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boletín electrónico de la Sociedad Española de Genética
beSEG22
1.
1.1.
XXXXX 2008
Tesis
Evaluación toxicológica de poblaciones humanas expuestas a fuel del Prestige
1.1.1. Tesis Doctoral presentada por Beatriz Pérez Cadahía el 24 de Noviembre de 2006 en el Departamento de Biología Celular y Molecular, Facultad de Ciencias, Universidade da Coruña, dirigida por las Doctoras Josefina
Méndez Felpeto y Blanca Laffon Lage.
Introducción
que se encargan del mantenimiento general del genoma. Son
relativamente poco frecuentes en la población humana las mutaciones que afecten a la función de las enzimas de reparación
(Au et al., 2003), debido a la gravedad de sus consecuencias.
Sin embargo, se han ido encontrando polimorfismos en varios
de estos genes que pueden provocar diferencias en la eficacia
de estos mecanismos.
Por todo ello, en este trabajo se realizó una determinación
de la exposición ambiental a compuestos orgánicos volátiles
en cada uno de los grupos. Además, se evaluaron los efectos
genotóxicos inducidos por la exposición a fuel del Prestige
durante las labores de limpieza en una población de de 240 individuos [60 voluntarios (VP) expuestos 5 días 4h/día, 60 trabajadores que recogieron manualmente el fuel (TR) durante 4
meses 6.5h/día y 60 trabajadores con hidrolimpiadoras (TH)
expuestos 3 meses 6.5h/día y 60 controles]. Por otra parte se
determinaron las características genotípicas referentes a ciertos polimorfismos presentes en las principales enzimas que
participan en la detoxificación de los compuestos del fuel
(CYP1A1, CYP1B1, EPHX1, GSTP1, GSTM1 y GSTT1) y
en los procesos de reparación del ADN (XRCC1, XRCC3 y
XPD).
Debido al elevado número de vertidos de fuel que se han
producido en los últimos 50 años en aguas de todo el mundo
(más de 377765 toneladas desde 1960 (Vieites et al. 2004)),
resulta sorprendente la ausencia a nivel internacional de estudios que contemplen los posibles efectos que la exposición a
fuel puede ejercer sobre la salud humana. Como consecuencia
de los vertidos existe una amplia población humana expuesta
al fuel de diversas maneras y durante diferentes periodos de
tiempo. Además, debido fundamentalmente a la conmoción
social desencadenada por este tipo de eventos y la premura de
la reacción ante la catástrofe, las medidas adoptadas en cuanto a organización, implementación de medidas de protección,
etc. no suelen ser las adecuadas.
El buque Prestige constituyó el último de ellos rompiendo
su casco a 310 millas de las costas de Galicia el 19 de Noviembre de 2002. El fuel transportado (fuel pesado nº6) fue clasificado como posible carcinógeno humano (Grupo 2B, IARC).
En su composición destacan por su carácter nocivo los VOC,
los PAH y los metales pesados, propuestos por normativa comunitaria europea como principales grupos en los que se debe
centrar la evaluación del riesgo del fuel (Directiva 93/67/CEE,
Reglamento 793/93 del Consejo y Reglamento 1488/94 de la
Comisión).
A la vista de sus características y de las principales formas
de interacción de sus componentes con el material biológico, resultan especialmente relevantes los fenómenos de genotoxicidad tomados como biomarcadores de efectos biológicos
precoces.
Muchos de los compuestos integrantes del fuel adquieren
su potencial genotóxico tras procesos de activación metabólica, siendo ya conocida la existencia de numerosos polimorfismos en genes que codifican para enzimas que participan en
ellos y presentando alguno de ellos consecuencias funcionales
que podrían repercutir sobre la eficacia de la ruta y los niveles
internos de metabolitos intermediarios.
