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MAESTRÍA EN CIENCIAS Y BIOTECNOLOGÍA
DE PLANTAS
DESARROLLO DE UN PROTOCOLO PARA
LA CONSTRUCCIÓN DE UNA BIBLIOTECA
GENÓMICA BIBAC DE BANANO (Musa ssp)
Leticia Peraza Echeverría
Centro de lnvestigación Científica de Yucatán, A.C.
Posgrado en Ciencias y Biotecnología de Plantas
Desarrollo de un protocolo para la construcción de una
biblioteca genómica BIBAC de banano (musa ssp)
Tesis que presenta para obtener el grado de
Maestro en Ciencias
Leticia Peraza Echeverría
CENTRO DE INVESTIGAclóN CIENTÍFICA DE YUCATAN
Mérjda, Yucatán, México
2003
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo se realizó en los laboratorios de la Unidad de Bi.otecnología del Cen{ro de
lnvestigación Científica de Yucatán, A. C. (CICY), bajo la dirección del Dr Andrew C.
James K. y el Dr Dieter Kaemmer a quienes agradezco su amistad, confianza y
apoyo.
Agradezco de mariera importante la beca-crédito recibida durante el primer año de la
maestría, al Conseio Nacional de Ciencia y Tecnología con el número de registro
162940.
A los revisores externos, Dr. Miguel Gómez Lim y Dr. Jean Philippe Vi.elle del Centro
de lnvestigación y Estudios Avanzados del l.P.N. (CINVESTAV, Unidad lrapuato), por
susvaliosassugerenci.asquepermitieronenriquecerestetrabajo.
A los revisores internos Dra
Cecilia Rodri'guez G. y Dra. Blondy Canto C. por su
amistadysusexcelentescomentariosyaportaci.onesparamejorarestetrabajo.
A la Dra. Mi-Kyung Lee por su valioso apoyo {écnico y amistad durante la estancja de
entrenamiento en la técnica para la construcción de bibliotecas genómicas BIBAC,
realizada en el laboratorio de SoW and Crop Center del Texas A & M University, bajo
la direcci.Ón del Dr Hong-Bin Zhang, a quien también agradezco su amistad y
confianza.
A Pablo, Tere, Rosa e llka, compañeros de posgrado, por su amistad.
A todos y cada uno de mis amjgos del grupo de plátanq
compañerismo, entusiasmo y apoyo.
por su amistad,
DEDICATORIA
AmimadreDalja,miabuelaEstílitaymiabueloSebastián(q.p.d)porquesinsuamor,
apoyo y enseñanza no hubiera yo llegado hasta donde me encuentro ahora.
A mis hijos Ricardo, Eyner y Eri.ck por su amor jncondicíonal, su paci.encja y su
entusjasmo.
A Santy, Vicky, Wi.lly y Mary por su cariño, ejemplo y confianza.
Sin ustedes hubiera sjdo imposible
Contenido
Resumen
Abstract
lntroducción
Capítulo l
Antecedentes
Generalidades del género Musa
El genoma del género Musa
lmportancia económica de bananos y plátanos en México
Selección e Íntroducción de cultivares resístentes
Obtención de nuevos clones generados en los programas
de mejoramiento convencional
Banano silvestre Calcutta 4 (Musa aoum/.naía ssp Oumannicoides)
lntroduccjón de plantas genéticamente mocljficadas a través
de la transformación genética
Vector binario tipo cosmido pCLD04541
Principales pasos para la construcción de una biblioteca genómica con insertos de ADN de alto peso molecular
Objetivo general
Objetivos específicos
Estrategia experimental
Referencias
Capítulo ll
Preparación del vector binario pcLD04541
33
lntroducción
Materiales y métodos
Obtención y purificación del vector de clonación
33
33
pCLD04541
Purificación del vector pCLD04541 mediante
35
gradiente de cloruro de cesío
Linearización del vector pCLD04541 con la enzima
35
BamH 1 o Hi.ndl 11
Desfosforilación del vector pCLD04541 linearizado
Resultados
Obtención y purificación del vector de clonación
pCLD04541
Linearización y desfosforilación del vector
pCLD04541
Discusión
Referencias
36
36
37
37
37
39
41
capítulo '11
Preparación de fragmentos de alto peso molecular
lntroducción
Materiales y Métodos
Material vegetal
Extracción de núcleos de Calcutta 4
Deteminación de las condiciones óptimas para la
digestión parcial del ADN genómico con las enzima
BamHl o Hi.ndlll
Selección de los fragmentos de ADN de 100 a 400 kb
por electroforesis de campo pulsante (ECP)
Resultados
Extracción de núcleos de Calcutta 4
Selección de los fragmentos de ADN de 100 a 400 kb por
electroforesis de campo pulsante (ECP)
Discusión
Referencias
Capítulo lv
Obtención de clonas BIBAC
lntroducción
Resultados
Ligación del vector V41 con los fragmento de ADN
seleccionados en las fracciones Fl y F2
Número de colonias necesarias para tener una
bi bl ioteca representativa
Referencias
Discusión general
Conclusiones
Perspectivas
Anexo
50
61
63
65
65
66
Materiales y métodos
Ligación del vector V41 con los fragmentos de ADN
seleccionados en las fracciones Fl y F2
Digestión con la enzima ~ofl y deteminación del
tamaño promedio de inserlo
Discusión
45
66
68
68
RESUMEN
Los
bananos
y
plátanos
representan
un
cultivo
de
gran
importancia,
:,|':c::ta:mb::::oenA:?Smgs,Íseessupnoabí:spg:aA::,fuecnet:trda:á":staesdeenAsta:r,yáE::n:syue|
Caribe Sin embargo, este cultivo es amenazado por plagas y enfermedades que
causan cuan{iosas pérdjdas en el rendimiento, y por consecuencia en las ganancias,
ap'r%cg\raan#?scodnees#.?orp.e#t.e,33osíyiÉ_-¿;ii:'á5S;í:e_yd_uv|cu!'or*:Snuqeung'aseeF:fsag=an=ofiÉadss
prograrnas de mejoramjento para la producción de híbridos resistentes a las
principalesenfermedades,nosehaobtenidoalafechaningúnbananooplátanoque
cubra los requerimientos necesarios que exige el mercado internacional, en respecto
como por ejemplo, la palatabilidad y la fisi.ología postcosecha.
Es um necesidad entonces, el buscar nuevas altemativas para la obtención
de plantas resistentes de banano que mantengan las caracteríslicas originales de
palatabilidad, tamaño de racimo y el tiempo de almacenamien{o, por ejemplo Una
alternativaquepuedeserutilizadacomoherramientaparaelaislamientodegenesde
i.nterés (como los de resistenci'a a enfermedades), es la construccíón de bibliotecas
genómicasconinsertosdeADNdegrantamaño(enpromediomayorque100kb)a
#¿redneseesrp:C::tseF:S:Ssteen;eÉac:/rfyerAm,e„d;8:asc,ye:!"'Zpaanr:°sveegcut%r:#||:r::asn':fser:::'::
resistencia parcial o total a vanedades susceptibles de importancia económica, a
través de la transformacjón mediada por Agnoóacíeri.um. Esta herramienta no solo
podrá ser utjlizada para el aislamiemo de genes, sino también para el estudio
completodelgenomadelgéneroMusa,delcualseconocemuypoco.
Ean ss'o bp:e#ann'=¡.t:3ribaa.j?,ns^er.S,e^'.3uC^C'en_ó_ _=I_ bapaio silvestre dipio.ide Musa
las
?acsu%gnaat?c,sosnpesbugEt2#na,gcoida:5-t:,OP6-.c^f,--c;iS;v8i3cvoÍ_t#=:ed.:;.ao,bsi'gxóegs:£pa=Egogds?ab%eucsear
condiciones Óptimas para la construcción de una biblioteca genómica BIBAC,
debido a que este banano es la principal fuente de resistencia contra la Sigatoka
:t:,?zr:d:peasraui:'zc:g:a:,:n'of:epá:g:,apTacsósdme,dTej:nr:rTo,,eáteonoc:?nvaedn.c,:nca[DOEJ5Z:?t:Í
cual ti.ene un tamaño de 29 kb. El vector
pCLD04541 fue purificado utilízando dos
gradientes de cloruro de cesjo, posteriormente se linearizó con la enzima BamHl o
HÍ.ndTIl y se desfosforiló.
Se aislaron núcleos de hojas jóvenes obtenidas de plantas ex vtíno y se
incluyeron en agarosa de bajo punto de fusión formando bloques, los cuales fueron
digeridosconproteinasaKparaliberaralADNyexponerloaunadigestiónparcialcon
la enzjma BamHl o Hr.ndHl, ensayando previamente diferentes concentraciones de
cada una para determinar las concentracjones Ópti.mas a las cuales se obtenían
fragmentos de ADN entre 100 y 400 kb Para la obtención de estos últimos se
procedjódedosformas:1)realizandounaprimerayúnicaselecci.óndefragmentosde
ADN,y2)efectuandoprimeraysegundaselecci.ÓndefragmentosdeADN.
tantodeE±tv::tooor.238akrbz,a::mf:ed:gÉ£:2d534moaon:rba,::g:,%en::,eunnt:rce::c:3;f:aoTaTe]n2o3
14 (inseftovector) Se electroporaron 20 Ltl de células competentes DH10B usando
k_5G;L2,H:edsep:%3c,8:y2;eF,asqeueá:::r:Tngeed,,onsueLeecrt¿vod:Bcco::n::tsra::C::n#:aTn€e:
(blancas)Posteriormente,afindecaracterizarlasligacionesobtenidasencuantoal
tamaño de inserto y el número de colonias con vector sin inserto (clonas vacías) se
analizaron colon.ias al azar (de F1), aislando el ADN recombinante med.ian¢ mini
preparación y digiriéndolo con la enzima Non para liberar al inserto y determinar su
tamañopromedioSeseleccionarondosligaciones,unaprovenientedelasfracciones
¡,r:o;ríí:2s;:::deB¡rT:#ecnot:su:,:aeTa::g:onmHe,:,á,¡ec:nnseuftnotg::2:#oym,:d::rae„Fnasc:::
Con estas ligaciones se pueden constrw dos bibliotecas genómicas BIBAC
ii;,Ía::?án:oddceá:;:;i::n:cr:r;r:,:.:;dr:d::e:rtoeng:un:o:x::t,::::n::s:r::,:ti;'ro`:o:rai:la,:o:p:rn:;":ei:;
estarán listos para ser utilizados en la transformación genética de plantas
Agrobacterium
mediante
ABSTRACT
countr,e:::a:::t:a|dAE;,a=úánnsdaer:stmAPs,:a:Lecrreopti,eypaahr:cu:#,:n,o.pdosord;:::ooi,:,:
bananasarethesourceofanimportantinputofforeigncurrencyinLatinAmericaand
:hneor%rLbsbFoasnsesH:nw:hv:ry,teh,'dsac:3Pth:tphrroefi:teb|,:;,bayffepcet:nt§8:fh€Lseeassme:„t:::dcuacuesr:
and the large banana expo" companies Although many resistant hybrids have
been obtained from conven{ional breeding programs, to date none of the resistant
banana hybrids developed attain international s{andards, in respect of for example,
palatabi.lityandpostharvestphysiology
M js therefore necessav to search for new alternatives to obtain disease
resistant banana plank that maintain their original traits such as palatiabmw bunch
size and sheM life. An alternati.ve triat can be used as a tool for the isolation of
:nfteáfsset:nsgeg:ens:stasnutchw::r:s:s::enscea::necsu,,t,,::hmeui:eosf:arggeen;n::chg;rnao,::c,árnar,::
;ohTcs;r::tne3ewiha,:'tga'n:do::cbu::[:e:goh,,taDnTAAárooór:c!::,:;ogukbbs,e::,:gt';,,|:svp::::3í:
to
transfer
parcially
or
totaw
this
resistance
by
Agnoóacíenum-mediated
:r,3:sí:rc::t:o:igtn:f,::n%oennooT,Fca::s:|Pcoensafnotrti:ssct:gt;bá:tx:r#sasguecnhoLb:ar,esmay
lnthisworkthewimdmbananaMusaaoum7naíasspbumannícoidestype
:fa,::s%t:hcweasksn:,::te:gt:,::tnsár,::tkag%na:omk,:„£:adv,,sbeug:dsef:r,stth[:mp:,rnpossoeur::
:::#t't%T:'e3r3%dL3go4P5r4°íg,rawmh:chhTahse:esc,tz°eroufs28kf8r+t::8:B84;4aísvt::to:'nwaa?
#TtrÁfi;gmu;',nogr#:di?,Uannddsd°efpcheos:;To#::'gegradlents,Subsequentlyitwashneanzed
Nuclei were isolated from young leaves obtained from ex vitro plants, these
were embedded in agarose plugs (LMP),
and di.gested with proteinase K. A wjde
range of restriction enzyme concentrations were used to obtain the optimal partial
digestion conditions wm BamHl or H/ndlll in order to obtain fragments between 100
::g,42°)°fii:t::d°sper:::8U::zsews:i:c't:oS;e:ft°DR&{a;rna:r£%Tt:n+She`),nae:::zte%'Zvees:J:C*::
Iigated independenw wm the fragments from F1 (100-250 kb) and F2 (250400 kb)
using molar ratjos of 1.2 or 1.4 (inseh..vector). Twenv mi.croli.tres of competent cells
LDeHdíuo:)w#rteet::eccyt:#:,a,t:ÍGW,áhnd|;-HéAo[2Á,ft::t2:,Lgiht:d.::!e:nod,p,:act::g,nnaLn:
cells (white) were recorded Subsequently, with the aim of characterizing the ligations
í::tJ:c,tno:::oiázt:daE;thme,nn,:re::rd?gfeesTepdvw:toh,o;;efls,ecn:,yo:,:stowreer,ee:::d,::,,yns:L:cáendd
theaverageinsensizeestimatedbypulsed-fieldelectrophoresis.
ave,ageT,#e,Lg3izoen:fw,e2r:i:,:Cnt:dth:noethf::Trof:gfra?nJseft,ged:;eedst:áthwpt:mHT;dY,',thwit:
:Fbaavne::3ed:Fceuh"S'Zec:fníb2e2c2o7n5tbruc#oih4eosxet'hgea#:;Fo#:eBn':#:s:::°gTv',:;'baragr¿eo/:
ofprobabilivofincludingaugenesinthelibravThisisthefmttransformation-ready
banana genom.ic library constructed with a binary vectctr.
lNTRODUCCIÓN
Los
bananos
y
plátanos,
pertenecientes
al
género
Musa,
son
F.,gTen!Io±LS?_#,con_ape_soa_rs€=ohne#osana&aioc±su*iaeotFiicg#FiasR.b!3_f_5!?=_ag_géoon?fdoeECs_r#E:,pngrc£enes
8'hp:°p'£::ed?[°9P5°5r)C'°nar°n
'OS
genomas
A
y
8
respectivamente
(Simmonds
y
Los cultivares comestibles son considerados tanto alimento básico, como
:Tg-:rhóap|:eosfu::Leeá:sgaÁa:,:,:,s;:n,g:a,p::seei::avJ:§c:ft,Joesa:ÍLo:,:i,c::,,?se:rpóupé:oseí
ap^ror_:_z_ü.nt:'gaomyphga:azngsedeencvuaí,net€a:d¿€:!tF:,aa-d<.o=S=£.,E.á"s?.d^c::|`'9vPopa='i£eesnt¥c'eo¿taae#nús££:Éde:
por un amplio rango de variedades, Ias cuales incluyen tanto bananos que son
ingeridos como fruta de postie (porque en su madurez son dulces y fácilmente
digeribles) como plátanos que son generalmente más almidonosos y pueden ser
ingeridosmaduroseinmadur®Estosúltimossonfritos,cocidosotostadosDeeste
¡EUut:sesg:ovpeYeídge7n2)°btener tamb'én harlnas, mermeladas, puré e inciuso cerveza
tone,adaLsampertorfcuacs?'áé,aa:u:Laiesn,:f,98mo,on:.:,p:osdudc:dg,reendeÁdf::a:eAs::d:i"g::;ficdo:
AméricaLatmylasregionesdelCaribe(FAO,2000)Alrededordel87%detodoslos
bananos y plát~ crecidos en el mundo son producidos a pequeña escala en
huertosfamiliares,paraautoconsumooparalaventaenelmercadolocaloregional,y
ita;iob:aí;:tdi:,:i¡ne:o:cáu:i:::tií:,a]Í#T::aegeccj:jjrn¡:i;f,;;i;Fii::ii!ijnfí:;:o;?m;:o;:r.:;:a:y:ej
i!u:fi:e;rfiíijíjiE::P;añjr;::;e;c:Í:te;n:fi.ioi:tsc;oij;Í:i,;:sg!:i;ií:íj!i'Ís!,Íí:i::;ic:£:id;::::n;jsc;c::!Ici::jac=;ie;s::;
de Panamá, ocasionada por el hongo Fusanum oxyspowm Schlecht f cubense
(Purseglove,1972)EstecuMfuesustituidoporcultivaresdelsubgrupoCavendish,
:'xep:!:oc,gned:s;e:n::ose|encT:t,:::u:i,:::osfn,gea:tbe:,rg:,:sut:,s::g:Lp:oT:n:::ece:?,b,,:
#áosepn^f::T;,áag"d,es,:mineaadc:sE,gatoeknafe::gerdaádqg:edeessoe=::on|:oq:dapo:eed,,a::enq:
#,acá:Í:sc::,;nuuearg:rfeusnegnut:c,ud:;;eg:roopeasrtaoe:,:vead::sa:obs,teonsted,,:r3:rucdc,hóunmhaansáa4o
Dentro de las estrategias planteadas para superar tanto las plagas y
enfermedades,asi.comomejorarlascaracteri.sticasagronómicasenlaproduccióndel
banano(PersleyyDeLanghe1987)sehapropuesto:
5
a)LainlroducciónyseleccióndecultivaresresistenlesSehantratadodesustiw
:::t,,:,aerne,:s,,ot::l:sendimpe,r::aan::nt:au,s,c:::,rbe,te:t:,o,rlg::t)Yacr::oseehe:F:oensatgodseÁ?rTc:
avc:y:tsat:,kóenepfo:,óalhgeg3,e,:,snper:dbua:tgooré:,daeT,bd:sac,aasso:,fne:esnec,tausv:nc?ampp::::a3#oa:nla
b)Laobiencióndenuevosclonesati.avésdelosprogi.amasdemejoramiento
iiieir:m::c:;Íaeí:::r::#,:;:;;oiíí;3;:o,s;:p3::s;t,:id;:a3i::i;p5rait;f:ó::::n:¡r;n:go:1íi:JC;;::eir`:eí;:;
esencialmente en el meioramiento de parentales masculinos, con la consecuente
creacióndediploidessintéticos,seguidodecruzassimplesconloscultivarestriploides
e3nqe:Í,::;niti:1:9:;É,:asBdre::;::c;::or;geáihgtb;,:s:;Í::ri:i:,i,;ia:cb:;d:;;::;neu:toeh:a:a::::o:iiei8:!:es,
i:áá:n:or::y::rnp:a:ft:::eo::,;:i:::aesi:hEaepr:a::d:ut:,i;oevn:f:::;,:e:ti::l::i:::£etto:r:eT:e;:rt::::;
una buena ó excelente producción de racimos Los parentales femeninos utilizados
Pma::c#::arr::::tse:tí::`d:SjTf::::t::"`::::rsmdeed8:á::r°fsu'e%`:nterFsb:::i%S::Leen:i'b::
Pisang Lilin y el banano silvestre Musa acuminafa spp burmannico/des, mejor
g:gn:tc:!:nc:gT:,,,:§,,?::osaa,::fta:"ía(yDa::aa,%:ebalng::,áesteu,t,moesres,Stenteala
ct La producción de plantas genéticamente modificadas a través de la
tg,:nnés,i:aT::::nmgoedTfifctácdaasEt,,eT:,ogrraaT,eai:oncTÓon,eá:L:áopaarat:aaot:e:c#,ad:apLaant3:
icioc:n;áa::n,t.en::i#:bs::u?3:u:p::.ii3e:s:t!e:::idí#ní:::n:::nLÉo:sr:3:!,:;::s:r:e:srai!h:o:sJr:c:::Fü:t;
::,ses:t%gr:p:stdáe:%sgepj3::::sg#t,a,,ará::::eFace,::;:dTcac:::,,nd:ecsaráocTe¡,,:tt,::sendt:
resistenciaatravésdelatransformacióngenétimeslaalternatMenelmeioramiento
:net:o3:::,nóontes:3:egroaoc%nL:sttar3,nesfg:má:Lóensgeennéet¡C:e:::daensuecr,eda:f,::::p:oormyo::
iídñ:i:i;íj:;:s:;d;:i:;n::;íiíi;i;ís:ÓÍ;;:;;i:ia;ije;#;j:i:ÍÍ::níg;;,;;;:u;;;:jfi:::caiígi;:sjA:£d;:o::i;:;ii[#ii(i!;id!o
desoxirribonucleico) de gran tamaño (mayor que 100 kb) listas para usarst en la
tiro:,i:.f:o:q:icu::en.éono;:u:ecn:t::i:a:3:a!t:e:,ig:ats:vj:opir:as,:,se`áa:nr::s:'::|::i:áai:o::::`Ta:r:::i3sirugs:;:;
6
de dichas bibliotecas pueden ser del tipo "Cromosoma Bacteriano Artificial Binario"
•íB;bíi;eíiii:;í::rsa::i:Tií;jnii:£hí::;:;i;s;íi;ci:d;j:emeiAS:!:íj::#::aí!:::oin¡;b:,a:nn::,inig::r!a:|::íie;ñ¥;;ai
genómiffi BIBAC que pueda ser usada inmediatamente en la transformación de
plantas.
