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Publicación Previa al VIII Congreso Nacional de Acuicultura (Santander, mayo 2001) Localización de los mRNA de los dos tipos de somatolactina en hipófisis de dorada Herrero-Turrión, M.J.; Velasco, A.; Rodríguez, R.; Aijón, J. y Lara, J. Instituto de Neurociencias de Castilla y León (INCyL), Univ. de Salamanca, Facultad de Medicina, Campus Unamuno 37007 Salamanca (España) Resumen Se ha analizado por hibridación in situ (ISH) la expresión de mRNA de los dos tipos de somatolactina (SL1 y SL2) descritas hasta el momento en hipófisis de dorada (Sparus aurata). El método de ISH no radiactivo que optimizamos en este trabajo utiliza como sondas oligonucleótidos marcados en su extremo 5’ con biotina o digoxigenina, lo que permite realizar ISH simples y dobles de muy alta especificidad y sensibilidad. Las distintas oligosondas de SLs empleadas presentan una fuerte señal fundamentalmente en la pars intermedia (PI) de la glándula pituitaria. Este estudio detecta por primera vez células que coexpresan ambas formas. Además, en el estudio de tres grupos de tallas diferentes, producidas por el crecimiento asincrónico de la dorada en cultivo industrial, no hemos apreciado diferencias cualitativas en los niveles de expresión de la familia de genes GH/PRL. Palabras clave: Somatolactina, familia GH/PRL, RNAm, hibridación in situ, Sparus aurata Abstract Localization of mRNA of the two types of somatolactin in the pituitary of gilthead sea bream The expression of mRNA of the two types of somatolactin (SL1 and SL2) which have been found, up to the present, in the pituitary of gilthead sea bream (Sparus aurata) has been analysed by in situ hybridization (ISH). The method of non-radioactive ISH which we optimise in this study uses oligonucleotides labelled in extreme 5’ with biotin or dioxygenin as probes, which allows simple and double ISH of high specificity and sensitivity to be performed. The distinct probes of SL’s used present a strong signal fundamentally in the pars intermedia (PI) of the pituitary gland. This study detects cells which co-express both forms for the first time. Moreover, in the study of three groups of different sizes, produced by asynchronic growth of the bream in industrial cultivation, we did not find qualitative differences in the levels of expression of the GH/PRL gene family. Keywords: Somatolactin, GH/PRL family, mRNA, in situ hybridization, Sparus aurata Introducción Se ha propuesto que las hormonas pertenecientes a la superfamilia GH de proteínas provienen de un gen ancestral común y se desarrollaron por procesos de amplificación y divergencia (Nicoll et al. 1986; Takayama et al. 1991b). Además, estos genes son transcritos por un mismo factor de transcripción, Pit-1 (Ono et al. 1994). La somatolactina (SL) es una hormona de la familia GH/PRL, fue aislada por primera vez en el bacalao atlántico (Gadus morhua) (Rand-Weaver et al. 1991a), y se produce principalmente en la pars intermedia (PI) de la hipófisis de la mayoría de los peces. La SL ha sido caracterizada exclusivamente en peces, por métodos como: aislamiento de la proteína e identificación de su secuencia aminoacídica, clonación de su cDNA o determinación de la propia secuencia genómica (Tabla 1). Tabla 1. Especies de peces en los que se ha caracterizado las SLs. El asterisco (*) indica que aunque todavía no se ha publicado la secuencia aminoacídica está accesible en las bases de datos del Gen Bank; s/n indica que esta secuencia aminoacídica no está incluída en las bases de datos. Nº acceso Especie GenBank Referencia ACTINOPTERIGIO TELEÓSTEOS Percomorpha (Pleuronectiforme) hhSL Hippoglossus hippoglossus L02117 Iraqi et al. 1993 poSL Paralichthys olivaceus M33695 Ono et al. 1990 ssSL Solea senegalensis U06753 Pendón et al. 1994 tmSL Tetraodon miurus AF253066 Rand-Weaver et al. * Percomorpha (Perciforme) saSL1 Sparus aurata P54863 Astola et al. 1996 saSL2 Sparus aurata P79894 Cavari et al. 2000 sgSL Signatus guttatus AB026186 Ayson et al. * soSL Sciaenops ocellatus AF062520 Zhu et al. 1999 dlSL Dicentrarchus labrax AJ277390 Company et al. 2000 Cyclopterus lumpus L02118 Iraqi et al. 1993 okSL Oncorhynchus keta D10640 Takayama et al. 1991a, b omSL Oncorhynchus mykiss s/n Yang et al. 1997 gmSL Gadus morhua D10639 Takayama et al. 1991a, b aaSL Anguilla anguilla U63884 May et al. 1997 caSL Carassius auratus U72940 Cheng et al. 1997 ipSL Ictalurus punctatus AF267991 Tang 1992 Acipenser transmontanus AB017200 Amemiya et al. 1999 AB017766 Amemiya et al. 1999 Percomorpha (Scorpaeniforme) clSL Salmonidae Otros teleósteos CONDRÓSTEO atSL SARCOPTERIGIO DIPNOI paSL Protopterus annectens En todas las especies examinadas, a excepción de los salmónidos, la SL se puede encontrar en dos formas, glicosilada y no glicosilada. Además, la alineación de las secuencias aminoacídicas de las SLs caracterizadas demuestra que está altamente conservada a lo largo de la filogenia y que posee unas características comunes significativas (Fig.1). Figura 1 Alineamiento de las secuencias aminoacídicas de las SLs caracterizadas (ver tabla 1) [ClustalW]. Los caracteres (-) se insertan para adaptar el alineamiento. La secuencia consenso común a todas las SLs se marca en rojo, con los residuos de Cisteina y el sitio de N-glicosilación subrayados. Los cuatro dominios conservados de las SLs y los péptidos señal se marcan en azul. hSL MNMMTVKQGVWA ALLWPYLLAASIPLD CKDEQGSFSACPSIS QEKLLDRVIQHAELI YRVSEESCSMFEEMF VPF PLRLQRNQAGY poSL MNMMTVKQQGVWA