Download Silenciamiento sRNAs, Biogénesis y función en estrés biótico

Silenciamiento
sRNAs, Biogénesis y función
en estrés biótico
Manipulacion del Gen de la Chalcona sintasa
para alterar su nivel de expresion
Chalcone
Synthase
(CHS)
Wild-type petunia
producing purple
anthocyanin
pigments
Chalcone synthase (CHS)
is the enzyme at the start
of the biosynthetic pathway
for anthocyanins
Anthocyanins
Photo credit Richard Jorgensen; Aksamit-Stachurska et al. (2008) BMC Biotechnology 8: 25.
La expresión de un mRNA en sentido debería
aumentar el nivel de expresión…
Endogenous gene
PRO
ORF
Transgene
Sense construct:
PRO
ORF
mRNA
Protein translated
mRNA
Extra protein translated
Sense RNA
mRNA
mRNA
..un antisentido disminuir la expresión
Endogenous gene
PRO
ORF
Transgene
Sense construct:
PRO
mRNA
Protein translated
mRNA
Extra protein translated
Sense RNA
ORF
mRNA
mRNA
Transgene
Antisense construct:
ORF
PRO
Antisense
RNA
Sense-antisense duplex forms
and prohibits translation
Sorprendentemente, las dos
construcciones pueden inhibir la
expresión del gen chalcona sintasa
Plants carrying CHS transgene
Sense
OR
CaMV 35S pro :
CHS
CaMV 35S pro : CHS
Antisense
Photo credit Richard Jorgensen
Co-suppression is a consequence of
siRNA production
Wild-type
PRO
ORF
Protein translated
mRNA
mRNA
Endogenous gene
Co-suppressed transgenic
PRO
ORF
Co-suppression
Sense RNA
Sense construct
PRO
ORF
Endogenous gene
siRNA
produced
mRNA
De Paoli, E., Dorantes-Acosta, A., Zhai, J., Accerbi, M., Jeong, D.-H., Park, S., Meyers, B.C., Jorgensen, R.A., and
Green, P.J. (2009). Distinct extremely abundant siRNAs associated with cosuppression in petunia. RNA 15: 1965–1970.
Silenciamiento genico
( breve reseña historica de sus mayores hitos)
1990 Jorgensen :
Introduction of transgenes homologous to endogenous genes
often resulted in plants with both genes suppressed!
Called Co-suppression
Resulted in degradation of the endogenous and the
transgene mRNA
1995 Guo and Kemphues:
-injection of either antisense or sense RNAs in the germline of
C. elegans was equally effective at silencing homologous
target genes
Contd….
1998 Mello and Fire:
-extension of above experiments, combination of
sense and antisense RNA (= dsRNA) was 10
times more effective than single strand RNA
Definition: the ability of double-stranded RNA
(dsRNA) to suppress the expression of the gene
which corresponds to the dsRNA sequence.
siRNAS
Genes Blanco
Biogenesis de sRNAs
RNA DOBLE CADENA ES
EL INICIO DEL
SILENCIAMIENTO
Biogenesis de sRNAs
Dicer and Dicer-like proteins
In siRNA and miRNA biogenesis, Dicer or
Dicer-like (DCL) proteins cleave long dsRNA
or foldback (hairpin) RNA into ~ 21 – 25 nt
fragments.
Dicer’s structure allows it to measure the RNA it
is cleaving. Like a cook who “dices” a carrot,
Dicer chops RNA into uniformly-sized pieces.
From MacRae, I.J., Zhou, K., Li, F., Repic, A., Brooks, A.N., Cande, W.., Adams, P.D., and Doudna, J.A. (2006) Structural basis for
double-stranded RNA processing by Dicer. Science 311: 195 -198. Reprinted with permission from AAAS. Photo credit: Heidi
Biogenesis de sRNAs
Argonaute proteins
ARGONAUTE proteins bind
small RNAs and their targets.
The Arabidopsis ago1 mutant and
the octopus Argonauta argo
ARGONAUTE proteins are
named after the argonaute1
mutant of Arabidopsis; ago1
has thin radial leaves and was
named for the octopus
Argonauta which it resembles.