Enelpresentetrabajosedesarrollounprotocoloparagenerarunabiblioteca
genómica del banano silvestre Calcutta 4, como se mencionó an{eriormente, este
:::raanoE,P::::orrs:,,:t=n,:,naadc:nftur:dv:r::pso::fseJTdeo,apdceibá¡g::,,a:T::;:::ft:,.geaé:k:
los vectores binarios convencionales (PBC)
La construcción de es{a biblioleca, asi'
:::Ff:tuurcoareancte:ríáas::é:,dceo::tht:?edne,:ess,ps:,emn:::spg:as::spt:,:orq;:ni:::aa.sfeorr;t:,rz:g:
dichogenesalgúnbananodeinteréscomerci.al
REFERENCIAS
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J:a;:'t:t2::§ií§:¡a§:§a:Íd;§Ín;;°:§:§;i!§íijiíiiiii:§:§§íi;í;:¡Í§::;j;i;;Í;b:a;Si:;;:::fi|;:;;i;;ní:;Ís;usi:;bs::i;n;:et:m;:a:S
Scjentia Horticul{urae 25, ppl 37-147
:P:e;e:eg:§Í:ii:::eii:Íii;P;rLi:§;íiig§jg:fr:;(:F;d§;::n:£:t:::7n;;n:B;::::S:h::a:nd:L:j:r:d:;s';:b;::;;íísg:acnt::er
sa-T::oa:,::::én:a::cgsní;infete:b:u;,e:tf:nbL:nToaah:Hf#::es::!:re4,s|:s7:nct::fpu,,:r:agr,cu,ture
Possibilities ln Disease of bananas, abacá and enset, Jones, D R (Ed) Cabi
sá-;pán::Ls;;n;gr::p::á:s:,Í6é::cTreonpno,:t,eES::aT:,,kaues:,spp,|9c#,"EÍ::S3:P,,cABB
group) protoplast isolation from regenerable embryogenic cew suspension
7
:::,:Lo;Ía§n,;3:::#e;p;íjj:3Í{:§n;::;:::o6í:Kf%,r,Í9::t¡o;ny::¡3e:;í::aoía;¡;dna:p:an:::::na:n{:::,:vp:ptTe:,,a
Tao'Qba:T:ar2ás83Jg'kLin-npni:¡3:):c?ñ;an,:g,:a5l:::ta:b:ij#ot::Fnpi:so:Erb£::adg,::t:rs
TheG,:::,,eúcué:,dG:::emairccsh,cVooL3:í#2o4og,o,lát:?t:gyfortheg,oba,M"a
388:T'€i833|Sp°pft;tsmRep°h°fameetingheidinA"musA,i7.2o„
vuy,ste;i;;,Joépr::,,ijgg::c5i,::pr?eaenriga:::a:::,;::h:G::a:r:e,ig:a,rcc:h:;;,:ioe#:p:,n:;t4::3;:tnst,tute
CAPITULO 1
Antecedentes
GENERALIDADESDELGÉNEROMusa
:%fs°:Td%:::°n:eí:?onr%€ash:eorrg:C:e:a::eci;r,:a!Toegs:::'iaass:v:a:n€t:a'}°miá°£r:Unce:S::;od¥:a:r:§tseár:ádna::s:
fi::ñ::Í;:::u:Ld:aocs;!,;;;a:Sspii::d;eí:n:fír;#j:a:;ivíñií,;:er:;i:ttíi,,;oiiii#,:;í;f:;d::i:;:;j,:iea;d,iae:;::i:
f:rn::c:¡f:csa:c¡:::::e;:,,g:s,aá%a,::d#:ucau::ddaób:::d:::o;:,#gr£:s:,sáénnzgu:,sÉ:fñná,e::
Lasbrácteasylasfloresinseftadasindependientementesobmelpedúnculo
:::u:onT::::nioesdneucá::a3ásí,ceespt:a?afr,:r,:ss%asr:oui,nf::c::ná|ecsu::t:::::r:ossqnuueds:
distales,lasbrácteassondecolorrojizo,púrpuraovioleadebtialasantocianinas
í%J:rrn:t:°:S'):::áecii¡;!v'8;:i:rd::¿*oé;;:ic::!§::::%iió:g:gÉd:r(dge:yíe::::ie:a;:9:8as;;S,€:'g::rE:
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"LosgenomasAy8deMusadifierenentamaño,elgenoma8es12%más
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EL GENOMA DEL GÉNERO Musa
estud,o::,s,tae:sot::c#r:rTa::Ó:p:::cr,=nddeé,gÁgoNm:eg:doMás:,u:aí,r::teTsutyüd:f,cJuey,
partjculares.
Sehanutilizadovariostiposdemarcadoresmolecularesybioquímicospara
•:¡;;e::gea::,8,::e::te:;:g:é:¡::oy,aEas:tá::,:aa?:aniier:st,a:::Tna:nticp:ersrome:tn:!Í;:d!%:o::::,iu:,:'X:í::::
itgr;b3uay,oBeunhea:thoo,,::,hdaenr::::eci:odso::,r:rcst,uorna:essddee::osmc::om:::myatsra`nFsi:£c::naéá
:n::ií§;:::';a;iriis;Í::¡;:i:_;b_::;Í:;;i;:(!íis:;:j{§;ie;d:Íiiec2;íi|ij;;i:§:ití:§e:a,:;::ii!°;Ssaoe:%;:;::::Piiigi;:;ii:;:íi
:t-órjcró-n ael cariotipo en Musa
de `os cromosomas (1 -2 _T_T!_9e .east:ag::£,rd°¿
::::::::=::;:::-:::::::;::::-:::::-::::-:::::::::;:=;s::--:::::::-:::::::_;:-:-::::-::::ii;s:::::,:::-:::-;:::-:s:::::-:::::,--:-:-:=;--::-::::-::=::::1:;-:::;:.:::::i-:::-:-::-:-::=::::
t,:::|£|ik|ceeáns::,,32::u:¡,,:::zga;::o:ng;!¡¡cn;:::cira:dta;:snvi¡:,in:ti;:oh::p:3`::r:2rn:kgo;,,'oA:Si:ms::ui::i:i
hMaunsac,o:,g_:_or::s_,:eeca:,::;C;ag:go:,r::ru3;:a:n:;::sdi:,erib:tg:;eiy:Íjtó#mo::aa-:láoe¡::;ig:t::::ii
'V'u.,\^.
_-.
descrita (Baurehs eí al.,1996),
a detalle.
A n'ivel de
sye:::::Lac:aT:r:3,:^n;cTalt:T;S:T:#,:;:d::,tqa:;,;:ecp:J::::::i;:nun::un::t
Se ha identificado
al„ 1998), y una ¥§¡;:Í.::::,:,;::;Írá:a.N,te_Guc¡;nrd::fásetí:::H;::m::n,a,:,dyeá,::d§::rpL:eon:cÍ:,,édrc:;u_:_:
banano; algunos
transferencia que
metalotion.ina.
En la actualidad, las nuevas tecnologias están permitiendo dar un nuevo
::fcoeqsuaen#ár,eac:,,ó:eg:::o::edsetu,g,?n::s,tigg:,::me,:ae,d:r::taegFan::onóuml:ahde:¡abT`nean;:
:ñ:;§;;:::r;s::;íííí;:t;;;8oÍ:ͧt:p;:%3síñ:::h;¡Ír:¡;s::r:Í¡:n:;£;;a;nj:í{t:e:nj:Í;íjz:atst¡:::;e;e;:p:§brt;a:¡§ebc¡;;íͧ;c::e:;
clonación de genes, la secuenciación del genoma completo, el mapeo fisico y la
10
fttiia:::aeí:,;i;ám;ieba,;is;:;c;a:s:sa:!:tio::e:ní;o:i::;;rí;ci!ere::ói¡;jts:::#;:¡;n;i;a:::,:Bi;?naA:g:::::¡,rTs:::sr
%§,:,tt::n,c::o§::n:et:eí:j:us:e::bí:,u:et:ett:¡;„;;pc¡::,t3r:„ort:,Sr:g:odo:;a::amroe,áge:é,:,::rd,:
•osobJeE;á:spt:g:ieg3obs,b!:tnetgsdeie.Tá:nusnoar::p,:fear:taecroenr:fTtin::npáLaacá:p#:,?
;i[:c::;Ug:a::SgpeencotgudnedFomc::f::Sc8::::n;:;::cmo°h:St':e°,rgaon+Z::[:n,estructura
IMPORTANCIAECONÓMICADEBANANOSYPLÁTANOSENMÉXICO
adcvc==tis=vaag:rr:3ud:ÉÉaasrnhgS.é=s^xSc*_o:n:a#ítyát:a¿n#p3%becabinD?ÍT¡£mo#eg!Q##^:-Spdr_e?_=É,,?ose
si|:prc:oiíf::e:ai:asb;:s:7;ó:RhEáoh;oa:nied:úcse;":muít,,:J::,,:::c:o:,gToyenanerti:d:a:ss,::,af:,it::adrd:es,:;uc%Í;ep:an:j
95 % se destina al consumo nacional (Orozco-Romero ef at 1998) A nivd de
£gte::aías,LFa#:r,2#e:oiFaÁ,á:,2t3í,,,oyo::p:,es,eqpi,,;t:,:#heandg:?dcuocnc,g„:::.::9a3gs
p#:¥fds:esn:a:;M::;í:;:3%::::¡óT::::[;::á¡:f;to::íjí;tí:r:g::e:nufi§:;;:¡:g;::dcd:e:§;á£í;á:s:ya¡:;,g:5t:;:o;o:ys::q;;rj
enfermedad
ha
modificado el
mane/o de
la§
plantaciones,
principalmente
los
•i::r::je:snaty:s::h:3:5Paeapr::Ó3ngyood;,fn:on::;C,::;Í:;:;;;:::8:ee:;at,hTa,a:gu:t::Zi:u::oapTr¡:ítt:°:StemT;;
;n:vte3na:ia;:::axíi;c:ta;Te:n,,:g:::7c:oó:::o:noeí|:i:i::Do:S:áí:3Feu:nLá¡::m:::te::ei,!iise::;í;á,
negraolaSigatokaa""sinotambiénporbacterias,virusyplagas,provocando
asi.mjsmoladismjnuciónenelrendjmi.entodelosfrutos
propuestotresestrategias1)laseleccióneintroduccióndecultivaresresistentes,2)Ia
ino°`nr^e±aes±:=a§!=£g==edie).=°snet|ea#Óe:a=,#°tsodeuf=rc:^°ns^dae^.=t9=_ata"e,sehn
t;:;e::;n::#:anc:::yg3¡:,:::Ío#o::je:y;:Db¡¡aLnn:td:;Shg:dTe%tá:7¡Sme:::gLaomd:f:caáaesamt::ovréasm¿eení:
11
SELECCIÓNEINTRODUCCIÓNDECULTIVARESRESISTENTES
s,gn,ficaEJa:anseir:8L°d|i:endt:nddeeio`:cui|:vaot:kdae#%raasphp:s:a#::::troudnuac,dr:dnuucecj%:
cultivaresresistentesotolerantesalaenfermedadEnAméricacentral,poreiemplo,
sehansustituidolasvariedadeslocalessusceptiblesconloscultivaresdebananosde
cocina(ABB)talescomoChato,PelipitaySaba(Jarreteía/,1985)
oca,,zadpoorenoter,aoepsat:edeeÁfr,,:::,tu::,e,cn::or:gc;o#:rodperofaggrbcu:tuit,:artrsoT;Fpi:,d`:':t)é
::Í;;Í:;§:¡;í:§Íje;:;§:;¡ñs;u{;::;e§:u:::;:§::::t:e:s:;:j::§;;:Í:§:j{;::eí;jd;§ut;¡;;;t:;;:¡:r;;:§;§:::;;Í::::§o::;§;s
OBTENCIÓNDENUEVOSCLONESGENERADOSENLOSPROGRA"
DEMEJORAMIENTOCONVENCIONAL
•::i::::íí,;!níi:r!r:irs:j;;s,:d¡e;n:v2;2s:ti!a::i?itggc:ris::E:nn(::gHg,g,S::ínucn:d:íahodá:::P:r;r3:ri:mo:,::;dá:
parenta,E:T:#adme,enct:"?veanrét:c3,::Tá::c!oenb:l:sáaqbuaesasdoonef:l:,esse,eAC:,,á,:nda:Lpeol:en,
i:uiivies:dL¡:;;guis::s:gr:s::;u:nti:u::?s:;;gsn;:sie:Íein;ic;r,Í:ts:!:i:Íci:!tp;r::ggr#giía:;aé;,:iicatij:`jz:;:d:;
::,T:,,::ni;:;istg:ep:!e:,,pa,rág;a,,Pdr:g,udcoc,:ns:eaíap,::ds:sstesn,:,t:t,:::tr:i:trs%:::::
negra,laSigatokaamarillayelmaldePanamá
r:e:sc::d;:n:i\;;i,,:ní:;,:ea::r::cti:p;:Í3á,;!::p:a:i::oÍ;o:.:a:jsn:s:Íe:;sio:r::::ia;Íbariigjsí,,,:F;idiír::c:#:;i;ri::iai
¡j¡::;j;;::so:§a::#:M¡jsr;;í{:¥;§:P¡:#ñr§,;:¡;:::Í;§ta;;*R§oíjd¡:[;:j:r:o::::;j#:§::§dr¡;:a;=Ío:jní¡r;ñ¡í:p;;::etT3:;
12
:=-::--:_:::Í=:Í::_Í::::::s:::_::ií-::::=-=:::i:::::i
Laintroduccióndehi'bridosresistentesparasustituirloscultivaressusceptibles
:Rn:a:::#:Oksa:,:::tí#j,dqoueFiiÁ-p2a3|,a#:)aene:es3|eesrt:,a:mu:nateveág#ar3on:cnesóduabd:
;,:v:::au:co|s:aduT::j:u;;.,íii::7:::,r:9:?:6;,:u:eyma,:ení::|:|:g:ucnp:rohg:r:sTd::dao::pT:ed:!oi::,:,,ct,:í#s:::,:á:
BANANO SILVESTRE DIPLOIDE CALCUTTA 4 « acumi.naía ssp
burmann¡co¡dás,
LasplantasdiploidessilvestrescomoCalcutta4seoriginarondelaespecieM
acumínaíaCollaytienensucentmdediversidadeneloes{edeMalasiadondeseha
reportado qm cuatro de las cinco subespecies se sobrelapan, éstas son
;,:íia¥n:a:€e:SpS'ftm:°%ac3ecn;"as'í:sm(:|i:r!:m:#aian:d°S#'::Sir;j:°X:e:spigu7;;:i§:sr:):a:;g:Tsr°on;:;
::t2e7'a°csy33:Tnyas,:::dEacu,:fe°nr;,rdeaqdui::rngseaunatemperaturaóptimadecrecimiento
Calcutta4,esunaplantamonoicaLainflorescenciaesunaespigacomplejay
:::s::ted,g:uuen§tpoesd::cdu¿osvf;Faosrossoodr:ne:;:::js,adsefl:,r:so::á:,Ta:r¿euge,aedsat3ne:ngrpuops::,g:
!rrií;É;oiíe,sas:Í;,R;íj;a,:c:o:::::Fn;jrí::ií!:;dry:l;::ro:;;o,:::goTfs:,:;:uí|::is::s:ei::p;o;dá:3:o:s;r:n;:n;a:íi:,
loscuakssoneventualmenteeliminadosLasfloresfemeninassonaproximadamente
de"cmdelargo,conunovarioinferiortriJocularbiendesarrolladoylasmasculinas
deaproximadarrúáhté-6'¿#lcvovna'goe=ntTaeTg:e'5l
:ot:::::Ld:e:,:rup::ái:á2::c:áf'::;;,:á::JTe:go:a:s::r:;:se:a:dn:::o:í::::?sirsn:o:ssofa:ú;:uiponans::fcd:udcJ:r::
13
semillas,aproximadamentede5mmdediámetro,sonsubg`obosasoangulares,mw
duras,conendospermoyconunembriónmuypequeñoenelexwmdelmicrópm
¡:%t;¡¡í:::a;::;::c¡fí§;;¡:e;;;Ñ¡n;:#;:§ÍÍ:a;!:ñf;¡Ío:3s::Ír;;,¡::::u:;¡:::::osÍ;§¡¡;Í;:ñ;;;;j:;:;:d;:í;:r:::í¡:§:¡í::s:Ír;;
de nulo .interés comercial.
Desde el punto de visb taxonómico este banano se clasifica (según
Purseglove,1972)comosemencionaacontinuación.
C'aseSubclase
OrdenFamilia
GéneSecc ro¡Ón
Lilió s'ida MonocotiledóneaLilidae'
Zin iberaesMusaceaeMusa
EUMusaÑñacupjp3±6ÚFñáannicog±
Es ecieSubesec.ie
EstasubespeciesedistribuyegeográficamentedesdeSriLanka,"deleste
yBurmacaicufta4,esconsideradadesdeeipuntodevisüdesuresistencia,Como
una linea pm (true-breeding), adecuada para su utilización en el me]oramiento
i:i;;íj:!Í:i:Íp;Ín:sj::::£:í;::¡:i:;;ii:;;i:ri;:in;iii:i;::;Íiicií;rií:;ii:;:c;ieiíu;Í:::í:;itp;:jáir:ail;i::iíiíF;;;¡Í;!!;;:i;;s
p:ri.;tdaotHEo::i;:ri,:e#::;f::::;`r%i::a;d:oe;L::sí,u:l;:rtií:feFii,:r3a:pTo:io:::T;:b;:o:,a:noasng::i::o::::
E:áat:cn,3:,aTaB,s,goant:aaesnpeegcr,:,Sá,::::res:sa::#3,::Mm,ódme::ds;r::nut:ar::í;::Lót:,eens::
i;i:v:u;:s:::ni,::e:,:,ai:al:qi:;:3oi:a:Ís;;j:ii,fciü;ii:sl:á;:t;:::rc:i,;p;i,r:aT:3,:e::niií:,di:ie:g;Í::a:d:ar:ai::;;
PO' Vuy'alt„", v. _-_,
genético de la res.istencia a la S.igatoka
14
jj;r;Í:i::i;:;ie;;i;Í::;i:f:!Íri;nií;jjí¡;s;t:;:Íjnñi;;iííi;o;s;;;:iiise;:;;;Í:i¡::;:i;;:i:ipie;i!;:d;i;Í:!;vii¡j:s
TRAVÉéNDTER:AD¥ifLÓsNFgEfATéróTNA%ÉNEENTi:LSAMENTEMOD,F,cADASA
Elmejoramientomo'ecularenplantasutilizandounaampliagamadetécnicas
t:E;Íjt;;idr;;ngii;:;i:;e:i:::::Ííi:;:,:i\ÍÍ:::i:ó;;íiíjí|:!;;Íi:;:i:tj:;!j:íji::d;Ó::iaíí:Ís:aíjin;e;i,;;j;s¡;:ii;Í:s:ci;¡;a,
"alternativaalmejoramientoclásico,sinocomounaherramientacomplementaria
Los biólogos moleculares y los me/oradores tradicionales deben traba/ar
:::::t3:Fonst:u7t:vr:r::et:á,:=:i:csosg,#csh:,em:nrte:risgy5)Pararea"za"spruebasde
MmeE8.:o?nm*..cna° C°nvencEonal del b"m y p"m a .ravés de .a
transformación genétjca
La primera prioridad en el me/oramiento del banano es la generación de
;u:;bvraar::ent:ec,á3rcgoanq::s,:;::cbaas:doenef:rTae::greosdu:c,3,nagsaesxuai,,neseT:r::gmo:n,:,
::a:i:a:iiahg:#;:tn:oa?:::L:ps::3icñ;;:s:,;:d:ar:cgFi:e:;!Ísmy,;;á:oe:g:a:gn:ci::n::,:de:|eti.::!g:r:;;
totalesterilidadfemeninaEsporestoquelaintroducciónderesistenciaatravésdela
¿rGág;orLTa:£:sgf:feent,cfa:st::FeadteerÁstLv:oTáunye:t:a¡j,svacr:a+:ssoumT:,3reaT,:ennttaost:ság:;
fundamentodelai.ngeni.eríagenética.
A#::ji!!:;;%Íe;e;nu;Sj:;;::;ié;;:;u:ncs;d;:iu!:§::;;!gíi;:;;js§:;e:y:g::;i;:u:§::fi:i:á:Í:in§::Íe§:::;;íj:;:a;a;idi:j:a;§g;
DNA,paraintroducmciial"tmdegenalascélulasvegetales,latransferenciadel
15
T-DNAesreguladaporunprocesocomp`eioqiie`nvolucraalosge"devri"
de la bacteria.
:::acv,::,,:si,ag::o:::,,:aa::e:nné:%:s,!i:r:ma:áaedd;:íi;,eacT::,:o::!sd,:dd:riÉn:sÍ!;:or:c`:me:;¥o:h:asns:u,;
:E£:fiíj:a:;;P::°:aTí:eq;¡;Sr:e::::n;§{:::;:;¡¥:::8:Í:::¡;;:,:r;;Í:g:eeun:bee:r::t:n:;r::d:;:;¡;dn=es:p°::8;S;::::gr::::sn:
(Sági ef a/.,1997).
3Ío::::i::tic;:;±,:iin;jg;e;i::;:eii;s;£Í;:Í:;a:r,:;í::,t:tri::a;;you:3::2:::;o;ii:Íee:a:isí::;;!:::i:nt:v!ííjs::i:#ii:yjó;;ii
li:o:v:;ne,:A:,:cs;og:9:;F::;eeng:ornee:e:ter,ou,aorreasc,odne,bsaenaT:":aenshf::mr:á:n::::oopla;i::taé
i%r:,r!:Íeg::7:¡::a:e,e::E;;i;!b;s;;:upii!:!s::::1;a:n:eix;:eiñr!;;:::::e;;átri;lEÍ:;;::;a;n;s;;!iii,¡diein:(;B:iík:i:;i:tii
i::5ii::a;n;gb!f;ei§;§::t?:a}s:g:éd::;i:s%nep:i{¥iai:a:i;:;iae:::%:,:dce;;í§::ip8r§::;P:;:;i:n:Spii%::;e:ii:¥d:
Mediantelastecnologiastradicionalesdemeioramientomoleculareraposible
:::rno,s:f:íj:eg:r:,:3::esdese:ie::c:::ndte::f3;#::dd:o:sdt:3i::e::::,;uri:a:::vcad?;:;:g;:n::i:á:pd:r3mj`:i
!j::ii:;ii;i:aí::,ii:ia;:,ijíi!í::;iq;l:::i¡s;yir¡;,gini:,;:jilc;:iie::::Ó:fi:gi:C!e:S,efs::;:iFj:t:e:;;i;
BibliotecasgenómicasconinsertosdeADNdegianümaño(%a4m
kb)
hospedeu,::b(,g::i:r::sgoel:ra,::ra:;qdueef,n:::t,ecnoeTofraugn:enctoo,:c:,,Ó:zadred:e*iañ
16
genómico,inse"eniinvector,estosfragmentossesobreJapanyensucon/unto
representana,9eriáñ=énñtrtedc=ourheosrgoasn:tamgon
;:iíií:i:§:§;¡ih;;§:;;Íiici::;Fi;¡Í[§Íeí;Í;:;e;Í:;§::;§:i::Í;i§::jba:i:ií:ij:í:£:A;ij:tíi§n§§:#i;iaiinf!:Íiáiaí;§:i;§d§e!e
i:sstaso!!t;:'i:ot:o,ip:ti;g,:i:a:Ó,egso,Ísi::t:ond::i:;í:o,sAert;£:ods:::eiaa:,:::i3;:d,ant:rnése,hamnapsédo,
:;á:r:§;£:t::j§;o§t:;n:fig;oÍ;::¡::::;:;Í:¡;Í:¡;:Í::Í:AÍ;y;,¡t¡;íu§:T§:n;:;:§;:;:í§:§;SÍ:j§;::Íje:ny:t;:§:Í;¡j;:::;§:e[:
clonaciónbasadosenbacteriacomoloscósmidos,fosmidos,bacteriófagosPl,BACs,
PACsy:?:s_::ñi:¿t-e_m`=:eac%#a°c.'ó°nsb%Sg3do°es:feóvsarid'SÉ;:oi£o:eu.rióyEa%
::r:nx:Le:L::sAm:::nts::mn,acs#:b;tsrs:;?:ssm,t:ae::ro:::,rEg::;a::qu:i::f,:c;a!e::e.:L:e,v:aend::e:::rf:qt::,:is;,;:
Ír:o::;;;¡:,::uína°;bp§j§;;tr¡¡:;:Síd:ñ§::t¡¡ÍC:;jd;°r8::U;a:¡;::aec:Í:e§§::r:;:;::¡fi;gb:°n:;°;::t;:Ísn:síjg;s;e;:s;§;fí;::j:í:g:;
fósmidos,yhash400kbparalosBAC,PACyPBC
s::tvee;:o:po:séfscso:;:a:ns::,sa:s:;tae:ra::::,:,ii::Ls:i:::bná::e:s::o:::F;;:g;,Sfyea:,i;i:!e:m::sedn:f::so:qa:ce:Ó:n,
de BAC.