ALLWPYLLTASIPLD CKEEQGSLSRCPSIS QEKLLDRVIQHAELI YRVSEESCSMFEEMF VPF PLRLQRNQAGY ssSL MMTAVKQSGVWA VLLWPYLLAVSIQLD CRDEQGNMSRCPFIS QEKLLDRIIQHAELI SRISEESCSLFEELF VPF PLRLQRNTVGY saSL1 MRMIRAIKQGQWA VLLWPYLLTASIPLD CRDEQGVLSHCPSIS QEKLLDRVIQHAELI YRVSEESCSLFEEMF IPF PLQLQRNQAGY saSL2 MRMMRAIKQGQWA ILLWPYLLTTSIPLD CRDEQGGLSRCPSIS QEKLLDRVIQHAELI YRVSEESCSLFEEMF IPF PLQLQRNQAGY sgSL MLMFTAIQRGVWV ALLWPHLLTASMPLD CREENGNLSRCPTIS QEKLLDRVIQHAELI YRVSEESCSLFEEMF VPF PLQLQRNQAGF soSL MYMMTALQRGVWA SLLWPYLITISIPLD CKEEQGSLSRCPSIS QEKLLDRVIQHAELI YRVSEESCSLFEEMF VPF SLQLQRNQAGY dlSL LWPYLLTVSIPLD CREEQSSLSRCPSIS QEKLLDRVIQHAELI YRVSEESCSLFEEMF VPF PLQLQRNQAGY clSL MHLVSVIQRGVWA VLLWPNLLASSVPLD CREEQGILSRCPSIS QEKLLDRVIEHAELI YRVSEESCSLYEDMF IP LQFQRNQVGY tmSL MAALQEVLLA VLLWPVLVTISNPIN CGDEQSSLSNCLSIS EEKLLDRESFSTLSS SIVFLKNHVLCLRRC LSHSQYSSRQARQEN gmSL MHTLAAVVVLQVCWA AVLWPCPPTHSSPVD CREEQAGSSQCPTIS QEKLLDRVIQHTELI YRVSEESCSMFEDMF VPFPVRLQRNQAGN okSL MNMMQVMQSVVWA VLLWPCLVSLGVPLE CKDEQGSIILCASIS KEKLLDRVIQHAELI YRVSEESCTLFEEMF VPFPMRSQRNQAGY omSL MNMMQVMQSVVWA VLLWPCLVSLGVPLE CKDEQGSIILCASIS KEKLLDRVIQHAELI TRVSEESCTLFDDMF VPFPMRSQRNQAGY atSL MQKVKVLQVCAWV LLLWRCWGVLGYPLD CKDEQGSIISCTSIS LEKLLDRVIQHAELI YHVSEESCTLFEEMF VPVSMRTQQNRARN paSL MHNWKGVWLCSLFLT FGQLWNGILLAYPLD CKDEQGSYTRCTSIS LEKLLDRAIQHAELL YRVSEESCTIFEDNF APFSLVSQRSRNFN aaSL MFSIRMNKVLQGF VCLMLTHRIVGYPMD CKEDQDGTRCPSIS LDKLLDRIIQHAELI YRVSEESCTLFEEMY IPS SIRAQLSRGGN caSL MKKTTVLQVCMV FVVCSLQAVIGSPVD CPDQDTAGVSCIIS LEKLLERAVQHAELI HHIAEESKLLFDEML ISFGVVNLHISEGT ipSL MIKTKVLQAWMG IWLCAVNGLLGSDQD CSDRDPTGSRCSIS VEKLLDRAIQHAELI YRISDEARTLFEEMF IPLLIPAHQVHGGN Cons. CC C [PÉPTIDO SEÑAL] [SL A] hhSL ACITKALPIPSSKSE IQQISDTWLLHSVLL LVQSWIDPLVYLQTT LDRYDNASEMLLNKT KWVSDKLISLEQGVV VLIRKMLDEGMLTAT poSL ACITKALPIPSSKSE IQQISDTWLLHSVLM LVQSWIEPLVYLQTT LDRYDNAPDMLLNKT KWVSDKLISLEQGVV VLIRKMLDEGMLTAT ssSL ACITKALPIPSSKSE IQQISDKWLLQSVLT LVQSWIEPLVYLQTT LDRYDNAPDVLLNKT KWVSEKLVSLEQGVV VLIRKMLDEGTLTTT saSL1 PCITKALPIPSSKSE IQQISDKWLLHSVLM LVQSWIEPLVYLQTT LNRYDGVPDMLLNKT KWVSEKLMSLEQGVV VLIKKMLDEEMMTTT saSL2 PCITKALPIPSSKSE IQQISDKWLLHSVLM LVQSWIEPLVYLQTT LNRYDGVPDMLLNKT KWVSDKLMSLEQGVA VLIKKMLDEGLMTTT sgSL TCITKALAIPSSKSE IQQISDKWLLHSVLM LVQSWIEPLVYLQNT LDRYDGAPDMLLNKT KWVSEKLISLEQGVV VLIKKMLDEGMATTA soSL ACITKAFPIPSSKSE IQQISDKWLLHSVLM LVQSWIGPLAYLQNT MDHYDGAPDMLLNKT KWVSEKLISLEQGVV VLIKKMLDEGILTTT dlSL ACITKALPIPSSKSE IQQISDKWLLHSVLM LVQSWIEPLVYLQTT MDRYDGAPEMLLNKT KWVSEKLIGLEQGVV VLIKKMLDEGMMTTT clSL ACITKTLPVPSSKNE IQQISDKWLLHSVLM LVQSWIEPLVYLQTS LDRYNAAPEMLLNKT KWVSEKLISLEQGVV VLIKKMLDEGMLTIN tmSL ACMTKVLPIPSSKSE IQQITDKWLLHAVLM LVQSWIKPLVYLQTT MVRYDYASDVLLNKT KWVLEKLISLEQGVV ILIKKILNEAVMTTT gmSL TCITKDFPIPTSKNE LQQISDTWLLHSVLM LVQSWIEPLVYLQTT LDRYDDVPDVLLNKT KWMSEKLISLEQGVV VLIRKMLDGAILNSS okSL TCATKAFPIPGSKSE IQQISDKWLLHSVLI LVQSWIEPLVYLQTT LDRYDDAPDTLLKKT KWVSEKLLSLEQGVV VLIRKMLDDDMLTTS omSL TCATKAFPIPGSKSE IQQISDKWLLHSVLI LVQSWIEPLVYLQTT LDRYDDAPDTLLKKT KWVSEKLLSLEQGVV VLIRKMLDDDMLTNS atSL TCITKAFPIPGSKSE IQKISDKWLLHSVLM LVQSWIEPLVYLQKT LDRYDDAPDTILNKT KWVTNKLSSLEQGIV ELIRKMLDEGLLAVD paSL SCYTKGLRLPSSKSE AQQVSDKWLLHSVLV LVQSWIEPFVYLQRT LDTYNSLPGSLVNKT KWVSDKLPSLEQGIV VLIRKMLHEGLITTD aaSL ACSTRSVPIQGR IQQISDKWLLHSTLV VIQSWTGPLQSLQIT MDLYDNAPDGLLNKT KWMSTKLMNLEQGVT VLIRKMLNEDILVSD caSL MCSPKTVSVPMSKTE IQQISDKWLLHSVLI LVQFWINPLVDVQAS LMNYQNAPSALVDRS KLMSTKITSLEQGIL VLIRQILGEGGLVVE ipSL SCTSNLVRVPISKLE IQQISDKWLLHSISI LVQVWIEPLADLQDS LDMYDNVPSSLISKT RWMSTKLMNLKQGVL VLMSKMLDEGSVELE Cons. C QDWLL QWPQ YNKT LQ L L [SL B] [SL C ] hhSL YNEQGLFQYDVLPDM LESVMRDYTLLSCFK KDAHKMEIFLKLLKC RQTDKYNCP 230 poSL YNEQGLFQYDAQPDM LESVMRDYTLLSCFK KDAHKMEIFLKLLKC RQTDKYNCA 231 ssSL YNEQDLLQYDVLPDM LESVMRDYTLLSCFK KDAHKMEIFLKLLKC RQTDKFNCA 230 saSL1 YSEQGLFQDDGQPEM LEYVMRDYTLLSCFK KDAHKMEILLKLLKC RQNDMHSCR 231 saSL2 YSEQGLFQDDGQPEM LEYVMRDYTLLSCFK KDAHKMEILLKLLKC RQNDIHSCA 231 sgSL YNEQSLFQDDAQPDM LESVMRDYTLLSCFK KDAHKMEILLKLLKC RQNDIYSCA 231 soSL YSEQGLFQYEVQPDM LESVMKDYNLLSCFK KDAHKMEILLKLLKC RQTDIYNCP 231 dlSL YSEQGLFQYDVPPEM LESVMRDYTILSCFK KDAHKMEILLKLLKC RQTDTYNCA 216 clSL HSEQGLLQNGVQPQM LESVMRDYTLLSCFK KDAHKMEAFLKLLKC RQTDRYNCS 229 tmSL VSELDLFPTDLQPDI LESVMNDYSLLSCFK KDARKIEILLKLLKC RRNDMYNCA 229 gmSL YNEYSAVQLDVQPEV LESILRDYNVLCCFK KDAHKIETILKLLKC RQIDKYNCALY 235 okSL YYEQGVAPYALQPEV LESVLRDYTLLSCFK KDAHKMETFLKLLKC RQTDKYSCFLH 233 omSL YYEQGVAPYALQPEV LESVLRDYTLLSCFK KDAHKMETFLKLLKC RQTDKYSCFLH 233 atSL HQQTLTRFDVQPEV VESILRDYAVLTCFK KDAHKMEVFLKLLKC RHTDKMSCYIS 232 paSL FQQSVIEIEPSPEI TDSSARDYMILNCFR KDAHKMETFLKLLKC RQIKKLNCY 232 aaSL PSQNLTHFATQPNM VESVLTDYTLLTCFR KDAHRVETFLKLLKC RQSDRLSCFLY 228 caSL GPEDTSDHFVSSDT FETVRRDYSVIYCFR KDAHKIQTLLKLLKC RQIDKENCSLF 230 ipSL NNESMLRHIVAPAM AEHVLRDYAVLSCFK KDAHKMETFLKLLRC RQTDNPTCSLF 230 Cons. DYCF KDALKLLC RC [SL D] La SL ha sido implicada en una gran variedad de procesos fisiológicos, como la maduración sexual o, en general, algunos aspectos de la reproducción (Planas et al. 1992; Rand-Weaver et al. 1992, 1995; Rand-Weaver & Swanson 1993; Olivereau & Rand-Weaver 1994a, b; Mousa & Mousa 2000). Otros procesos en los que puede jugar un papel importante son: la respuesta al estres en la que se activan las células somatolactogénicas (Rand-Weaver et al. 1993; Johnson et al. 1997), la regulación ácido-base y de los niveles de calcio (Olivereau et al. 1981; Wendelaar Bonga et al. 1984, 1986; Kakizawa et al. 1993, 1995a, b; Kakizawa et al. 1996), el metabolismo de los ácidos grasos y del fosfato (Kaneko et al. 1993a; Lu et al. 1995; Company et al. 