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Mutagénesis sitio-dirigida en la proteína OppA de Yersina pseudotuberculosis
YPIII
Escobar Garduño Elenaa, Soto Urzúa Lucíaa, Scior Thomasb, Baca Beatriz Eugeniaa,
Martínez Morales Luis Javier*a.
a
Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas Instituto de Ciencias, bFacultad
de Ciencias Químicas. Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Edif. 103 J, C.U.
Av. Sn. Claudio y 24 sur Col. Sn. Manuel, C.P.72570, puebla, Pue. Mex.
E-mail: [email protected]
Porcentaje de actividad de αglucosidasa
Introducción. Yersinia pseudotuberculosis tiene sistemas de transporte tipo ABC entre
ellos el sistema de transporte de oligopeptidos (Opp), cuya proteína receptora (OppA)
que tiene actividad supuesta de tipo chaperona y de unión a ligando. La relación entre
la actividad dual propuesta de OppA y su estructura no está analizada, por lo que en
este estudio se realiza sustitución de aminoácidos, para determinar cómo afectan estos
cambios a la supuesta actividad de tipo chaperona en OppA.
Material y métodos. Para determinar los aminoácidos a sustituir, se compararon in silico
las proteínas OppA de E. coli (PDB: 3TCH y 3TCG), de Y. pestis (PDB: 2Z23) y la
chaperona HdeA (PDB: 1DJ8), usando los programas SwissPdbViewer y Discovery
Studio de Accelrys. Mutagénesis sitio-dirigida: Realizada mediante PCR inversa con
oligonucleótidos mutagénicos complementarios. Purificación de las proteínas OppA
silvestre y OppA(mut): El gen oppA está clonado en el vector de expresión pEXP5-CT y
las proteínas fueron purificadas con Ni-NTA (siguiendo las instrucciones del fabricante).
Ensayos de actividad de chaperona: Una unidad de α-glucosidasa se desnaturalizó con
urea 4 M, después de 60 minutos, se agregaron 1.15 μM de albúmina, OppA wt u OppA
R41A/D42A, en un volumen final de 500 μL, por 90 minutos, posteriormente se
agregaron 2 μg de maltosa y después de 90 minutos se midió la concentración de
glucosa con el método de glucosa oxidasa. Los ensayos fueron realizados por
triplicado.
Resultados.
Los cambios seleccionados
Renaturalización de α-glucosidasa
fueron: Arg 41 y Asp 42 sustituidos por alanina,
100
Asp 419 y Tyr 420 por glicina y sustituir estos
50
cuatro aminoácidos juntos. La mutante
analizada fue OppA R41A/D42A. Al agregar
0
solución de KH2PO4 50 mM y KCl 200mM a la
enzima desnaturalizada, el porcentaje de
recuperación de la actividad es del 36%, con
Figura 1. Porcentaje de recuperación de la actividad de αalbúmina
es del 55%, con la proteína OppA wt
glucosidasa. Sin desnaturalizar, desnaturalizada con urea
del 83% y con OppA R41A/D42A
del
4M, agente renaturalizante buffer, albúmina, OppA wt y
OppA R41A/D42A
61%.(fig.1)
Conclusiones. Con los datos obtenidos se comprueba que la proteína OppA, tiene
actividad tipo chaperona bajo las condiciones utilizadas, el cambio de Arg 41 y Asp 42
por alanina disminuye esta acción, lo que sugiere que esa región de OppA, está
involucrada en la actividad de tipo chaperona.