:;;:ni::aígíg:::ii:;Í:í:í;pis;o:?:ph:;;ñop:A;id2:o::Í:níj:;i:p::;;:i:o;Ío!n;k:ija:ri:Íjáiiii:níjji;;Í:!:;a:::a!ij;i:ir;:e:;
::#f%t°oSs (qGU,:d:,+¿eenfdaa/? 2roeog;?nes largas del genoma o más aun cromosomas
17
BibliotecasBACdesaTrolladasenelgéi`eroMusa
•smo3:ei:t:e:ár#aubdr:r;ar:::udneo,3:::!::,v::Je:,:,o:e::eratee,Cdoenssa,:::Fo`::erunnactoanpa:
fisicodebananoutilizandolatécnicadehibridización/ns/Wporfluorescencia(BAC-
f::Hp,,::ern::it;;gn,:,::ant,;nng,berse,ákpearpao::t:i,#,taer,hzhaoc;ó:fdai,,2óroa3S,,ocac,ondepuntosde
checaspeo:so.táracg:sht:úyeennde"::t::3,,g:e:aotÉÁ,8ad:`x3:::#,á,:Bju::`faB:si:::c`:
CGU,:bas,e¿á„Ca°8:Leomm:::a8:n:::,jams,£¿bdi.o)tecasconsmasparaeigenomaA(The
18
YAC
BAC
__--\v``.'Olluu'a
_. _...u u iusraio eseri
i!:piíñií:jíiÁ::a:t;eai:tíde:ii:á:Í.:s:á:n;;q:ÍT::aíoíui;jr,i.:r!:É!;Í::faucr:N:YmA£:;,,,;c:oa:e;:R:nu§É;;u:_:^cfa:_:_ut,óg::t:ucdt:
:íí{e:;a;i#:apíiidís¡s:::;í::a;íd;§eií:;}oai,ií;b;d:af;o§§x:i¡Íj§:;&íj!;;í;°°!:Bg
íjn:,:;rei::::q:Í;C;UE!¥j::#a:;tg#fin:d;;§i',
19
TransferenciadeADNdeal.opesomolecularalgenomadeplantas
(Tanksley ef a/.,1995).
conten,::b:,o::cavsecgt::eósm.::nsar:oosn:,ns:::o;a:ae,:DY'a::foa#oacpl:snodmeol::,uu',aaré
vegetales
clonac.ión.
¡e¡ats:Te:;oei:t;::;ij;ií::ngs;m:ii::::oi:í::j:;áa:3;ae:ro:::s::L::::n:;:`Íj:is:t:::;:s:Ía:pv::r;ii:apn;ig3`:Íi
•hn:edrieo:odse,,gá:nt;ammb:::„q,:eBia-,á:%eb,,,,dsaedftá:n,Vaesnt:?onna:sP,::T,:r::::::i::i:)s::
:;i:a:d:o::di:;a:':Tg:e:r§,,Ódn:9:9:8P);::=:j:2sntc:°:P:;§:C%e:::a}t:d:s:oi;V::%:j:S:e:ri:::||:gue:n!;
20
t3.a=e%]3bo§:os°n::.ab#m8:®vpea:rt=oer=:%p:aecrnha%§odp%#°óósnsigvonescbtda°e::e=:,vabe:sE#,;n§egs,npb#nomog§dc°gs=APp#N:áadegemsná:esr
de 100 kb_
deADN:::irseud:::+¿°es3PoBocksb:::müoi::eBSAdcesc)°npaArcysmantenerestab/esfragmentos
tíí:i:i;:§::°r;:iiiu§;::::ii:i::Í:i:i:§;§;;iri:;;iííi§;§osií§Sií;u;Íi;!:Íjii;§:;§:í;§i{j;§;§iij¡;§§Íin§;§::i§;Íjí:;§jí;:Í:;:)
:í3!;::Ó;ieiíi;;;;ji;o!jo;::;d::i:ia:q:Tee::::y;g:!;;;j::q,:2j!eotábi::;:mg,u::oáa!ii¡t;áit;;::;aáp;a;:j::::o;pi:r:o;:;nr
Estatecnologíadetransformaciónhacontribuidoenlac/onaciónbasadaen
j,:anTá3sg:::sp`¡i;:,a#n,nte,piirg:,,os#,:c:douenne:ee:nt::ter::e:n,,if;::d::;fn:ur:::::,:ó:::::c:n::¡n:t!:ai:
::á,,?,:agne;::ái::e:ncz?=aosadqeu:::§r:t:ems:tiebnoc,:£ntranagrupadosporeJemp,o,osque
Enlosañ%recientstÍasbibliotecasgenómicasquecontieneninsertosde
§:§::o:ff:cd;ó¡::r;;a:j;¡a:n;::ípÍÍ:e§í::p::a:§:F:;:í::;í§a;s:Í;:¡t:,;;a¡;pg::s:í:ges§::;,¡:yí::::¡::¡aí;í§;ft::s:,,;;;:
sus característi.cas más notables.
21
vegetalesconstruidasenvectoresBACyBIBAC,consuscaracteris"prmcüW
Cuadro l Algunas bibl.iotecas genóm`cas vegmonocotiledóneas,D,dicot.iledóneas.
Tamaño deTg:;,ooTdaeDMbM750
Tamaño8:Q.Tseodi°o
Equival®ntosdelgenoma6x
Roferenclas
Tipos devector
Aplicacione§Mapeofisicoyc`onación::#:;
OrganlsmoSorgo•`¡.:'.:..`¡
de resistencia basado entec::o:pi:i:ii:óííefld:Íó;toiifto;::3;i:p.aeo)
Woo eta/.1994
pBeloBAC 11
1 57 kb
Friiters ef aí.,1997Vinazeíg1a/,1998
D
LechugaLc!ucasaííva)
111
2300-2700
kb
2x
pBeloEAC 11
(a Manzar`a
5x
120
7509532250
D
pBe`oBAC '
8¿;ngaec*:nd(eb:ess::tae::Lae'vTypmapst
Ham`ilton ef a/. ,1999Dongefa/,1999
(Malusxdormsiica)Tomate\::`:.::`::.;.`....`
D
A,godón(GossypiumhirsutLimCañadeazúcaí(Sacnanjmspp)
125
4632x
BIBAC 2CLD04541
masada en el mapeo)ntíael
PpBe\oBAC 11plnd`goBAC451
120130kb
D
Tomkins eí aí.,1999LllaveFgkgyg°Ía''
45x
`stencia co'zól1:Í:y:i::,eg::!ó:n"
del gen de reCionaciónpovemaliza
30005600800-930
M
Tngo (genoma A)m: : : gum)Papa(SO'anumtubemsum(G/ys,: amax)
ffiracteris icomodegenecomMapeorisicogcnoClonación(ba
s do resistenciaoelVOyginDéticodei
1 1 5 kb155kb148kb
MD
resistenci nvec:`£aB:' tDesar ol\odecobehi ramestud\ldentiíicac ontieneng
56x37x
n en el área de laicamoiecuiarunabibliotecacon laásamp\iaparaelnoma
Song eí a/„ 2000Tomk'inse(a/.,2000
pBeloBAC 11BeloBAC`1
27 4x
D
(£:%aeduam
M
5ooo
P BeloBAC 1'
ode' 8,::edsepcLoá:vso:udee'ter\cla
1115
i06kb
6&
P
~%•Amamp`m~detragmentosderestricciónpol`mórficos..RARErestricciónporendor`ucleas®asistidopwReMvulasre
Yu el a/„ 2000
CONTINUACIÓN DEL CUADRO 1
M
Tamaño de
0D
9enomahaploide(Mbp)
Tamaño
promediodeinsorto
Equivalentes
del genóma
Tipo de
Organjsmo
vector
Aplicaciones
Referencia
Petunia inflata
D
1158
1364
76x
B'BAC 2
Aislamiemo de grandes fragmentos de
ADN conteniendo el locus de auto-incomoatibilidad(S,\
Mccubbin eí a/ ,
2000
ldentificación de clonas ligadas al locusderestauracióndefertilidad
Wu eí a/„ 2000
Brassica napus
D
1150
1 05 kb
7x
PCLD04541
D
450-500
118 kb
154x
plndigoBAC 536
D
380
80kb
96x
pBeloBAC 11
que incluye el locus del gen de la
resistencia contra el virus de la tristezadeloscítricos
Yang ef a/., 2001
D
450
94kb
6x
pCLD04541
Clonación basada en el mapeo yconstrucc(óndeunmapafisico
Men eí a/ , 2001
D
758
8x
pBeloBAC 11
Análisis del genoma dol betabel a través
de la caractenzación del centrómero delmutantePR01
Gindullis eí a/„ 2001
125 kb
D®8arrollo do un mapa físlco a .ravós
do BAC-FisH. o8ta t)lbllotoca sorá una
horramlonta l mpoiunto dontro dol
consorclo intomaclonal dol oonomad®Mu88
Vilarinhos et a/„2002
Melón
(Cucijmis melc»
ldentificxición de clonas ligadas al locu8
Cítnco
(PO"rus
Betabel
(Beta vumans)
Banano,
Calcu" 4
(„usa
acumlnsú|
M
600
100 kb
9x
plndlgoBAC-5
D
3000
80kb
45x
pBeloBAC n
genes putativos de receptores
transmembranales
M
420
130 kb
67x
pCLD04541
Clonación basada en el mapeo de genes
de resistencia y mapeo fisico
Tao eí a/„ 2002
D
120
1 62 kb
115x
BIEmc 2
Para facilitar la ldentlficación de genes a
trsvés de un escrutinio decx?mDlememaclón
Chang eí a/ , 2003
500
1 02 kb
52x
pBeloBAcl'
Ensamble de "contiguous° de clones
BAC que ext.enden al fidr7, el locus queconfiereresistenciaalamanchaneara
Glrasol
(Helianthus
annuus`
Arroz
(Oryza sativa)
Arabidospsis
thal'ana
ROsa
(Rosa rugosa)
Luo eí a/., 2001
Construcx>ión de un contiguo de 1.2 Mb
trifol'ala)
Lotusiaponicus
(Fom-2) que confiere resistencia almarchitamientodelmelóncausadaporFusanum
ldentificación de clonas que comienen
D
Gentzbittel eí a/
2002
Kaufmann eí a/
2003
VECTOR BINARIO TIPO COSMIDO pCLD04541
El vector pCLD04541 fue construido inseftando un fragmento de 9.1 kb que
contiene al sitio cos (para el empaquetamiento en lambda), el gen 35S-NPTll (qLie
confiere resistencia a kanamicina) y un sitio múltiple de restricción "dark Bluescript'
(dBS), dentro del sitio de restricción Scal del plásmido pSLJ1711 (Jones eí a/ ,1992);
éste a su vez fue derivado del plásmido pRK290 (Difta eí a/ ,1980), (figura 2).
El sitio múltiple de restricción dark Bluescript (dBS) contiene sitios para
múltiples enzimas, varios de estos son únicos en todo el plásmido, de tal manera que
permiten linearizar al vector para la introducción del ADN foráneo; además, este sitio
proporciona un color azul intenso, diferente al color azul que normalmente se
desarrolla en colonias de E. co//. sobre 5-bromo4-cloro-3-indolid-beta-D-galactosido
(X-Gal) e lsopropiltiogalactosido (lpTG), lo que contrasta mejor y permite distinguh
más fácilmente las clonas blancas positivas Esto último representa una gran ventaja
en un vector binario de baja copia (5-8 copias por equivalente cromosómico). Como se
muestra en la figura 2, el pRK290 contiene un gen bacteriano que confiere resistencia
a tetraciclina.
Para consultar sobre su secuencia y mapa de restricción, el número de
accesión es AF 184978 en el Genebank.
RI-K (69"
(4¥oS`íg|(is|2),j
(28i2)
sínj:5zpsr
Figura 2. Vector tipo cósmido pCLD04541 de 29 kb. dBS, sitio múltiple de re§tricción del ''dark bluescript"; *
::,no:md,:,:ea:t¡:c;,,Ógne:ná=rsés=tséns::áoap:ertarae:,:,TnEaque,am,entoen,ambda,35S-NPT„ionfiereres,stenc,aa
24
PRINCIPALES PASOS PARA LA CONSTRUCCIÓN DE UNA BIBLIOTECA
GENÓMICACONINSERTOSDEADNDEALTOPESOMOLECULAR
La metodologi'a para la construcción de bibliotecas con insertos de ADN de
altopesomolecularhasjdosjgnificativamentemejoradadesdequelossi.stemasBAC,
PAC y PBC fueron establecidos. En la figura 3 se muestra el procedjmiento
generalmente utiljzado en la cons{rucción de bibliotecas con insertos grandes (la
mayoría de más de 100 kb), su clonación en bacterias y su ordenami.en{o (Zhang,
2000). Este mjsmo esquema ha sido utilizado exitosamente en la construcci.Ón de
varias bibliotecas BAC, PAC y BIBAC de plantas, ani.males, insectos y
microorganismos, y consi.ste en los siguientes pasos.
a)
Preparación del vector. El vector debe estar totalmente purificado y ser de la
más alta calidad (Íntegro y m de ADN bacteriano), se debe realizar una
djgestjón apropiada (nunca sobredi.gerido o poco digerjdo) y desfosforilarlo
completamente.
b)
Extracción de núcleos. Se extraen núcleos de las hojas y estos son jncluidos
en agarosa, donde posteriormente son someti.dos a di.gesti.ón con la enzima
protei.nasa K (para di.gerir las proteínas nativas entre las que se encuentran
las de la membrana nuclear) y dejar libre al ADN genómico.
c)
Djgestjón
parcial
del ADN
genómico.
La
parte técnica
más
djfícil
del
procedimiento es la obtención de fragmentos de ADN del tamaño requerido
(100400kb),estosúltimossonobtenidosatravésdeunadjgestiónparcialdel
áepeNccFoenaa,¿%::sounmgo¿;c::ara;caor:tseaT,duot,,,::n¿ooseí:ocTruoef:reds:sadgear::ajp:
pulsante (ECP).
d)
Ligacióm La inserción de los fragmentos selecci.onados en el vector es otro
de los pasos cruciales, debido a que se debe optimjzar la relación
inseho:vector.
e),Er3rbs,í:tremc:c,::tbr::tsefrá:::,c,,g:ná,:,cÉc:Óo7,d:o:,oe|aASDPNoS,:,cvá#,:::taemabs,F::::
el número total de clonas requeridas para tener completa la biblioteca
dependen estrechamente de las células competentes utiljzadas. Una ligación
eficienti3 introduci.da en células competentes con una efici.encja de
{ransformación menor a 10" colonias/Hg de ADN requerjrá, entre otros, de un
mayor número de eventos de transformación, de un mayor número de cajas
Petri, lo que al m encarecerá de manera impohante la construcción de la
biblioteca. Por lo tanto, se recomienda utjlizar siempre células comerciales
como las DH10B de GibcoBRL que poseen una efi.ciencia de transformación
mayor a 10`° colonias/Hg de ADN.
25
Objetivo general
Establecer las condiciones Óptimas para la construcción de la biblioteca
genómica del banano silvestre Musa acum/naía ssp burmannicoídes tipo Calcutta 4,
utilizandounvectordetipoCromosomaBacterianoArtificialBinario(pCLD04541).
O bjetivos es pecificos
1.-
Purificar el vector binario pCLD04541 a través de una lisis alcal.ina y
utilizando dos gradientes de cloruro de cesio
Linearizar al vector con la enzima
BamHl o Hi.ndlll y desfosforilarlo.
2.- Obtener núcleos de hojas de Calcutta 4, incluirlos en agarosa de bajo
punto de fusión y digerirlos con proteinasa K. El.iminar la proteinasa K lavando los
plugs con PMSF
3.- Digerir parcialmente al ADN genómico con la enzima BamHl o Hi.ndlll para
obtener fragmentos entre 100 y 400 kb.
4.-Ligar los fragmentos seleccionados de 100 a 250 kb y de 250 a 400 kb al
vector pCLD04541 (linearizado y desfosforilado) utilizando una relac.ión 1.2 o 14
(inseno.vector) para cada zona (Fl o F2).
5.- Transformar células de E. co// DH10B (por electroporación) con las
l.igaciones realizadas, util.izando 1.5 o 2 LLl de cada una,.
6.- Caracterizar las ligaciones en cuanto al tamaño promedio de inserto y el
número de clonas sin inseho. Calcular con base en el tamaño promedio de .inseho el
número total de clonas que serían necesarias para tener representado 10x el genom.a
haploide de Calcutta 4 con un 99 % de probab.ilidad de encontrar cualqu.ier secuencia
de interés.
E§trateg ia experimenta l
Se purificó, Imearizó y desfosforiló el vector pCLD04541, paralelamente se
extrajeron núcleos de hojas ióvenes de Calcutta 4 crecidas en invernadero y se
incluyeronenbloquesdeagarosadenominados"plugs".Éstosfueronexpuestosauna
;:,ruc:#edne,:,s:ánci:::ozleJ:asaa#,a:a::bne,a;nad,?Ds:uEt:,,ióD:,gcet::fT;S:,:u:ed:gae#:
pulsante para
cuales fueron
vector,1:2 y
con 1.5 o 2
separar los fragmentos originados en el rango de 100 a 400 kb, Ios
ligados al vector pCLD04541 bajo dos relaciones molares de inserto:
W Se transformaron, por electroporación células de E. coW (DH10B)
Ltl de las ligaciones
efectuadas; Ias células transformadas fueron
plaqueadas en el medio selectivo LB con tetraciclina, X-Gal e lpTG. Las cé"
recombinantes (blancas) fueron analizadas para estimar el tamaño promed.io del
inserto y ei número de clonas sin inserto. Con esto se determinó que relación Tolar
inserto:vector y que cantidad de l.igac.ión utilizada en la transformación fueron meiores
para obtener una mayor eficiencia de transformac.ión. Por último se estimó el número
total de clonas que se requieren para tener una bibl.ioteca representativa de Calcutta
4_
26
DELA
Q4muTTA 4
em#bkdgeef"ug#oT3#%rrosa
.
Digestión parcial de ADN con
- BamHl o Hindlll y selecci.Ón de
L,neaá,::fco]gfno%nc,g:::+%,#,,w
fragmento de 100400 kb utilizando
ECP
Vector ljnearizado
Ligación
(T4 'jgasa)
^
Plásmido con
inserto
Transformación de E. co//.
(cepa DH10B)
Células recombinantes en medio LB
selectivo con Tetracicli`na, X-Gal e
lpTG
Ordenamiento al azar de cada
biblioteca
Figm2.Esciue"generalparalaconstruccióndelabiblio{ecadeCalcutta4utilizandoelvectorbinario
!:pooor:é::#:.::|:#b#ote®E,noordseen:eT:e:t:qsuee:esfi::Leoieqnuaeda,:sdec:ocnuaesm3ua€:np.ss::,::esne,gu=ndc::,::
?'-8inL::-ab::Poef:::r:-,3|np¿::i-;aé:as_aD?#:,áaó:,á::t,,gi,Gd,e,::rpnr:rp:,'t,:ga%::dmofores,Sdeffimpopu,sante,
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:awnekns,j?,,tsR3a#av:u:y:,:;::eT'ra:npd,,#9;#:,:::Bgá,,,g!:,;!,:£aj:ks::ees,,Sa::,,n:,a:ta,n
paradi.gm
for
map-based
gene
cloning
in
plants
wim
large
genomes
Tao,Q.(aRnedv£#tnTgr#3.'n(iG983;t'8iónJ,|dpapn33s-{6asbiemaintenanceofDNA
fragments over 300 kb in Echerichia con with conventi.onal plasmjd-based
Tao,Q.,V¿Cá:rgs,E.uÁ'.eácnáczdhaRnegs,ea:cBh(2V3t2,6g:!,,:pg::,:::ng3ian,transformatíon-competent BIBAC librav and three BAC ljbraries of Japonjca
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32
CAPITUL0 11
Preparacjón del vector binario pCLD04541
lNTRODUCCIÓN
ElprimervectorbinarioBACdesarrolladoparaserusadoenlatransformación
:::ae:t:j::fit:p:ieto:b:t:i:Ía!dn:due;'gga::nnd`eEaecTa::ti:acd:eíít,pp:::c;,,á::n,2,,-e2muc:oap;i;.,c:e#:o,,::
r:jjiri:::r::un`t::?ár::;,,tdee:va:aq:;e:s:|!,::;t:ae,:a3:tí":3:,:::n:sd:e::t:p:oa::n;:Zah:::iíro:o;o!r:cícéónfa?saor:
Comosemencionóenelcapítuloantenor,losplásmidosycósmidoscomolos
BACsyPACs,puedenmantenerestablesgrandesinsertosdeADNforáneo,además
dequepermitenunamejormanipulaciónypurificacióndelADN,yunamejorselección
;asrt::3:i4:,:,aá,et:;fo(:a:d::ó:naz:,iern::d:ut;v:ogsd8!,á,g::c5;p,#:ig;vR:,ien:t:;:dL:;myuot:f;:aii:;¡r:a::;:r
elaboracióndebibliotecascomplementariasyelgen/aczcomomarcadordeselección
de células recombi.nantes.