2000) y la adaptación a los fondos oscuros en las especies no salmonidas (Van Eys 1980; Olivereau et al. 1980; Ball & Batten, 1981; Rand-Weaver et al. 1993; Zhu & Thomas 1995, 1996, 1997, 1998; Kakizawa et al. 1995a; Zhu et al. 1999). En general, podemos considerar que la función principal que lleva a cabo la familia de hormonas GH/PRL/SL en los teleósteos es la regulación de diferentes iónes. Recientemente, Cavari et al. (2000) han identificado, por primera vez en un pez, una segunda forma de SL en la dorada (Sparus aurata, Linnaeus 1758). Esta última, se denomina SL2 a diferencia de la SL, única forma caracterizada en las demás especies de peces, o SL1 en el caso de S. aurata. La SL2 se diferencia solamente en once aminoácidos de la forma SL1, clonada por Astola et al. (1995). De estos once aminoácidos, siete son substituidos por otros aminoácidos semejantes en cuanto a su polaridad. Por lo tanto, dadas las semejanzas tan marcadas entre SL1 y SL2, la técnica de ISH nos ofrece un instrumento ideal para estudiar la distribución de estas proteínas en la hipófisis de la dorada. Material y métodos Preparación de la muestra Hemos utilizado ejemplares juveniles (de 87, 188 y 346 días) de S. aurata de tres tamaños diferentes para cada edad, provenientes de una misma freza (febrero 2000) de la piscifactoria MARESA (Ayamonte, Huelva). La selección de los tres grupos, teniendo en cuenta el crecimiento asincrónico de esta especie en cultivo industrial, se efectúo por sucesivos tamizados en determinados periodos de tiempo según las necesidades del cultivo industrial, estableciendo unas tallas y pesos para cada uno de ellos con valor estadístico significativo para su posterior análisis comparativo. Todas las soluciones empleadas en este trabajo fueron tratadas con dietilpirocarbonato que previene la degradación del RNA. Al menos tres peces de cada grupo, previamente anestesiados, fueron decapitados y sus encéfalos fijados por perfusión previa o por inmersión de las muestras, según el tamaño del animal, en una solución de paraformaldehido en tampón fosfato salino pH 7,3 (PBS). Después de la fijación, las hipófisis fueron disecadas, se lavaron varias veces en tampón fosfato pH 7,3 (PB) y se crioprotegieron en sacarosa/PBS, antes de encastrarlas en OCT (Tissue-TekR). Secciones de criostato de 8-10 m, transversales y sagitales, se montaron en portaobjetos pretratados con poli-L-lisina (Menzel-Glaxe) y se almacenaron a -20 ºC hasta su uso. Todas los procedimientos utilizados en la manipulación de los animales cumplen la normativa de la Directiva de la Comisión Europea (86/609/EEC) y la Legislación Española (BOE 67/8509-12, 1998). Diseño de oligonucleótidos Como sondas utilizamos oligonucleótidos de 24, 30 y 31 nucleótidos marcados en su extremo 5’ con digoxigenina (1) o biotina (2). El análisis de los alineamientos de secuencias nucleotídicas (datos no mostrados) y aminoacídicas (Fig. 2) de la familia de proteínas GH/PRL/SL de S. aurata, determinó un diseño de las oligosondas en las regiones proteícas alrededor de los dominios D de estas proteínas y en sus zonas no traducidas en los extremos 3’ de los cDNAs. Las oligosondas "antisentido" utilizadas en este estudio son: SaSL1a(1) y SaSL1c(2) 5’tcgacagctgtgcatgtcattttg3’ y SaSL1d(2) 5’caggtttaattaggcgagttaagccactgc3’ complementarias al cDNA de SL1 (673-696 nt y 1281-1311 nt respectivamente, Cavari et al. 1995); SaSL2a(2) 5’tgcacagctgtgtatgtcattctg3’ y SaSL2c(1) y SaSL2d(2) 5’ggtggagagagggcaaagcattacacctac3’ complementarias al cDNA de SL2 (688-711 nt y 875-904 nt, Cavari et al. 2000). Mientrás, las oligosondas "anti-sentido" diseñadas para la hormona de crecimiento (GH) y la prolactina (PRL) son SaGHa(1) y SaGHc(2), 5’tctcagcgactcgtcggtgcccagactttg3’ complementarias al cDNA de GH (533-562 nt, Cavari et al. 1994; Funkenstein et al. 1991) y SaPRLa(2) 5’ggaaatgttgtcctcgccgatgtcattggac3’ complementaria al cDNA de la PRL (534-564 nt, Santos et al. 1999). Como controles utilizamos oligosondas "sentido" de la misma secuencia que los cDNAs de S. aurata de SL1 (SaSL1b (1)), SL2 (SaSL2b (2)), GH (SaGHb (1)) y PRL (SaPRLb(2)). Figura 2. Alineamiento de las secuencias aminoacídicas de la familia de proteínas GH/PRL/SL de Sparus aurata [ClustalW]. Las caracteres (-) se insertan para adaptar el alineamiento. La secuencia consenso se marca en rojo y los residuos de Cisteina y el sitio de N-glicosilación se muestran subrayados. Los cuatro dominios conservados se marcan en azul y los péptido señal aparecen subrayados en cada secuencia proteíca. SL1 MRMIRAIKQGQWAVL LWPYLLTASIPLDCR DEQGVLSHCPSISQE KLLDRVIQHAELIYR VSEESCSLFEEMFIP FPLQLQRNQAGYPC 89 SL2 MRMMRAIKQGQWAIL LWPYLLTTSIPLDCR DEQGGLSRCPSISQE KLLDRVIQHAELIYR VSEESCSLFEEMFIP FPLQLQRNQAGYPC 89 GH MDRVVLMLS VMSLGVSSQPITDGQ RLFSIAVSRVQHLHL LAQRLFSDFESSLQT EDQRQLNKIFLQDFC 69 PRL MAHRETNGSKLFI TVLCMVAACSAVPIN DLLDRASQRSDMLHS LSTTLTKDLSNHVPP VGWTMMPRPPLC 70 Consenso C C L C C [DOMINIO A] SL1 ITKALPIPSSKSEIQ QISDKWLLHSVLMLV QSWIEPLVYLQTTLN RYDGVPDMLLNKTK WVSEKLMSLEQGVVV LIKKMLDEEMMTTTY 178 SL2 ITKALPIPSSKSEIQ QISDKWLLHSVLMLV QSWIEPLVYLQTTLN RYDGVPDMLLNKTK WVSDKLMSLEQGVAV LIKKMLDEGLMTTTY 178 GH NSDYIISPIDKHETQ RSSVLKLLSISYRLV ESWEFPSRSLS GGSAPRNQ ISPKLSELKTGIHL LIRANEDGAEIFPDS 147 PRL HTSSLQTPNDKEQAL QLSESDLMSLARSLL QAWQDPLVDLSNSAN SLLHPSQSSISNKIR ELQEHSKSLGDGLDI LSGKMGPAAQAISSL 160 ConsensoPK SLL WPL NKT L [DOMINIO B] [DOMINIO C ] SL1 SEQGLFQDDGQPEML EYVMRDYTLLSC FKKDAHKMEILLKLL KCRQNDMHSCR 231 SL2 SEQGLFQDDGQPEML EYVMRDYTLLSC FKKDAHKMEILLKLL KCRQNDIHSCA 231 GH