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Bioprospección por screening de bibliotecas metagenómicas Leonardo Erijman Ingeniería Gené2ca -­‐ 2do cuatrimestre 2013 Metagenómica como respuesta a la demanda de nuevos genes y sus productos La diversidad natural es la fuente principal de nuevas moléculas La explicación está en la vasta riqueza de suelos, océanos y otros nichos microbianos La metagenómica es una tecnología clave para acceder al potencial presente en los genomas de los microorganismos Permite la inves2gación de los genes individuales, el análisis de operones completos codificantes para vías biosinté2cas o degrada2vas Obje9vos de estudios metagenómicos Integrar conocimientos biológicos fundamentales para crear una imagen integrada de como funciona un ecosistema Determinar que genes hay
(metagenómica basada en secuencia)
Extracción de
ADN de la
comunidad
•  Comparacíon entre comunidades
•  Identificar genes y pathways metabólicos
•  Determinar la expresión de dichos genes
• y más…
Determinar que hacen los genes
(metagenómica basada en función)
•  Screening para identificar funciones de interés
(producción de vitaminas, resistencia a
antibióticos, etc)
•  y más…
Primeros pasos: clonado y expresión Chemistry & Biology 5: R245–R249 (1998) Clonado para acceder a los genomas colec2vos (metagenoma) y a la maquinaria enzimá2ca de la microbiota del suelo La metagenómica es un nuevo campo de la biología Análisis gené2co directo de los genomas en una muestra ambiental http://dels-old.nas.edu/metagenomics/
Representatividad!
Metagenómica y nuevos catalizadores Iqbal et al., Curr Op Chem Biol 2012, 16:109–116
Screening basado en función •  Nuevas funciones
•  Selección por
genes funcionales
•  Laborioso
(screening)
•  Baja frecuencia
•  Depende de la
expresión en el
huésped
Screening basado en secuencia •  No depende de
huésped
•  Estrategias
similares para
diferentes targets
(PCR/hibrid)
Funciones
relacionadas a
genes conocido
Limitaciones en la
predicción
Errores en la
anotación
Construcción de bibliotecas metagenómicas Meyerdierks & Glöckner Metagenome analysis, en Introduc5on to Marine Genomics 2010, Springer Metagenómica como respuesta a la demanda de tecnologías más limpias 1. Detergentes
2. Alimentos
3. Agricultura
4. Procesamiento textil
5. Industria del papel
6. Industria química
Qué genes, qué productos? 1. Detergentes
2. Alimentos
Screening m
3.etagenómico Agriculturafuncional de ac2vidades hidrolí2cas dominan actualmente la literatura 4. Procesamiento textil
5. Industria del papel
6. Industria química
Qué genes, qué productos? Enzimas usadas en la industria Enzimas presentes en metagenomas Búsqueda metagenómica de biocatalizadores Iqbal et al., Curr Op Chem Biol 2012, 16:109–116
Screening basado en función La probabilidad de identificar un cierto gen depende de:
1.  La abundancia del gen en el metagenoma de origen
2.  Tamaño del gen
3.  El sistema vector-huésped
4.  La eficiencia de expresión heteróloga
Selección del ambiente Selección del ambiente •  Ambientes naturalmente enriquecidos en el blanco
(celulasas en rumen de vacas)
No garantiza alta frecuencia de detección
•  Ambientes extremos
Biocatalizadores estables en condiciones extremas
•  Ambientes altamente diversos (suelos)
Mayor diversidad y mayor flexibilidad
Selección del ambiente Elend et al. 2006 Appl. Environ. Microbiol. 72, 3637-3645
Selección del ambiente Suenaga et al., 2007 Environmental Microbiology 9, 2289–2297
Busqueda metagenómica de enzimas lipolí9cas agar tributirina
Elend et al. 2006 Appl. Environ. Microbiol. 72, 3637-3645
Esterasas: estabilidad al pH y temperatura Elend et al. 2006 Appl. Environ. Microbiol. 72, 3637-3645
Esterasas: estabilidad frente a solventes 160
140
EstA3
% Actividad
120
100
80
60
40
20
0
ctrl
15% 30% 15% 30% 15% 30% 15% 30% 15% 30%
metanol
DMSO
DMF isopropanol acetonitrilo
Elend et al. 2006 Appl. Environ. Microbiol. 72, 3637-3645
Aislamiento de ADN 1.  El DNA debe ser extraído de un amplio rango de microorganismos para que sea representa2vo de la comunidad original 2.  Se requiere DNA de alto peso molecular 3.  El DNA debe estar libre de sustancias contamnantesque interfieren con el procesamiento (restricción, ligación) •  Métodos directos e indirectos
•  Pre-enriquecimiento
Construcción de bibliotecas metagenómicas Fragmentos
2-8kb
Necesidad de expresión en un sistema heterólogo Plásmido de
expresión
cósmidos,
fósmidos
BAC
DNA metagenómico
Pequeños insertos
•  Alto número de copias.
