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Diseño de un fragmento corto de DNA para la construcción de vectores de expresión de
proteínas heterólogas para Bacillus subtilis.
Sánchez-Estrada Ricardo1*, Luna-Suárez Silvia 2
1,2
Centro de Investigación en Biotecnología Aplicada. Carretera Estatal Santa Inés Tecuexcomac-Tepetitla, km. 1.5, Tepetitla de
Lardizábal, Tlaxcala. Correo: [email protected]
Palabras clave: Bacillus, bpr, expresión, proteína, vector
Introducción
Bacillus subtilis, la bacteria Gram-positiva mejor
caracterizada, es bien conocida debido a su poderosa
capacidad de secreción de proteínas (Pohl y Harwood,
2010; van Dijl y Hecker, 2013). En comparación con otros
sistemas de expresión procariotas, tales como E. coli, B.
subtilis tiene muchas ventajas, incluyendo su no
patogenicidad (Westers col. 2004), la ausencia de uso
preferencial de codones (Shields y Sharp, 1987), una alta
susceptibilidad para la ingeniería genética y la
fermentación a gran escala (Harwood y Cranenburgh,
2008). Por lo tanto, B. subtilis se ha utilizado ampliamente
para producción de enzimas industriales (van Dijl y
Hecker, 2013) y se considera que es la fabrica celular de
siguiente generación (van Dijl y Hecker, 2013).
En el presente trabajo, para lograr una producción
extracelular de proteínas de alto nivel en B. subtilis, se
diseñó un fragmento corto de DNA (115pb) que contiene
la secuencia del péptido señal extracelular bpr que
pertenece
a
la
bacillopeptidasa
F
(SP:MRKKTKNRLISSVLSTVVISSLLFPGAAGA), con el
propósito de que esté péptido señal se fusione en la
región del amino terminal de la proteína que se desee
expresar y de esta manera se optimice su producción. En
los extremos del fragmento de DNA se encuentran las
secuencias reconocidas por las enzimas de restricción
SmaI y HindiIII para facilitar la inserción de la proteína
fusionada con el péptido señal en nuestro vector de
destino pSG1170.
Metodología
Se utilizó la base de datos del NCBI (National Center for
Biotechnology Information) para obtener la secuencia del
péptido señal bpr, así como también se utilizó el programa
Snapgene como herramienta bioinformática para conocer
los sitios de restricción de enzimas y observar el mapa de
restricción del vector de bacillus subtilis pSG1170
obtenido del Bacillus Genetic Stock Center.
Resultados y Discusión
Utilizando las herramientas bioinformáticas mencionadas
en la sección anterior, fue posible el diseño de un
fragmento de 115 pares de bases el cual contiene la
secuencia
del
péptido
señal
extracelular
bpr:
ATGAGGAAAAAAACGAAAAACAGACTCATCAGCTCTG
TTTTAAGTACAGTTGTCATCAGTTCACTGCTGTTTCCG
GGAGCAGCCGGGGC, el sitio de corte para la enzima de
restricción SmaI CCCGGG al inicio y el sitio de corte para
la enzima HindiIII CTCGAG al final, con el propósito de
que la secuencia del péptido señal pueda ser insertada en
el vector de destino para Bacillus subtilis pSG1170 (Figura
1), el cual contiene en su sitio de clonación múltiple la
secuencia para ambas enzimas de restricción, de este
modo al contener tanto fragmento de DNA como el vector
pSG1170 estos sitios, se garantiza que la inserción del
péptido señal en el vector de destino se lleve a cabo.
Fig. 1. Vector de expresión para bacillus subtilis pSG1170.
Conclusiones
El diseño del fragmento de DNA que contiene al péptido
señal extracelular bpr, permitirá insertar esta secuencia en
el vector de expresión para Bacillus subtilis pSG1170 con
el fin de potencializar la producción extracelular de
proteínas heterólogas en éste organismo.
Referencias
Harwood, C.R., Cranenburgh, R., 2008. Bacillus protein
secretion: an unfolding story.Trends Microbiol. 16, 73–79.
Pohl, S., Harwood, C.R., 2010. Heterologous protein secretion
by Bacillus species from the cradle to the grave. Adv. Appl.
Microbiol. 73, 1–25.
Shields, D.C., Sharp, P.M., 1987. Synonymous codon usage in
Bacillus subtilis reflects both translational selection and
mutational biases. Nucleic Acids Res. 15, 8023–8040.
van Dijl, J.M., Hecker, M., 2013. Bacillus subtilis: from soil
bacterium to supersecreting cell factory. Microb. Cell Fact. 12, 3.
Westers, L., Westers, H., Quax, W.J., 2004. Bacillus subtilis as
cell factory for pharmaceutical proteins: a biotechnological
approach to optimize the host organism. Biochim. Biophys. Acta
1694, 299–310.