SALQLAPYGNYYQSL GTDESLRRTYELLAC FKKDMHKVETYLTVA KCRLSPEANCTL 204 PRL PYRGSNDIGEDNISK LTNFHFLLSC FRRDSHKIDSFLKVL RCRAAKVQPEMC 212 Consenso LLC FDHKL CRC [DOMINIO D] Hibridación in situ (ISH). Para la realización de las ISHs hemos empleado el método descrito por Herrero-Turrión et al. (2001) que brevemente a continuación se describe. Se ha comprobado que tratando el tejido previamente a la hibridación con diferentes agentes químicos mejoran los resultados, puesto que evitan las señales de fondo. Con este objetivo, realizamos una postfijación en 4 % paraformaldehido en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente (22 ºC), varios lavados en PBS y una acetilación en una solución de 1,5 % Trietanolamina (TEA), 150 mM NaCl y 0,25 % anhídrido acético durante 10 minutos a temperatura ambiente. Tres lavados en PBS, deshidratación en una batería de etanoles y secado de las secciones preparan la prehibridación. Ésta, se realizó en una cámara húmeda durante dos horas a 45 ºC en una mezcla de hibridación (MH) compuesta de: 4X citrato sódico salino (SSC: 600 mM NaCl, 50 mM citrato sódico pH 7,0), 10% sulfato dextrano, 1X Denhardt’s (50 X: 5 g ficoll type 400, 5 g polivinilpirroldina y 5 g seroalbumina bovina (BSA) fracción V), 50 % formamida deionizada, 200 g/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado, 20 unit/ml de RNAt de levadura y PB. La estimación de las temperaturas de hibridación (Tm) para cada oligosonda se determinaron experimentalmente y son similares a las calculadas teóricamente (Heath et al. 1996). La hibridación se realizó durante toda la noche a 45 ºC en cámara húmeda con la MH y la correspondiente oligosonda a una concentración de 15-20 ng/ml. Después, las secciones fueron lavadas en condiciones de alta astringencia: un lavado en 0,1 % dodecil sulfato sódico (SDS), 2X SSC durante 30 minutos a temperatura ambiente y dos lavados en 0,1 % SDS, 0,1X SSC durante 30 minutos a 45 ºC y a temperatura ambiente respectivamente. A continuación, las secciones en las que hibridamos las oligosondas marcadas con la digoxigenina se incubaron en una solución con 100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl2, 1 % BSA y 2 % suero normal de oveja durante 1 hora a temperatura ambiente. Esta solución fue reemplazada por una idéntica a la que se adicionaron anticuerpos anti-digoxigenina conjugados con fosfatasa alcalina (PA, Boehringer Mannheim) a una dilución 1:500 durante al menos 90 minutos a temperatura ambiente. Por otra parte, las secciones en las que hibridamos las oligosondas marcadas con biotina se preincubaron en 200 mM PBS con Triton X100 al 0,2 % (PBS-Tx) durante 30 minutos a temperatura ambiente, se incubaron con la molécula estreptavidina conjugada con peroxidasa (P, 1 g/ml, JacksonImmunoResearch) durante 3 horas a temperatura ambiente. Ambos tipos de secciones fueron lavados en PBS (3 X 5 min) e incluidas en los tampones de revelado. Para las que contienen PA, la mezcla de revelado está constituida por una solución de 100 mM Tris-HCl pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2 se le adicionaron 20 l/ml de la solución 18,75 mg/ml NBT (4-nitro blue tetrazolium chloride) y 9,4 mg/ml BCIP (5bromo-4-cloro-3-indol-fosfato) hasta la visualización óptima de los precipitados azul oscuro. Por su parte, las que contienen P se incubaron en una mezcla de revelado compuesta por una solución de 200 mM TrisHCl pH 7,5, 0,02 % de 3,3’-diaminobenzidina (DAB) y 0,003 % H2O2 hasta la visualización nítida de los precipitados de color marrón. Las reacciones colorimétricas se bloquearon con varios lavados en agua destilada y las secciones fueron montadas en una solución de glicerol. En algunos casos, para mejorar la visualización de las señales, las secciones se contratiñeron en hematoxilina férrica. Se han realizado varios controles de las ISH: (1) secciones incubadas en la MH sin la oligosonda correspondiente, (2) secciones incubadas con la MH conteniendo el oligonucleótido "con sentido" correspondiente, (3) secciones hibridadas con las respectivos oligosondas "anti-sentido", pero no incubadas con el anti-digoxigenina-PA o estreptavidina-P que correspondería en cada caso. Todos estos controles fueron negativos. Doble Hibridación in situ. Se llevaron a cabo dos tipos de marcajes utilizando esta técnica: (a) una hibridación con oligosonda marcada con digoxigenina, una posterior con la correspondiente marcada con biotina, o viceversa, e incubaciones consecutivas con anticuerpos anti-digoxigenina-PA y estreptavidina-P; (b) empleando dos oligosondas marcadas con biotina en indistinto orden, pero primero una hibridación con una de las oligosondas e incubación con estreptavidina-P y, posteriormente la segunda hibridación, con la otra sonda e incubación con estreptavidina-PA. En ambos casos, las secciones fueron procesadas con DAB, analizadas, lavadas con PBS, procesadas con NBT/BCIP y otra vez analizadas. Resultados y discusión Hasta el momento la localización de células productoras de SL en diferentes especies de peces se ha determinado fundamentalmente por estudios inmunohistoquímicos (IHC) (Rand-Weaver et al. 1991b; Kaneko et al. 1993b; Olivereau & Rand-Weaver 1994a, b; Zhu & Thomas 1995; Dores et al. 1996; García-Hernández et al. 1996; Vissio et al. 1996, 1997; Rendón et al. 1997; Villaplana et al. 1997, 2000; Johnson et al. 1997; Saga et al. 1999; Mousa & Mousa 1999; Salam et al. 2000). De este modo, las células inmunoreactivas a SL (ir-SL) se han localizado principalmente en la PI de la hipófisis, bordeando