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1 NUEVAS PAUTAS PARA EL DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DE LA HIPERPLASIA SUPRARRENAL CONGÉNITA A. Belgorosky, M.A. Rivarola, G. Guercio, R. Marino Servicio de Endocrinología Hospital de Pediatría Garrahan Pozos 1881 Buenos Aires, Argentina 1245 INTRODUCCION La hiperplasia suprarrenal congénita (HSC) está constituida por un grupo de alteraciones hereditarias autosómicas recesivas de alguna de las 5 enzimas requeridas para la síntesis de cortisol en la corteza suprarrenal. La alteración más frecuente es la deficiencia de la 21-hidroxilasa, que está presente en más del 90 % de los casos. La forma severa (clásica) de la deficiencia de 21-hidroxilasa se presenta en dos formas clínicas: una combinación de deficits de cortisol y aldosterona, llamado forma perdedora de sal, y otra, forma virilizante simple sin deficiencia de aldosterona. En ambas formas existe un incremento anormal de la síntesis de andrógenos suprarrenales y en los precursores esteroideos previos al bloqueo de la síntesis, que es secundario a un desenfreno de corticotrofina (ACTH) [1, 2]. Este incremento de los andrógenos suprarrenales cuando están presentes durante la vida fetal generan genitales externos ambiguos en el feto femenino afectado. Además, existe una forma moderada (no clásica) que suele asociarse con signos post natales de exceso de andrógenos [2]. La 21-hidroxilasa es una enzima del tipo citocromo P-450 [3, 4], localizada en el retículo endoplásmico. En el camino biosintético del cortisol, en la zona fasciculata de la corteza suprarrenal, la 21-hidroxilasa cataliza, la conversión de 17hidroxiprogesterona en 11-desoxicortisol, y en el camino biosintético de la aldosterona, en la zona glomerulosa, la conversión de progesterona en 11-desoxicorticosterona (Figura 1). El gen CYP21 está localizado en el cromosoma 6p21.3 dentro de la zona del complejo de histocompatibilidad HLA que es altamente polimórfico (Figura 2). En el genoma humano existen dos lugares (loci) 21-hidroxilasa, un gen funcional, llamado formalmente CYP21A2 (P450c21B) y un pseudo gen no funcional, llamado formalmente CYP21A1 (P450c21A). Estos dos loci están duplicados en tandem junto con los loci C4A y C4B que codifican para cuarto componente del complemento del suero [4-6]. Además, otros genes duplicados se han descripto en este locus, tales como, entre otros, TNXB que codifica para la tenascina X y TNXA, que es su pseudo gen correspondiente (Figura 2) [7]. 2 ADRENAL STEROIDOGENESIS Cholesterol P450 scc Pregnenolone 3 HSD P450 c 17 17OH Pregnenolone P450c21 DOC P450c11 Aldosterone P450c11 Cortisol P450 c 17 3 HSD P450 c 17 DHEA Progesterone 17OH Progesterone P450c21 11Desoxicortisol P450 c 17 3 HSD Androstenedione FIGURA 1. Esquema de la esteroidogénesis suprarrenal. A partir del colesterol se muestran los tres caminos principales de la biosíntesis que se realizan en tres zonas diferenciadas de la glándula. La vía horizontal superior esquematiza el camino de la pregnenolona hsata la aldosterona que tiene lugar en la zona glomerulosa y en el que interviene la 21hidroxilasa (P450c21, en rojo). La pregnenolona se hidroxila en el C17 (P450c17, en celeste) en la zona fasciculata y sigue la vía horizontal media, el camino hasta la síntesis de cortisol, que también requiere de la 21hidroxilasa. En la zona fasciculata, la segunda función enzimática de la P450c17, la escisión de los C20 y C21 de la cadena lateral de la molécula, genera los andrógenos, especialmente la androstenodiona. Por fin, la vía vertical en el extremo izquierdo, representa el camino hacia la DHEA y, eventualmente, la DHEAS, propio de la zona fetal (en la vida