La preparación del vect" de clonación BAC o BIBAC es uno de los puntos
más críticos duranb la construcción de bibliotecas genómicas y consiste en la
purificacióm la linearización (corte del vector con una enzima de restricción), y
desfosforilaciónparaevitarlarecircularizacióndelvectordurantelaligación
la
MATERIALES Y MÉTODOS
ElvectorpCLD04541fuedonadoporelDrHong-BinZhangdeTexasA&M
University, College Station, TX
OblenciónypurificacióndelvectordeclonaciónpCLD04541
Texas AS&e#n,:v::s,;:tco:,%á%,,astraet%onTaTdxa en e, manua, de, Dr Zhang t2ooo, de
;éLSDeo4P:a4q|Tesaorgrnecmé:uá:ossdó:,,d:t:CBk,tdr:pt:naco,,;g?LT|eox:rárc::sá:r:::3:,:o5ng:i,VR:,8í
10gm)conteniendo15Hgmdetetraciclina,60Hg/mlde5-bromo4-cloro-3-indolyl-
::,tt:v-:-ag3;a:!oá,:roaíte-%La,,:,n:cHhgéT;adr:,:s:t[::::áonga,:cct:,so,:,:Í,Fn|:)dyu::srec,Óe,
33
2-Seseleccionóumcoloniaazul,seinoculóen50mldemedioLBconteniendo15
53/rT`,ad:btteet:ac:;Ci`::,¥nsóec:,U:t`Vóa37C'Cenagitación(2"rpm)durantetodaianoche
3-Setomaron5mldelinóculo,seadicionarona500mldemedioLBcon15Wde
tpert:::`rc:`rnoan:nsteot:r!t'Y,?roas3:c°uFt,::ag`tac`Óna250rmdurantetodaianochese
:#:ScPuuai;udeed%-%;°rasdecreclmlentodelcuwosemidioladensidadópticaa6oo
5-Seañadieron5mldeunasoluciónstockdecloramfenicol(34mg/mlenetanoopor
cadalitrodecuMysecontinuóincubandopor14horasa37°Cenagitacióna250
rpm.
6.- Se alicuotaron
células en cinco tubos de centrifuga
. _ __ _i:.`i.Á
de 250
ai e^hrenadante
ml
y se
las céiuias en
i,iiiuu `u,,v. ._
__
_
_
getr;feusguasr:enna,::2d°agpg::,,,ta5eT`To%4mi:epT°Estf:,r¿°rmenteseeliminoeisobrenadante
7-Secentrifugóa5520g(rotorJA-14deBeckman)por10rnma4°Cyseeliminóel
igobr:nMai:n::u:::ar:i3,,p2áahsMedr:STur:sP-eHng,,:pCHagipast,,,aen,om,de,aso"„
8-Se añadió a cada tubo 1 ml de una solución de lisozima (10 mg/ml, recién
3rae,gaá:gdea,,:Ta:opTrTd::::iu-,:Fe,spHEs8,myusye,#ánat:eumnp:Latgr:a::b:eunete,ap?,::zLl:
sea eficiente.
:o7osdeeasñ38`)óyas=#e£:PÓ°g:r°anmd`od:,'taubs:`£`nónm'|cr::`édne,%raedpeazr:dhaa!?a2q¥ed:eNf%9mHó
unasoluciónmuyviscosaytransparentePosteriormenteseincubóentiielopor5min
10 -Se adicionó 15 ml de la solución 111 fria (5 M de KOAc, pH 4 8-5 3) y se agitó
suavemente por inversión para mezclar, formándose un precipitado blanco que
consiste en el ADN cromosomal bacteriano, el ARN de am peso molecular y el
compleio de potasio/SDS/proteína/membranas Finalmente se incubó en hielo por 5
min.
11-Secentrifugóa5520g(rotorJA-14deBeckman)por10mma4°Cysefftúe`
sobrenadante de cada tubo a través de cuatm capas de "cheesecloth", el filtrado se
colectó en tubos limpios.
12-Se añadieron 06 volúmenes de isopropanol a cada tubo y se incubó a
temperatura ambiente por 10 min.
13 -Se centrifugó a 15 300 g (rotor JA" de Beckman) por 10 mm a temperatura
amb.iente y se eliminó el sobrenadante.
34
14 - Se invir(ieron los tubos para que todo el líquido escurriera, se enjuagaron las
ggáe:e,sroi:r':i-t#odsec3:c:t:::,,a:o7ro|oío:,n,eamt:ei:teurraatuarTba,;nbtF;n::,cseentdr::ggnaó,ei
sobrenadanteysede,Óst=:cá;.€=.óarsvti,,,=.
15.-Se disolvi.ó todo el ADN en 15 ml de TE.
PurificacióndelvectorpCLD04541(V4nmedian.egiadientedecloruro
de cesio.
1 L Se vertú la solución de ADN plasmídico m ml) en una probeta graduada (de
t2o:a:8í6gíá,Seagregóío8gdec,orurodeces,osÓ„porcadam,deso„ten
2 -Se añadió 12 ml de una solución s(ock de bromuro de etidio (10 mg/mo a la
solucióndeADN/Cscl,semezclómuybien,sedeterminóelvolumendeestasolución
(21"asícomoelpesodelaprobetacontodosestoscomponentesDNA+Cscl+EB
:;27|d2::,,,d:,'ópae:n:tr:::2::naár,P:aá:á;itp:;ini|epn:t:3ed:e!::osR:r3;:::tá:a:,e2d3;ugeD-N;¡.2¡8s5!,:gE;á,¥s;tig
g:,:Sc',::deensttuuvb°osdednetr:edn:;,fruagna9°oi¥,%eer:í°tuqbue:edsedBee:k5jaín6yg:g'eqsu:hgreapr::'t:o':
glicerol hasta casj el tope de los tubos.
396og%o:,¡gv#pynor:o2oS2:e:¥É#ng£:o*:eánn„3fuu,:o%n¥aw"3gcdeent:\e"c5:axnL.tsvoe\d:a#cdke#:on:o=
4 - Se sacaron los tubos de la centrífuga con mucho ciiidado Se observaron dos
viea:n:::sg:diu:b;::r:araoig:un::a:ed:e:i=hraéfruá::i,:urg:::t::,:,t::f:::::Lipgrix:,i::r:bm3:i;:,á::::y:v,:,,
alvectorcircularV41Seformótambiénunapastillarojaenelfondodeltubo,que
conteni'a un comple/o de ARN y bromuro de etidjo
5 -Se inserffi una agup (número 21) en la pane superior del tubo para permim la
entrada de am La colecta de la banda inferior, que correspondía al vector V41, se
reahzóuki:Zban8°e:,::J:r'qnugea::nmaugyuJ,amg:'nnaunTee::;:rezadeipiásmido,fuenecesario
hacerunadoblepurificaciónengradienedeclorurodecesio,repitiendodelpaso1al
5.
6 - Se recuperó la banda de
ADN, se lavó con una solución de alcohol-isoami.Iico
saturado con agua (bien
agl.tada antes de iiearia\ h --.--.-_ _ _ ' -' 'v`,`-' , ' ' '',\J
completamente el bromuro
d:9:[t:dq,:, ::tt:Ses:eha:tsaar:au)e ::Sobbtuqv:eunsae ::T:,:':
jncolora de ADN/Cscl.
35
::-,nu:#::::du:Óis:oa|Pás%o::irg!,:rgJ:aA!2:eN?(éia::ái:#Tpvo3r,e:Tneiniisoa:eo4:%ap:rs,e5amñ,:d,`oy::
8 - Se eliminó el sobrenadante,
se lavó la pastilla con etanol al 70% (dos veces),
gnÁrbf#g::dd:S:,:,ot2eí088(t:t3reJfÉ20Ftneapme:*t:asn!E%:e'rom#'|:e£:::iirapc:3th"aey|
ADN plasmidico en iin gel de agarosa al 1%, utilizando como estándar el ADN de
lambda.
LinearizacióndelvectorpCLD04541conlaenzimaBamHlocon"M
La mezcla de reacción para linearizar con la enzima BamHl se realizó
adicionandolossiguientescomponentesH20bidestiladaestéril,238hADNV41,100
Lil(10Lig),amohiguadordereacción10x(lnvitrogen),40Lil,espermidina40"20h
Bamm(10U/m2Wparaunvolumenfinalde400ulSeincubóa37°Cpor2horas,
go3S;eor¿ormenteSeleañadió1tilmU)másdeenzimaysedeióincubandooühora
La mezcla de reacción para linearizar con la enzima H/ndm se rea%
adicionandolossiguientescomponentesH20bidestiladaesté"240Lil,ADNV4t98
Lil(5ug),amortiguadordereacción10x(lnvitrogen),40Hl,espermidina40"20Lil,
H/ndm(10U/m2hparaunvolumenfinalde400LilSeincubóa37ÓCpor2horas
posteriormenteseleañadió1W(10U)másdeenzimaysedeióincubandootrahora
a 37 OC_
near,zaE:r,f,=a:,ó%adme±,veocto=:,neHa,r:áf,ÍoseAa::c,oT:zc:andveo,:ema::,Ó¡4odoe,HT;ctdo:
fíc:::í¡;,te:i;e:it::iuH!,::3iM;;:g:rEÍ55n;r:fnumro,!,t:óp6!2;t;ioeiim::s;ri:du::i:c:e:n#:d:o:ri::5,lí;áíi;j:P::;d::r
10 mim se descaftó el sobrenadante y se lavó la pastilla con etano` al 70%, se
centrifugó a 10 621 g por 5 min, se secó la pastilla y se disolvió en 400 H de H20
bidestest.ilada estéril.
Desfosforilación del vectoT pCLD04541 linearizado.
vector l.inear.izado estuvo
La mezcla . de .__i_^
reacción
para desfosforilar
el 48 5 ul; vector linearizado
^^n`n^nan+a<.
H.O bidest.
constituida por los siguientes componentes.. H20 bidest., 4ü o H vt;u`u, ,„ ..... ____
400 Hl (35 HgJ+/"H y 5 Lig-BamHl ), amortiguador de reacción 10x de CIAP
(fosfatasaalcalinaintestinaldeternera)50LilylaenzimaCIAP*(BioLabsde05U/W
1 5 Hl, para un volumen final de 500Lil Se incubó a 37 ac por 1 h La reacción se
ie%::nr:a::iai,:i:b:,e:T:,:,,::FPTrfoos5e#cuE:a8535ocH,pg:3%Dms,na)3:o/áeío5eonfr,`ard:
*La enzima CIAP se diluyó a 0 5 U/Ltl con el amortiguador de dilución de
lnvitrogen-
36
(5755H±o,sseea::t':';nsóe:e'natr,Tu::C:a,d7eg¿ega:C;°o:
§4§;;::ne;n;::::;:¡;rí¡:T¡p;;:;;u:¡u:É¡;¡:u¡:í;;;:b§:;an¡Ío;Í;s;:€:íír:,íÍ3:p:¡;j::#Í;:Ey:;Á::c:í:v;:¡f::p¡j§g;:;po::;
§o%:c:ett¡,;:á::ngd:e:,::e:::¡eísn§o,::::5Tr:Tc#na:c:ód:eeí§:¡:gcáar::Dmñ::d;¡áfi;¡,:eregne,2doeoaH:adr:s:2£
Prueba de desfosforilación
ídr::::t:i:ri:j:;|:n;;:Í;i::s;iícig:;oí;íi:jíñ¡:!c:::f;í;g;ÍÍ;d:;;eí::;:;::g:!zíii!Í:::!te:;uíjq:::r:í;::ie:;p;;,ig;¡:e:T:o::
RESULTADOS
ObtenciónypurificacióndelvectordeclonaciónpCLD04541
El vector pCLD045" fue aislado mediante el método de lisis alcalina
convencional,mlanecesidaddeutilizarunKitSeutilizóunaaltaconcentraciónde
ͧÍ:§rja¡jí;§jr:::,,::t:,;::::ríqíj,;:Ó:::&:§:ÍÍ:¡;;;dj:fi;uͧt§Ó;jr:::e:n;c;#Íj:#í:j;:§c;,e;;r¡;;;¡:E::;::c;;op:s;á:s:m;:í;
concentracjón estimada fue de 200 ng/Hl.
Linearizaciónydesfosforilacióndelvectorpcld04541
desfosfo:,fadno:C::gaurí:n::faetifz:rétqoudeo%:rae*ara%:Í¿fLcacc::nfedne:,,P:áesT:db°e":t::zrázrafe°no:
§jníug:o:n:£:£c::::dan:tr:£::t§;3rí::n:r¡:::eípíoe::{::c:E:é:r:Ó::án:d:Sv;t3er:qc:í::s:::;ct;:dá:r:énotd:eEj,::;cáa::n:ta::,;
;f:i,;ií:ai;o;Íin:ií,icí:i;:iiiii!;a::::Í;É#í¡iís::;:ci:;;:::aréi!,s;:;a;i,,:iv:;i,i,;á::fi:g::fi;Í;a:i:a:;:;,
37
Se obtuvieron en total 4 Lig/200 ul, se
concentración estimada fue de 20 ng/LLl. Se oDtuviewH " `vu, . r3__
gíe3Fár:Lo,aoa„,:nu3á:,:addeo2%ou:y,asee:L#;:enH::odT„a;2geos:osEf:r,,Fag3rrFa3cBo::eTt:::,tá:
•~ .--- J^ fna ha % nm se obtuvo 3.5 ug/100 Hl, se prepararon alicuotas de 20 Hl y
estimada fue de 35 ng/ul,
se almacenaron a -20 ac.
ADN de lambda (ng)
5
10
15
20
25
V41
ADN de lambda (ng)
F"m3A)Cumestándardelambdaparaestimarlaconcenmmde`vestüpCLD045WW
lineanzadoconlaenzimaBamHl(20ng/LLl)8)Curvaestandardelambdapmestim#laconcentracm
::lá:cfoonre:?uLe:o#=:a:?á,á,,,,no,oa:,:aTdBOEcgn5l:7eoni,,m3%:,,:md,:!::rlgáH,t,nE:::r:::r:::Smeu:;a::aert,áios
38
Prueba de desfosforilación
:§:,,fu:osaf:¡#%:g::e::;eás::e:§:¡:j:;;;;::rí:::rg{acíjr:a:Íí§o:rí[%nsníí:ít,rA:¡¡o:r;£e:a;;::bsd:Eí;;§;¡¡;±oce;b:c::n;g:;
azules del 5 0/o.
DISCUSIÓN
Elgradodepurezadelplásmidoesunfactordeextremaimporianciaenla
construcciónde"bibliotecaBACoBIBAC,porloqueesnecesarioasegurarsede
obtenerunADNplasmídi.colomáspuroposi.ble.
t,poBACS:EiEArspoEnna:fc:,::r=t::sevsércat:er::asBÁ8,a,o,:cpuuar,:=::ó:n:::::,avne:tnor::
rd=aenng#n;,e_b;aaram_€_ogg,adi,7_a82"Í:-#¿po£cÉíeu`:Éc:gvens€,B:#:`:?a~sp_¡tLr!ag3gs?S.:ees=sueÉggg?t::=Én
É:E:ZnboasJac::3:as,e,haa2o::apáaosepnormcoédrfí:iryeiuv:cutráf;ceanc,::arnet3uát,ansue:eprroobd,:m®a:=s
g::opre:dpué3,Gí3Aecsi:efi::omsahasnes,daonecí:as,tdr::d:t,y::tnodr:su:oenst:::en,ukT)eáoendoem::gáa;
$2rngv!éis:'3="e£t%gEortsa,sgñd`-g-cm*TÍ:#re=Ssyo,sapr:t:`¡Sgnt,dsoom,=gn?eii£,Te.y,:dkg:i:dgisÉOÉte:£=oaáíoí
2001).
LapurificacióndelvectorpBeloBAC11(elmásutilizadodelosBACs)seha
j;#u;;n:::::'í::sae:do:::::a:r:ot#:ei;:m:3oíse::eseTe:c:t:?Tr:a:j:s;e:n:t?erg:::r:;sa:;reo:::oÁ::,f:ao3n::n:g:
iají!zÍ:,::i:Íia::i;Ír:i:nra;;jj::t:e;::::::;:Íi;¡;í:ngí!:!¡d;:t;;::ip;uñTíi:ir::iji;;::g;f;ííi::zíi;:u;:;:a:o:n:jí;ir;ií;,
ciue utilizan los "ki.ts" antes menci.onados
pmr:ef:tr,a:LOTsueríf:;::ir:essm:;n:pA:ieá;goedTo:ir:g:::,:r::igd:eed;::rda::,u:rea,rio:s-2:;:,,:u:r,::don:t::eési:io:
bíi:::|síi;i;a;eiai;¡jaia:o;i;::;ia;i;:Íg:;q;u¡jí::f;iiu;Íi:::,::;is;i;:;ai#;ñíe;;o;;r;ií:jieiíi:;;:¡:::i;i:;:;;ii:;
39
2332g,r::,:?t2ifneg:,,oá:rso,deCes,o,Mekseme-ooo,Me-„,,2oo""
acentr,t:gsaecpóanra:Lóngrdaed`,ep|i:sm`dde°¥e4nts:de:dApe¥:rq°uT:bsr:oTi:rb;:tdeor:anc%'nac|roar:::3:
::iáoaic,qo::r3ed:e:eus::-abr:F:::n,ceae:,#)e:3ram:téóJ:s:b:enní:3nd:f:r::c::assgid:a::,::3
:Í:i:nit;:¡a;g;;:is;:.;:;i;é:::,v:q::i:í:si:tu;:;:d;:h:t,ííní:!i:ií!s¡t`:;;::i:iii;aí,;qi!:;::;tuui::;i:j:i:i:ii:í;r::jii!ji
::re::£:::aná,iebr:o:E?:uoreo::g:ft:;,:o|ihe:s:táaec:!,::d:oes:,:e:nrei:sá:ms:ñ:gc:u:i,soEnds!::ír::TnTd::::,r:e:a::tá;
á,:cg::L:::tá::t:13risdáemn;ero:i:,,oarr,r2odoel,Ces,oqueCont,eneCant,dadesSaturantes
Otro punto importante a considerar es la desfosforilación del vector V41
:¡:osir;;g;:ñ:;;n!;;::eisivrn;:;ij:a;::;s;;:r:ij:;:;:jza:;:!;iz;::;i:idiioi:ieoíii;:;i:i;:,::,;i:;;d;:o%;iii;iig!:;;:i:ñ;i:so!:iic
(eznnz:+2a)'(8:bLdb?oaoFsU:t:rb2°oSo;rc0factoresesencialesparaiaoptimaactividaddeia
i:a:!;i:íi;i::I:::;Ííeo;:eii:::jíií,i:iy;;zÍ;Í::;¡;oí;Í:e;g:í¡;i!ije:1ji:;;:ijíiií::iíí::!:iii;jie;n:;ciií[iij:!u::;a
concentraciónX,esnecesariodiluirlaconelamortiguadordedilucióndelnvitrogem
q#:gezcn:án,:,:nseee:t£:t,:::nc%Tpaosn::tnecséndt:a::¿:%rsmnaeg::a:,á:ptuíé;#ed:,,#£2e;ZdTam#
des,osfoEr:,::,Tner:ed:::::Tob,ndaenntt::(::iorná:;ob,:::::!::,te::i:seds,r:ná;::E:e8:do,o
(Zhang, 2000).
40
Aunque la purificacíón del vector pCLD04541 siguiendo el método de
gradientes de densidad con cloruro de cesio requirió de destreza manual y de mucho
más tiempo en comparación con otros métodos de purificación reportados en la
literatura, el resultado fue la obtención de ADN plasmídico altamente purificado,
linearizado y desfosforilado el cual fue utilizado para establecer el protocolo para la
construcción de la biblioteca genómica BIBAC de Calcufta 4.
REFERENCIAS
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41
CAPITULO 111
Preparación de fragmentos de ADN de alto peso molecular
INTRODUCCIÓN
EI ADN genómico de alto peso molecular (megabase) debe ser de alta
calidad (Iibre de fragmentos pequeños, de sales y de impurezas), esto es un requisito
esencial en la construcción de bibliotecas BAC o BIBAC EI ADN megabase es muy
susceptible a la ruptura física durante su preparación, Ios
más utilizados
_ métodos
_ J_ _í'_.'__
.J---+-'-~ ^para
J^
evitar este problema son.. el aislamientó de protoplastos de células vegetales o de
núcleos de células vegetales y animales, Ios cuales son incluidos en una matriz de
agarosa de bajo punto de fusión (LMP) en foi.ma de bloques cúbicos (plugs) o en
forma de microesferas. La agarosa en los plugs o en las microesferas actúa como una
matriz sólida y porosa, permitiendo la difusión de los diferentes reactivos para la
liberación del ADN y la subsiguiente manipulación (Schwans y Cantor,1984)
En plantas, se ha utilizado más ampliamente el método de extracc`ión de
núcleos (Zhang ef a/.,1995), que consiste en el rompimiento físico de la pared celular,
el aislamiento de los núcleos y su inclusión en agarosa formando plugs o en
microesferas. Este método es simple, resulta en una baia contaminación por ADN de
cloroplasto y mitocondria, es económico y se puede aplicar a una gran variedad de
espec.ies vegetales (Zhang eí a/., 1995). Posterior a la preparación de los plugs, es
necesario determinar la digestib.il.idad del ADN megabase, ya que la presencia de altas
cantidades de polisacáridos o fenoles (que en algunas especies vegetales se
encuentran en grandes cantidades), pueden inhibir la acción de las enzimas de
restricción.
EI
ADN
genómico
debe
ser
parcialmente
digerido,
para
producir
fragmentos del tamaño deseado para su clonación
Para la separación de los fragmentos grandes de ADN no se utiliza la
electroforesis convencional, ya que utiliza un campo eléctrico estático (Birren y Lai,
1993). Bajo estas condiciones las moléculas se alargan y se alinean con el campo y
migran hacia el ánodo a través de un proceso llamado ``reptación"; esto significa que el
ADN se mueve como una serpiente, esto es, la ``cabeza" selecc.iona el camino y el
"cuerpo'' le sigue Normalmente las moléculas más grandes de 20 kb no pueden
separarse entre sÍ, ya que tienen la misma área de sección-cruzada después de que
se alinean en el campo eléctrico.
Se ha demostrado que después de remover el campo eléctrico, las moléculas
de ADN alargadas se relajan, regresando a su estado no pehurbado. La proporción de
relajación es dependiente de la longitud del ADN (Klotz y Zimm,1972). Esta propiedad
se explotó para separar grandes moléculas de ADN cambios periódicos en la
orientación del campo eléctrico forza a las moléculas de ADN a relajarse, al removerse
el primer campo, y a elongarse para alinearse con el segundo campo.
42
La efectividad de la interrupci.ón y cambio de dirección del campo se demostró
a través de la separación de cromosomas de levadura, los cuales son de tamaño en
kHobases (Schwarts y Cantor,1984) Esta electroforesis fue denominada electroforesis
de campo pulsante
(ECP) (PFGE-Pulse Field Gel Elec{roforesis). EI ADN debe
cambiar su conformaci.ón y reorientarse antes de que pueda mi.grar en la dirección del
segundo campo. El tiempo requerido para esta reorientación se correlaciona con la
longM de la molécula. Moléculas muy grandes de ADN se tomarán más tiempo para
realinearse, en comparación con las moléculas pequeñas, debido a la barrera física
que presenta la matriz de agarosa
La selección de los fragmentos de ADN de tamaño determinado se efectúa
utilizando geles preparativos sometidos a electroforesis de campo pulsante. Se realiza
una primera selección del ADN parcialmente digerido; si éste es muy concentrado,
fragmentos pequeños de ADN co-migran con los grandes durante la electroforesis, ya
que se quedan atrapados entre estos. Para enriquecer la preparación con fragmentos
de ADN de gran tamaño y eliminar los de menor tamaño, se hace necesaria una
segunda selección de fragmentos, que permi.te aumentar el tamaño promedio de los
insertos en la biblioteca.
