contenido intestinal. El paciente presenta
un cuadro de deshidratación importante.
A la exploración física se obtuvieron los
siguientes datos:
Tensión arterial (TA): 80/50 mmHg
Frecuencia cardiaca (Fc): 120/min
Frecuencia respiratoria (Fr): 32/min
Temperatura (T): 36o C
Los estudios de laboratorio mostraron lo
siguiente:
Electrolitos séricos:
+
Na = 128 mEq/l
+
K = 2.8 mEq/l
–
Cl = 100 mEq/l
Gasometría arterial:
CO2t = 12
pH = 7.29
pCO2 = 24 mmHg
pO2 = 95 mmHg
HCO - = 11.2 mmol/l
3
EB (exceso de base) = 20
Química sanguínea:
Glucosa = 5.2 mmol/l (95 mg/dl)
BUN = 15 mmol/l
El tratamiento consistió, primero, en el
restablecimiento del balance de líquidos
con solución salina a 0.9%, electrólitos
+
(reposición de K ) y cirugía.
Preguntas de bioquímica
1. Evaluar el estado ácido-base del
paciente; tomar en cuenta los valores
de pH y presión parcial de bióxido de
carbono (pCO2), el valor de bicarbonato
–
plasmático (HCO3 ), etcétera.
2. ¿Es normal el estado ácido-base del
paciente? ¿Qué tipo de desequilibrio
presenta? ¿Cuál podría ser la causa de
ese desequilibrio?
3. ¿Qué
relación
existe
entre
el
metabolismo de los electrolitos y el
agua y entre los trastornos ácido-base y
los electrolitos?
4. ¿Qué tipos de alteraciones de líquidos y
electrolitos corporales existen?
5. Calcule la osmolaridad sérica (tome en
cuenta la concentración de las
sustancias que mayormente contribuyen
a establecerla) como aparecen en las
pags. 98 y 113.
6. ¿Cuáles
son
los
signos
de
deshidratación?
7. ¿Qué terapéutica recomendaría a este
paciente para equilibrar sus líquidos y
electrolitos?
Conceptos y áreas de aprendizaje
1. Propiedades fisicoquímicas del agua.
2. Concepto de pH.
196
3. Explicar el significado de las variaciones
de los valores normales de pH y de la
composición electrolítica de la sangre.
4. Sistemas amortiguadores del plasma,
líquido intersticial y células. La
aplicación de la ecuación de Henderson
y Hasselbalch al cálculo del pH y de la
concentración de bióxido de carbono y
bicarbonato.
5. Equilibrio
ácido-base
y
su
mantenimiento.
6. Equilibrio
hidroelectrolítico
y
su
mantenimiento.
REFERENCIAS
1. Harrison. Principios de medicina interna.
15a.
ed.
Madrid:
McGraw-Hill
Interamericana
Editores; 2001; cap:
Líquidos y electrólitos y Obstrucción
intestinal aguda. p. 184.
2. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto
con aplicaciones clínicas. 4a. ed.
Barcelona: Editorial Reverté; 2004.
3. Montgomery R. Bioquímica: Casos y
texto. 6a. ed. Barcelona: Editorial
Harcourt-Brace, 1998; cap. 4.
4. Laguna J, Piña E. Bioquímica de
Laguna. 5a.ed. México: Editorial El
Manual Moderno; 2002: 41-76.
5. Villazón SA, Cárdenas CO,Villazón DO,
Sierra UA. Fluidos y electrólitos. México:
JGH Editores; 2000.
197
Caso 3
Hipoglucemia secundaria
a intoxicación alcohólica
Se trata de un paciente de 58 años,
alcohólico crónico , cuyos familiares relatan
que ha ingerido una gran cantidad de
alcohol en los dos últimos días con un
consumo muy escaso de alimentos. Inició
su padecimiento con náusea, vómito,
mareo, sudación, cefalea, visión borrosa y
confusión; presentó, en una sola ocasión,
una convulsión, por lo que es llevado al
servicio de urgencias. A la exploración se
encuentra semiconsciente con aliento
alcohólico e hipotermia.