fetal) y de la zona reticularis en la vida postnatal. La deficiencia de la 21-hidroxilasa disminuye la síntesis de cortisol y genera un sobre estímulo de ACTH que hiperplasia la glándula y estimula la secreción de los esteroides situados antes del bloqueo, tales como la 17hidroxiprogesterona, cuyos niveles séricos son útiles para el diagnóstico y los andrógenos, que condicionan parte de la sintomatología. En las deficiencias graves no se produce suficiente aldosterona (pérdida de sodio y acumulación de potasio), hay hipovolemia por deshidratación severa. En los primeros meses de la vida las crisis de insuficiencia suprarrenal suelen ser mixtas, mineralo y glucocorticoideas. En los pacientes tratados, las crisis, inducidas por situaciones de stress, son predominantemente glucocorticoideas. 3 C4/CYP21 LOCUS HLA Class I HLA Class II HLA Class III ZA C4A YA 21A XA ZB C4B YB 21B XB FIGURA 2. El complejo locus de la 21-hidroxilasa en la región del HLA, en el cromosoma 6. Los dos genes 21A (pseudogen) y 21B (gen activo) en amarillo, en tandem con los genes C4A y C4B del complemento, en rosa. También existen otros genes, como el TNXB que codifica para la tenascina X y TNXA, que es su pseudo gen correspondiente, que se transcriben en la dirección opuesta. Los genes CYP21 contienen 10 exones (Figura 3), una longitud aproximada de 3.4 Kb y difieren entre sí en solamente en 87/88 bases [6, 7]. El 75 % de esas diferencias representan mutaciones deletéreas presentes en el pseudo gen que pueden transferirse al CYP21A2 en los llamados “eventos de conversión génica”. Estas “mutaciones puntuales” pueden afectar solamente una base, o un pequeño número de bases continuas, y ubicarse en los exones o los intrones. Se han descripto un gran número de ellas (Figura 3). En otros casos las conversiones afectan segmentos mayores del gen, por ejemplo, aproximadamente el 20 % se deben a recombinaciones meióticas secundarias a un entrecruzamiento desigual durante la meiosis que deleciona un segmento de 30 Kb. Esta deleción transcribe un pseudo gen no functional, quimérico [8] (Figura 4). 4 POINT MUTATIONS IN CYP21 GENE AGGGas G178A I172N In2 delE 196 L300F V281G L363W G424S R426H GT CTds GT GDds R316X Q318X AGGGas W22X H28+C P30Q G64E 141deIT 1 P30L 10bp del (330 -333) I172N AGGGas GTATds In2 TGC AC169 K74X G90V Y97X 8bp del 2 3 In2 4 CIEx6 5 6 delA246 L261P Q262X G291C G291S W302X 306 T ins 7 V304M V281L P105L SW SV R341X R354C R354H R356Q R356P R356W A362V 16bp dupl (393 -397) 8 9 R339H L317M G375S E380D R408C R843 fs R483P W405X 10 R435C P453S LO FIGURA 3. Esquema del gen de la 21-hidroxilasa (CYP21A2), con sus 10 exones, mostrando la localización de las mutaciones puntuales más frecuentes. No se muestran las grandes deleciones y conversiones, generadas por eventos anormales en la meiosis, con participación del pseudo gen. Las mutaciones que producen las formas clínicas de aparición temprana (clásicas), en sus variantes de pérdida salina (SW), en amarilo, y virilizante simple (SV), en celeste, se muestran en la parte superior, mientras que las mutaciones que producen las formas clínicas de aparición tardía (LO, no clásicas), en verde, se muestran en la parte inferior. Las mutaciones puntuales de las diferentes formas clínicas, descriptas en rojo, son las de mayor frecuencia en la población argentina [13]. 