•  Mayor expresión (promotores)
•  DNA degradado o contaminado
•  Técnicamente simple
•  Requiere mucho análisis para
hallar positivos
•  Improbable clonar vías completas
Fragmentos
>30kb
Grandes insertos
•  taxones raros
•  Clones positivos con menos
número de análisis
•  Vias metabólicas completas
•  Requiere DNA de alto PM y
altamente purificado
•  Expresión limitada de genes
•  Técnicamente más complejo
Vectores de expresión Cósmidos son plásmidos en los cuales se han clonado las secuencias cos necesarias para la encapsulación de par]culas de fago lambda El si2o cos y la longitud entre 2 si2os cos son los únicos requisitos para ser empaquetado en el fago. Tienen 5 kb, por lo tanto se pueden clonar fragmentos de 33 -­‐ 48 kb Fosmidos son similares a los cósmidos en que con2enen si2os cohesivos (COS) para el empaquetado de insertos de 35-­‐45 kb en fagos Derivan del factor de fer2lidad de E. coli (F), que les permite mantener insertos de DNA genómico con mucho mayor estabilidad que los cósmidos BAC también están basados en el plásmido F, manteniendo los genes que regulan su replicación y controlan el número de copias Puede introducir fragmentos de 100-­‐350 kb Screening basado en función La actividad enzimática se ensaya
generalmente en agar suplementado con
sustratos
+ simple
- señales débiles
Metaloproteasa en agar + leche
(80000 clones)
Medio conteniendo trioleilglicerol y
rodamina
Waschkowitz et al. Appl. Environ. Microbiol. 2009, 75: 2506-2516
Screening basado en función Genes de resistencia a antibióticos provenientes del metagenoma
Genes de resistencia a antibióticos provenientes de aislamientos
Functional Characterization of the Antibiotic Resistance Reservoir in the Human
Microflora Morten O. A. Sommer, et al. Science 325, 1128 (2009);
Screening basado en función Vectores autolí9cos para screening masivos cassette autolítico SRRz
Inducible por UV insertado en pUC18 para transformar E. coli BL21
Eficiencia de lisis: 44.5% a 30 °C
Li et al. 2007 J Biotech 127: 647–652
Como mejorar el número de reacciones, la especificidad y la sensibilidad •  Múl2ples sustratos con diferentes modalidades de detección (fluorescencia y colorimétrica (detección simultánea de varias ac2vidades) •  Pool de clones •  Modificando gené2camente la expresión del huésped para reducir el background •  Inducción del número de copias de fósmidos (ú2l para genes clonados sin promotores o de baja eficiencia de expresión) Nyyssönen et al. Front Microbiol 3, 1-14 (2013)
High throughput screening of metagenomic libraries 12,160 clones
170,240 reacciones
Nyyssönen et al. Front Microbiol 3, 1-14 (2013)
Como mejorar el número de análisis, la especificidad y la sensibilidad Elimina las actividades WT de amilasa y fosfatasa
Nyyssönen et al. Front Microbiol 3, 1-14 (2013)
Inac9vación de genes cromosomales en E. coli FLP recognition target
Sitios de priming
FLP
Regiones de homología
Datsenko & Wanner Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640–6645 (2000)
Inducción de mayor número de copias CopyControlTM
System
(Epicentre
Technologies)
Se puede usar para
cualquier tipo de
vector— BAC,
fosmido
Permite mantener el
stock de células con
bajo número de
copias de vector e
inducir a alto número
cuando es necesario
Wild et al. Conditionally Amplifiable BACs: Switching From Single-Copy to High-Copy Vectors and Genomic
Clones Genome Res. 2002; 12: 1434–1444
20 familias de glucosido hidrolasas Nyyssönen et al. Front Microbiol 3, 1-14 (2013)
Complementación heteróloga Uso de cepas huéspedes mutantes que requieren el gen blanco para crecer en condiciones selec2vas. Ventajas: simple, rápida, no hay falsos posi2vos, altamente selec2va. 9 genes nuevos
Ejemplo: gen codificante para DNA
polimerasa por complementación de una
mutante polA de E.coli.