Finalmenle, Ios fragmentos seleccionados de ADN son recuperados del gel
utilizando la enzima gelasa que degrada el gel, o a través de la electroelución
utilizando tubos de diálisis (Strong eí a/.,1997). Este segundo método es ampliamente
utilizado; Ia electroelución se lleva a cabo u{ilizando electroforesis de campo pulsante
En el presente capítulo se describe la extracción de núcleos de Calcufta 4, el
procesamiento de los mismos (inclusión en agarosa de bajo punto de fusión),
digestión de la membrana nuclear con proteinasa K y la inac{ivación de esta enzima
con fenilmelil sulfonH fluoride (PMSF), la estandarización de las condiciones Óptimas
para la digestión parcial con la enzima BamHl o H/.ndlll y la ob{ención de fragmentos
de ADN de alto peso molecular (100 a 400 kb).
MATERIALES Y MÉTODOS
Matei.ial vegetal
Se utilizaron 45 plantas de Calcutta 4 micropropagadas /'n v/fno y adaptadas a
condiciones de invernadero del CICY; se regaron dos veces por semana, se
fenilizaron cada 15 días y se expusieron a la luz solar (77.63 Hmol a 168.6 Hmol).
Cuando alcanzaron una altura promedio de 80 cm, aproximadamente dos meses en el
invernadero, las plantas reci.bieron un tratamiento de obscuridad por 72 horas, previo
a la cosecha de las hojas, para promover la degradación del almidón acumulado, que
es difícil de remover durante el procedimiento de exti.acción de núcleos, por lo que
dismi`nuye la calidad del ADN. Posterior al tratamienlo de oscuridad se colectaron las
primeras dos hojas jóvenes de cada planta, se pesaron en paquetes de 50 g cada uno
y fueron inmediatamen{e congeladas en nitrógeno líquido y almacenadas a -80 °C.
43
Extracción de núcleos de Calcutta 4
Se utilizaron 100 g de hojas congeladas a -80 °C. Este mater.ial se procesó
para la obtención de los núcleos siguiendo la metodología reportada por Zhang
colaboradores (1995).
y
1.-Se molieron 100 g de tejido congelado (en dos morteros) adicionando suficiente
nitrógeno líquido para evitar el descongelamiento del material, por aprox.imadamente
20 min hasta la obtención de un polvo fino. lnmediatamente, éste es transferido a 1
litro de la solución HB lx (anexo 1) conteniendo 2% de polivinilpirrolidona (PVP40)
(modificación), 0.15% de P-mercaptoetanol y 0.5% de Triton X-100; se dejó incubar
en hielo con agitac.ión muy suave durante 10 min, se filtró con dos capas de
"cheesecloth" y una capa de "miracloth" y se recuperó el filtrado en tubos de centrífuga
previamente enfriados y estériles de 250 ml.
2.- Se centrifugó el filtrado util.izando un rotor (Beckman) de ángulo fijo a 1 800 g por
20 min a 4 ac, se eliminó el sobrenadante y se añadió, a cada tubo, 1 ml de
amortiguador de lavado previamente enfriado (anexol). La pastilla se resuspendió
suavemente con ayuda de un pincel estéril previamente remojado en el amortiguador
de lavado frío.
3.- Se colectaron todas las resuspensiones nucleares en un solo tubo de 40 ml
(oakridge) utilizando puntas cortadas; se llenó el tubo con amortiguador de lavado.
4.- Se centrifugó utilizando un rotor de ángulo móvil (sw.inging bucket centrifuge) a
1,800 g por 15 min a 4 °C, posteriormente se decantó el sobrenadante y la pastilla se
resuspendió en amortiguador de lavado con la ayuda del pincel; este paso se repitió 4
veces. Esta etapa es muy impoftante porque minimiza la contaminación con organelos
como mitocondria y cloroplasto.
5.- Después del Último lavado se resuspendió la pastilla de núcleos en una pequeña
cantidad (aprox 1 ml en total) de amohiguador HB 1 x sin P-mercaptoetanol (anexo 1).
Los núcleos se almacenaron en hielo hasta su incliisión en agarosa
lnclusión de los núcleos en
agarosa (plugs) de bajo punto de fusión
(LMP)
1 -Se prepararon 5 ml de agarosa de bajo punto de fusión (BRL USA) al 1%
utilizando el amortiguador HB lx sin mercaptoetanol ni Triton X-100; Ia solución se
precalentó en baño María a 45 °C antes de usarse.
2.- La suspensión de núcleos se precalentó a 45 °C por 5 min; se mezclaron
volúmenes iguales de agarosa y núcleos agitando muy suavemente de vez en vez, se
utilizó una punta coriada para pipetear la suspensión de núcleos.
3.- Se mantuvo la mezcla núcleos-agarosa en el baño a 45 °C mientras se llenaban
los pozos del molde, añadiendo 90 ul por pozo y utilizando la misma punta cortada, el
44
molde se mantuvo sobre hjelo. Cuando la agarosa estuvo completamente solidificada,
los moldes se transfirieron a un tubo falcon de 50 ml conteniendo 10 volúmenes del
amortiguador de ljsjs (anexo 1).
4 - Se incubaron los plugs en el amortiguador de lisis por 48 h a 50 °C con agitacjón
suave; después de 24 h el amortiguador se cambió por uno nuevo
5.- Se lavaron los plugs con 0.5 M de EDTA (pH 9.0-9.3) durante una hora a 50 °C,
posteriormente con 0.05 M de EDTA (pH 8) por una hora, en hi.elo, por úl{imo se
almacenaron en 0.05 M de EDTA, pH s a 4°C. En este paso los plugs conteniendo el
ADN megabase puede ser almacenado por un año a 4 °C sin que sufra una
degradación signjficativa.
Determinación de las condiciones óptimas para la digestión parcial del
ADN genómico con las enzima BamHl o #/.nd"
Se efectuaron 2 experimentos para determinar la concentración óptima de la
enzima de restricción que generara fragmentos de ADN de al{o peso molecular en el
rango de 100 a 400 kb. En el primero se utilizó la enzima BamHl y fue realizado en la
Universidad de Texas A & M. En el segundo se utilizó la enzjma Hí."H y fue realizado
en el CICY.
Previamente a la digesti.Ón, los plugs que habían estado almacenados en 0.05
M de EDTA se depositaron en un tubo falcon de 50 ml y se lavaron (den{ro de la
campana de extraccíón) tres veces con 10 volúmenes de TE frío conteniendo 0.1 mM
de fenilmetH sulfonil fluoride (PMSF-PhenylMethyl Sulfonyl Fluoride) para eliminar la
proteinasa K que afecta la acción de las enzimas de restricción. Cada lavado se
incubó en hielo por una hora Posteriormente, se dieron otros tres lavados (también de
unahoracadauno)conTEfríoeincubandoenhieloyfinalmentesealmacenóa4°C.
VerificacióndelaintegridaddelADNenlosplugsypruebadedigestión
Para determinar si el ADN no se encontraba degradado y con contaminantes
que interfirieran en la digestión, se corrieron tres pruebas. 1) digestión con la enzima
BamHI, 2) digestión con H/.ndlH y 3) análisis de los plugs sin digerir. Para ello se utilizó
electroforesjs de campo pulsante.
La digestión parcial del ADN genómico, se efectuó utilizando dos
amortiguadores; el amorti.guador de digestión 1 que conlenía todos los componentes
para la digestión a excepción de la enzima de restricción y la albúmjna sérica bovi.na
(BSA-Bovine Seric Albumin), en este amortiguador se incubaron los plugs por 30 min
(dos veces) con la finaljdad de permftm que los componentes se difundieran dentro de
los plugs. El amortiguador de digestión 2 contenia todos los componentes para la
digestión incluyendo la enzima y el BSA.
Para determinar las condiciones ópti.mas de diges{ión parcial o prueba de
digestión se utilizaron 2 plugs, mientras que para la djgestión parcial a gran escala se
45
utilizaron 10 plugs; cada plug se seccionó en 24 paftes util.izando un filo estérw (figura
4 A). Para la prueba de d.igestión parc.ial se utilizaron seis pedacitos de plug por
reacción La mezcla de reacción se preparó como se describe a continuacióm la
mezcla de reacción del amoftiguador para la d.igestión 1, por cada concentración de
enzima a utilizar, fue de: 867 Hl, H20 bidest., 22.5 Hl (3.75 Lil x 6), ADN megabase; m
Hl de amortiguador 10x de la enzima BamHl (hecho en el lab.); 2 Hl, espermidina lM.,1
LLl, DTT IM; como esta mezcla de digestión se utilizó para dos incubaciones (de 30
min cada una), las cantidades se duplicaron.
Para el amoniguador de digest.ión 2, Ia mezcla de reacción para cada
concentración fue la s.iguiente:
137 til, H20 bidest., 22.5 ul de ADN (6 pedacitos).,17
Ltl, amortiguador de la enzima BamHl o "H 10x; 0.34 Lil, espermidina lM, 017 Ltl,
DTT I M., m Hl, BSA (10 mg/ml), 2-10 Lil de enzima BamHl o H/."H de 1 U/Lil o 0.1
U/Li.l; el volumen final de reacción fue de aprox. 200 Hl de mezcla por tubo. Se
ensayaron concentraciones de 0, 0.3 U, 0.6 U 1.2 U, 2 4 U y 4 8 U de enzima BamH/
incubando a 37 °C por s m.in. En el caso de la enzima H/" para la prueba de
digestión se ensayaron las concentraciones de 0, 0 3 U, 0.6 U,1.2 U y 2.4 U de
enzima, como se había mencionado, los expermentos con H/.ndlH fueron realizados
en el CICY, por lo que se ensayaron 3 diferentes tiempos de incubación a 37 °C, los
cuales
fueron.12 min,16 min y 20 min.
Las reacciones efectuadas con diferentes concentraciones de BamHl o H/.ndHl
(cada una con seis pedacitos de plug), se analizaron en un gel de agarosa al Wo
preparado en O.5x de TBE (anexo 1). Para esto los pedacitos de plug se depositaron
en un solo pozo y el marcador de lambda de 50 kb en los pozos extremos. Los pozos
del gel fueron sellados con 1% de agarosa. El gel se depositó en la base de
electíoforesis de un CHEF DR n (BioRad) utilizando como amortiguador de corrida
TBE O.5x. Las condiciones de corrida fueron. pulso inicial 50 s, pulso final 50 s, 6
V/cm,12.5 °C, 80 rpm (bomba),120° de ángulo, tiempo de corrida 16 h.
Al final de la corrida, el gel fue teñido con una solución de bromuro de etidio
durante 30 min y desteñido durante 30 min con agua destilada. Para llevar a cabo la
primera selección de fragmentos de alto peso molecular, se seleccionaron tres
concentraciones de enzima BamHl o de H/.ndlll, que formaban una zona de
compresión bien definida entre 50 y 500 kb.
Procedimiento de digestión a gran escala.
Experimento realizado en la Universidad de Texas A & M
Se incubaron, en un tubo falcon de 50 ml, todos los pedacitos
correspond.ientes a 10 plugs (240 pedacitos en total) en el amortiguador 1 durante 30
min; éste se reemplazó con el mismo volumen de amortiguador 1 y se incubó por otros
30 min Posteriormente se transfir.ieron seis pedacitos de plug en tubos de eppendori
de 1.5 ml y se les añadió 170 Lil del amortiguador de digestión 2, adicionando al final
la concentración de enzima correspond.iente a cada tubo. Las concentraciones
ensayadas fuei.on de 0.1 U, 0.2 U y 0.3 U de BamHl y se utilizaron 80 pedacitos de
46
plug por cada concentración en un total de 40 tubos. Todas las reacciones se
incubaron en el amortiguador 2 durante 1 hora en hielo y luego a 37 °C durante s min.
La reacción se detuvo ponjendo los tubos eppendori inmediatamente en hi.elo y
adicionándo 1/10 del volumen de EDTA 0.5 M, pH S
Eme£imep!g±ea!±za9gj2!igQ)LY
Se incubaron, en un tubo falcon de 50 ml, todos los pedacitos
correspondientes a 10 plugs (240 pedaci.tos en total) en el amortiguador 1 duran{e 30
min;éstesereemplazóconelmismovolumendeamohiguador1yseincubóporotros
30 min Posteriormente se transfirieron seis pedacitos de plug en lubos de eppendoff
gael.:5nrmlnxr?e.,!e^sa^ñ_adTg_:|o_uL5_e_,_?T"n.,gLéiir-ói€iiGtti*Ógn`i:`fi.ic:or-ancdpovf,„,Enoan,
la concen{ración de enzima correspondiente a cada tubo. Las concentraciones
ensayadas fueron de 0.2 U, 0.3 U y 0.4 U de H/'ndlH y se utilizaron 80 pedacitos de
plug por cada concentración, en un total de 40 tubos. Todas las reacciones se
incubaron en el amortiguador 2 durante 1 hora en hielo y luego a 37 °C durante 12
min, 16 min y 20 min. La reacci.ón se detuvo poniendo los tubos eppendori
inmediatamenteenhieloyadicionando1/10delvolumendeEDTA(0.5M,pH8).
Selección de los fragmentos de ADN de 100 a 400 kb por electroforesjs
de campo pulsante (ECP)
Prjmera se[ección de fragmentos
La digestión parci.al a gran escala utilizando 10 plugs se analizó en un gel
preparatM3 de agarosa al 1% en O.5x de TBE; en esta ocasión, Ios dientes del peine
fueron sellados dejando únicamente libres los pozos de los extremos para el marcador
de 50 kb. Cada pedacito de plug fue ordenado en fila india dentro del pozo, es decir
uno después del otro, hasta depositar los 240 pedacitos de plugs, si era necesario se
formaban "dos pisos" (Fi.gura 4 8). Posteriormen{e, el pozo se selló con la mi.sma
agarosa al 1%. Las condiciones de comda para la primera selección fueron.
amortiguador de corrida O.5x de TBE, pulso inicial 90 s, pulso final 90 s, 6 V/cm, 12.5
°C, 80 rpm (bomba), 120° de ángulo, tiempo de corrida 16 h.
Al final de la corrida el gel se colocó sobre hielo y se prosigui.ó a cortar los
extremos del mismo, estos incluían al marcador ^ y unos 5 mm de los extremos del
carril conteniendo los plugs Estos bordes fueron teñidos con una solución de bromuro
de etidio durante 30 min,
desteñidos con agua bidestilada duranle otros 30 min y
fotografiados sobre un transiluminador de UV para localizar la zona comprendida entre
100 y 400 kb. Con ayuda de una regla se localizó la regjón de i.nterés y se cortó el gel
preparativoparatenerlosfragmentosde100a250kb(F1)yde250a400kb(F2)
Purificación de los fragmentos de ADN de la zona Fl y F2 a través de
electroelución (1)
Las membranas de diálisis de 14 KD (Gibco BRL) se cortaron de acuerdo al
anchodelgel,selavaronprimeroconaguadestiladaestérilfríayluegoconO.5xde
47
TBE,frío.ElgelcorrespondientealazonaF1,quecomprendialosfragmentosde100
a 250 kb y el de la zona F2, que comprendía los fragmentos de 250 a 400 kb, fueron
13.75HI
1
1
1
1
1
\
1
Plug
Piezas de plug ordenadas en el
pozo del gel
M
Gel preparativo
Figum 4. A) División en 24 pahes "iguales" de un plug conteniendo ADN de ab
peso molecular; se utilizaron 6 partes para cada concentración en la mezcla de
digestión parc.ial. 8) Forma en que se ordenan en el gel preparatM (uno después
del otro) las 240 partes de los 10 plugs para la primera selección de fragmentos;
M, marcador de lambda de 50 kb.
48
ln{roducidos cada uno a los tubos de diáljsi.s, cerrando primero un extremo con un clip;
se añadió por tubo de 400 a sOO til de TBE O.5x frío, y se cerró el otro extremo con
otro clip para posteriormente colocarlos en la cámara de electroforesis del CHEF DR
11 Las condiciones de corrida fueron: amohiguador de corrida O.5x de TBE, pulso
inicial 40 s, pulso final 40 s, 6 V/cm, 12.5 °C, 80 rpm (bomba),
120° de ánguio,
tiempo de corrida 4 h, Después de las 4 h, Ios {ubos de diálisis fueron girados " y
la corrida continuó por 50 s, para despegar el ADN eluído de la pared del tubo de
diálisis.
Segunda selección de fragmentos
Se elaboró otro gel preparati.vo de agarosa al 1% en O.5x de TBE; en es{e
`ac^ aa A.`iiJ:Á ^J ..^:__ _ ._ ___..
caso
se dividió el peine a la mitad y se sello cada mitad procurando dejar
•---------....-- r/.`-`.uiciiiu`+ ut;/ai
inHi`/;Ai.aJaÉ`
--.. _ ..., y
___
individuales, ..h^
uno^1al^ centro
uno_ a cada extremo. para depositar el marcadortres pozos
de 50 kb.
Después de deposi.tar el marcador, Ios pozos fueron sellados con la misma
agarosa al 1%. EI ADN electoeluído se recuperó de los tubos de diálisis con una punta
cortada (todo debe estar en frío). EI ADN de cada zona, Fl y F2, fue puesto en tubos
eppendoff de 1 5 ml. A cada fracción se le añadíó lm del volumen del amortiguador
de carga 10x (anexo 1), se agitó muy suavemente hasta homogenizar y se depositi5 al
gel preparatM3 prevjamente sumergido dentro de la cámara de electroforesis Las
condiciones para la segunda selección fueron.. amortíguador de corrida O.5x de TBE,
pulso i.nicial 5 s, pulso final 5 s, 4 V/cm, 12 5 °C, 80 rpm (bomba), 120° de ángulo,
tiempo de corrida 6 h.
Al final de la corrida el gel fue puesto sobre hielo y se prosiguió a cortar los
extremos del gel los cuales incluían al marcador y unos 5 mm de los extremos del
carril conteniendo las muestras de ADN. Estos extremos fueron teñidos con una
solución de bromuro de etkl® durante 30 min y luego fueron desteñidos con agua
durante 30 min, para fotografiarse sobre un transiluminador de UV y localizar las
zonas Fl y F2. Con ayuda de una regla se localizaron y se cortó el gel preparativo
para obtener la banda correspondiente a los fragmento de 100 a 250 kb y la
correspondjente a los fragmentos de 250 a 400 kb.
Purificación de los fragmentos de ADN de la zona Fl y F2 a través de
electroelución (2)
Se procedió exactamente de la misma manera como se mencionó en la
purificación de fragmentos de ADN de la primera selección, solamente que se debe
añadh de 200 a 350 Hl de TBE O.5x al tubo de diáli.sis en lugar de 400 a 800 Hl como
ocurre para la recuperación de la banda de primera selección.
Diálisi§
lnmediatamente después de la electroelución los tubos de diálisis con{eniendo
los ADNs electroeluídos se dializaron en un m de O.5x TE (anexo 1) estérw y frío,
durante 5 h a 4 °C(cuarto
ícuartofrío),
frín`haciendo
ha.ianrh
.-mhi^-.^
i` [`,dé_
j_ T-E-iríó'
Ti-£_!_ d-uTa-h'''e'cáává
.
cambios
de o.5x
hora (4 veces).
49
Deteminación de la concentración de ADN en cada fracción (Fl y F2)
Se colectó la solución de ADN de cada tubo (midiendo el volumen) utilizando
una punta cortada y se depositó en tubos eppendori (1.5 ml) por fracción. Se tomaron
5 Hl de cada fracción, se añadieron 2 Hl de amortiguador de carga (anexo 1) y se
anal.izaron en un gel de agarosa al 1% en O.5x de TBE, empleando concentraciones
conocidas del marcador lambda como estándar (5, 10, 15, 20, 25 y 30 ng). Las
condiciones de corrida fueron: 70 V, amortiguador 0 5x de TBE, 30 min de corrida.
Posteriormente el gel se t.iñó con bromuro de etidio por 30 min y se destiñó por otros
30 min. Finalmente se tomó una fotografía del ADN revelado con luz UV y se
determinó su concentración en base a los estándares de concntraciones conocidas
RESULTADOS
Extracción de núcleos de Calcutta 4
Siguiendo el protocolo de Zhang y colaboradores (1995), se pudieron obtener
aproximadamente 200 bloques de agarosa (plugs) conteniendo ADN de alto peso
molecular a partir de 100 g de tejido de hojas de plantas de invernadero expuestas a
un tratamiento de oscuridad por 72 h.
Cabe mencionar que estos bloques tenían iina coloración café muy tenue y
transparente ( figura 5). Estos fueron almacenados a 4 °C.
Selección de fragmentos de ADN de 100 a 400 kb mediante electroforesis
de campo pulsante (ECP)
ADN de alto peso molecular.
Para estimar la calidad del ADN de alto peso molecular se seleccionaron al
azar 12 plugs (figura 6); un barrido significa una degradación del ADN y una zona de
compresión significa que el ADN está Íntegro, en cuanto a la cantidad, Ia intensidad de
la zona de compresión indicaria si es elevada, media o baja. Los resultados indicaron
que el ADN aislado de Calcutta 4 estaba muy poco degradado y que la cantidad
estimada del ADN de alto peso molecular era media EI ADN de alto peso molecular
pudo ser digerido con la enzima BamHl y con la enzima Hi.MH (figura 7 y 8) Este
experimento indicó que no contenía componentes que interfirieran con la digestión
del ADN, por lo que los plugs eran de muy buena cal.idad para el establec.imiento de
las condiciones óptimas para la construcción de la biblioteca.
En Texas, por sugerencia del Dr Zhang se decidió trabajar con la enzima
BamHl para establecer un protocolo para la construcción de la biblioteca genómica
BIBAC para CalcLitta 4, debido a que el vector pCLD04541 había sido linearizado con
esta misma enzima. En la figura 7 A, se observa que a una concentración de 0 3 U de
BamHl se forma una zona de compresión entre 100 kb y 400 kb, mientras que a
mayores concentraciones, el ADN se sobre-digirió; por lo tanto, para realizar la
50
primera selecci.ón de los fragmentos de ADN de alto peso molecular se decidió utilizar
0.3 U y dos concentraciones debajo de ésta.. 0.1 U y 0.2 U
En el CICY, se determinó la concentración óptima de enzima H/.ndlll y el
::Tcpeontróapct,'Ómnodgeo,:cúbá:,é:z:m:7yoac,2Enm,|adfi;grnr:uzac:¿ns:39soecw:eq,::m::::
mejor zona de compresión entre 100 y 400 kb, por lo que se decidió trabajar con esta
concentración y dos concentraciones más, 0.2 U, y 0.4 U de H/.ndlll.
51
Figura 5. Plugs de Calcutta 4 almacenados en 0 05 M de EDTA.