el tejido neurohipofisario. Estas células son las que histológicamente se definen como positivas al ácido periódico reactivo de Schiff, a excepción de los salmónidos en los que se definen como cromofóbicas. La presencia de células ir-SL ha sido descrita en numerosas especies (Tabla 1), suponiéndose su universalidad en todos los teleósteos, aunque hay especies como Gymothorax meleagris en la que no se ha detectado mediante estudios IHC esta proteína (Dores et al. 1996). Por consiguiente, dadas las limitaciones del método IHC y la reciente clonación en S. aurata de un segundo tipo de SL, con muy pocas diferencias respecto al primero (Cavari et al. 2000), el empleo de la ISH se hace necesario para analizar su patrón de distribución. Para ello, en primer lugar optimizamos las condiciones de la ISH para esta especie y la detección específica de sus mRNAs. La utilización de oligosondas no radioactivas, marcadas en su extremo 5’ con biotina o digoxigenina, se ha evidenciado como un método con alta especificidad y sensibilidad. La especificidad de las oligosondas se ha demostrado al utilizar dos o tres oligonucleótidos que son complementarios al mismo transcrito de mRNA. Así, para el caso de las SLs, diseñamos oligosondas complementarias a los cDNAs, tanto en su zona traducida como en la no traducida. Las primeras, presentan un grado de similitud muy alto, del 84 % (SaSL1a ó SaSL1c, y SaSL2a), y a pesar de ello, y en condiciones de alta astringencia, hemos demostrado que son específicas (Fig. 3). En este aspecto, otros estudios han empleado como sondas oligonucleótidos con una similud más alta, del 92 %, y demuestran que son altamente especificos en condiciones de alta astringencia (Sommer et al. 1990). Figura 3. Secciones medio-sagitales de la hipófisis de animales juveniles de S. aurata de 346 días. a: Señales de ISH de oligosonda para SL1 (SaSL1a). b: Señales de ISH de oligosonda para SL1 (SaSL1d). Barra de escala, 200 mm. c: Señales de ISH de oligosonda para SL2 (SaSL2c). d: Señales de ISH de oligosonda para SL2 (SaSL2d). Barra de escalas, 100 mm. El asterisco (*) marca las células de SL presentes en la PPD. Hasta ahora, el estudio de células que expresan la SL por ISH se describe exclusivamente en dos trabajos. En el primero de ellos (Kaneko et al. 1993c), esta técnica se utilizó para demostrar la expresión génica de la SL de la trucha arco iris en las células que rodean al tejido neurohipofisario que penetra en la PI. Los mismos autores demostraron, en estudios ultrastructurales, que las moléculas de SL son biosintetizadas y almacenadas en los gránulos secretores de estas células. Por otra parte, Kakizawa et al. (1993), realizaron un estudio fisiológico en esta misma expecie, cuantificando los niveles de mRNA de la SL en ambientes hipocalcemicos e hipercalcemicos, determinando la posible función hipercalcémica de esta hormona. Las dobles ISH de secciones hipofisarias de S. aurata han demostrado que ambos tipos de SLs se coexpresan en las mismas células (somatolactogénicas), situándose principalmente en la PI de la hipófisis, formando un cordón de células alrededor de la neurohipófisis (NH), como en otras especies de teleósteos (Rand-Weaver et al. 1991b; Kaneko et al. 1993c; Parhar & Iwata 1994; Zhu & Thomas 1995, 1996). Además, hay células SLs-ir aisladas o formando agrupaciones en porciones más internas de la propia PI (Fig. 4). También, aunque con expresión más débil, se encuentran células positivas a las SLs en S. aurata en grupos celulares aislados principalmente en la zona ventral de la proximal pars distalis (PPD) (Fig. 3d; Fig. 5a), como en distintas especies del género Oncorhynchus y en Seriola dumerilii (Rand-Weaver et al. 1991b; Olivereau & Rand-Weaver 1994a; García-Hernández et al. 1996), lo que sugiere diferentes actividades según el patrón de distribución dentro de la propia hipófisis. La proximidad de las células somatolactogénicas al tejido neural, mostrando a menudo procesos celulares que contactan con las ramas neurohipofisarias, sugiere que éstas están reguladas por substancias neurohipotalámicas. Figura 4. Sección transversal de la PI hipofisaria de animales juveniles de S. aurata de 188 días. a: Señales de ISH para SL2. b: Doble ISH (SL2 y SL1) de la sección mostrada en a. c: Detalle de a. d: Detalle de c. Barra de escalas, a y c: 100 mm, b y d. 50 mm. En relación a las células positivas SL-S. aurata, se aprecia que los gránulos secretores se sitúan en la periferia del citoplasma y principalmente se centran en uno de los polos (Fig. 5b, c), al igual que en otras especies (Olivereau & Rand-Weaver 1994a,b; García-Hernández et al. 1996). Figura 5. Sección transversal (a) y sagital (b y c) de hipófisis. a. Señales de doble ISH en la PPD para GH (punta de flecha) y SL2 (cabeza de flecha). b: Detalle de las células somatolactogénicas en una simple ISH (SL2). c: Detalle de las células somatolactogénicas en una doble ISH (SL2 y SL1). Barra de escalas: a, 20 mm; b y c, 10 mm. Estas localizaciones son muy distintas de las observadas para los otros miembros de la familia GH/PRL (Quesada et al. 1988; Power & Canario 1992; Villaplana et al. 2000). En el caso de las células somatotropas de S. aurata se localizan principalmente en la región dorsal de la PPD formando una capa alrededor de la NH. Por el contrario, las células lactogénicas de S. aurata están presentes principalmente en la rostral pars distalis (RDP) (Fig. 5a, 6e). Finalmente, cabe resaltar que todos estos datos de distribución hipofisaria