Los mecanismos de reparación del ADN desempeñan un
papel crucial en relación a los niveles de daño genético ya
Material y Métodos
Determinación ambiental de compuestos orgánicos
volátiles (VOC)
Se emplearon 66 dosímetros pasivos individuales repartidos entre los tres grupos de expuestos (28 VP, 19 TR
y 19 TH) para determinar las concentraciones ambientales de 13 compuestos, que son los más característicos
de ambientes relacionados con combustibles derivados del
petróleo: benceno, n-heptano, tolueno, n-octano, etilbenceno,
m+p-xileno, o-xileno, estireno, 1,3,5-trimetilbenceno, 1,2,4trimetilbenceno, 1,2,3-trimetilbenceno y n-decano. El análisis
se llevó a cabo según lo indicado por Fernández-Villarrenaga
Martín et al. (2000).
Biomarcadores de efecto
Se desarrollaron los ensayos del cometa ((Singh et al.
1
1988) con modificaciones (Pérez-Cadahía et al. 2006)) mi- necesidad de un período de exposición largo para que el efecto
cronúcleos (Pérez-Cadahía et al. 2006) e intercambios entre citotóxico se manifieste.
cromátidas hermanas (Pérez-Cadahía et al. 2006).
Biomarcadores de susceptibilidad
Se determinaron los polimorfismos presentes en la región
3’UTR del gen CYP1A1 (Laffon et al. 2003a), codón 432 de
CYP1B1 (Pérez-Cadahía et al. 2007a) codones 113 (Laffon
et al. 2003b) y 139 (Laffon et al. 2006) de EPHX1, codón
105 de GSTP1 (Saarikoski et al. 1998) y poliimorfismos de
deleción GSTM1 y GSTT1 (Laffon et al. (2003b).
Con respecto a los genes de reparación se analizaron los
polimorfismos presentes en los codones 194 y 399 de XRCC1
(Laffon et al. 2006), codón 241 de XRCC3 (Hu et al. 2001) y
codón 751 de XPD (Pérez-Cadahía et al. 2007b)
La edad de los individuos suele influir en los resultados de
los tests de genotoxicidad. El incremento de la edad en los individuos del estudio parece asociado a una disminución en los
niveles de roturas de cadena. Su explicación puede residir en
el tipo de daño que pone de manifiesto el ensayo del cometa,
de modo que el incremento en la tasa de roturas de cadena
encontrado en los grupos de menor edad puede no representar
mayores niveles de daño, sino un incremento en la actividad
de reparación por escisión. De hecho, los datos procedentes de
los ensayos citogenéticos reflejan incrementos en los niveles
de daño en los individuos de mayor edad, resultando concordante con lo descrito en diversos estudios (Barale et al. 1998;
Bolognesi et al. 1997; Fenech et al. 2003).
Asociado de manera especial al tipo de exposición aquí
evaluada se encuentra el tabaco, debido a la cantidad de compuestos que comparte con el fuel. En este caso, es únicamente
el ensayo del cometa el que detecta influencias significativas de este factor (Figura 2), que parece ejercer un efecto
de reducción del daño en el ADN en las subpoblaciones con
una exposición más prolongada, lo que podría apuntar nuevamente a una respuesta adaptativa a medio plazo. Así, los individuos fumadores poseerían una maquinaria más activa tanto
metabólica como de reparación debido a la constante inducción de la misma (Garaj-Vrhovac and Kopjar 2005).
Por otra parte, en este estudio se ha evaluado la eficacia
de las medidas de protección empleadas por los individuos,
consistentes en mascarillas para evitar la exposición por vía
respiratoria y traje completo que evitaría el contacto dérmico.
Sin embargo, el efecto sobre los niveles de daño ocasionados
no ha resultado determinante, lo que indica que las mismas no
ejercieron una protección suficiente frente a esta exposición.
