Download DESARROLLO DE UN MÉTODO DE TIPADO DE HAPLOTIPOS EN

Estudio de polimorfismos en tandem
mediante PCR-alelo específica.
Automatización en un Analizador Genético
(ABI Prism 310 Applied Biosystems).
Carmen Cañadas, Eduardo Diaz Rubio, Trinidad Caldes y
Miguel de la Hoya
Laboratorio de Oncología Molecular.
Hospital Clínico San Carlos de Madrid.
INTRODUCCIÓN
•SNPs (polimorfismos de un solo nucleótido). Tienen múltiples
aplicaciones como marcadores genéticos.
•Genotipado de un SNP adyacente a otro SNP o SNPs en
tándem:
resulta
complicado
con
las
técnicas
empleadas
habitualmente.
•Hemos desarrollado una técnica especialmente diseñada para
genotipar los SNPs dispuestos en tándem: tSNPh (tandem SNPs
haplotyping assay).
INTRODUCCIÓN
BRCA1: Gen de susceptibilidad en cáncer de mama
familiar.
BARD1: Gen que codifica una proteína relacionada
con BRCA1 por lo que se ha estudiado en
susceptibilidad a cáncer de mama.
¾Una variante estudiada es Val507Met (1592 A>G)
¾Se ha encontrado asociación con cáncer de mama
pero existen pocos estudios diseñados para aclarar
su papel.
¾Presenta un SNP adyacente His506His (1591 C>T)
OBJETIVO: Diseño, puesta a punto y validación de un método de
genotipado de SNPs en tándem: tSNPh.
MATERIAL Y MÉTODO
Extracción de DNA genómico
tSNPh
1. Amplificación mediante PCR
2. Comprobación en gel
de agarosa (~200 pb)
3. Análisis de fragmentos
en electroforesis capilar
RESULTADOS
DISEÑO DEL MÉTODO
6-FAM
1591 1592
(C/T)-(A/G)
Gen BARD1 exón 6
Haplotipos
C-G
C-A
T-A
T-G
G-CG-TA-TA-C-
(A)4
(A)5
(A)12
•Fragmento de aproximadamente 195 pb.
•Cebador directo: marcado con FAM.
•Cebadores reversos: el extremo 3´ coincide con las posiciones
polimórficas y tienen colas de poli-A de diferente tamaño.
oLa diferencia de tamaño de los cebadores específicos determina que la
longitud de los amplicones sea diferente para cada alelo amplificado, así
sabemos que haplotipos están presentes en la muestra.
RESULTADOS
ANALISIS DE FRAGMENTOS EN ELECTROFORESIS CAPILAR
C-G
C-A
C-A
T-G
C-G
T-G
RESULTADOS
-C-A-C-A-
-C-A-T-G-
-C-G-C-G-
-C-A-C-G-
-T-G-T-G-
-C-G-T-G-
Resultados con concentraciones
equimoleculares de los cebadores
PUESTA A PUNTO: resulta crítico para
obtener un resultado específico optimizar
las concentraciones de los cebadores.
-C-A-C-A-
-C-A-T-G-
-C-G-C-G-
-C-G-C-A-
-T-G-T-G-
-C-G-T-G-
Resultados con concentraciones modificadas de
los cebadores especificos
RESULTADOS
VALIDACIÓN DEL MÉTODO
1. COMPARACIÓN CON DATOS DE SECUENCIACIÓN
2. GENOTIPADO DE MUESTRAS HETEROCIGOTAS A PARTIR DE MUESTRAS
HOMOCIGOTAS
3. GENOTIPADO DE MUESTRAS MOLDE OBTENIDAS SINTÉTICAMENTE: se
confirma que el método es capaz de detectar el haplotipo T-A (no aparece en
ninguna de las muestras analizadas)
¾ Los resultados fueron concordantes en el 100% de las muestras.
RESULTADOS
FRECUENCIAS GÉNICAS EN LA POBLACIÓN CONTROL
•El polimorfismo Val507Met (1592 A>G) es común en nuestra población
•Las frecuencias encontradas son similares a las publicadas por HapMap
•El haplotipo T-A no se ha detectado en ninguna de las muestras
analizadas
CONCLUSIONES
1.
El método tSNPh es una técnica fiable y reproducible que
permite el genotipado de SNPs que se localizan dispuestos
en tándem.
2.
Es un método sencillo y con buen rendimiento que se
puede desarrollar sin que sea necesario disponer de
grandes medios tecnológicos en el laboratorio.
3.
Además también nos informa del haplotipo, es decir, nos
dice en que fase se localizan los SNPs.
4.
Permite distinguir verdaderos SNPs en tándem de dobles
mutaciones.