son coincidentes con los estudios IHC realizados en esta especie cuando sólo se conocía un tipo de SL (Villaplana et al. 1997). Figura 6. Secciones sagitales de hipófisis de individuos juveniles de S. aurata de 87 días de tallas pequeñas (a, b y c) y grandes (d, e y f). a: Simple ISH para SL2 en sección laterosagital. b: Simple ISH para SL2 en sección medio-sagital. c: Doble ISH para SL1 y SL2 de a. d: Simple ISH para SL2. f: Doble ISH para SL2 y SL1. e: Doble ISH para GH (punta de flecha) y PRL (cabeza de flecha) en sección medio-sagital. Barra de escalas: a, b, c, d, f, 50 mm; e, 100 mm. La colocalización de hormonas hipofisarias, no es exclusiva de las SLs de S. aurata, puesto que, específicamente en el caso de la SL, en dos especies de holósteos, Lepisosteus osseus y Amia calva, se han descrito células que coexpresan en las células de la PI en distinto grado la SL y la hormona estimulante melanotrofa (MSH). De esta forma, se postula que los teleósteos modernos se desarrollaron a partir de un antecesor del A. calva, diferenciándose las expresiones de SL y MSH en dos tipos celulares (Dores et al. 1996). Por lo tanto, proponemos que la expresión de dos tipos de SL en la dorada se produjo a lo largo de la filogenia por duplicación génica, y que ésta, se ha mantenido en el mismo tipo celular. En los grupos de animales analizados en este trabajo, no hemos apreciado diferencias cualitativas significativas en lo referente a la distribución de la expresión génica de las hormonas hipofisarias de la familia de proteínas GH/PRL/SL de S. aurata (HerreroTurrión et al. 2001). No obstante, la diferencia de volumen/tamaño hipofisario y, por lo tanto, del número de células en cada uno de estos grupos, podría sugerir una secreción cuantitativa diferente de las SLs. De este modo, nuestros resultados indican que en el crecimiento asincrónico de la dorada en cultivo piscícola, no hay diferencias significativas en la distribución de la población de células hipofisarias somatolactogénicas, aunque el número de componentes de dicha población puede ser distintos. Conclusiones 1. Hemos optimizado las condiciones de la ISH, para la determinación de la expresión génica de una familia de hormonas hipofisarias con grandes similitudes estructurales. 2. Es la primera vez que se encuentra que los dos tipos de somatolactinas de la dorada se expresan en las mismas células, es decir, están colocalizadas. 3. No hay una diferencia apreciable en la distribución de células somatolactogénicas entre los animales de dorada, de crecimiento asincrónico, provenientes de una misma freza. Agradecimientos Este trabajo ha sido financiado por la Junta de Castilla y León y F.S.E. (Sa 30/99 y Sa 103/01) y FEDER-CICYT (1FD97-1739). Bibliografía Amemiya, Y., Sogabe, Y., Nozaki, M., Takahashi, A. y Kawauchi, H. (1999). Somatolactin in the white sturgeon and African lungfish and its evolutionary significance. Gen Comp Endocrinol114, 181-90. Astola, A., Pendon, C., Ortiz, M. and Valdivia, M. M. (1995). Cloning and expression of somatolactin, a pituitary hormone related to growth hormone and prolactin from gilthead seabream, Sparus aurata. Gen Comp Endocrinol 104(3), 330-6. Ayson, F. G., de Jesus, E. G., Amemiya, Y., Moriyama, S., Hirano, T. y Kawauchi, H. (1999). Isolation and cDNA cloning of somatolactin in rabbitfish (Siganus guttatus). Gen Comp Endocrinol 115, 292-300. Ball, J. N. and Batten, T. F. (1981). Pituitary and melanophore responses to background in Poecilia latipinna (teleostei): Role of the pars intermedia PAS cells. Gen Comp Endocrinol 44, 233-248. Cavari, B., Le Bail, P. Y., Levavi-Sivan, B., Melamed, P., Kawauchi, H. y Funkenstein, B. (1994). Isolation of the growth hormone and in vitro translation of the mRNA isolated from pituitaries of the gilthead seabream Sparus aurata. Gen Comp Endocrinol 95, 621-29. Cavari, B., Noso, T. y Kawauchi, H. (1995). Somatolactin, a novel pituitary protein: isolation and characterization from Sparus aurata. Mol Mar Biol Biotechnol. 4(2), 117-22. Cavari, B., Funkenstein, B. and Kawauchi, H. (2000). Cloning of a second variant of somatolactin-encoding cDNA from the gilthead seabream Sparus aurata. Fish Physiology and Biochemistry 22 (2), 145-150. Cheng, K. W., Chan, Y. H., Chen, Y. D., Yu, K. L. and Chan, K. M. (1997). Sequence of a cDNA clone encoding a novel somatolactin in goldfish, Carassius y. Biochem Biophys Res Commun. 232, 282-7. Company, R., Calduch-Giner, J. A., Mingarro, M. y Pérez-Sánchez, J. (2000). cDNA cloning and sequence of European sea bass (Dicentrarchus labrax) somatolactin. Comparative Biochemistry and Physiology Part B 127, 183-192. Dores, R. M., Hoffman, N. E., Chilcutt-Ruth, T., Lancha, A., Brown, C., Marra, L. y Youson, J. (1996). A comparative analysis of somatolactin-ralated immunoreactivity in the pituitaries of four neopterygian fishes and one chondrostean fish: an immunohistochemical study. Gen Comp Endocrinol. 102, 79-87. Funkenstein, B., Chen, T. T., Powers, D. A. y Cavari, B. (1991). Cloning and sequencing of the gilthead seabream (Sparus aurata) growth hormone-encoding cDNA. Gene. 103, 243-7. García-Hernández, M. P., García-Ayala, A., Elbal, M. T. y Agulleiro, B. (1996). The adenohypophysis of Mediterranean yellowtail, Seriola dumerilii (Risso, 1810): an immunocytochemical study. Tissue Cell 28(5), 577-85. Heath, P. R., Sanders, M. W. y Pearson, R. C. A. (1996). In situ hybridization wiyh 35S- labelled oligonucleotides. In In situ hybridization techniques for the brain, Z. Henderson, ed. (Univ. Oxford: Methods in Neurosciences). Herrero-Turrión, M.J.; Velasco, A.; Rodríguez, R.; Aijón, J. y Lara, J. (2001). Métodos no radioactivos de hibridación in situ, simple y doble, para GH y PRL de dorada. VIII Congreso Nacional de Acuicultura. Iraqi, F., Gong, Z. y Hew, C. L. (1993). Isolation and characterization of somatolactin genes from cold water marine teleost lumpfish (Cyclopterus lumpus) and habilut (Hippoglossus hippoglossus). Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 2, 96-103. Johnson, L. L., Norberg, B., Willis, M. L., Zebroski, H. and Swanson, P. (1997). Isolation, characterization, and radioimmunoassay of Atlantic halibut somatolactin and plasma levels during stress and reproduction in flatfish. Gen Comp Endocrinol 105, 194-209. Kakizawa, S., Kaneko, T., Hasegawa, S. and Hirano, T. (1993). Activation of somatolactin cells in the pituitary of the rainbow trout Oncorhynchus mykiss by low environmental calcium. Gen Comp Endocrinol. 91, 298-306. Kakizawa, S., Kaneko, T., Hasegawa, S. and Hirano, T. (1995a). Effects of feeding, fasting, background adaptation, acute stress, and exhaustive exercise on the plasma somatolactin concentrations in rainbow trout. Gen Comp Endocrinol. 98, 137-46. Kakizawa, S., Kaneko, T., Ogasawara, T. y Hirano, T. (1995b). Changes in plasma somatolactin levels during spawing migration of chum salmon. Fish Physiology Biochemistry 14, 93-101. Kakizawa, S., Kaneko, T. y Hirano, T. (1996). Elevation of plasma somatolactin concentrations during acidosis in rainbow trout. J Exp Biology 199, 1043-1051. Kaneko, T. y Hirano, T. (1993a). Role of prolactin and somatolactin in calcium regulation in fish. J Exp Biology 184, 31-45. Kaneko, T., Kakizawa, S. y Yada, T. (1993b). Pituitary of "cobalt" variant of rainbow trout separated from the hypothalamus lack most pars intermedia and neurohypophysial tissue. Gen Comp Endocrinol. 92, 31-40. Kaneko, T., Kakizawa, S., Yada, T. y Hirano, T. (1993c). Gene expression and intracellular localization of somatolactin in the pituitary of rainbow trout. Cell Tissue Res. 272, 11-16. Lu, M., Swanson, P. y Renfro, J. L. (1995). Effect of somatolactin and related hormones on transport by flounder renal tubule primary cultures. Am. J. Physiol. 268, R577-R582. May, D., Todd, C. M. y Rand-Weaver, M. (1997). cDNA cloning of eel (Anguilla anguilla) somatolactin. Gene 188, 63-7. Mousa, S. A. y Mousa, M. A. (1999). Immunocytochemical and histological studies on the hypophyseal-gonadal system in the freshwater nile tilapia, Oreochromis niloticus (L.), during sexual maturation and spawning in different habitats. J Exp Zool 284, 343-54. Mousa, M. A. y Mousa, S. A. (2000). Implication of somatolactin in the regulation of sexual maturation and spawning of Mugil cephalus. J Exp Zool 287, 62-73. Nicoll, C. S., Mayer, G. L., y Rusell S. M. (1986). Structural features of prolactins and growth hormones that can be related to their biological properties. Endocr. Rev. 7, 169-203. Olivereau, M., Aimar, C. y Olivereau, J. M. (1980). Response of the teleost pituitary (goldfish, eel) to deionized water. Cell Tissue Res. 208, 389-404. Olivereau, M., Olivereau, J. M. y Aimar, C. (1981). Specific effect of calcium ions on the calcium sensivite cells of the pars intermedia in the goldfish. Cell Tissue Res. 214, 23-31. Olivereau, M. y Rand-Weaver, M. (1994a). Immunocytochemical study of the somatolactin cells in the pituitary of Pacific salmon, Oncorhynchus nerca, and O. keta at some stages of the reproductive cycle. Gen Comp Endocrinol. 93, 28-35. Olivereau, M. y Rand-Weaver, M. (1994b). Inmunoreactive somatolactin cells in the pituitary young , migrating, spawing and spent chinook salmon, Oncorhynchus tshawytscha. Gen Comp Endocrinol. 13, 141-151. Ono, M., Takayama, Y., Rand-Weaver, M., Sakata, S., Yasunaga, T., Noso, T. y Kawauchi, H. (1990). cDNA cloning of somatolactin, a pituitary protein related to growth hormone and prolactin. Proc Natl Acad Sci U S A. 87(11), 4330-4. Ono, M., Harigai, T., Kaneko, T., Sato, Y., Ihara, S. y Kawauchi, H. (1994). Pit-1/GH factor-1 involvement in the gene expression of somatolactin. Mol Endocrinol. 8, 109-15. Parhar, I. S. y Iwata, M. (1994). Gonadotropin releasing hormone (GnRH) neurons project to growth hormone and somatolactin cells in the steelhead trout. Histochemistry 102(3), 195-203. Pendón, C., Martinez-Barbera, J. P., Perez-Sanchez, J., Rodriguez, R. B., Grenett, H. y Valdivia, M. M. (1994). Cloning of the sole (Solea senegalensis) growth hormone-encoding cDNA. Gene 145, 237-40. Planas, J. V., Swanson, P., Rand-Weaver, M. y Dickhoff, W. W. (1992). Somatolactin stimulates in vitro gonadal steroidogenesis in coho salmon, Oncorhynchus kisutch. Gen Comp Endocrinol. 87, 1-5. Power, D.M. and Canario, A.V. (1992). Immunocytochemistry of somatotrophs, gonadotrophs, prolactin and adrenocorticotropin cells in larval sea bream (Sparus auratus) pituitaries. Cell Tissue Res. 269(2):341-346. Quesada, J., Lozano, M. T., Ortega, A. y Agulleiro, B. (1988). Immunocytochemical and ultrastructural characterization of the cell types in the adenohypophysis of Sparus aurata L. (teleost). Gen Comp Endocrinol 72(2), 209-25. Rand-Weaver, M., Noso, T., Muramoto, K. y Kawauchi, H. (1991a). Isolation and characterization of somatolactin, a new protein related to growth hormone and prolactin from Atlantic cod (Gadus morhua) pituitary glands. Biochemistry 30(6), 1509-15. Rand-Weaver, M., Baker, B. J. y Kawauchi, H. (1991b). Cellular localization of somatolactin in the pars intermedia of some teleost fishes. Cell Tissue Res. 263, 207-215. Rand-Weaver, M., Swanson, P., Kawauchi, H. y Dickhoff, W. W. (1992). Somatolactin, a novel pituitary protein: purification and plasma levels during reproductive maturation of coho salmon. J Endocrinol. 