Atendiendo a la posible influencia de polimorfismos en
genes metabólicos o de reparación sobre los niveles de
daño cabe destacar que el descenso de la actividad epóxidohidrolasa generada por la presencia del alelo variante del
codón 113 del gen EPHX1 se asocia en general con disminuciones en la tasa de daño. Paralelamente, mayores niveles de
daño se obtuvieron en individuos portadores del alelo variante del codón 139, que provoca una aumento en la actividad
de la enzima. El efecto observado resulta previsible debido
a que los compuestos más reactivos y considerados últimos
carcinógenos de la exposición a PAH son los diol-epóxidos
(Pavanello and Clonfero 2000), generados tras la acción de
esta enzima, por lo tanto una reducción en su tasa de actividad dará lugar a menores niveles de exposición interna. Resulta también destacable el efecto de los polimorfismos estudiados en los genes GSTP1 (principal enzima implicada en la
detoxificación de estos compuestos (Sundberg et al. 1998)) y
Resultados y Discusión
Resultados y Discusión Estudios previos realizados en
poblaciones expuestas a vertidos de fuel describen irritaciones
en la piel y ojos, dolores de cabeza, problemas de carácter respiratorio y alteraciones de índole psicológico (Liu et al. 1998;
Morita et al. 1999). No obstante, dado el carácter potencialmente carcinogénico asignado a muchos de los componentes
del fuel, resulta necesaria una evaluación desde el punto de
vista genotóxico de la población para determinar de manera
incipiente el posible daño ocasionado.
La fracción de fuel integrada por los VOC constituye una
de las principales fuentes de exposición tanto por el carácter genotóxico de sus integrantes como por su elevada tasa de
volatilidad. Los valores medios obtenidos fueron más elevados (con un P≤0.05) para el grupo VP, seguido de TR y por
último TH (Figura 1). Estos niveles resultan similares a los
de ciudades altamente contaminadas como Atenas y Méjico
y más elevados que los detectados tras el vertido del buque
Nakhodka en Japón (Morita et al. 1999).
Los tres tipos de ensayos de genotoxicidad empleados,
evalúan de forma diferencial no sólo del tipo de lesión en
el ADN sino también su alcance. El ensayo del cometa refleja lesiones primarias, fundamentalmente roturas de cadena
y procesos incompletos de reparación por escisión, poniendo
por lo tanto de manifiesto un daño relativamente reciente (Sul
et al. 2003). Incrementos en los niveles de daño en el ADN se
han asociado con todos los grupos de exposición, resultando
más acusado el incremento en VP, de acuerdo con los mayores
niveles de exposición ambiental a VOC (Tabla 1). Este hecho
apuntaría a un posible fenómeno de respuesta adaptativa ante
una exposición prolongada, propuesta hoy en día en diversos
estudios (Fenech et al. 2003; Gourabi and Mozdarani 1998).
Los ensayos citogenéticos MN y SCE reflejan incrementos en
el daño genético en los grupos de exposición más prolongada, TR y TH respectivamente. Los resultados, por lo tanto,
parecen indicar que la mayor parte de las roturas de cadena
detectadas mediante el ensayo del cometa fueron reparadas
o procedían de procesos de reparación por escisión, ya que
no alcanzaron a convertirse en alteraciones citogenéticas estables. Incrementos en las tasas de ambos parámetros debidos
a la exposición hidrocarburos se encuentran reflejados en diversos estudios (Çelik et al. 2003; Siwinska et al. 2004). El
índice CBPI (Cytokinesis Blocked Proliferation Index) refleja
a su vez un retardo del ciclo celular en los grupos TR y TH.
Dicho efecto no se ha observado en los VP, lo que sugiere la
2
GSTT1, presentando en general los individuos que poseen las Bibliografía
isoformas con mayor actividad menores niveles de roturas de
cadena y MN, probablemente debido a la mayor actividad de
Barale R et al. 1998. Environ Mol Mutagen 31:228-242.
detoxificación de las enzimas.
Bolognesi C et al. 1997. Environ Mol Mutagen 30:396-402.