Reprinted by permission from Macmillan Publishers Ltd: EMBO J. Bohmert, K., Camus, I., Bellini, C., Bouchez, D., Caboche, M., and Benning, C. (1998) AGO1 defines
a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development. EMBO J. 17: 170–180. Copyright 1998; Reprinted from Song, J.-J., Smith, S.K., Hannon, G.J., and Joshua-Tor,
L. (2004) Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity. Science 305: 1434 – 1437. with permission of AAAS.
Mecanismo en
Animales y
plantas
Proceso de Amplificación
dependiente de RDRs
Efecto de Transitividad
El silenciamiento se propaga
sistémicamente
Movimiento sistemico
Datos aun controversiales
RNA doble cadena es producido por
la infección viral
Silenciamiento
como mecanismo
de defensa
antiviral
Viruses have suppressor proteins
that interfere with RNA silencing
RdRP
By interfering with RNA silencing, the
viral suppressor proteins can interfere
with the plant’s viral defense
mechanism. Suppressors can act at
any step of the process.
La supresión del silenciamiento es un estrategia de contra
defensa usada por virus de DNA y RNA.
Supresores Modo de Accion
Chapman et al
Estabilización
de dúplex
P19 y HcPro
Degradación
de AGO1
mediado por
P0
Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
RNA as Supressor
CaMV Leader seq.
Múltiples modos/sitios de acción de los supresores
Antiviral Immunity Directed by Small RNAs
Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet
Sistema inmune:
Virus
Sistema inmune: Modelo del
ZIGZAG Virus
Pequeños RNAs?
Regulación mediada por
ncRNAs
Clasificación de sRNAs
Clase*
Descripción
Biogénesis y origen genómico
Función
miRNA
Micro RNAs
Regulación post-transcripcional de
los transcriptos de un amplio
rango de genes
siRNAs
primarios
sRNAs
pequeños
interferentes
Transcriptos de genes miRNAs
forman estructuras secundarias de
RNA doble
cadena
que
son
procesados por Dicer o por RNAsas
tipo III
Procesamiento de RNA doble cadena
o de estructuras secundarias
Por miembros de la familia Dicer
siRNAs
secundarios
sRNAs
pequeños
interferentes
tasi RNAs (
Trans
acting
siRNAs)
natsi RNAs
(
natural
antisense
transcriptderived siRNAs)
Unión
a
RNAs
targets
complementarios, guía para la
iniciación de siRNas secundarios
Se forman por la actividad de RNA Regulación post transcripcional de
polimerasas RNA dependientes, las los transcriptos, formación y
cuales generan RNAs doble cadena
mantenimiento
de
la
heterocromatina.
sRNAs
que Transcriptos de genes TAS son Regulación post transcripcional de
actúa en trans
clivados
por
un
mecanismo los transcriptos.
dependiente de miRNAs, luego son
convertidos en RNA doble cadena por
RdRP, seguido del procesamiento por
Dicer
siRNAs
Pares de transcriptos sense y Regulación post transcripcional de
derivados
de antisense son procesados por Dicer
la
expresión
de
genes
transcriptos
involucrados en mecanismos de
antisentidos
defensa y respuesta a stress
naturales
piRNAs
RNAs
que
(
Piwi- interaccionan
interacting
con Piwi
siRNAs)
El mecanismo de biogénesis no se
conoce completamente,
sería dependiente de argonauta e
independiente de Dicer
Supresión de transposones y
retroelementos
en
líneas
germinales de moscas y de
mamíferos.
sRNAs clasificación por
Tamaño
•
•
•
•
•
21-22 bases
siRNAs
tasRNAs
miRNAS
Asociados a
silenciamiento
posttrasncripcional
• 24-26 bases
• sRNAs
heterocromaticos
• sRNAs
provenientes de
zonas repetitivas
• Asociados a
silenciamiento
trasncripcional
Las diferentes clases de sRNAs se
diferencias solo a partir de su diferente
Biogénesis
Estructura de un gen miRNA
Region Promotora
microRNAs
Estructura de miRNA Inmaduro
(precursor) en forma de horquilla
El miRNA maduro
coloreado con rojo
Biogenesis de microRNAs
Proceso de biogénesis estructural de los miRNAs.