133(3), 393-403. Rand-Weaver, M., Pottinger, T. G. y Sumpter, J. P. (1993). Plasma somatolactin concentrations in salmonid fish are elevated by stress. J. Endocrinol. 138, 509-515. Rand-Weaver, M. y Swanson, P. (1993). Plasma somatolactin levels in coho salmon (Oncorhyncus kitsutch) during smoltification and sexual maturation. Fish Physiology Biochemistry 11, 175-182. Rand-Weaver, M., Pottinger, T. G. y Sumpter, J. P. (1995). Pronounced seasonal rhythms in plasma somatolactin levels in rainbow trout. J Endocrinol 146, 113-9. Rendón, C., Rodríguez-Gómez, F. J., Muñoz-Cueto, J. A., Piñuela, C. y Sarasquete, C. (1997). An immunocytochemical study of pituitary cells of the Senegalese sole, Solea senegalensis (Kaup 1858). Histochem J. 29(11-12), 813- 22. Saga, T., Yamaki, K., Doi, Y. y Yoshizuka, M. (1999). Chronological study of the appearance of adenohypophysial cells in the ayu (Plecoglossus altivelis). Anat Embryol 200(5), 469-75. Salam, M. A., Ando, H., Ban, M., Ueda, H. y Urano, A. (2000). Immunocytochemical analysis of pituitary cells in pre-spawing chum salmon. Zoological Science 17, 805-819. Santos, C. R., Brinca, L., Ingleton, P. M. y Power, D. M. (1999). Cloning, expression, and tissue localisation of prolactin in adult sea bream (Sparus aurata). Gen Comp Endocrinol 114(1), 57-66. Sommer, B., Keinanen, K., Verdoorn, T. A., Wisden, W., Burnashev, N., Herb, A., Kohler, M., Takagi, T., Sakmann, B. y Seeburg, P. H. (1990). Flip and flop: a cell-specific functional switch in glutamate-operated channels of the CNS. Science 249, 1580-5. Takayama, Y., Ono, M., Rand-Weaver, M. y Kawauchi, H. (1991a). Greater conservation of somatolactin a presumed pituitary hormone of the growth hormone/prolactin family than of growth hormone in teleost fish. Gen Comp Endocrinol. 83, 366-374. Takayama, Y., Rand-Weaver, M., Kawauchi, H. y Ono, M. (1991b). Gene structure of chum salmon somatolactin, a presumed pituitary hormone of the growth hormone/prolactin family. Mol Endocrinol. 5, 778-86. Tang, Y. (1992). A study on the catfish (Ictalurus punctatus) growth hormone gene family: structures of growth hormone and prolactin genes and somatolactin cDNA, their evolutionary implication and expression in the pituitary gland. Thesis. University of Maryland. Van Eys G. J. (1980). Structural changes in the pars intermedia of the cichlid teleost Sarotherodon mossambicus as a result of background adaptation and illumination. II. The PAS-positive cells. Cell and Tissue Res. 210, 171-9. Villaplana, M., García Ayala, A., García Hernández, M. P. y Agulleiro, B. (1997). Ontogeny of immunoreactive somatolactin cells in the pituitary of gilthead sea bream (Sparus aurata L., Teleostei). Anat Embryol. 196(3), 22734. Villaplana, M., García-Ayala, A., Chaves-Pozo, E. y Agulleiro, B. (2000). Identification of mammosomatotropes, growth hormone cells and prolactin cells in the pituitary gland of the gilthead sea bream (Sparus aurata L., Teleostei) using light immunocytochemical methods: an ontogenic study. Anat. Embryol. 202, 421-429. Vissio, P. G., Paz, D. A. y Maggese, C. (1996). The adenohypophysis of the swamp eel, Synbranchus marmoratus, an immunocytochemical analysis. Biocell 20, 155-61. Vissio, P. G., Somoza, G. M., Maggese, M. C., Paz, D. A. y Strussmann, C. A. (1997). Structure and cell type distribution in the pituitary gland of pejerrey Odontesthes bonariensis. Fisheries Science 63, 64-68. Wendelaar Bonga, S. E., Van der Meij, J. C., Van der Krabben, W. A. y Flik, G. (1984). The effect of water acidification on prolactin cells and pars intermedia PAS-positive cells in the teleost fish Oreochromis (formerly Sarotherodon) mossambicus and Carassius auratus. Cell Tissue Res. 238, 6019. Wendelaar Bonga, S. E., Van der Meij, J. C. y Flik, G. (1986). Response of PAS-positive cells of the pituitary pars intermedia cells in the teleost Carassius auratus to acid water. Cell Tissue Res. 243, 609-617. Yang, B. Y., Arab, M. y Chen, T. T. (1997). Cloning and characterization of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) somatolactin cDNA and its expression in pituitary and nonpituitary tissue. Gen Comp Endocrinol. 106, 271-280. Zhu, Y. y Thomas, P. (1995). Red drum somatolactin: development of a homologous radioimmunoassay and plasma levels after exposure to stressors or various backgrounds. Gen Comp Endocrinol 99, 275-288. Zhu, Y. y Thomas, P. (1996). Elevations of somatolactin in plasma and pituitaries and increased alpha-MSH cell activity in red drum exposed to black background and decreased illumination. Gen Comp Endocrinol 101, 21-31. Zhu, Y. y Thomas, P. (1997). Effects of somatolactin on melanosome aggregation in the melanophores of red drum (Sciaenops ocellatus) scales. Gen Comp Endocrinol 105, 127-33. Zhu, Y. y Thomas, P. (1998). Effects of light on plasma somatolactin levels in red drum (Sciaenops ocellatus). Gen Comp Endocrinol 111, 76-82. Zhu, Y., Yoshiura, Y., Kikuchi, K., Aida, K. y Thomas, P. (1999). Cloning and phylogenetic relationship of red drum somatolactin cDNA and effects of light on pituitary somatolactin mRNA expression. Gen Comp Endocrinol. 113, 69-79. Artículo publicado en la Revista AquaTIC nº 13 (especial VIII Congreso Nacional de Acuicultura), mayo 2001
