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P R O Y E C TO S D E I N V E S T I G A C I Ó N N E U M O M A D R I D
Papel del transforming growth factor β-1 en la evolución clínica
de la fibrosis quística
R.M. Girón Moreno, J. Ancochea Bermúdez, A. Xaubet Mir, A. Salcedo Posada, C. Almonacid
Sánchez, A. Martínez Meca, M. Bueno de Andrés, B. Beltrán Bengoechea
Servicio de Neumología. Hospital Universitario de La Princesa. Hospital Clínico de Barcelona. Hospital
Universitario de La Princesa
INTRODUCCIÓN
El transforming growth factor (TGF)-β1 es una citocina que
estimula la proliferación de los fibroblastos y el depósito de colágeno. La producción de (TGF)-β1 es variable entre los individuos debido a los diferentes polimorfismos del gen de (TGF)-β1
en las posiciones + 869 y + 915, que codifican los codones 10 y
25, respectivamente. El polimorfismo bialélico en la posición +869
puede dar lugar a la presencia de una Timidina o una Citosina
de la secuencia del DNA, lo que ocasiona cambios en el aminoácido del codón 10 de leucina o prolina. Similarmente el polimorfismo bialélico en la posición + 915, Guanina o Citosina, da
lugar en el codón 25 a arginina o prolina. Para ambos polimorfismos, el alelo que codifica una prolina se asocia a una menor
síntesis de (TGF)-β1 tanto in vivo como in vitro. Estudios en humanos y en animales han mostrado que una síntesis mayor de
(TGF)-β1 desarrolla una mayor fibrosis pulmonar debido a una
más intensa respuesta inflamatoria secundaria a la exposición de
una quimioterapia o radioterapia o tras recibir un trasplante pulmonar.
Recientemente se ha publicado la relación entre el codón 10
del (TGF)-β1 en pacientes con FQ y un más rápido deterioro pulmonar. Así, los pacientes con FVC < 70% y FEV1 < 50% tienen
un polimorfismo asociado a una mayor producción de este marcador. Como hemos comentado, la enfermedad pulmonar en la
FQ se caracteriza tanto por obstrucción pulmonar como por fibrosis intersticial. Por ello se esperaría una estrecha correlación
entre los polimorfismos del gen de la profibrótica citocina y la fibrosis pulmonar más que con la obstrucción de la via aérea.
OBJETIVOS
Investigar la presencia de polimorfismos del gen TGF ß-1
en la fibrosis quística, comparación con un grupo control de sujetos sanos y su relación con algunos parámetros clínicos.
TABLA I.
Polimorfismos Posición
-800 y -509
Codones
10 y 25
26
-937
-500
+597
+1078
Secuencia de los iniciadores
Producto
5’-GGGGACACCATCTACAGTG 455 pb
5’-GGAGGAGGGGGCAACAGG
5’-TTCAAGACCACCCACCTTCT 500 pb
5’-TCGCGGGTGCTGTTGTACA
MATERIAL Y MÉTODOS
Poblacion
Grupo control. Constituido por 140 sujetos sanos, que servirán para establecer la frecuencia de los diferentes polimorfismos
del gen del TGF β-1 en la población general.
Grupo de paciente con fibrosis quística. 43 pacientes diagnosticados de fibrosis quística según las recomendaciones de la Cystic
Fibrosis Foundation (J Pediatr 1998; 132: 589-95). Son todos pacientes procedentes de la Unidad Pediátrica del Hospital Niño Jesús
y de la Unidad de Adultos del Hospital de La Princesa.
Metodos
Polimorfismo del gen del TGF β-1
El estudio de los polimorfismos en el gen TGF β-1 se realizó en el Hospital Clinic de Barcelona.
Se extrajeron 5 mL de sangre total en tubos con EDTA para
obtener las células de la serie blanca. El ADN genómico se purificó por el método de las sales. Se realizó dos amplificaciones del
gen del TGF β-1, una para detectar las variantes alélicas presentes en la región 5‘ no traducida (posiciones –800 y –509) y otra
para las variables presentes en el exón 1 (codones 10 y 25). Los
primeros serán los siguientes (Tabla I).
Ambas amplificaciones se realizaron bajo las mismas condiciones. La mezcla de la reacción contiene PCR buffer x 1 (10mM TrisHCl, pH 8,3; 50mM KCl; 1,5 mM MgCl2) 1 µM de los primers correspondientes a la región 5’ o al exón 1, 0.2mM dNTPs, 2.0 U Taq
ADN polimerasa (Boehringer Mannheim) y 25 ng de ADN genómico en un volumen final de 30µL. Asimismo, se incluyeron controles negativos para chequear la posible contaminación por los amplicones. Las soluciones fueron cubiertas con aceite mineral y se llevó
a cabo la reacción en un termociclador PT-100 (MJ Research).