Loop to base
Base to Loop
Bologna N G et al. Briefings in Functional Genomics
2013;12:37-45
tasRNAs Biogenesis
Complejo Risc
Contiene Ago 1, 2, 7, ?
tasRNAs Biogenesis (Via 22mer)
Several “phased” tasiRNAs are
derived from each TAS gene
miRNA cleavage
site of primary
transcript
The tasiRNAs can
be produced from
either strand.
DCL4 moves
along the
dsRNA,
measuring and
cutting
Reprinted from Allen, E., Xie, Z., Gustafson, A M., and Carrington, J.C. (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants. Cell 121: 207-221, with permission from Elsevier.
NatSiRNAs Biogenesis
Ago Complex
Las plantas tienen RNA
polimerasas adicionales que
contribuyen al silenciamiento
Complex
Distribution
Function
RNA Polymerase I
All eukaryotes
Production of rRNA
RNA Polymerase II
All eukaryotes
Production of mRNA,
microRNA
RNA Polymerase III
All eukaryotes
Production of tRNA, 5S rRNA
RNA Polymerase IV
Land plants
Production of siRNA
RNA Polymerase V
Angiosperms
Recruitment of AGO to DNA
Most siRNAs are produced from
transposons and repetitive DNA
Chromosome
Centromere
Abundance of
small RNAs
Abundance of
transposon/
retrotransposons
Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive
sequences. In Arabidopsis, as shown above, there is a high density of these repeats
in the pericentromeric regions of the chromosome.
Kasschau, K.D., Fahlgren, N., Chapman, E.J., Sullivan, C.M., Cumbie, J.S., Givan, S.A., and Carrington, J.C.
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs. PLoS Biol 5(3): e57.
Biogenesis siRNAs
Heterocromaticos
Transcriptional gene silencing
Small RNAs can initiate gene silencing through
covalent modifications of the DNA or its associated
histone proteins, interfering with transcription.
Transcription
Histone
proteins
DNA
Silencing
This form of silencing
is frequently
associated with stably
silenced DNA
including centromeres
and transposons, but
also occurs at genes.
siRNAs can target DNA for silencing
by cytosine methylation
or by histone modification
NH2
N
O
NH2
CH3
N
N
~
cytosine
O
N
~
The precise mechanisms by which siRNAs
target DNA for silencing are not known, but
involve the action of two plant-specific RNApolymerase complexes, RNA Polymerase IV
(Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V).
5-methylcytosine
DNA
methyltransferase
DNA can be covalently
modified by cytosine
methylation, carried out by
DNA methyltransferases.
Histone modification
DNA methylation
Activated transposons in ddm
mutants induce mutations
Wild-type
After one
generation
After three
generations
After five
generations
After DDM inactivation, plants become more and more
abnormal as they accumulate transposon-induced mutations.
Kakutani, T., Jeddeloh, J.A., Flowers, S.K., Munakata, K., and Richards, E.J. (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations. PNAS 93: 12406-12411. Copyright (1996) National Academy of Sciences, U.S.A.
Rol de los transposones? Generar variabilidad
genética o Parte de una maquinaria de
regulación genetica ? AMBAS?
Epigenetic silencing of transposons by
DNA methylation is necessary to
maintain genomic integrity.
Este fenotipo
es producido
por:
Metilasas y
Diferentes
actores del
sistema de
silenciamiento
(Pol IV)
Kakutani, T., Jeddeloh, J.A., Flowers, S.K., Munakata, K., and Richards, E.J. (1996) Developmental abnormalities and epimutations
associated with DNA hypomethylation mutations. PNAS 93: 12406-12411. Copyright (1996) National Academy of Sciences, U.S.A.
Epigenetic reprogramming in plants
Large-scale epigenetic changes have been
observed in the endosperm and in the
vegetative nucleus of the male gametophyte.