Simon et al., 2009 Appl. Environ. Microbiol. 75, 2964-2968
Vectores autolí9cos para liberación de enzimas intracelulares Indicador no permeable
Degradación intracelular
Acumulación intracelular de producto
cassege autolí2co SRRz insertado en pUC18 para transformar E. coli BL21
Eficiencia de lisis: 44.5% a 30 °C
Li et al. 2007 J Biotech 127: 647–652
Screening funcional: SIGEX DNA metagenómico es clonado
upstream del gen de gfp
Se basa en que los genes
catabólicos están en operones
cuya expresión en muchos
casos es controlada por
elementos regulatorios que
están próximos (inducibles por
sustrato)
Uchiyama et al., 2005 Nat. Biotechnol. 23:88–93
Screening funcional: SIGEX 152000 clones con insertos de 7kb
1.  Construcción de library 58 clones regulados por benzoato
metagenómica 4 clones regulados por naftaleno
2.  Eliminación de clones conteniendo plásmidos expresando gfp cons2tu2vamente 3.  Selección de clones expresando gfp en presencia del inductor 4.  Aislamiento en agar de colonias separadas Uchiyama et al., 2005 Nat. Biotechnol. 23:88–93
Screening funcional: SIGEX •  El clon 2ene que contener suficiente porción del operón para ser ú2l en los subsiguientes estudios funcionales, pero no debe tener la porción terminal del operón que lleve una señal de terminación de la transcripción REDUNDANCIA EN LA LIBRARY •  La maquinaria regulatoria que reconoce el promotor y el sustrato deben estar presentes y ser funcionales en el huésped USO DE OTROS HUESPEDES •  Hay genes que se ac2van por efectores que no son sustratos •  Los genes regulatorios y catabólicos pueden estar alejados •  No siempre los genes catabólicos se inducen por sustratos Uchiyama et al., 2005 Nat. Biotechnol. 23:88–93
Screening funcional: PIGEX Los clones positivos
para amidasa catalizan
la conversión de
benzamida a benzoato
se induce la
expresión del
gen reportero
El benzoato activa
el regulador
transcripcional
BenR, que activa el
promotor benA
gfp
Uchiyama & Miyazaki 2010 Appl. Environ. Mirobiol. 76, 7029–7035
Screening funcional: PIGEX 96,000 clones
11 amidasas, 3 nuevas
96 wells c/100 clones de una library de fósmidos (x100)
1.  Capacidad de distinguir entre sustrato y producto
2.  Ausencia de inductores endógenos
3.  Los productos generados por la amidasa deben ser
inertes in vivo para asegurar constante inducción del
sensor
sensor cells were in log phase
Uchiyama & Miyazaki 2010 Appl. Environ. Mirobiol. 76, 7029–7035
Screening funcional: METREX El desarrollo de un ensayo intracelular para pequeñas moléculas se basó en un sistema que se encontrara en organismos y ambientes diversos y respondiera a una variedad de moléculas Moléculas que inducen quorum sensing Proceso de comunicación inter-­‐celular mediado por pequeñas molécula que le permite a las bacterias sensar su propia densidad celular Variaciones estructurales en inductores de QS sirven para regular específicamente muchas funciones ecológicamente relevantes, tales como formación de biofilms, luminescencia, virulencia y producción de an2bió2cos Screening funcional: METREX METabolite Regulated EXpression El biosensor que detecta los clones ac2vos está dentro de la misma célula que el DNA metagenómico Activador
transcripcional
Williamson et al. 2005 Appl. Environ. Microbiol 71, 6335-6344
Posibles causas de la falta de expresión •  Diferencias en el uso de codones •  Falta de reconocimiento del promotor •  Falta de factores de iniciación •  Folding inadecuado •  Formación de cuerpos de inclusión •  Ruptura enzimá2ca del producto •  Toxicidad •  Incapacidad de secreción del huésped Uso de vectores con amplio rango de huésped Feno2pos asociados con la producción de moléculas pequeñas (an2bió2cos, pigmentos, morfología alterada)
•  Agrobacterium tumefaciens •  Burkholderia graminis •  Caulobacter vibrioides •  Escherichia coli •  Pseudomonas pu5da •  Ralstonia metallidurans antibact en R