5 CYP21 LARGE GENE DELETION AND LARGE GENE CONVERSION NORMAL ARRANGEMENT CYP21 P C4B CYP21 LARGE GENE DELETION CYP21 LARGE GENE CONVERSION C4B CYP21 P CYP21 P CYP21 CYP21 FIGURA 4. Esquema que muestra en forma simplificada mecanismos teóricos que pueden llevar a groseras alteraciones del gen CYP21A2, por intercambios anómalos con el pseudogen CYP21A1 que ocurrirían en el crossing-over durante la división meiótica. El dibujo horizontal superior representa la secuencia de exones e intrones de los genes (ADN), en el sector del pseudo gen, con sus 10 exones en color púrpura, a la izquierda, unidos al gen del complemento C4A (en celeste), que lo separa del gen activo CYP21A2, en verde a la derecha, también con sus 10 exones. El dibujo horizontal central esquematiza un ejemplo de una gran deleción, con pérdida de varios exones en el extremo 3 del pseudo gen y también varios exones del extremo 5 del gen activo. Finalmente, el dibujo horizontal inferior esquematiza una conversión génica amplia en la que una parte del gen activo es reemplazada por el pseudogen. Estas grandes deleciones/conversiones del CYP21A2 generan una grave deficiencia enzimática con ausencia de la función de la enzima, y son relativamente frecuentes dentro de las formas clásicas de la HSC. La identificación de diversas mutaciones del gen CYP21A2, llevó lógicamente a evaluar la posible existencia de correlaciones genotipo-fenotipo en la HSC (9-13). Está claro que hay una correlación entre las mutaciones que producen ausencia de la proteína o que generan proteínas inactivas, y aquellas con baja actividad enzimática o moderada deficiencia, y el cuadro clínico (14-16). Para interpretar adecuadamente la correlación genotipo-fenotipo hay que tomar en cuenta que lo que más define el fenotipo es el grado de deficiencia del alelo deficitario con mayor actividad enzimática. De todas formas, algunas mutaciones, como Intron 2 o I172N, pueden dar cuadros clínicos diferentes. En la Figura 5 se muestran la frecuencia de las mutaciones en la población argentina en las 6 formas clásicas y no clásica de la HSC. En general difiere poco de la de otras poblaciones descriptas. El estudio de las mutaciones tiene valor diagnóstico confirmatorio de la enfermedad en diversas situaciones clínicas, en especial en el hirsutismo de la mujer post menárquica, y es utilizada en el diagnóstico pre-natal. CYP 21 GENE MUTATION IN ARGENTINE POPULATION (Dardis et al J Pediatr Endocrinol Metab . 1997 / Marino et al. XVI SLEP, Cancún , Mexico, 2003 Classical Forms 30 Non-classical Form 70 28,1 60,2 60 25 50 % 17,2 40 % 15,1 15 12 11,5 30 10 20 11,4 ND 1,1 P30L 1,1 In2 -Q318X In2 -V281L 1,1 V281L R356W 2,3 1,1 I172N 0 Q318X ND V281L -Ex3 V281L -R356W -Q318X In2 -Ex3 CL EX6 -R356W 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 11,4 6,8 3,4 In2 10 In2 -V281L 2,1 1,6 In2 -Q318X CL EX6 EX3 1 R356W I172N In2 DEL OR CONV 0 Q318X 1 V281L 5 3,1 R483fs 4,7 DEL OR CONV 20 ) Figura 5. Se muestra la frecuencia de las mutaciones del gen CYP21A2 en un estudio de la población argentina. En el panel izquierdo se muestran las mutaciones de las formas clásicas (de iniciación prenatal) Se observa que las deleciones/conversiones (17.2 %), Intrón 2 (29.1 %), Q318X (11.6 %) e I172N (16.1 %) son las mutaciones más frecuentes. En el panel derecho se muestran las mutaciones no clásicas, de aparición habitual después de la adolescencia. La mutación V281L (60.2 %) es, por lejos, la más frecuente. 7 CRECIMIENTO CORPORAL LINEAR EN LA HSC En los pacientes con HSC, la altura final alcanzada suele ser un problema importante. Un tratamiento insuficiente, con el exceso de andrógenos consiguiente, produce una aceleración del crecimiento durante los primeros años, pero merced a un avance exagerado de la maduración esquelética, lleva una fusión prematura de los cartílagos de conjugación y baja talla final. Además de este problema, algunos pacientes con HSC pueden quedar bajos a pesar de haber recibido tratamiento adecuado. El mecanismo de este fenómeno no es claro. Se discutirá este problema enfocando el