No obstante, desde una perspectiva genética es poco probable que un solo polimorfismo en un único gen altere la expresión o la función de proteínas específicas para llegar a producir un fenotipo patológico (Matullo et al. 2001). Teniendo
en cuenta además que diferencias en las tasas de actividad
en distintos niveles de las rutas metabólicas poseen influencia sobre los adyacentes hemos realizado un análisis combinado centrándonos de manera especial en los fenotipos esperados que pudieran resultar especialmente desfavorables en
cuanto a acumulación de especies reactivas (Figura 3). Sabiendo que los compuestos más reactivos, y causantes en mayor medida de la carcinogenicidad de los PAH, son los diolepóxidos, generados tras la acción sucesiva de las enzimas
CYP y EPHX1, cabría esperar que los individuos con mayores tasas de actividad para ambas resultasen expuestos a una
mayor dosis interna de dichos compuestos. Así, en los resultados se aprecian incrementos en la tasa de roturas de cadena
asociado a los individuos portadores de los alelos variantes
para los genes CYP1A1 y EPHX1 (codón 139). En cuanto a
los procesos de interacción entre los distintos pasos de la ruta se observa que el genotipo más desfavorable resulta ser el
portador del alelo GSTT1 nulo en homocigosis junto con al
menos un alelo variante de EPHX1 para el codón 113. Esto
probablemente sea debido a un bloqueo relativo de la detoxificación de los compuestos intermedios, al tener mermadas
las dos vías principales de metabolización.
Çelik A et al. 2003. Mutagenesis 18(5):417-421.
Fenech M et al. 2003. Mutat Res 534:65-75.
Fernández-Villarrenaga Martín V et al. 2000. Analusis 28:737-742.
Garaj-Vrhovac V, Kopjar N. 2005. Appl Toxicol 25:184-192.
Gourabi H, Mozdarani H. 1998. Mutagenesis 13:475-480.
Hu JJ et al. 2001. Carcinogenesis 22(6):917-922.
Laffon B et al. 2003. Toxicology 186:131-141.
Laffon B et al. 2006. Environ Int 32:342-348.
Liu Y et al. 1998. Mutat Res 413:39-45.
Matullo G et al. 2001. Carcinogenesis 22(9):1437-1445.
Morita A et al. 1999. Environ Res 81:185-194.
Pavanello S, Clonfero E. 2000. Mutat Res 463:285-308.
Pérez-Cadahía B et al. 2006. TheScientificWorldJOURNAL 6:12211237.
Pérez-Cadahía B et al. 2007. Toxicol Sci. (In review)
Pérez-Cadahía B et al. 2007. Basic Clin Pharmacol Toxicol. (In review)
Saarikoski ST et al. 1998. Int J Cancer 77:516-521.
Singh NP et al. 1988. Exp Cell Res 175:184-191.
Siwinska E et al. 2004. Occup Environ Med 61.
Sul D et al. 2003. Mutat Res 538:109-119.
En cuanto a la influencia de variaciones en las actividades Sundberg K et al. 1998. Carcinogenesis 19(3):433-436.
de reparación del ADN derivadas de polimorfismos en genes Vieites DRN-R, S et al. 2004. Naturwissenchaften 91:535-538.
que codifican para las proteínas participantes en dichos proLos resultados del presente trabajo han dado lugar a
cesos hemos observado que el descenso en la actividad de
las
siguientes
publicaciones:
reparación determinado por la presencia del alelo XRCC1T rp
194
lleva consigo una disminución en la cantidad de ro1. Pérez-Cadahía, B., Laffon, B., Pásaro, E., Méndez, J.
turas de ADN y un incremento en la frecuencia de MN, lo
(2006) Genetic damage induced by accidental environque sugiere que muchas de las roturas detectadas mediante el
mental pollutants. TheScientificWorldJournal. 6: 1221primer ensayo son resultantes de de procesos de reparación
1237.
por escisión incompletos. La presencia del alelo XRCC3M et
241
da lugar en general a un incremento en la tasa de
2. Pérez-Cadahía, B., Lafuente, A., Cabaleiro, T., Pásaro,
daño, probablemente debido a la reducción en la actividad de
E., Méndez, J., Laffon, B. (2007). Initial study on the
reparación.
effects of Prestige oil on human health. Environ Int. 33:
176-185.