metallidurans
antibact
en E. coli
antibact en R
metallidurans
Pigmento
en P putida
antibact
en E. coli
Pigmento en A
tumefaciens
Wrinkle en A
tumefaciens
Pigmento en R
metallidurans
Mínima superposición de clones Craig et al., 2010 Appl. Environ. Microbiol. 76, 1633-1641
Expresión de DNA metagenómico en otras Proteobacterias Craig et al. 2011 Curr. Op. Biotechnol, 22:465–472
Screening basado en homología La aplicación de estrategias basadas en homologías implica el diseño de sondas de DNA o primers derivados de regiones conservadas de genes •  Hibridación •  PCR •  Síntesis Microbioma especializado en actividad hidrolítica
Celulasa
Hess et al., (2011) Science 331, 463-467
Screening basado en homología 268 gigabases
27,775 genes putativos, activos para carbohidratos
90 candidatos amplificados por PCR
12% de los 27,755 genes tienen
51 con actividad celulolítica
75% identidad con genes en NCBI-nr
43% de los genes menos 50% de
identidad con proteínas conocidas
Hess et al., (2011) Science 331, 463-467
Metagenómica sinté9ca http://www.cazypedia.org/index.php/Glycoside_Hydrolases
Despolimerización de material celulósico
Algaier et al. PLoS ONE 5: e8812 (2010)
Enriquecimiento en bioreactor Incubación: 31 días
termofílica
Auto
calentamiento
maduración
Cambio en el perfil taxonómico Análisis de correspondencia del microbioma Los genes involucrados o asociados al metabolismo
lignocelulósico no contribuyen suficientemente a la
señal funcional en este tipo de análisis global
Hábitat
lignocelulósico
SIP/metagenómica Es una forma de caracterizar (y
enriquecer) miembros
ecológicamente relevantes de
una comunidad, y sus funciones
metabólicas, aunque no sean
numéricamente dominantes
SIP/metagenómica genes codificantes para la
glicerol deshidratasa
dependiente de coenzima B12
Frecuencia de detección:
2.1X - 3.8X mayor
Schwartz et al. 2005 World J Microbiol Biotechnol 22, 363-368
SIP/metagenómica SIP/metagenómica Pocas enzimas descubiertas por metagenómica son usadas en procesos biotecnológicos Expresión de la proteína pura en can2dades suficientes a un costo razonable Baja frecuencia de clones que son posi2vos en las bibliotecas metagenómica Acceso a exper5se en bioinformá2ca Métodos complementarios Warnecke & Hugenholtz, Genome Biology 2007, 8:231
NGS: Secuenciación paralela masiva Next Genera2on Sequencing •  Masiva por la capacidad de secuenciar tanto ADN •  Es masiva porque se puede hacer en paralelo 60
Pirosecuenciación (454 / Roche) 61
Pirosecuenciación (454 / Roche) DNA Library Prepara2on 4.5 hours emPCR 8 hours Sequencing 7.5 hours • Well diameter: average 44μm • 400,000 reads obtained in parallel • A single cloned amplified sstDNA bead is deposited per well • 4 bases (TACG) cycled 100 2mes • Chemiluminescent signal genera2on • Signal processing to determine base sequence and quality score Source :454 Sequencing © Roche Diagnos2cs Pirosecuenciación (454 / Roche) Pirosecuenciación (454 / Roche) 1.  ePCR produce ar2ficialmente secuencias replicadas Gomez-Alvarez et al., ISME J (2009) 3, 1314–1317
2. Problemas en correlacionar la intensidad de luz producida con el número de nucleó2dos en homopolímeros (corrimientos de marcos de lectura para CDs) Terminador reversible (Illumina) 65
Métodos de estudios metagenómicos Gilbert & Dupont Annu. Rev. Mar. Sci. 2011. 3: 347–371
Literatura Simon & Daniel. Metagenomic Analyses: Past and Future Trends. Applied and Environmental Microbiology 2011, 77: 1153-­‐1161 (lectura obligatoria) Taupp et al. The art and design of func2onal metagenomic screens. Current Opinion in Biotechnology 2011, 22: 465-­‐472 Ekkers et al. The great screen anomaly—a new fron2er in product discovery through func2onal metagenomics. Applied Microbiology and Biotechnology 2012 93:1005–1020 Iqbal et al. Biocatalysts and small molecule products from metagenomic studies. Current Opinion in Chemical Biology 2012, 16:109-­‐116