Se procede a un lavado gástrico para
remover el alcohol aún no absorbido; se
mantienen
permeables
las
vías
respiratorias; se instala oxígenoterapia y se
le administra solución glucosada por vía
endovenosa.
Los resultados de laboratorio muestran:
Alcohol
300 mg/dl
Glucosa
2.0 mmol/l
Lactato
9.0 mmol/l
pH
7.2
Preguntas de bioquímica
1. ¿Cuáles son los síntomas de la
hipoglucemia?
2. ¿De qué forma el etanol produce acidosis
láctica e hipoglucemia? ¿Cómo se
encuentra la relación intracelular de
+
NADH/NAD ? ¿Qué procesos metabólicos
se favorecen con los niveles altos de
NADH?
3. El alcoholismo es la base de muchas
deficiencias
vitamínicas.
¿Qué
implicaciones metabólicas tienen estas
deficiencias (complejo B)?
Conceptos y áreas de aprendizaje
1. Hipoglucemia. Regulación de la glucemia.
2. Acidosis láctica.
3. Metabolismo de carbohidratos.
4. Trastornos del metabolismo de vitaminas.
5. Metabolismo del etanol.
REFERENCIAS
1. Murray KR, Granner DK, Mayes PA,
Rodwell VW. Bioquímica de Harper. 16a.
ed. México: Editorial El Manual Moderno;
2004. p. 980-981
2. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con
aplicaciones clínicas. 4a. ed. Barcelona:
Editorial Reverté; 2004.
3. Harrison. Principios de medicina interna.
15a.
ed.
Madrid:
McGraw-Hill
Interamericana Editores; 2001. Capítulos:
Acidosis láctica, hipoglucemia, alcohol y
alcoholismo, deficiencia y exceso de
vitaminas.
4. Academia Nacional de Medicina. Tratado
de medicina interna. 2a. ed. México:
Editorial El Manual Moderno; 1994.
Capítulos: Acidosis láctica e intoxicación
aguda por alcohol etílico.
198
Caso 4
Cetosis por inanición. Obesidad
Una mujer de 27 años llega al servicio de
urgencias médicas después de haber sufrido
un desmayo. Al interrogarla, relata que lleva
15 días a dieta de agua, té y verduras
cocidas para bajar de peso, sin ningún
control médico. Se detectó aliento con olor a
manzana, cetonuria, cetonemia, ácidos
grasos libres elevados, triacilgliceroles
elevados, hipoglucemia y presión arterial
baja; su peso al iniciar la dieta era de 78 kg y
su estatura de 1.59 m. Se diagnostica
cetoacidosis por inanición y obesidad
exógena.
El estudio de su dieta mostró que gran
parte de su ingesta calórica era en forma de
carbohidratos (galletas, chocolates, pasteles,
refrescos, dulces, etcétera).
El tratamiento consistió en administrar
parenteralmente solución glucosada y
continuar con una dieta normocalórica.
Preguntas de bioquímica
1. En esta mujer de 27 años: ¿corresponde
el peso a su talla? Determinar su índice
de masa corporal, grado de obesidad y el
porcentaje de sobrepeso.
2. ¿Cómo es posible que se formen grandes
almacenes de energía en forma de
grasas,
si
la
dieta
contiene
predominantemente carbohidratos?
3. ¿Cuáles
son
las
interrelaciones
metabólicas de los principales tejidos
(hígado, tejido adiposo,
cerebro, músculo, etcétera) en la
obesidad?
4. ¿Cuáles
son
las
interrelaciones
metabólicas de los principales tejidos en
el estado de ayuno temprano y en la
inanición?
5. ¿Cuál es el papel de los cuerpos
cetónicos en el metabolismo?