El estrés es una causa importante de
reprogramación epigenética, esto incluye al
estrés genómico
Estrés
Genómico
En el hombre el
25% de los
promotores tiene
una porción de
transposon o un
“rastro” derivados
de los mismos.
Regulación
Coordinada?
Producción de
epialelos?
Energy use efficiency is characterized by an epigenetic component that can
be directed through artificial selection to increase yield.
Hauben M, Haesendonckx B, Standaert E, Van Der Kelen K, Azmi A, Akpo H, Van
Breusegem F, Guisez Y, Bots M, Lambert B, Laga B, De Block M.
Source
Bayer BioScience NV, 9052 Gent, Belgium.
Mejoramiento EPIGENETICO
Accionamiento del mecanismo
proteínas Argonaute (efectoras)
Rol de los miRNAs
Regulación post trasncripcional
Some miRNAs are highly conserved
and important gene regulators
Nearly half of the targets of
conserved miRNAs are
transcription factors.
Factors
•Non-conserved MIRNA families
usually occur as single genes
•Conserved ones have often
duplicated to larger gene families
Fahlgren, N., Howell, M.D., Kasschau, K.D., Chapman, E.J., Sullivan, C.M., Cumbie, J.S., Givan, S.A., Law, T.F., Grant, S.R., Dangl, J.L., and Carrington,
J.C. (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs: Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes. PLoS ONE. 2007; 2(2): e219.
Modo de Acción de los miRNAs
Zona de unión a blancos
Targets of some conserved miRNAs
miRNA gene family
Target gene family
Function
156
SPL transcription factors
Developmental timing
160
ARF transcription factors
Auxin response,
development
165/6
HD-ZIPIII transcription
factors
Development, polarity
172
AP2 transcription factors
Developmental timing, floral
organ identity
390
TAS3 (tasiRNA) which acts
on ARF transcription factors
Auxin response,
development
395
Sulfate transporter
Sulfate uptake
399
Protein ubiquitination
Phosphate uptake
Adapted from Willmann, M.R., and Poethig, R.S. (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development. Curr. Opin. Plant Biol. 10: 503–511..
miRNAs and stress
miRNAs and vegetative phase
change
Vegetative phase change is the transition
from juvenile to adult growth in plants.
Vegetative phase
change
Germination
zygote
EMBRYONIC
PHASE
JUVENILE
PHASE
ADULT
PHASE
REPRODUCTIVE
PHASE
Vegetative phase change affects
morphology and reproductive competence
Some cacti have very
different juvenile and
adult growth patterns.
Adult
Juvenile
A
J
Photos courtesy of James Mauseth
miR156 overexpression prolongs
juvenile phase in Arabidopsis
Reprinted from Poethig, R.S. (2009) Small RNAs and developmental timing in plants. Curr. Opin. Genet. Devel. 19: 374-378, with permission from Elsevier.
miR156 targets SPL genes,
promoters of phase change
The SPL genes
are a family of
transcription
factors that are
miR156 targets.
SPL3
Promoter
In wild-type plants, miR156
expression decreases with
plant age, allowing SPL to
accumulate and promote
phase change.
ORF
3’ UTR
miR156
miR156
binding
site
SPL
miR172 promotes flowering in
Arabidopsis by targeting AP2-like
transcription factors
Wild-type
miR172-OX
Arabidopsis plants overexpressing
miR172 flower early.
miR172 homology
Aukerman, M.J., and Sakai, H. (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15: 2730-2741.
miR172 expression temporally
regulates AP2-like proteins
It is thought that floral initiation
can occur when the level of
AP2-like floral inhibitors drops
below a certain level.
Aukerman, M.J., and Sakai, H. (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15: 2730-2741.