Condiciones de amplificación: desnaturalización a 94º C y
30 sg; anillamiento a 60º C y 30 sg y extensión a 72º C y 30 sg,
durante 35 ciclos. Posteriormente, 10 µL de producto correspondiente a la región 5’ del gen fueron digeridos independientemente con las enzimas de restricción MaeIII y AocI (Boehringer Mannheim) con tal de detectar las variantes alélicas –800 y –509, respectivamente. Asimismo, 10µL de la amplificación correspondiente al exón 1 fueron digeridos con los enzimas MspA1I y Fse
(New England Biolabs) con tal de detectar las variantes localizadas en el codón 10 y 25, respectivamente. Los fragmentos poREV PATOL RESPIR 2006; 9(SUPL. 1): 26-27
TABLA II.
Frecuencias genotipicas
Frecuencias alélicas
Resultados fibrosis quística
CODÓN 10 (MspA1I)
CODÓN 25 (FseI)
11
"= Leu / Leu"
11
"= Arg / Arg"
12
"= Leu / Pro"
12
"= Arg / Pro"
22
"= Pro / Pro"
22
"= Pro / Pro"
Resultados fibrosis quística
CODÓN 10 (MspA1I)
CODÓN 25 (FseI)
1
"=alelo Leu"
11
"=alelo Arg"
2
"= alelo Pro"
2
"=alelo Pro"
TOTAL 11=
TOTAL 12=
TOTAL 22=
16
19
8
37,2%
44,2%
18,6%
TOTAL 11=
TOTAL 12=
TOTAL 22=
37
6
0
86,0%
14,0%
0,0%
TOTAL 1=
TOTAL 2=
51
35
Frecuencia
0,593
0,407
TOTAL=
43
100,0%
TOTAL=
43
100,0%
TOTAL=
86
1,000
TOTAL 11=
TOTAL 12=
TOTAL 22=
47
69
24
Resultados grupo control
33,6%
TOTAL 11= 129
49,3%
TOTAL 12= 9
17,1%
TOTAL 22= 2
92,1%
6,4%
1,4%
TOTAL=
140
100,0%
TOTAL=
140
100,0%
TOTAL 1=
TOTAL 2=
80
6
Frecuencia
0,930
0,070
TOTAL=
86
1,000
Resultados grupo control
TOTAL 11= 163
0,582
TOTAL 11= 267
TOTAL 12= 117
0,418
TOTAL 12= 13
0,954
0,046
TOTAL=
1,000
280
1,000
TOTAL=
280
limórficos así obtenidos se separaron en minigeles de poliacrilamida al 7% y visualizados con bromuro de etidio
Estudio de la relación entre los polimorfismos del TGF ß-1 y la
evolución clínica de la fibrosis quística
La evolución de la fibrosis quística se valorará mediante:
• Exámenes complementarios: estudio funcional respiratorio
(FVC, FEV1, FEV1/FVC, índice de masa corporal (IMC), puntuación radiológica de Brasfield y puntuación de Shwachmann.
RESULTADOS PRELIMINARES
43 pacientes con FQ con un rango de edad de 16 a 44 años,
19 mujeres y 24 varones. Los porcentajes de colonización bacteriana de la vía aérea fueron los siguientes: 16% por Staphylococcus aureus,11,6% por Staphylococcus aureus resistente a meticilina, 48,8 por P. aeruginosa, 14% por Achromobacter xylosoxidans y 2,3% por Haemophilus influenzae y Burkholderia
cepacia. Los datos de función pulmonar, expresados en valores
absolutos y media de porcentaje sobre el valor teórico estándar,
fueron los siguientes: capacidad vital forzada (FVC) 3.284,5 ml
(75,53%), volumen espirado en el primer segundo (FEV1) 2.285,07
ml/s (63,66%) y FEV1/FVC 66,18.
Las frecuencias genotípicas y alélicas de los codones 10 y 25
del TGF-beta1 en individuos sanos y enfermos con FQ se presentan en la tabla I.
En la figura 1 se muestran algunos ejemplos de los geles realizados en el codón 25 correspondientes al polimorfismo 11
(Arg/Arg) observado en el 86% de los enfermos.
CONCLUSIONES
Los polimorfismos observados del Transforming Growth Factor –beta1 no difiere de los observado en la población de sujetos
sanos.
No se observó relación entre el diferente polimorfismo del codón 10 y 25 del Transforming Growth Factor –beta1 con los porcentajes sobre el valor teórico de FEV1 y FVC, IMC y las pun-
Figura 1. Amplificación DNA fibrosis quística, Hospital de La Princesa. Fase I Codón 25.
tuaciones radiológicas de Brasfields y clínicas de Shwachman.
Sólo se acercó a la significación estadística (p < 0,06) el % de
FEV1 con los polimorfismos en el codón 10, mostrando peor función pulmonar los enfermos del alelo Leu.
R.M. Girón Moreno et al. Papel del transforming growth factor β-1 en la evolución clínica de la fibrosis quística
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