6. ¿Qué régimen dietético recomendaría a
esta persona para bajar de peso?
Conceptos y áreas de aprendizaje
1. Describir las principales rutas de
biosíntesis,
catabolismo
y
almacenamiento de lípidos.
2. Conocer la estructura y función de los
triacilgliceroles, ácidos grasos y cuerpos
cetónicos.
3. Establecer las bases bioquímicas de la
cetosis y obesidad producidas por
anomalías en el metabolismo de los
lípidos.
4. Describir las alteraciones del equilibrio
ácido-base que se producen en la cetosis.
5. Conocer las interrelaciones metabólicas
de los principales tejidos corporales en los
estados de buena nutrición, de ayuno
temprano, de inanición, de renutrición, de
homeostasis calórica, etcétera.
REFERENCIAS
1. Harrison. Principios de medicina interna.
15a.
ed.
Madrid:
McGraw-Hill
Interamericana Editores; 2001.
2. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con
aplicaciones clínicas. 4a. ed. Barcelona:
Editorial Reverté; 2004.
3. Montgomery R. Bioquímica: Casos y texto.
6a. ed. Harcourt-Brace; 1998.
4. Casanova E. Nutriología médica. Editorial
Médica Panamericana; 1995.
199
Caso 5
Hipercolesterolemia y aterosclerosis
Un hombre de 56 años acudió al médico por
presentar dolor precordial en reposo que se
incrementaba con el esfuerzo. Se le detectó
hipercolesterolemia que, al análisis de los
lípidos plasmáticos, mostró que la mayoría
del colesterol plasmático elevado se
encontraba en la fracción de lipoproteína de
baja densidad (LDL). Se le realizó una
arteriografía coronaria la cual mostró un
estrechamiento de las arterias. La evaluación
de la dieta indicó que consumía gran
cantidad de alimentos ricos en colesterol,
aunque en los últimos meses había seguido
una dieta baja en grasas.
Fue diagnosticado de aterosclerosis en las
arterias coronarias.
El tratamiento consistió en una dieta sin
colesterol y en administrar preparados de
lovastatina, un inhibidor de la HMGCoA
reductasa.
Fue tratado también con colestiramina,
una resina que capta las sales biliares. La
resina no se absorbe y permanece en la luz
intestinal donde se une a las sales y aumenta
la cantidad de las mismas que se excreta con
las heces.
1.
2.
3.
4.
5.
Preguntas de bioquímica
¿Cuáles son algunos alimentos ricos en
colesterol?
¿Cuál es el destino del colesterol de la dieta?
¿Cuál es la función de la bilis en la digestión?
¿Qué conexión metabólica existe entre el
colesterol y las sales biliares?
¿Cómo disminuye la resina de colestiramina
la concentración plasmática de colesterol?
6. ¿Por qué se le ha llamado al colesterol-LDL:
“colesterol malo” y al colesterol-HDL:
“colesterol bueno”?
7. ¿Cómo puede la hipercolesterolemia producir
aterosclerosis,
infarto
del
miocardio,
xantomatosis, etcétera?
8. ¿Por qué el hecho de disminuir la
concentración plasmática de colesterol puede
ser útil para la salud de este paciente?
9. ¿Qué papel desempeña la HMG-CoA
reductasa en la biosíntesis del colesterol?
10. ¿Cuál es la razón del uso de la lovastatina
para el tratamiento del paciente?
Conceptos y áreas de aprendizaje
1. Estructura del colesterol y otros esteroles
importantes.
2. Biosíntesis, metabolismo y excreción del
colesterol y de los ácidos biliares.
3. Describir la función de la bilis y su relación
con el colesterol.
4. Considerar el papel del colesterol en el
desarrollo de la aterosclerosis y de la relación
entre hipercolesterolemia e ingesta dietética
de lípidos en esta enfermedad.