Phase change may involve a
temporal cascade of miRNAs and
transcription factors
In Arabidopsis, SPL9
directly activates
transcription of
MIR172b
miR156
SPL
miR172
AP2-like
Estudio de la acción de
miRNAS
Mutantes naturales
Sobreexpresión
Genes blanco insensibles
miRNAs en el desarrollo vegetal
WT
Mutante JAW
Expresión alterada del miR319
(mutante natural)
Sobre expresión, o expresión ectópica
Maiz
WT
Mutante
Insensibilidad a la regulación por miRNA
Gen Blanco
miRNA
Mutaciones puntuales en gen blanco
Gen blanco insensible
NO hay reconocimiento →
NO hay regulación
miR156-resistant SPL promotes
precocious phase change
SPL3
Promoter
ORF
SPL3Δ
Promoter
ORF
SPL3m
Promoter
ORF
Wild-type
miR156resistant
3’ UTR
3’ UTR
miR156
miR156
miR156
binding
site
SPL
SPL
Reproduced with permission from Wu, G., and Poethig, R.S. (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis
thaliana by miR156 and its target SPL3. Development 133: 3539–3547.
Insensibilidad a mir159
Insensibilidad a mir172
Planta
WT
Planta
Transgenica
La infecciones virales producen grandes
perdidas en la agricultura
Virus
Plant
Grandes cambios metabólicos y
fisiológicos.
Los síntomas incluyen la
alteración de la estatura, el
aspecto general y la morfología de
la planta.
Reprogramación génica mediada por la
infección viral
Proceso Dinámico
Posibles vías
de interacción
Virus y sRNAs
SINTOMAS
Impacto de la infección de
ORMV en el perfil de sRNAs
PLoS ONE 6(5): e19549. doi:10.1371/journal.pone.0019549
Virus and miRNAs pathway “Direct
interaction”
PTGS Suppressors
alters miRNA.
Chapman et.al
miRNA alteration is a side
effect of counter-defense
suppressor activity?
Silencing (PTGS) as defense mechanism, PTGS suppressors as virus counter-defense
NO todo los datos coinciden en
todos los casos para explicar
síntomas
Acción INDIRECTA de sRNAs
en la interacción viral
Alteración mediada por expresión transgénica de
supresores
Chapman et.al
Misregulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 Underlies the Developmental
Abnormalities Caused by Three Distinct Viral Silencing Suppressors in Arabidopsis
PLoS Pathog 7(5): e1002035. doi:10.1371/journal.ppat.1002035
microArray of
miRNAs
Profiling the whole
miRdatabase along 3
time points after the
infection (5,15, 22
dpi)
Sample
Inoculate
ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR
Hormones and Defense
Rajendra Bari and Jonathan D. G. Jones Plant Mol
Biol (2009) 69:473–488
miRs Promoter Analysis
HAN-HUA LIU et al, RNA (2008), 14:836–843.
Developmental Symptoms
depend on infection times
Early stage
Mid stage
Late stage
Usos del silenciamiento génico
Knock out genico
Análisis funcional
Métodos basados en PTGS para disminuir la
expresión de un gen endógeno
miRNAs artificiales
Antisentido
HpRNAi
VIGS
Origen de dsRNAs
que luego son
procesados por
DCL
Explota a los
precursores de miRNAs
endógenos para
generar sRNAs.
Formación de
dsRNA a partir del
apareamiento del
transcripto
antisentido y el
trascripto sentido. El
dsRNA formado es
procesado por DCL.
En estas
construcciones
el transcrito
sentido y
antisentido
están próximos
de modo que el
dsRNA se forma
fácilmente
Los dsRNAs se
forman durante la
replicación viral o
bien por
estructuras
secundarias que
adquiere el virus
Silenciamiento
transiente
sistémico
Se ha observado
silenciamientos
sistémico a pesar de
que no hay evidencias
que muestren que el
silenciamiento
desencadenado por los
miRNAs se transmita a
otras células
Si
Si
Si
Construcción
empleada
Construcción
empleada
Antisentido
HpRNAi
miRNAs
artificiales
VIGS
Requerimien
to de
transgénesis
para obtener
un
silenciamient
o sistémico
Si
Si
Si
No
Origen de
dsRNAs que
luego son
procesados
por DCL.
Formación de
dsRNA por
apareamiento
del transcripto
sentido y del
antisentido.
