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Secuenciación de Próxima Generación con el equipo MiSeq de Illumina Castillo Di Giacinto, C.P; Fernández Salvatierra, D.J; González Luna, C.D. Instituto Nacional de Higiene “Rafael Rangel”. Gerencia de Producción y Servicios Básicos, División de Biotecnología y Desarrollo – Caracas. Correo electrónico: [email protected] RESUMEN La secuenciación masiva o de próxima generación (NGS) se refiere a la tecnología que permite secuenciar millones de fragmentos de ADN de forma paralela. Los instrumentos NGS son capaces de realizar secuenciación y detección de manera simultánea, lo cual ha revolucionado la investigación genómica, produciendo enormes cantidades de datos en poco tiempo y reduciendo costos con respecto a la secuenciación Sanger. Actualmente, existen numerosas plataformas diseñadas para realizar NGS, siendo una de ellas Illumina con el equipo MiSeq, el cual es un secuenciador de próxima generación que utiliza una química de secuenciación por síntesis (SBS), capaz de detectar cada nucleótido a medida que es incorporado a la cadena de ADN. Con este secuenciador, se puede generar hasta 15Gb de información en 56 horas, con una lectura de fragmentos de hasta 2x300bp, dando como resultado datos de alta calidad. Illumina cuenta con BaseSpace SequenceHub, una plataforma en la nube con una capacidad de almacenamiento a partir de 1TB, que permite monitorear las corridas en tiempo real, guardar y compartir los resultados obtenidos con otros investigadores. Asimismo, en la nube se pueden encontrar algunas herramientas bioinformáticas para iniciar el análisis de los datos. El Instituto Nacional de Higiene “Rafael Rangel” cuenta con un equipo MiSeq para realizar investigaciones mediante secuenciación de genoma completo de microorganismos, detección de mutaciones, metagenómica, epidemiología molecular, entre otras, las cuales tienen impacto en materia de salud a nivel nacional y colocan al Instituto a la vanguardia tecnológica. SECUENCIACIÓN DE PRÓXIMA GENERACIÓN (NGS) NGS o secuenciación masiva permite secuenciar millones de fragmentos de ADN de forma paralela y generar grandes cantidades de datos, en poco tiempo y reduciendo costos. Con esta tecnología se pueden detectar variaciones genómicas en un único experimento. Existen diversas plataformas que realizan secuenciación masiva como el 454 (Roche), PacBio, IonTorrent, Illumina, entre otras. PLATAFORMA MISEQ, ILLUMINA. Flujo de trabajo Preparación de la librería Amplificación de clusters Secuenciación en paralelo • Preparación de la librería genómica a través de tagmentación, donde la enzima transposasa corta e incorpora adaptadores al ADN templado. PARÁMETROS DE RENDIMIENTO DEL MISEQ Longitud del read 2x150bp 2x250bp 2x300bp • Amplificación de clusters con el fin de generar cientos de hebras de ADN idénticas y así aumentar la señal de la fluorescencia en cada cluster, para que esta sea detectada por el equipo. Tiempo de secuenciación ~24h ~39h ~56h Datos producidos 4,5-5,1Gb 7,5-8,5Gb 13,2-15Gb Calidad de datos (Q30) >80% bases >75% bases >70% bases BASE SPACE SEQUENCE HUB Plataforma en la nube de Illumina: • Capacidad de almacenamiento de 1Tb de forma gratuita. • Monitoreo en tiempo real de las corridas de secuenciación. • Disponibilidad de diferentes herramientas bioinformáticas. • Permite compartir los datos con otros investigadores. • Secuenciación por síntesis (SBS) donde la fluorescencia de cada nucleótido es detectada a medida que se incorpora a la cadena de ADN de forma complementaria. Incorporar Detectar Desbloquear Cortar el fluoróforo Alineamiento y Análisis de datos Emisión Excitación APLICACIONES • Alineamiento de las secuencias con un genoma de referencia y análisis de datos generados con herramientas bioinformáticas. • • • Secuenciación de novo Resecuenciación Metagenómica • • Epidemiología molecular Detección de mutaciones y SNPs.