M
Plugs
M
plugs
zona de compresion
Figura 6. Análisis del ADN de alto peso molecular de plugs de Calcu" 4 para estimar ia caiidad y
cantidad Concliciones de ECP. agarosa 1%, 0 5x TBE, pulso inicial 50 s, pulso final 50 s, 6 V/cm,
12.5 °C, 80 rpm (bomba),18 h de corrida M, marcador de lambda de 50 kb Tinción cm bromuro de
etidio
52
A388kb -
Unidades de BamHI
M
0
03 061.224 4.8 0 M
Unidades de Hindlll
97 kb _
+r- +rJLy12 min
16 mjn
20 min
:i3rmma7ó8:r#39eo8'gd:S:íóc:bpaa:íJ:'pdoer3DmYnd;É)t°®Pneia°eT:¡'icau£,rnefflT,baei¡g°m:T,T':g;,nAy)2Co°L!:
de incubación a 37 °C Condiciones de ECP: agarosa 1%, 0.5x TBE, pulso inicial 50 s, pulso final 50
s, 6 V/cm,12.5 °C, 80 rpm (bomba),18 h M, marcador de lambda de 50 kb Tinción con bromuro de
etldio.
53
Selección de fragmentos obtenidos con BamHI
Primer experimento. En la figura s se muestran los extremos del gel teñido
correspondiente a la primera y única selección de fragmentos de ADN de Calcutta 4;
las flechas indican los puntos de corte realizados en el gel antes de su tinción, para
recuperar las fracciones. La fracción F1 (100 kb a 250 kb), fue recuperada realizando
dos cortes en el gel, uno a los 8.2 cm de la regla de referencia y el segundo corte a los
7.6 cm; para recuperar la F2 (250 a 400 kb), se realizó un tercer corte a los 7.0 cm El
grosor de cada sección de gel cortado fue de 6 mm máximo, ya que una cantidad
mayor a ésta no entra en el tubo de diálisis. En la figura 9 se muestra el gel teñido con
bromuro de etidio, expuesto a luz UV y ensamblado de nuevo para mostrar donde se
coftaron las dos zonas. Los fragmentos obtenidos fueron directamente electroeluídos
y dializados para posteriormente ligarlos al vector V41.
Segundo experimento En la figura 10 se muestran los extremos del gel teñido de la
primera selección y se indica con flechas los puntos de corte que se realizaron para
aislar las fracc.iones del gel antes de su tinción. La fracción F1 (100 kb a 250 kb) fue
recuperada realizando dos cohes en el gel, uno a los 6 5 cm de la regla de referencia
y el segundo a los 5 9 cm, esto es, 6 mm de grosor. La segunda fracción F2 se
recuperó haciendo un tercer corte considerando 6 mm hacia arriba, a los 5.3 mm. En
la figura 11 se muestra el gel reconstruido después de la tinción de los extremos, en
donde se separaron las dos zonas (Fl y F2) y la alta densidad del ADN de los plugs
de Calcutta 4.
En la figura 12 se muestra el gel preparativo en donde se efectuó la segunda
selección de fragmentos. La corrida electroforética fue lo suficiente para dejar salir el
ADN del pozo y poder observarlo como una banda bien definida. Esta segunda
selección se llevó a cabo para eliminar fragmentos pequeños atrapados entre los
fragmentos grandes. Para recuperar la banda de ADN, las fracciones F1 (lado
izquierdo) y F2 (lado derecho) se recuperaron cortando a los 2 8 cm y a los 2.3 cm de
la regla de referencia. En la figura 13 se muestra el gel reconstruido y el área donde
se recuperaron las zonas (Fl y F2)
Selección de fragmentos obtenidos con H/.ndlll
Tercer experimento. En la figura 14 se muestran los extremos del gel teñido de la
primera selección y se indica con flechas los puntos de corte que se realizaron para
aislar las fracciones del gel antes de su tinción. La fracción F1 (100kb a 250 kb) fue
recuperada realizando dc)s cohes en el gel, iino a los 9.2 cm de la regla de referencia
:lsegundoalos8.6cm,estoes,6mmdegrosor.LasegundafracciónF2serecuperó
haciendo un tercer corte considerando 6 mm hacia arriba, a los 8.0 cm. En la figura 15
se muestra el gel reconstruido después de la tinción de los extremos, en donde se
separaron las dos zonas (Fl y F2) y la alta densidad del ADN de los plugs de Calcufta
4.
54
Extremos del gel preparativo
M1>M
388kb +
97kb +
Figura s Alineación de los extremos del gel correspondiente a la primera selección de fragmentos de
ADN (prímer experimento), teñido con bromuro de etidio y examinado con luz UV para localizar la
zona que contenga los fragmentos de ADN en{re 97 kb y 388 kb. Las flechas indican los corles que se
efectuaron en la parte del gel no teñida y que contenía la zona de interés Concentración de BamHl
01, 0 2 y 0 3 U/200 Lil de reacción. Condiciones de ECP: agarosa 1°/o, 0 5x TBE, pulso inicial 90 s ,
pulso final 90 s , 6V/cm,12 5 °C, 80 rpm (bomba),16 h. de corrida; M, marcador de ^ de 50 kb
Digestión de ADN de alto peso molecular
388 kb -
97 kb -
Porción no
teñida
Figura 9 Reconstrucción del gel de la primera selección, teñido con bromuro de etidio y expuesto a
UV.
Se muestra la porción no teñicla correspondiente a los fragmenlos F1 (100-250 kb) y F2 (250 a
400 kb) recuperados para la segunda selección La inten§idad del ADN de Calcutla 4 teñido con
bromuro de etidio refleja la alta densidad del ADN en los plugs M, marcador de ^ de 50 kb
55
ME¥emos del gel Prepa+ M
388kb +
97kb +
Figura 10 Alineación de los extremos del gel correspondiente a la primera selección de fragmentos
de ADN (segundo experimento), teñido con bromuro de etidio y examinado con luz UV para localizar
la zona que contenga los fragmentos de ADN entre 97 KB y 388 kb. Concentración de BamHI 0 1, 0 2
y 0 3 U/200 iil de reacción Condiciones de ECP: agarosa 1%, 0.5x TBE, pulso inicial 90 s, pulso final
90 s, 6V/cm,12 5 °C, 80 rpm (t)omba),16 h de corrida, M, marcador de lambda de 50 kb
Digestión de ADN de alto peso molecular
388kb -
Porción no
teñida
97kb -
Figura 11
Reconstrucción del gel de la primera selección, teñido con bromuro de etidio y expuesto a
UV. Se muestra la porción no leñida correspondien{e a los fragmentos F1 (100-250 kb) y F2 (250 a
400 kb) recuperados para la segunda selección La intensidad del ADN de Calcutta 4 teñido con
bromuro de etidio refleia la alta densidad del ADN en los plugs M, marcador de lambda de 50 kb
56
-
Extremos del gel
M
485kb -
Figura 12 Alineación de los extremos del gel para la segunda seleccíón de fragmentos de ADN
(segundo experimento), teñido con bromuro de elidio y examinado con luz UV para localizar la banda
que contenga los fragmentos de ADN Condiciones de ECP agarosa 1%, 0.5x TBE, pulso inícial 5 s,
pulso final 5 s, 6 V/cm,12.5 °C, 80 rpm (bomba), 8 h de corrida; M, marcador de lambda de 50 kb
MF1
F2M
á:raebanda +
_ 48.5kb
Figum 13. Reconstrucción del.gel de la segunda selección. Teñido con bromuro de etidio y
examinado cx)n luz UV para localizar la banda Fl que corresponde a los fragmentos de 100 a 250 kb
y la banda F2 a la fracción de fragmentos de 250 a 400 kb M, marcador de lambda de 50 kb.
57
Extremos del gel preparativo
>
<
MC
CM
388_
kb
97kb Figura 14 Alineación de los extremos del gel para la primera selección de fragmentos de ADN (tercer
experimento), teñido con bromuro de etidio y examinado con luz UV para localizar la zona que
contenga los fragmentos de ADN entre 100 y 400 kb. Las flechas indican los cortes que se efectuaron
en la parte del gel no teñida y que contenía la zona de interés. Concentración de H/.ncíIH 0 2, 0 3 y 0.4
U/200 Hl de reacción. Condiciones de ECP. agarosa 1%, O.5x TBE, pulso inicial 90 s, pulso final 90 s,
6V/cm,12 5 °C, 80 rpm (bomba),16 h de corrida, C, control sin enzima, M, marcador de lambda de 50
DLgestión de ADN de alto peso molecular
388 kb 97kb _
PorcLón de gel no
teñida
Figura 15. Reconstrucción del gel de la primera selección de los fragmentos de ADN. El gel fue teñido
con bromuro de etidio y expuesto a UV. Mostrando una porción no teñida correspondiente a los
fragmentos F1 (100-250 kb) y F2 (250 a 400 kb) recuperados para la segunda selección La
intensidad del ADN de Calcufta 4 teñido con bromuro de etidio refleia la alta densidad del ADN en los
plugs M, marcador de lambda de 50 kb.
58
En la figura 16 se muestra el gel preparativo en donde se efectuó la segunda
selección de fragmentos. La corrida electroforética fue lo suficiente para dejar salir el
ADN del pozo y poder observarlo como una banda bien definida Esta segunda
selección se llevó a cabo para eliminar fragmentos pequeños atrapados entre los
fragmentos grandes. Para recuperar la banda de ADN, las fracciones F1 (lado
izquierdo) y F2 (lado derecho) se recuperaron cortando a los 2.7 cm y a los 2.1 cm de
la regla de referencia.
Extremos del gel
Sa°nndeadeia{
-=-----ií:É:---
48.5kb _
Figura 16 Alineación de los extremos del gel correspondiente a la segunda selección de fragmentos
de ADN (tercer experimento) el gel fue teñído con bromuro de etidio y examinado con luz UV para
localizar la banda que contenga los fragmentos de ADN La banda Fl corresponde a los fragmentos
de 100 a 250 kb y la banda F2 corresponde a los fragmentos de 250 a 400 kb Condiciones de ECP
agarosa 1°/o, O.5x TBE, pulso inicial 5 s, pulso final 5 s, 6 V/cm,12 5 °C, 80 rpm (bomba), 8 h de
corrida; M, marcador de lambda de 50 kb.
Volumen de las fracciones recuperadas después de la diálisis
Primer experimento. Se recuperaron 770 L.I de la fracción Fl y 800 Ltl de la
fracción F2.
Segundo experimento. Se recuperaron 280 Hl de la fracción Fl y 160 til de la
fracción F2.
Tercer experimento. Se recuperaron 334 Lil de la fracción Fl y 294 Ltl de la
fracción F2.
Determinación de la concentración de ADN en cada fracción (Fl y F2)
Primer experimento En la figura 17 se muestra el gel donde se determinó la
concentración de cada fracción proveniente de una sola selección de fragmentos,
usando diferentes concentraciones estándar de ADN de lambda. Se estimaron 40 ng
para la fracción F1,
pero como se depositaron 5 Hl en el pozo entonces la
59
concentración fue de s ng/Hl; para la fracción F2 se estimaron 30 ng, como se
depositaron 5 Hl entonces la concentración fue de 6 ng/Lil.
Segundo experimento. En la figura 18 se muestra el gel donde se determinó
la concentración de cada fracción obtenida en las dos selecciones de fragmentos, se
estimó 15 ng para la fracción F1, como se depositaron 5 Lil en el pozo entonces se
tiivo una concentración de 3 ng/Hl. Para la fracción F2 se estimaron 5 ng, como se
depositaron 5 Ltl entonces se obtuvo 1 ng/Hl. Esta Última concentración fue muy baja
por lo que no es recomendable utilizarla
De preferencia se recomiendan
concentraciones entre 2 a 10 ng/Lil, ya que son las más adecuadas para trabajar en
los siguientes pasos.
ADN Lambda
5ng
10ng
15ng
20ng
25ng
FI
F2
Figura 17. Gel para deteminar la concentración de ADN en las fracciones Fl y F2 provenientes de
primera selección de fragmentos (primer experimento) La concentración se estimó utilizando m
curva estándar de lambda Condiciones de corrida. agarosa 1 % en 0 5x TBE, 70 V, 30 min de corrida
Tinción con bromuro de etidio.
ADN de lambda
5ng
10ng
15ng
20ng
25ng
30ng
FI
F2
Figura 18. Gel para determinar la concentración de ADN en las fracciones Fl y F2 de la segunda selección
de fragmentos (segundo experimento) La concentración se estimó utilizando una curva estándar de lamt)da.
Condiciones de cx)rrida. agarosa 1 % en 0 5x TBE, 70 V, 30 min de corrida Tinción con bromuro de eticlio.
60
Tercer experimento. En la figura 19 se muestra el gel donde se determinó la
concentración de cada fracción obteni.da en las dos selecciones de fragmentos; se
estimó 20 ng/LLl para la fracción Fl y para la fracción F2 se estimaron 15 ng/iil.
ADN de lambda
1
5
10
i5
2o
FI
F2
FI
F2
Figura 19. Gel para deteminar la concentración de ADN de las fracciones Fl y F2 de la segunda
selección de fragmentos (tercer experimento) La concentración se estimó utilizando una curva
estándar de lambda. Condiciones de corrida
agarosa 1% en O.5x TBE, 70 V, 30 min de corrida
Tinción con bromuro de etidio.
DISCUSIÓN
El segundo paso crítico en la construcción de una biblioteca genómica es la
preparación del ADN de alto peso molecular parcialmente di.gerido (Frijters eí a/.,
1997) Por lo tanto, se debe tener especial cuidado para obtener suficiente cantidad y
alta calidad de ADN.
Las hojas del banano contienen altos niveles de poljfenoles y polisacáridos
(Vilarinhos eí a/., 2002) por lo que se modificó la preparación del material vegetal y de
los núcleos. En el caso del materia vegetal las plantas de Calcutta 4 se sometieron a
oscuridad durante 72 para reducir la cantidad de carbohidratos como se ha reportado
para Loíus /.aponí.cus (Men eí al., 2001) También el método de extracción fue
ligeramente modificado,. se añadió PVP40 al amohiguador de extracción de núcleos
ya que este componente reduce la co-precipitación de los polifenoles con los núcleos.
Esta mi.sma modificación se realizó en la construcción de la biblioteca genómica de
manzana debi.do al alto contenido de compuestos fenólicos en sus hojas (Vinazer eí
a/., 1998). A pesar de que los plugs luvieron una coloración ligeramente café,
posi.blemente debido a la oxidación del remanente de polifenoles, no se afectó la
digestión del ADN de alto peso molecular.
Por otra parte, en la construcción de la biblioteca de sorgo se reportó que
llevando a cabo una segunda selección de fragmentos se podían eliminar los insertos
de tamaño pequeño (Woo eí a/.,1994) En la construccjón de la biblioteca de arroz se
observó que con una segunda selección de los fragmentos de ADN se incrementó, de
un 60 % a un 80%, Ia proporción de insertos mayores que 120 kb (Zhang eí a/.,
1996). Estos resultados indican que una doble selección de fragmentos de ADN
61
resulta necesaria y crucial para incrementar el tamaño promedio de los insertos en la
biblioteca a construir. La segunda selección permite eliminar fragmentos pequeños de
ADN y obtener insehos de tamaño más uniforme En los experimentos realizados en
Texas con el ADN de Calcutta 4 se efectuó una primera selección de fragmentos
debido a que se estaba estableciendo el protocolo y era necesario saber si el sistema
estaba funcionando baio las condiciones indicadas por el Dr. Zhang. Posteriormente
se realizó una segunda selección de fragmentosde ADN para aumentar el tamaño
promedio de inserto. En los experimentos realizados en CICY se efectuó directamente
la segunda selección de fragmentos a partir de la digestión con la enzima Hmdlll,
debido a que ya se sabia que este sistema funcionaba en banano.
De los fragmentos obtenidos por la digestión con BamHl, se observó que en el
primer experimento, en donde se realizó la primera selección, la concentración de
ADN fue alta para F1 (8 ng/Hl ) y F2 (6 ng/ul)
mientras que en el segundo
experimento, en donde se realizaron dos selecciones secuenciales, se obtuvo menos
ADN; 3 ng/Lil para F1, y 1 ng/Lil para F2.
En el tercer experimento (fragmentos obtenidos por la digestión con Hi.ndlll) se
pudo recuperar más ADN (20 ng/ Hl en Fl y 15 ng/Hl en F2,) debido a que en la
electroelución (2), se añadió solamente 200 Lil de TBE O.5x.
En cuanto a la selección del sitio (BamHl o H/.ndlll) para construir la biblioteca,
cabe mencionar que, estudiando el centrómero del minicromosoma de Beía w/gar/.s
se demostró que existe un sesgo en la representatividad de regiones centroméricas al
digerir el ADN de 8 w/gari.s con la enzima BamHl e hibridar con sondas específicas
para satélites que se encuentran en esta zona (pTS5) (Gindullis et al 2001). Se sugirió
que la posible causa de esto podría ser que las secuencias repetidas de los satélites
centroméricos se encuentran relativamente conservados y homogéneos o que BamHl
fue inhibida por la metilación de los satélites, puesto que
una alta proporción de
citosina metilada ha sido previamente encontrada en esta familia, en particular en el
pTS5 (Heslop-Harrison ef a/., 1999). Por otra parte, se obtuvieron fragmentos de
restricción que contenían al satélite pTS5 con un tamaño menor a 150 kb en las
digestiones con EcoRl y H/.ndlll, y con BamHl se produjeron fragmentos de hasta 340
kb. De estas er`zimas, H/.ndlll fue la única que produjo fragmentos de restricción en el
rango de 120 kb cuando fueron hibridados con las dos sondas (pTS4.1 y pTS5). Esto
demostró
que es mejor construir una biblioteca con H/'nc/lll ya que produce
fragmentos de restricción que incluyen las regiones centroméricas, por lo tanto, hay
una mejor representativtdad del genoma en estudio (Gindullis eí a/., 2001 ).
En este capítulo se presentaron los resultados de las digestiones parciales del
ADN de Calcutta 4 con la enzima BamHl o con Híndlll, de tal forma que el protocolo
para desarrollar la biblioteca con cualquiera de ellas está establecido, y en un futuro
pueden ser ambas construidas, complementándose una con otra y evitar se tenga
algún sesgo en la representatividad del genoma.
62
REFERENCIAS
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of a BAC library for the molecular dissection of a single wild beet centromere
and sugar beet (Befa w/gan.s) genome analysis. Genome, 44, pp 846-855
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Zhang, H-B., Choi, S., Woo, S-S., Li, Z., Wing, R. A. (1996). Construction and
63
caracterization of two r'ice bacterial artificial chromosome libraries from the
parents of a permanent recombinant inbred mapping population. Molecular
breeding, 2, pp 11 -24
64
CAPITULO IV
Obtención de clonas BIBAC
INTRODUCCIÓN
La efici'encia de clonación en términos de número y tamaño promedio de
inserto de las clonas recombinantes, obtenidas utilizando el vector convencional
binario pCLD04541 (V41) o los vectores BAC (pBeloBAC11) y BIBAC (p20818), varia
dramáticamente con las preparaciones de los fragmentos de ADN genómico (Wu eí
a/, 2000). En {odas las ligaciones en donde se han utilizado fragmentos de ADN
seleccionados, el vector V41 siempre mos{ró una eficiencia de clonación simi.Iar a los
vectores BAC y BIBAC. La eficienci.a de transformación de las diferentes ligacjones
obtenidas fueron de 100 a 10 000 colonias blancas por microlitro de ligación y el rango
del tamaño promedio de los insertos obtenidos osciló entre 50 y 150 kb (Wu ef a/.,
2000). Estas diferencias reflejan la influencia del método de preparación del ADN de
alto peso molecular, de la digestión parci.al, de la selección de fragmentos de
determinado tamaño y de la concentración y calidad del ADN que se va a clonar.
Dentro de estos factores, la digestión parcial del ADN resulta ser el paso más crítico y
difícil de controlar.
Una óptima digestión parcial debe producir en su mayoría fragmentos de ADN
entre 200-500 kb, con una concentración de aproximadamente 1.5 ng/Hl. Cuando el
tamaño de los fragmentos de ADN genómico son muy grandes (> 500 kb) o la
concentración es muy baja (< 0.1
ng/HI), se obtienen muy pocas clonas
recombinantes (Wu eí a/., 2000).
La cantidad de los fragmentos de ADN utilizados para llevar a cabo la ligación
es tan importante como la calidad del mi.smo Se requiere de una gran cantidad de
ADN genómico parcialmente digerido (2L10 ng/HI) para compensar la baja eficiencia
de tran§formación que se obtiene al in{roducir el vector portando los insertos de gran
tamaño (Frijters eí a/., 1997). Un sol)recargo de ADN en el gel durante la
electroforesis, con la finalidad de incrementar la cantidad a recuperar del ADN
parcialmente digerido, puede resultar en la co-migración de fragmentos pequeños de
ADN atrapados dentro de los grandes. Además, Ios fragmentos pequeños se ligan
preferentemente al vector y las transformaciones con estos resultan más eficientes,
por lo que la bi.blioteca resultaría con i.nsertos de tamaño promedio menor que 80 kb,
lo cual no es recomendable porque implicaría elevar más los costos y el tiempo que se
invertiría en construir la bibli.oteca.
Con la finalidad de incrementar la cantidad y la calidad del ADN que se usará
como inserto, se ha propuesto realizar una segunda selección de los fragmentos
producidos durante la digestión parcial Esto removerá los fragmentos pequeños de
ADN que queden atrapados entre los fragmentos grandes obtenidos en la primera
selección e incrementará el tamaño promedio de los inseftos clonados. Sin embargo,
es importante mencionar que la eficiencia de transformación se reduce drásti.camente
65
cuando se introduce el vector ponando los insenos obtenidos de la segunda selección
(Woo ef a/.,1994). Para incrementar la eficiencia de transformación se han propuesto
realizar diferentes modificaciones, como el llevar a cabo una pseudo segunda
selección qiie consiste brevemente en la selección del ADN a través de tres etapas en
el mismo gel. 1) se permite que el ADN de alto peso molecular depositado en los
pozos migre al extremo superior del gel (1 cm después del pozo) para llevar a cabo
este paso el gel se tuvo que invertir, 2) después que los fragmentos pequeños fueron
sacados del gel, se invierte a su posición normal, esto es, a favor de la corriente
eléctrica, para que el ADN de alto peso molecular migre y regrese a su posición en el
pozo, 3) finalmente se corre una electroforesis como cualquier otra segunda selección
para separar las fracciones de ADN en el rango de 150 a 500 kb. Esta metodología
fue efectiva para remover los fragmentos pequeños de ADN atrapados, sin afectar la
calidad ni la cantidad del ADN; este experimento fue llevado a cabo con ADN de ratón
(Osoegawa et a/., 1998) Este mismo procedim.iento ha utilizado también con ADN de
8. Wapus, obteniéndose resultados similares, esto es, incrementando el tamaño de los
insertos (Wu eí a/„ 2000).
La
principal
limitación
en
la
construcción
de
una
biblioteca
altamente
representativa es el número de transformaciones requeridas para generar el número
de clonas necesarias. Si el propósito es el mapeo físico y la secuenciación del
genoma completo, entonces es necesario tener una redundancia muy elevada del
genoma paraconstruircontiguos(contigs)completos(Osoegawaeía/.,1998).