5. Comentar los principios del transporte de
lípidos en el sistema circulatorio.
6. Describir
la
composición,
estructura,
metabolismo y función de los principales
tipos de lipoproteínas plasmáticas.
7. Describir los defectos del metabolismo
lipídico que tienen relevancia clínica en
relación con la hipercolesterolemia.
REFERENCIAS
1. PLM.
Diccionario
de
especialidades
farmacológicas. 49 ed. 2004.
200
2. Montgomery R. Bioquímica. Casos y texto.
6a. ed. Barcelona: Editorial Harcourt-Brace,
1998: cap. 10 y 11.
3. Harrison. Principios de medicina interna. 15a.
ed. Madrid: McGraw-Hill Interamericana
Editores; 2001: Capítulos: Aterosclerosis y
otras
formas
de
arteriosclerosis
e
hiperlipoproteinemias y otros trastornos del
metabolismo lipídico.
4. Pennachio D. Lineamientos para la detección
de hipercolesterolemia. Atención Médica
1997;10/2:30-43.
5. Vogel RA. Coronary risk factors, endothelial
function, and atherosclerosis. Clin Cardiol
1997; 20:426-432.
6. Goodman & Gilman’s. The pharmacological
basis of therapeutics. 10th ed. McGraw-Hill
Interamericana Editores; 2002.
7.Mecanismo
de
acción
de
los
hipercolesterolemiantes.
Rev
Médico
General. 1997; 2(7): 71-74.
201
Caso 6
GOTA
Un hombre de 53 años relata que su
padecimiento actual se inició con una
inflamación aguda del ortejo mayor del pie
derecho e intenso dolor, el cual se
intensificaba con el frío y el movimiento.
Además, asegura que poco antes de
presentar este episodio agudo el paciente
había incrementado el consumo de carne,
vísceras, leguminosas y vino de mesa en
abundancia.
Fue tratado con fenilbutazona, pero
presentó daño gástrico, por lo que se cambió
el medicamento por alopurinol y naproxén.
Preguntas de bioquímica
1. ¿Qué alteraciones metabólicas pueden traer
como consecuencia un aumento en los
niveles séricos de ácido úrico?
2. ¿Son necesarias las purinas y las pirimidinas
en la dieta?
3. ¿Qué alimentos son ricos en purinas y
pirimidinas?
4. ¿Qué valores de laboratorio podrían estar
alterados en este paciente?
5. ¿Son importantes los antecedentes familiares
de este paciente?
6. ¿Cuál es la base bioquímica para sospechar
que una dieta rica en proteínas puede
provocar ataques de gota en pacientes
susceptibles?
7. ¿Cómo se relaciona la ingestión de etanol
con el incremento de la concentración
plasmática de ácido úrico?
8. ¿Qué régimen dietético le recomendaría a
esta persona para mejorar sus niveles de
ácido úrico?
9. ¿Cuál es la base bioquímica para la acción
de los medicamentos utilizados en la gota?
Conceptos y áreas de aprendizaje
1. Características estructurales de los ácidos
nucleicos.
2. Biosíntesis y catabolismo de purinas y
pirimidinas.
3. Explicar
cómo
interfieren
algunos
medicamentos utilizados en el tratamiento de
la gota con el metabolismo de los
nucleótidos.
REFERENCIAS
1. Harrison. Principios de medicina interna. 15a.
ed. Madrid: McGraw-Hill Interamericana
Editores; 2001.
2. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con
aplicaciones clínicas. 4a. ed. Barcelona:
Editorial Reverté; 2004.
3. Montgomery R. Bioquímica: Casos y texto.
6a. ed. Barcelona: Editorial Harcourt-Brace;
1998: Cap. 13.
4. Rodríguez Carranza R y col. Vademécum
académico de medicamentos. 4a. ed.
México: Facultad de Medicina, UNAM y
McGraw-Hill Interamericana Editores; 2004.
202