Considerando las serias propiedades nocivas de los compuestos integrantes del fuel, la amplia población humana ex3. Pérez-Cadahía, B., Pásaro, E., Méndez, J., Valdiglesias,
puesta tras la catástrofe y la ausencia a nivel internacional de
V., Laffon, B. (2007) Genetic Polymorphism in Cyestudios que contemplen los efectos crónicos derivados de la
tochrome P450 1B1 in a Spanish Population. Basic Clin
exposición a fuel, en este estudio se ha llevado a cabo una dePharmacol Toxicol. 101:70-72.
terminación de la exposición ambiental y los niveles de daño
genético presentes en los individuos. La gran cantidad de re4. Laffon, B., Pérez-Cadahía, B., Pásaro, E., Méndez, J.
sultados obtenidos en este trabajo ha permitido concluir que
(2007) Human health: the great forgotten after accidenlos parámetros seleccionados han demostrado ser buenos intal oil spills. Environmental Research Advances. Nova
dicadores de los procesos de toxicidad derivados de la exposiScience Publishers. (En imprenta).
ción a fuel procedente del buque Prestige, así como la influen5. Pérez-Cadahía, B., Laffon, B., Porta, M., Lafuente,
cia de otros factores asociados o la existencia de diferencias
A., Cabaleiro, T., López, T., Caride, A., Pumarega, J.,
en la susceptibilidad individual a los efectos. Por todo ello,
Romero, A., Pásaro, E., Méndez, J. Título: Relationconsideramos que para evaluar los riesgos que comporta una
ship between blood concentrations of heavy metals and
catástrofe de este tipo se deben realizar estudios que contemcytogenetic and endocrine parameters among subjects
plen detalladamente el tipo de variables a tener en cuenta y
involved in cleaning coastal areas affected by the “Prespermitan establecer un protocolo de actuación concreto para
tige” tanker oil spill. Chemosphere. (En imprenta)
minimizar el posible daño ocasionado.
3
6. Pérez-Cadahía, B., Lafuente, A., Cabaleiro, T., Pásaro,
La realización del mismo ha sido posible gracias a la asigE., Méndez, J., Laffon, B. (2007) Biomonitoring of hu- nación de una Beca de Formación para Personal Investigador
man exposure to Prestige oil: effects on DNA and en- (Fundación MAPFRE–Universidade da Coruña (2003-2004))
docrine parameters. Occup Environ Med. (En revisión). y una Beca Predoctoral de la Universidade da Coruña (20052007).
7. Pérez-Cadahía, B., Laffon, B., Pásaro, E., Méndez, J.
(2007) Cytogenetic effects induced by Prestige oil on
human populations: roles of metabolic and DNA repair Miembros de Tribunal
polymorphisms. Mutat Res. (En revisión).
Dr. Verea (Jefe del Servicio de Neumología. Complejo
Hospitalario-Universitario Juan Canalejo), Dr. Porta (Catedrático de Medicina Preventiva y Salud Pública de la UniverAgradecimientos
sidad Autónoma de Barcelona), Dr. Marcos (Catedrático de
El presente trabajo fue realizado en el marco de los Genética. Departamento de Genética y Microbiología. Uniproyectos de investigación “Recogida y limpieza de fuel del versidad Autónoma de Barcelona), Dra. Mayan (Directora del
Prestige. Evaluación de la exposición y daños a la salud Departamento de Salud ambiental y Toxicología del Instituen voluntarios y trabajadores” financiado por la Fundación to Nacional de Salud Dr. Ricardo Jorge. Porto. Portugal) y
Arao y “Evaluación de poblaciones humanas expuestas a Dra. Lafuente (Catedrática de Toxicología. Departamento de
carcinógenos o mutágenos potenciales” (Xunta de Galicia, Química Analítica y Alimentaria. Universidad de Vigo).
PGIDT04PXIB10602PR).
Calificación obtenida: Sobresaliente cum laude.
4