En la construcción de bibliotecas genómicas BAC o BIBAC, la cepa de E. co//'
DHIOB es la más ampliamente utilizada debido a que posee las siguientes
particularidades.. a) una mutación en hsdRMS, endonucleasa endógena, que bloquea
la restricción de ADN foráneo, b) una mutación que bloquea la restricción de ADN
metilado (mcrA, mcm, mc¢ y mm), c) una mutación que bloquea la recombinación
(recA1 ) y d) permite incorporar ADN de gran tamaño (deoR).
En el presente capítulo se describen las ligaciones del vector pCLD04541
con los fragmentos de ADN (Fl y F2) procedentes de la digestión con BamHl o
H/.ndlll, la transformación de células de E. co// DH10B con el vector recombinante y el
análisis de las clonas para determinar el tamaño promedio de los insehos y el número
de clonas vacías (sin inserto) de cada ligación realizada.
MATERIALES Y METODOS
LIGACIÓN DEL VECTOR V41 CON LOS
SELECCIONADOS EN LAS FRACCIONES FI Y F2
FRAGIVIENTOS
DE
Fragmentos de ADN procedentes de la digestión con BamHI (Texas)
Primer experimento
66
ADN
Se procedió a llevar a cabo la ljgación del vector desfosforilado con los
fragmentos correspondientes a las fracci.ones Fl y F2, empleando una razón molar de
1 :2 (inseho:vector).
La mezcla de reacción para la fraccjón Fl consisti.Ó en. 695 HI H20 bidestilada,
350 Hl de F1 (2 800 ng), 47 Hl de vec{or V41 (940 ng), 280 ul de amortiguador 5x y 28
Ltl de T4 ligasa de 1 U/ul (lnvitrogen), volumen final 1 400 ttl.
La mezcla para F2 consistió en: 516 HI H20 bidest , 400 Hl de F2 (2 400 ng),
20 Hl de vector V41 (800 ng), 240 Hl de amortiguador 5x y 24 Hl de T4 Iigasa de 1 U/ul
(Invitrogen),. volumen final de 1 200 HI
Se realizó la mezcla de los componentes con extremo cujdado, esto es,
girando el tubo eppendorf en posición semi-horizontal. Posteriormente, se incubó a 16
°C durante 8.5 h. Se realizó una prueba de ligación, para confirmar la actividad de la
T4 Iigasa, mezclando 1 ul
de lambda/H/.ndlll con 10 Hl de la mezcla de ligación
procedente de la Fl o F2 (bajo las condiciones de incubación antes mencionadas).
Es importante mencionar que el ADN (inserto) y el vector se deben pipetear
con puntas cortadas para evitar daño mecánico.
Segundo experimento
Se llevó a cabo la ligación del vector con los fragmentos de la segunda
selección (Fl y F2) en una razón molar 1:2 (inserto.vector).
La mezcla de reacción consistió para la fracción Fl de. 71. Ltl H20 bidestilada,
140 Hl de F1 (420 ng), 7 Hl de vector V41 (140 ng), 56 Hl de buffer 5x y 6. Hl de T4
ligasa de 1 U/Hl (Invitrogen); volumen final 280 ul.
La mezcla para F2 consistió en 0. HI H20, 160 Hl de F2 (160 ng), 2.7 Hl de
vector V41 (54 ng), 41 Hl de buffer 5x y 4 Hl de T4 li.gasa de 1 lJ/til (lnvitrogen),
volumen final 207.7 HI
Los componentes se mezclaron como se descnbió previamente.
Fragmentos de ADN procedentes de la digestión con H/.ndlll (CICY)
Tercer experimento
Se llevó a cabo la ligación del vector con los fragmentos de la segunda
selección (Fl y F2) en dos razones molares 1,.2 y 1 : 4 (inserto.vector).
Razón molar 1 :2
La mezcla de reacción consistió para la fracción Fl de: 92| HI H20 bidestilada,
100 Hl de F1 (2 Hg),19 Hl de vec{or V41 (665 ng), 266.67 Hl de buffer 5x y 26.66 Hl de
T4 ligasa de 1 U/Ltl (Invitrogen),. volumen final 1333.33 Hl.
La mezcla para F2 consistió en: 887.67 HI H20,133.33 ul de F2 (2 Hg),19 Lil
de vector V41 (665 ng), 266.67. ul de buffer 5x y 26.66. Hl de T4 ligasa de 1 U/HI
(Invitrogen), volumen final 1333.33 Hl.
Los componentes se mezclaron como se describió previamente.
67
Razón molar 1 :4
La mezcla de reacción consistió para la fracción Fl de. 902 L.l H20 bidestilada,
100 ul de F1 (2 Lig), 38 til de vector V41 (133 Lig), 266.67 ul de buffer 5x y 26.66 Lil de
T4 ligasa de 1 U/Lil (lnvitrogen); volumen final 1333.33 LLl.
Los componentes se mezclaron como se describió previamente.
Transformación de E. co/i. (cepa DHIOB) con el ADN recombinante
Una alícuota de 1.5 HI Ó 2 Lil de la ligación se mezcló con 20 Lil de células
competentes de E co//. DH10B (BRL Gibco). La mezcla se depositó en celdas de
electroporación de 0.15 cm (distancia entre los electrodos). Las condiciones de
electroporación fueron voltaje de 350 V, capacitancia de 330 LiF, impedancia a nivel
bajo, carga rápida, resistencia 4 Q. Una vez transformadas, Ias células DH10B se
recuperaron adicionando 1 ml de medio SOC (anexo) e incubándolas a 37 °C en
agitación (250 rpm) durante 50 min. Posteriormente, se plaqueó todo el mililitro en
cajas de petri de 15 cm, conteniendo medio LB, tetraciclina 15 Lig/ml, lpTG 12 Lig/ml y
X-GAL 60 Lig/ml. Las cajas se incubaron a 37 °C durante 24-37 h. La eficiencia de
transformación del lote de células de
E co//. DH10B cuando se utilizó al plásmido
control pUC 19 fue de 9 x 109 cfu/ug.
Digestión con la enzima Wod y deteminación del tamaño promedio del
inser(o
La extracción del ADN recombinante se realizó aplicando la técnica de
minipreparación y siguiendo el protocolo reponado por Zhang (2000). El plásmido
aislado se digirió con la enzima Wofl con el fin de liberar los insehos. La mezcla de
reacción utilizada en la digest.ión con la enzima Nofl fue de.12.75 Hl de ddH20, 5 Lil de
ADN (vector-inserto), 2 Hl amortiguador 10x NEB, 0 2 Hl de 10 mg/ml de BSA, 0.05 Hl
de Wofl (10 U/Hl, BioLabs) volumen final 20 Hl. La reacción se incubó a 37 °C durante
3 h, posteriormente (a cada muestra) se le añadió un décimo de volumen del colorante
de carga 10x (anexo 1) y se incubó a 65 °C por 10 min para separar los extremos
pegajosos e inmediatamente se transfirieron a hielo Las reacciones se depositaron en
un gel y se utilizó el equipo ECP para separar los fragmentc>s, productos de la
digestión Finalmente se analizó y se determinó el tamaño de los insenos comparando
con el marcador de lambda de 50 kb.
RESULTADOS
Prueba de ligación
La figura 20 corresponde a los resultados de la prueba de ligación para los
fragmentos obtenidos en la primera selección (Fl y F2); en el control de ligación los
fragmentos pequeños de lambda fueron ligados,
esto es, no se observaron bandas
libres en los carriles 1 y 2, en comparación con el control sin ligasa (carril 1), indicando
que la ligasa T4 se encontraba en condiciones Óptimas de actividad.
68
lambda/H/.ndlll
FI
F2
12
23kb _
Figura 20 Prueba de ligación empleando el ADN seleccionado en las fracciones F1 (100-250 kb) y F2 (250
a 400 kb) Para esta prueba se mezcló ILtl de lambda/H/ndlll con 10 Ltl de reacción de ligación de F1 (carTil
1 ) y F2 (carril 2). El análisis de la ligación se realizó empleando electroforesis estándar Las condiciones de
corrida fueron: agarosa 1 %, 0.5x TBE, 70 V, 30 min de corrida. Tinción con bromuro de etidio.
Ligación del vector V41 con los fragmentos de ADN seleccionados en la§
fracciones Fl y F2
lnsertos obtenidos en el primer experimento
El número de colonias blancas obtenidas en la ligación correspondiente a la
fracción Fl fue de 230 y para la fracción F2 fue de 5 colonias blancas. Debido a que
en la fracción F2 se obtuvieron muy pocas colonias recombinantes se decidió no
analizar esta fracción La eficiencia de transformación obtenida para la fracción F1, no
pudo ser evaluada debido a que solo se registro el número de colonias blancas.
La figura 21 A muestra el análisis de 37 clonas BIBAC de la ligación de la
fracción F1. El tamaño promedio estimado de los insehos fue de 93 kb, se observaron
insenos entre 9 kb y 220 kb, agrupándose el 70.27 % entre 9 y 100 kb y sólo un 29 72
% mayores que 100 kb, no se presentó ninguna clona sin inserto En la figura 21 8 se
muestra la distribución de los insehos, la mayoría de estos se agrupó entre 9 kb y 80
kb_
lnser(os obtenidos en el segundo experimento
El número de colonias blancas obtenidas en la ligación empleando la fracción
Fl fue de 100 colonias y para la fracción F2 fue de 15 colonias. Debido a que en la
fracción F2 se obtuvieron muy pocas colonias recombinantes se decidió no analizar
69
esta fracción. La eficiencia de transformación obtenida para la fracción F1, no pudo
ser evaluada debido a que solo se registro el número de colonias blancas.
La figura 22 A muestra el análisis de 19 clonas BIBAC (de 36 analizadas) de la
ligación con la fracción F1. El tamaño promedio estimado de inseno fue de 125 kb; se
observaron insertos entre 70 kb y 175 kb, de estos el 28 °/o se agrupó entre 70 y 100
kb y el 72 % con insertos mayores que 100 kb, no hubo ninguna clona vacía. En la
figura 22 8 se muestra la distribución de los insertos, la mayoría de estos se
agruparon entre 101 kb y 120 kb.
37 Clonas seleccionadas al azar
1455kb +
97.Okb -
485kb -
V41-
v41_
V41-
9-80
81-100
101-120
121-140
141-160
161-180
181-200
201-220
F`ango de tamaño de los inseitos (kb)
Figura 21. A) Análisis por ECP de 37 clonas BIBAC procedentes del primer experimento. El asterisco
indica una inserto menor a 10 kb 8) Distribución de los insertos en base a su tamaño Los plásmidos
recombinantes (clonas BIBAC) se digirieron con la enzima Woíl. Las condiciones de la ECP fueron.
agarosa 1%, 0.5x TBE, pulso inicial 5 s, pulso final 15 s, 6V/cm,12.5 °C, 80 rpm (bomba),16 h de
corrida. V41, vector pCLD04541 ; M, escalera de lambda Tinción con bromuro de etidio
70
M
145.5kb
19 muestras tomadas al azar
+
97_Okb _
48.5kb _
-
V41_
V41
v41_
70-80
81-100
101-120
121-140
141-160
161-180
F`ango del tamaño de los insertos (kb)
Figura 22. A) Análisis por ECP de 36 clonas BIBAC (solo 19 de éstas se muestran) procedentes del
segundo experimento 8) Distribución de los insenos de 36 clonas en base a su lamaño. Los
plásrnidos fueron digeridos con la enzima ~ofl Las condiciones de la ECP fuercm agarosa 1%, 0 5x
TBE, pulso inicial 5 s, pulso final 15 s, 6V/cm,12 5 °C, 80 rpm (bomba),16 h de corrida M, escalera
de lambda; V41, vector pCLD04541. Tinción con bromuro de etidio.
71
lnsertos obtenidos en el tercer experimento
Para determinar que ligación proporcionaba el mayor número de insertos con
tamaños mayores que 100 kb y sin insertos menores que 10 kb, se estimó el tamaño
promedio de inserto de 18 a 20 clonas de cada transformación, para después
seleccionar la mejor ligación y evaluar aproximadamente 100 clonas.
Tran§formaciones
a) Razón molar 1:2,1.5 Hl de ligacjón para la transformación
El número de colonias blancas obtenidas en la transformación empleando la
ligación de la fracción Fl fue de 187 colonias (61.5 %) y 117 colonias azules que
representan el 38.4 %. Para la fracción F2 fue de 30 colonias. Estas últimas no se
analizaron por las razones antes mencionadas. La eficiencia de transformación cfu/ug
de ADN obtenida para la fracción 1 fue de 1.05 x 105cfu/Hg (cfu= unidade de colonias
formadas).
La figura 23 A muestra el análisis de 19 clonas BIBAC de la ligación con la
fracción F1. El tamaño promedio estimado de inseno fue de 115 kb, se observaron
insenos entre 63 kb y 150 kb, agrupándose el 16.66 °/o por tamaños entre 60 y 100 kb
y el 83 33 % mayores que 100 kb; no hubo ninguna clona vacía. En la figura 23 8 se
muestra la distribución de los insertos, la mayoría de estos se agruparon entre 101 kb
y 120 kb.
b) Razón molar 1 :4, 1.5 ul de ligación para la transformación
El número de colonias blancas obtenidas en la transformación empleando la
ligación de la fracción Fl fue de 271 colonias (55.4 %) y 218 colonias azules que
representan el 44.5 %. No se evaluó la fracción F2. La eficiencia de transformación
obtenida para la fracción 1 fue de 1 30 x 105 cfu/Hg
La figura 24 A muestra el análisis de 20 clonas BIBAC de la ligación con la
fracción F1. El tamaño promedio estimado de inseno fue de 111.25 kb; se observaron
insehos entre 10 kb y 196 kb, agrupándose el 30 % entre 9 y 100 kb y el 70 °/o
mayores que 100 kb, no hubo ninguna clona vacía. En la figura 24 8 se muestra la
distribución de los insertos , la mayoría de estos se agruparon entre 101 kb y 140 kb.
72
M
19 muestras tomadasal azar
145.5kb +
970kb 485kb -
V41_
v41_
V41_
=:..:.
L.`l
60-80
81-100
F
101-120
121-140
141-160
Rango del tamaho de los insertos (kb)
Figum 23 A) Distribución por ECP de las 19 clonas BIBAC procedentes del experimento 3 a El
asterisco indica una clona en donde no se digirió bien el plásmido 8) Análisis de los insenos en base
a su tamaño Los plásmidos fueron digeridos con la enzima Woíl. Las condiciones de la ECP fueron:
agarosa 1%, 0 5x TBE, pulso inicial 5 s, pulso final 15 s, 6V/cm,12 5 ac, 80 rpm (bomba),16 h de
corrida M, escalera de lambda de 50 kb, V41, vector pCLD04541 Tinción con bromuro de etidio
73
20 muestras tomadas al azar
M
--
145.5kb +
97.0 kb
48_5 kb
V41-
v41_
V41-
9-80
81-100
101-120
121-140
141-200
Rango del tamaño de los inserto§ (kb)
Figura 24. A) Análisis por ECP de 20 clonas BIBAC (clonas procedentes del tercer expe mento, 3b).
Los asteriscos muestran las dos clonas con insertos de aproximadamente de 10 kb. 8) Distribuclón de
los insertos en base a su tamaño. Los plásmidos fueron digerídos con la enzima ~oÍI Las condiciones
de la ECP fueron: agarosa 1%, 0.5x TBE, pulso inicial 5 s, pulso final 15 s, 6V/cm,12.5 °C, 80 rpm
(bomba),16 h de corrida M, escalera de lambda de 50 kb,
bromuro de etidio.
74
V41, vector pCLD04541
Tinción con
c) Razón molar 1 :4, 2 Lil de ljgación para la transformación
El número de colonias blancas obtenidas en la transformación empleando la
ligación de la fracción Fl fue de 316 colonias (37.5 %) y 526 colonias azules que
representan el 62.4 %. No se evaluó la fracción F2. La eficiencia de transformación
obteni.da para la fracción 1 fue de 1.68 x 105 cfu/LLg
La figura 25 A muestra el análisis de 18 clonas BIBAC de la ligación con la
fracción F1. El tamaño promedio estimado de inseho fue de 125.8 kb; se observaron
jnsertos entre 10 kb y 172 kb, agrupándose el 11.11 % de estos por tamaños entre 9 y
100 kb y el 88.88 % mayores que 100 kb, no hubo ninguna clona vacía En la figura
25 8 se muestra la distribución de los insertos, la mayoría de estos se agruparon entre
101 kb y 140 kb.
En el cuadro 2 se resumen los resultados obtenidos en los tres experimentos.
En el tercer experimento, las ligaciones 3b y 3c (cuadro 2) presentaron una
eficiencia de transformación elevada, con respecto al número de colonias blancas,
esto es, 271 y 316 clonas respectivamente; sin embargo estas ligaciones no se
consideran Óptimas para la construcción de la biblioteca por la presencia de insertos
pequeños de aproximadamente 9 kb . La ligación 3a (cuadro 2), proporcionó la mayor
cantidad de insenos mayores que 100 kb; además no presentó insertos pequeños, por
lo que se decidió evaluar mas clonas de esta transformación hasta completar
aproximadamente 100 clonas.
Al analizar 94 clonas para completar un total de 112 clonas (94 + 18 = 112), el
tamaño promedio de inserto aumento a 122.27 kb; no se encontró ninguna clona con
tamaño de inserto de 9 kb, como en los otros experimentos. El rango del tamaños de
los insertos estuvo entre 27-190 kb y solo hubo una clona sin inserto; agrupándose el
14.28 % de estos insertos entre 27 kb y 100 kb. De este grupo, se encontraron dos
clonas, una con un inseho de 27 kb y la otra con un inseno de 43 kb (insertos más
pequeños); el resto de clonas tuvieron insertos mayores que 60 kb; el 85.71 % de los
insenos fueror` mayores que 100 kb.
En la figura 26 A se muestra el análisis de 41 clonas de un total de 112
analizadas y en la figura 26 8 se muestra la distribución de los inseitos en base a su
tamaño de las 112 clonas.
Se ha observado que en el genoma de las plantas monocotiledóneas se tiene
una mayor frecuencia de sitios de reconocimiento Wofl, comparado con las plantas
dicotiledóneas, por lo tanto, no es raro observar en el análisis de clonas más de una
banda procedentes de los insertos.
El vector pCLD04541 posee 5 sitios de restricción para Wofl, obteniéndose 5
fragmentos de los cuales solo tres son visibles en el gel; los otros dos se salen del gel
por las condiciones de la corrida electroforética.
75
18 muestrastomadas al azar
M
145.5kb +
97.Okb -
48.5kb -
V41-
v41-
9-80
81-100
101-120
121-140
141-160
161-180
Rango del tamaño de los insertos (kb)
Figura 25` A) Análisis por ECP de las 18 clonas BIBAC. 8) Distribución del tamaño de insenos de 18
clonas
pro®dentes
del
ter®r
experimento,
3c
El
asterisco
muestra
un
fragmento
de
aproximadamente 10 kb, la flecha señala una clona sin inserto` Los plásmidos fueron digericlos con la
enzima ~oíl. Las condiciones de la ECP fueron: agarosa 1%, 0.5x TBE, pulso inicial 5 s, pulso final
i5 s, 6V/cm,12.5 °C, 80 rpm (bomba),16 h de corrida M, escalera de lambda;
V41, vector
pCLD04541. Tinción con bromuro de etidio
76
A
M
41 clonas seleccionadas al azar
M
1455kb +
970kb +
48.5kb -
v41+
V41+
v41+
27-80
81-100
101-120
121-140
141-200
201-250
Rango del tamaño do inserto (kb)
Figura 26. A) Análisis por ECP de 41 clonas BIBAC de un total de 112 analjzadas, procedentes del
primer experimento, 3a. 8) Distribución de los insertos en base a su tamaño de las 112 clonas antes
mencionadas` Los plásmidos recombinantes (clonas BIBAC) se digirieron con la enzima WoÍI Las
condiciones de la ECP fueron. agarosa 1%, 0.5x TBE, pulso inicial 5 s, pulso final 15 s, 6V/cm,12.5
°C, 80 rpm (bomba),16 h de corrida. V41, vector pCLD04541, M, escalera de lambda. Tinción con
bromuro de etidio.
77
Cuadro 2 Resumen de los resultados obten idos en los tres experimentos
Experimento
Enzim a
Razón molar
1a
de
(inserto:vector)
selección
23a3b
BamHl
BamHlHindlll
1
.2
11
2:2
S
SS
3c
H ind'll
H lndlll
1.4
•1 5 pl de ligación
1 ul de ligac]ón
no no evaluado
S
S
%deinseftos
enel
de
selección
transformaclóncfu/uq
colonias
blancas
colonlas
colonias
azules
analizadas
enel
rango
9- 1 00kb
NO
230.
ne
37
70.27
SS
100,187*
ne117
3618
-
de
número de
1.01 x 10-
1:4
%deln§ertos
2a
restricclón
1
número
número
de
Eficiencia
S
1 30 x 10'
27r
218
20
30
S
1 68 x 1 0'
316_
526
18
11.11
rango
60-100kb
%de
Tamaño
insertos
mayor
promedio
que100kb
de
lnserto(kb)93125
29.722.22
27.7716.66
7.83.33
11511125
70
8888
1258
lllllIL-
Se ha observado que en el genoma de las plantas monocotiledóneas se tiene
una mayor frecuencia de sitios de reconocimiento ~ofl, comparado con las plantas
dicotiledóneas, por lo tanto, no es raro observar en el análisis de clonas más de una
banda procedentes de los insertos.
El vector pCLD04541 posee 5 sitios de restricción para Woíl, obteniéndose 5
fragmentos de los cuales solo tres son visibles en el gel; los otros dos se salen del gel
porque son fragmentos más pequeños.
Número de colonjas necesarias para tener una biblioteca representativa
El cálculo del número de colonias necesarias para construir una biblioteca
representativa se realiza utilizando la siguiente ecuación:
N= In (1-P)/ln (1-L/G)
Donde:
N= número de colonias en la biblioteca
P= probabilidad de tener cualquier secuencia de interés
L= longitud promedio de inseíto en pares de bases
G= longitud del genoma haploide en pares de bases.
Con esta fórmula, si se tiene un 99 % de representatividad, el número de
clonas calculadas representa 5 veces el genoma haploide.
Aplicando la ecuación con diferentes valores de tamaño promedio de inseno y
considerando que el genoma haploide de Calcufta 4 es 600 Mpb tenemos
a) con tamaño promedio de fragmentos de 125 kb (2° expto.).
N= ln (1-.99)/ln (1-1.25xl05/6 xlo8) = 22 000 clonas
b) con tamaño promedio de fragmentos de 122 27 kb (3er. expto.)