Formación de dsRNA por
apareamiento del transcripto
sentido y del antisentido.
Explota a los
precursores
de miRNAs
endógenos
para generar
sRNAs.
Los dsRNAs se forman
durante la replicación
viral o bien por
estructuras secundarias
que adquiere el virus.
Silenciamiento inducido por virus (VIGS)
VIGS
●El silenciamiento del gen target se
produce tras la
formación de
dsRNAs durante la replicación viral
o bien por estructuras secundarias
que adquiere el virus.
Genoma viral
Fragmento de gen target
PTGS
●El silenciamiento puede hacerse
extensivo debido a que el virus tiene
la capacidad de moverse por la
planta.
Virus
Género
Tobacco
Mosaic Virus
Tobamovirus
Tobacco
Rattle virus
Tobravirus
Genes
silenciados
Referencias
PDS, PSY
Kumagai et al
(1995)
Varios genes
PDS,
PSY,
GFP,
EDS,
RAR , NPR1
Liu et al(
2002b)
Ratcliff et al
(2001)
PDS, GFP
Ruiz et
(1998)
Barley stripe Hordeivirus
mosaic virus
Nicotiana
benthamiana,
Nicotiana
tabacum
Amplio rango N.
de
benthamiana,
hospedantes
Arabidopsis,
Tomate,
especies
de
Solanum,
pimiento
Solanum
N.
tuberosum
bentahmiana,
Brassicca
Solanum
Campestris
tuberosum
Trigo, cebada, Trigo, cebada
maíz
PDS
Tomato goleen Begomovirus
mosaic virus
Lycopersicum
sculetum
Su(Sulfur
gene)
Holzberg et al
(2002)
Scofield et la (
2005)
Peele
et
al(2001)
Potato Virus X Potexvirus
Hospedantes
naturales
importantes
Nicotiana
tabacum
Probado en
N.
benthamiana
al
Empleo de genes reporteros en la puesta
a punto de VIGS
Gen reportero
Características
Fenotipo observado
Phytoene Desatuarse(PDS)
Enzima implicada en la
síntesis de carotenoides,
protege a la planta del foto
blanquedo
Hojas con manchas blancas
Proteína verde fluorescente( GFP)
Da fluorescencia verde bajo
la luz UV.
El tejido de las plantas que
expresan GFP se observa verde
bajo luz UV, mientras que al esta
silenciado se ve rojo debido a la
clorofila.
Chalcone syntetasa ( CHS)
Enzima clave en la síntesis
de antocianinas, requerida
para la coloración de los
pétalos en Petunia
El silenciamiento lleva a que los
pétalos sean blancos
Sulfur gene SU
Codifica para una de las
unidades de la enzima
magnesium chelatasa
presente en el cloroplasto
Se observan manchas amarillas
en las hojas
Godge et al, 2008.
Sistema VIGS
Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silencio el gen
PDS mediante el sistema de VIGS. Nicotiana benthamiana, Nicotiana
tabacum, Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate)
respectivamente
El silenciamiento mediado por VIGS no es
completamente homogeneo tisularmente.
miRNA artificial
•Terapia Génica
mRNA
•Transgénesis
Ventajas de los amiRNAs
 Especificidad (reducido numero de of-targets)
Posibilidad de hacer blanco en un gen
único de un familia o en varios
(amiRNAspolicistronico), hacer blanco en
isoformas diferencialmente
Posibilidad de tener especificidad tisular
Posibilidad de usar promotores inducibles
Construcción de un amiRNA
miR artificial anti-GFP
WMD 3 - Web MicroRNA Designer
WMD 2 - Web MicroRNA
Designer
http://wmd3.weigelworld.org/cgi-bin/webapp.cgi
http://katahdin.mssm.edu/arabidopsis/2010/scripts/main2.pl
MIGS:
miRNAinduced gene
silencing
14 FEB 2012
DOI: 10.1111/j.1365-313X.2011.04896.x
Felipe Fenselau de Felippes†,
Jia-wei Wang‡,
Detlef Weigel*