N= ln (1-.99)/ln (1-1.2227 xl05/6 xl08) = 22 609 clonas
DISCUSIÓN
En el desarrollo del protocolo para la construcción de la biblioteca genómica
de Calcufta 4 utilizando un vector binario (pCLD04541), fue necesario empezar con
una primera selección de fragmentos para establecer las condiciones debido a que no
se tenía información previa para banano.
El tamañc> promedio de los insertos provenientes de la digestión con BamHI
cuando se realizó únicamente la primera selección de los fragmentos de ADN, fue de
93 kb, agrupándose el 72.2 % en el rango de 9 a sO kb; no estando satisfechos con la
79
distribución del tamaño de los insertos, se decidió no considerar esta ligación para la
construcción de la biblioteca de Calcutta 4 (puesto que la mayoría de las bibliotecas
reportadas presentan la mayoría de insertos con tamaños mayores que 100 kb)
(Lijavetzky eí a/, 1999; Wu eí a/, 2000; Luo eí a/, 2001 ; Gindullis eí a/ 2001 ).
Con la finalidad de aumentar el tamaño de los insertos se prosiguió a realizar
una segunda selección de los fragmentos de ADN (Woo eí a/., 1994, Zhang eí a/.,
1996). Cuando se realizaron dos selecciones consecutivas el tamaño promedjo de
inserto incrementó a 125 kb, y el 72 % se agrupó entre 101 kb y 120 kb. Esta
diferencia (93 kb y 125 kb) se debió a que en la primera selección los fragmentos
pequeños que quedaron atrapados entre los más grandes, fueron más fácilmente
ligados al vector, reduciendo así el tamaño promedio de los insertos en las clonas. En
la segunda selección la mayoría de los fragmentos pequeños fueron eliminados, por lo
que el tamaño promedio de los insertos aumentó, haciendo que esta ligación fuera
adecuada para la construcción de la biblioteca de Calcufta 4.
Es imponante remarcar que además de analizar el tamaño promedio de
inserto en la muestra seleccionada, es necesario apoyar este dato con el análisis de
cómo se distribuyen los insenos en base a su tamaño para determinar la calidad de la
bibll'oteca.
Se ha reportado que la construcción de una biblioteca de una especie con una
sola enzima de restricción puede traer problemas en la representatividad del genoma,
por el sesgo que puede haber debido a la distribución no uniforme de los sitios de
restricción (Wu eí a/., 2000, Tao eí a/., 2002; Yim eí a/ , 2002). Es por esto que se
decidió realizar otra ligación utilizando ADN genómico digerido con la enzima H/'ndlll.
Como ya se había mencionado antes, los experimentos utilizando a la enzima
Hi.ndlll se realizaron en el CICY. De las dos ligaciones obtenidas, esto es, variando la
proporción inserto:vector (1.2 o 1:4), la que presentó el mejor tamaño promedio de
inseho y la mejor distribución de estos (la mayoría con insertos mayores que 100 kb)
fue la ligación apli.cando la razón
molar 1.2 (experimento 3a),
de la cual
posteriormente se analizaron 94 clonas más para completar 112 clonas analizadas.
Se pudo observar que el tamaño promedio de inserto incrementó de 115 kb a 122.27
kb; aunque con este tamaño de muestra se obtuvieron dos insertos pequeños (27 y 43
kb) la gran mayoría de los insertos se encontró por arriba de 100 kb.
Con respecto a la cantidad de ligación (1.5 Hl o 2 Hl) para la transformación de
bacterias por electroporaclón, cuando se utilizó la razón molar 1 :4 y se transformó con
1.5 Lil o 2 Hl de ligación, el número de clonas recombinantes aumentó de 271 a 316
repectivamente con respecto al experimento 3a (187 clonas) Sin embargo, se
presentaron fragmentos menores de 10 kb, lo cual es una desventaja desde el punto
de vista económico y práctico, porque al tener insertos pequeños estos reducen el
tamaño promedio de inserto de la ligación y se requerirán más clonas para cubrir n
veces el tamaño haploide; esto trae como consecuencia un incremento en los costos y
un incremento en el tiempo necesario para la construcción de la biblioteca. Esta es la
80
segunda razón por lo que la llgación del experimento 3a resultó ser la más adecuada,
aunque se obtuvo un número de clonas recombinantes menor (187 colonias).
exper,m::togse:xeir:!'c::/H°gbsdeewÁDUNn):,:a¿:aFfi¿::nnc:+ae::ntr,:n:::roT::':nene|atitde::tj::
(Fritjers eí a/.,1997; Wu eí a/., 2000; Vinazer eí a/.,1998). De aquí la importancia de
iniciar con un ADN genómico de la más alta calidad y con una concentración
::::'uean:: é#| ::g (ext |a:to `cg,:,5u); áseí Á:i:? puá'::za:o:é;:'::a,e',eact;oa::mep,:ct,::tc:: ::
transformación obtenida, no solamente por el tamaño de inserto clonado (mayores
que 100 kb), sino también por utilizar vectores de tamaño grandes (29 kb) como es
nuestro caso.
Cabe mencionar que después de analizar el porcentaje de clonas
recombinantes (blancas) y no recombinantes (azules), se puede observar es que hay
un gran porcentaje de clonas azules en cada transformación (del 40 al 60 %), esto
podría indicar que el vector no se encontraba completamente linearizado, ya que la
prueba de desfosforilación realizada indicaba que la desfosforilación fue buena (95 °/o
de recombinantes). Estos resultados indican que habría que realizarle una purificación
al vector linearizado y desfosforilado para eliminar aquel vector que se encuentre
circular, esto se puede llevar a cabo utilizando electroforesis convencional para
separar el vector lineal del circular y posteriormente recuperar el vector linearizado por
electroelución.
Las dos ligaciones procedentes con los fragmentos de ADN de la segunda
selección (una procedente de fragmentos obtenidos de la digestión con BamHl y la
otra con H/.ndlll) resultaron ser mejores en cuanto al tamaño promedio de inser(o (125
kb y 122.27 kb respectivamente), sj se cx)mparan con algunas de las bibliotecas
construidas con el mismo vector (pCLD04541 ), como por ejemplo la de Goss)ip/.um
h/.rsuíum,
120 kb (biblioteca-H/.ndlll, Dong eí a/., 1999); LoÍus
/.apon/.cus, 94 kb
(biblioteca-H/.ndlll, Men eí a/„ 2001) o Bras/.ca napus,105 kb (biblioteca-HÍ.nd]H, Wu eí
a/_, 2000).
Cuando se aisló la parte del gel en la región donde el tamaño de los
fragmentos de ADN era muy alto (250400 kb o F2), el número de clonas
recombinante se redujo drásticamente. En la construcción de bibliotecas como la de
papa, trigo, arroz y papaya (Song eí a/., 2000; Lijavetzky eí a/.,1999; Tao eí a/., 2002;
Mng eí a/., 2001) se encontró también un bajo número de recombinantes en la zona
con fragmentos de ADN mayores que 250 kb. Se propuso que se puede deber a que
los insertos ligados son muy grandes y no fue posible transformar eficientemente E.
co/i', aún siguiendo el método de electroporación. Se ha visto también que hay un alto
número de clonas sin inserto en estos casos.
La región Fl del gel permite la construcción de bibliotecas con un tamaño
promedio de inseno aceptable, que va de 100 kb a 250 kb. Sin embargo, la
localización de esta región es variable, ya que con solo cambiar ligeramente la
concentración del ADN también cambia su movilidad durante la electroforesis, de tal
81
forma que el marcador de tamaño de ADN no proporciona una indicación exacta del
tamaño de los fragmentos (Vinazer eí a/.,1998).
En el análisis de las clonas positivas digeridas con la enzima Wofl, es posible
observar en el gel teñido con bromuro de etidio y expuesto a rayos UV, múltiples
bandas que pueden reflejar verdaderos sitios Wofl dentro de los insertos (figura 26 A)
o una digestión incompleta con la enzima. Para diagnosticar si se debe a una
digestión incompleta es necesario comparar la intensidad de la o las bandas del
inserto con respecto a las bandas del vector. Debido a que el rendimiento del ADN
plasmídico aislado de diferentes clonas BIBAC es bastante comparativo, la intensidad
de la fluorescencia en la banda del vector debe ser relativamente uniforme de una
clona a otra. Si no son visibles las bandas del vector en la zona esperada y se
observa una gran banda intensa, se debe asumir que la digestión fue incompleta; esta
banda corresponderá al vector y al inseno unidos.
Las clonas BIBAC pueden no producir bandas visibles en el gel que
correspondan al inserto después de su digestión con Woíl, debido a que el inserto se
fragmenta en tamaños pequeños por lo que se salen durante la corrida o porque son
débilmente teñidos. Alternativamente pueden haber vectores sin insertos, los cuales
fueron purificados de clonas que resultaron de una alteración en el sitio de clonación
debido a contaminación con nucleasas, lo que usualmente ocasiona una deleción, y
como consecuencia un desfasamiento del marco de lectura del gen reportero .
En resumen, con las dos ligaciones obtenidas se pueden construir dos
bibliotecas BIBAC del banano silvestre Calcutta 4; una sería construida con la ligación
de BamHl y la otra con H/.ndlll, permitiendo ser ambas complementarias, de tal forma
que se tenga una mejor representatividad y cobertura del genoma. Se tendrían que
obtener 22 000 clonas de la ligación con tamaño promedio de inseno de 125 kb y 22
609 clonas de la ligación con tamaño promedio de inserto de 122.27 kb para tener una
cobertura del genoma haploide de 10x. Estas serían las primeras bibliotecas
construidas del banano silvestre Calcutta 4 con un vector binario con jnser(os listos
para la transformación de plantas mediante A. Íumeraci'ens.
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82
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83
Discusión general
El método utilizado para la construcción de las bibliotecas con insertos
tamaño grande (en promedio mayor que 100 kb) tiene que ser adaptado para
especie bajo investigación. La construcción de bibliotecas BAC o BIBAC implican
esfuerzo que consume mucho tiempo y son muy demandantes. El éxito en
obtención de este tipo de bibliotecas recae en la buena preparación del vector y
correcta selección de los insertos de alto peso molecular (Lou eí a/., 2001 ).
Para optimizar la preparación del vector V41 se requirieron de dos pasos
secuenciales de purificación con cloruro de cesio, en lugar de utilizar los métodos de
purificación por columna que comúnmente son usados en la construcción de la
mayoría de las bibliotecas BAC o BIBAC en plantas (Fritiers eí a/„ 1999; Mozo ef a/ ,
1998; Wang eí a/.,1995 o Woo eí a/.,1994) o de combinar la purificación por columna
con la purificación utilizando gradiente de cloruro de cesio (Luo ef a/., 2001, Woo ef
a/.,1994; Fritjers eí a/.,1997) Siguiendo este procedimiento de doble purificación con
cloruro de cesio se obtuvo un vector puro, que posteriormente fue linearizado (con
BamHl o H/.ndlll) y desfosforilado para ser utilizado en el establecimiento de las
condiciones óptimas de ligación para la construcción de la biblioteca de Calcutta 4.
Junto con la preparación del vector, Ia cantidad y calidad de ADN genómico
digerido parcialmente son los factores más críticos en la construcción de bibliotecas
genómicas con insertos de gran tamaño (Fritjers ef a/ ,1997; Zhang et al 1995)
Primeramente, el tratamiento que se le proporcione al material vegetal antes
de la extracción de núcleos es muy importante, de esto depende en gran medida la
obtención de ADN de alto peso molecular y de alta calidad. En el caso específico del
banano se siguieron las recomendaciones reportadas en la literatura para otras
especies. Se utilizaron plantas /.n v/.Íro provenientes de invernadero sometidas a un
tratamiento de oscuridad total durante tres dias antes de la cosecha de las hojas
jóvenes; esto último con la finalidad reducir el contenido de carbohidratos que
interfieren durante la extracción de los núcleos (Men eí a/,, 2001, Vilarinhos eí a/.,
2002). En el caso de plantas , como el banano que contienen altos niveles de
polifenoles en sus hojas se ha recomendado adicionar componentes al amortiguador
de extracción, como el PVP40, (Vinazer et al 1999) y/o ácido ascórbico (Kaufmann ef
a/., 2003), que permitan atrapar los compuestos polifenólicos
El método de obtención de ADN de alto peso molecular más frecuentemente
utilizado es el de la extracción de núcleos reportado por Zhang y colaboradores
(1995), debido a su versatilidad para el aislamiento de ADN de alto peso molecular de
diferentes especies, a su sencillez, a su bajo costo y a su muy baja contaminación con
ADN cloroplástico y mitocondrial. Es por estas razones que para el banano se decidió
utilizar este método de extracción de núcleos, modificado con la adición de PVP40 al
amortiguador de extracción para reducir la cantidad de polifenoles libres y obtener un
ADN de alto peso molecular, fácil de digerir con las enzimas BamHl y H/'ndlll. De estas
dos enzimas, la más comúnmente utilizada en la construcción de bibliotecas BAC o
81 BAC es Hi.ndl 11.
84
Se obtuvieron fragmentos en la zona del gel que contenía los fragmentos de
ADN de 100 a 250 kb, de acuerdo a lo que se ha visto en el desarrollo de otras
bibliotecas, esto es, que solo una zona del gel proporciona fragmentos de ADN con
tamaño Óptimo de para ser clonados. Esta zona es detectada únicamente después de
realizar las ligaciones de los fragmentos aislados de cada zona con el vector, y de
transformar E. co// La ligación que proporcione el tamaño de insenos más elevada
será la zona de fragmentos adecuada (Vinazer eí a/., 1998; Song eí a/., 2000; Fntjers
eí a/.,1997; Lijavezky et al 1999; Mccubbin eí a/., 2000; Tao eí a/., 2002: Ming ef a/,
2001).
Se observó también que a partir de la primera selección los fragmentos
obtenidos y clonados al vector fueron muy pequeños; en el caso del experimento uno,
la mayoría de éstos se agruparon en el rango de 9 a 100 kb. En el resto de los
experimentos donde se realizó segunda selección de fragmentos, la mayoría se
agrupó en el rango mayores que 100 kb Este dato confirma lo reportado en otras
bibliotecas donde se recomienda realizar sjempre una segunda selección de los
fragmentos de ADN para eliminar todos los fragmentos pequeños que queden
atrapados con los fragmentos grandes durante la primera selección (Vinazer eí a/.,
1998; Zhang eí a/.,1996; Woo ef a/.,1994).
Las ligaciones en donde se aplicó una razón molar inseno:vector 1:2 y se
utilizó 1.5 L.l para la transformación resultaron ser mejores en cuanto al tamaño
promedio de inserto, esto es 125 kb con BamHl y 122.27 kb con H/.ndlll, respecto a
otras bibliotecas de otras especies donde se ha utilizado el vector pCLD04541, como
ejemplos tenemos, las bibliotecas de Goss}ip/.um h/`ffiuníum,120 kb (biblioteca-H/.ndlll,
Dong eí a/., 1999), L. /.apon/'cus, 94 kb (biblioteca-H/'ndlll, Men eí a/., 2001) o
napus,105 kb (biblioteca-H/'nc/lll, Wu eí a/„ 2000).
8.
Se ha visto que el rastreo o el escrutinio con una misma sonda, en dos
bibliotecas de la misma especie pero construidas con diferentes enzimas de
restricción, rara vez identifica el mismo número de clonas. Como ejemplo se pueden
mencionar los estudio realizados en las bibliotecas de lechuga (Fritjers ef a/ , 1997) y
betabel (Gindullis ef a/., 2001). Estas variaciones se pueden deber a diferentes
factores que incluyen: la heterogeneidad en las secuencias, las diferencias en los
contenidos de GC de los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción
(BamHl, H/`ndlll o EcoRl), su distribución no al azar y el muestreo de los fragmentos de
ADN durante la clonación Es por esta razón que se decidió utilizar dos enzimas de
restricción diferentes para cortar el ADN genómico de Calcutta 4.
Las siguientes bibliotecas son algunos ejemplos en donde se han utilizado
más de una enzima de restricción para la construcción de bibliotecas
complementarias: melón (Luo eí a/., 2001), arroz (Tao eí a/., 2002), maíz (Yim eí a/.,
2002), soya (Meksem eí a/ , 2000) y Arab/.c/ops/'s (Mozo ef a/.,1999).
Debido a los diferentes objetivos en la investigación de genomas compleios,
se hace necesario tener bibliotecas, con insertos grandes, preparadas para la
trasformación directa a plantas, ya que esto permitirá perfeccionar la clonación basada
en el mapeo, el análisis funcional de las secuencias genómicas, la ingeniería del gen,
85
agrupados de genes, QTLs (Quantitative Trait Loci) y en el mejoramiento molecular de
plantas (Tao ef a/., 2002).
Con este trabajo se estableció por primera vez el protocolo para la
construcción de dos bibliotecas del banano silvestre Calcutta 4, una biblioteca-BamHl
y otra biblioteca-Híndlll utilizando el vector pCLD04541, con tamaños promedios de
inserto adecuados, comparado a otras bibliotecas construidas con el mismo vector
Para construir las bibliotecas físicamente, a partir de la transformación de E. co//' con la
reacción de ligación, se tendrían que obtener 22 000 clonas con un tamaño promedio
de inserto de 125 kb y 22 609 clonas con un tamaño promedio de inserto de 122 27
kb, para tener una cobertura del genoma haploide de 10x Estas serán las primeras
bibliotecas construidas del banano silvestre Calcutta 4 en un vector binario, que
estarán listas para la transformación de plantas mediado por A. íumeíac/.ens.
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88
CONCLUSIONES
o
Se purificó el vector pCLD04541 utmzando una doble purificación con
gradiente de cloruro de cesio, resultando de la pureza necesaria para la
ligación con los fragmentos de ADN de Calcutta 4.
o
Se obtuvo ADN de alto peso molecular a partir de núcleos de hojas de
plantas de Calcma 4 procedentes de invernadero y tratadas en oscuridad
por 72 h. Este ADN fue de buena calidad y adecuado para ser digerido
parcialmente por enzimas de restricción como la BamHl o la H/.ndHI.
o
Se
estableció el protocolo para la obtención de fragmentos de ADN
genómico, en promedio mayores que 100 kb, siendo las ligaciones con
una relación molar inserto:vector de 1 :2, adecuadas para la construcción
de bibliotecas binarias en el banano Calcu«a 4.
89
PERSPECTIVAS
Los resultados presentados en este trabaio son la base y el primer paso
dentro del proceso que involucra la construcción de la biblioteca BIBAC de Calcufta 4
Para construir y caracterizar cada biblioteca faltan realizar los siguientes puntos:
•
•
Realizar todas las transformaciones necesarias para tener el numero de
clonas que abarquen 10x el genoma haploide de Calcutta 4, tanto para la
ligación de los fragmentos procedentes de BamHl como con los de H/.ndlll.
Realizar una copia maestra de cada biblioteca y varias copias para trabajar en
la preparación de membranas de Nylon de alta densidad de cada una de las
bibliotecas construidas.
Se hará el escrutinio de las membranas de cada biblioteca con sondas de
cloroplasto y mitocondria, con la finalidad de determinar la calidad de la misma
en cuanto a contaminación con ADN mitocondrial o cloroplástico; también se
evaluará la presencia de algún gen de bajo número de copia para determinar
la representatividad de la biblioteca.
•
A mediano plazo, se podrían utilizar genes de resistencia análogos para
rastrear su presencia y localizar las clonas dentro de la biblioteca que posean
estos genes, y confirmar la función de protección contra alguna(s) de esa(s)
enfermedad(es).
Otras aplicaciones:
•
Estudios básicos para la evaluación de la estabilidad del genoma receptor del
megalocus, la expresión de los transgenes en las plantas transgénicas, el
efeéto sobre ei fenotipio, etc. Evaiuando ia transformación de banano y
también de otras especies vegetales.
Transformación con fragmentos que contengan familias génicas, grupos de
genes involucrados en una misma vía metabólica, etc.
90
ANEXO
AMORTIGUADOR DE HOMOGENIZACIÓ" (HB) 10X (1 litro
Reactivo
Cantidad
Trisma base
12-19
0.1M
Cloruro de potasio
59.6 9
0.8M
EDTA
37.2 9
0.1M
Espermidjna-HCI
2.55 9
10mM
Espermina-HCI
3.48 9
10mM
Agua bidestilada
para 1 litro
Concentración final
Ajustar a un pH de 9.4-9.5 con NaoH. Almacenar a 4 °C.
AMORTIGUADOR DE HOMOGENIZACIÓN (HB) 1X íl litro
Reactivo
Cantidad
HB 10 X
100 ml
lx
Sacarosa
171.15 9
0.5M
Agua bidestilada
para 1 litro
Almacenara
Concentración final
4°C.
Antes de usarlo añadir
P-mercaptoetanol
1.5 ml
0.15 %
20 % DE TRITON X-100 EN AMORTIGUADOR HB I X Í100 ml
HB 10 X
10ml
Sacarosa
171.15 9
Triton X-100
20ml
Agua bidestilada
para 100 ml
91
Almacenar a 4 °C
AMORTIGUADOR DE LAVADO (HB I X MAS 0 5 % de TRITON X-100),1 litro.
Concentración final
Reactivo
Cantidad
HB 10 X
100 ml
lx
Sacarosa
171.15 9
0.5M
Triton X-100
(Stock de 20 %
0.5%
en HB I X)
Agua bidestilada
Almacenara
4°c.
Antes de usarlo añadir
P-mercaptoetanol
0.15 %
15ml
AMORTIGUADOR DE LISIS (1 L)
EDTA
500 ml del stock 1 M
Na lauril sarcosina
500 ml del stock 2 %
0.5 M (pH 9.0-9.3)
1%
Antes de usarla se añade
0.2 mg/ml
Prote'r" K
Medk) SOB (1 L\
Bacto triptona
2%
209
Bacto extracto de levadura
59
0_5%
NacI
10 ml del stock 1 M
10mM
KCI
2.5 ml del stock 1 M
2.5 mM
Agua bkffilada
para 980 ml
Aiustar el pH a 7 y esterilrir.
MEDIO SOC (1 L)
Al medio SOB estéril se le añade los siguientes componentes:
92
Mgs04/Mgc12a
Glucosab
10 ml del stock 2M
lo ml del stock 2M
20 mM
20 mM
a. esterilizar por filtración 2 M de Mg++ (1 M Mgc12-H20 + 1 M Mgs04-7H20)
b: esterilizar por filtraci.Ón un stock de 2 M de glucosa.
4MORTIGUADORDECARGA10XÍ500mL}
Reactivo
Cantidad
G'icerol
350 ml
TBE 5 X
25m1
EDTA 0 5 M (pH 8)
20m'
20 % SDS
Concentración final
35%
0.25 X
20mM
5ml
O . 2 0/o
10 mg/ml de
azul de bromofenol
Agua bidestilada
TE I X (1L|
Reactivo
Cantidad
Tris-HCI
10 ml de un stock 1 M
Concentración final
EDTA
2 ml de un stock 0.5 M
Agua bidestilada
cbp
1 L
Estermzarlo.
93
10mM
1.0 mM
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