tema, primero en el crecimiento lineal, y segundo en el sistema GH-IGF en pacientes con HSC. La talla adulta final que se alcance en un paciente tratado con corticoides durante la pre-pubertad por muchos años depende de varios factores: la dosis de glucocorticoides utilizada, el grado de control hormonal alcanzado (nivel de la supresión androgénica), la edad a la que se inició la terapia con glucocorticoides, asociada o no a mineralocorticoides, y el cumplimiento de la indicación por parte del paciente o su familia [17-20]. La Figura 6 enfatiza la relación de equilibrio que existe entre la dosis de glucocorticoides y la secreción de andrógenos suprarrenales. CLASSICAL CONGENITAL ADRENAL HYPERPLASIA : linear growth adrenal androgens OPTIMAL ADULT HEIGHT Figura 6. La figura expresa que para llegar a la altura final óptima es esencial que los pacientes con HSC reciban una dosis, que debe ser por un lado suficiente alta como para inhibir la secreción anormal de andrógenos suprarrenales, y por otro suficientemente baja como para no producir efectos adversos similares a los del síndrome de Cushing, entre ellos retardo de crecimiento y sobrepeso. 8 Un meta-análisis de los datos, de 18 Centros mostró que la media pesada del score de desvio estándar (SDS) de la talla final (TF) en 561 pacientes fue -1.37, mientras que la media pesada del SDS de la talla blanco (TB) calculada de la talla parental, disponible en 204 pacientes fue -1.21. No se encontraron diferencias de sexo [20]. En el estudio retrospectivo multicéntrico de Muirbead y co. [19], la distribución de la TF, corregida por el potencial genético, en 42 pacientes con HSC estuvo corrida a la izquierda, y 21.4 % de los pacientes estaban por debajo o iguales a -2 SDS de rango blanco. Debido a que hay mucha heterogeneidad en el enfoque terapéutico de esta enfermedad, y a que en la mayoría de los casos los estudios son análisis retrospectivos, es difícil discernir, en el seguimiento, el peso de cada variable implicada en la TF, en la HSC. Sin embargo, parece haber consenso en considerar al diagnóstico temprano, las dosis adecuadas de glucocorticoides utilizadas y el cumplimiento por parte del paciente, parecen mejorar el resultado final. 180 Height (cm ) Girls 2SD o o+ 160 - 2SD B4 140 HC treatment compliance : 120 B2 good 100 lack 80 60 40 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Age Figura 7. Se muestra la curva de estatura de una niña con HSC en tramiento. Durante los primeros 4 años la estatura (en verde) se mantuvo alrededor del 50 percentilo y la edad ósea (línea horizontal) coincidía con la edad cronológica. Por razones familiares, el tratamiento se hizo irregular a partir de entonces. Se observa la aceleración del crecimiento (en naranja) que superó el 90 percentilo, y la aceleración de la maduración ósea que ensombrece el pronóstico de talla final. Simultáneamente, se inició la pubertad gonadal prematuramente, evidenciada por la aparición de mamas en estadío 2 de Tanner (B2) a los 6 años, que progresaron hasta estadío 4 a los 8 años de edad. 9 En la Figura 7 se muestra un ejemplo de seguimiento en un paciente que tuvo un período de buen tratamiento durante los primeros 4 años de su vida y una falta de cumplimiento entre los 4 y 10 años de edad, documentándose los efectos de un tratamiento insuficiente. La causa de la baja estatura en los pacientes con HSC es parcialmente desconocida. Por una parte, un exceso de andrógenos durante largo tiempo es un factor de riesgo para la estatura baja debido al avance en la maduración epifisaria con cierre prematuro epifisario, como se muestra en el ejemplo, y a la inducción de pubertad precoz central. En la HSC, este último fenómeno se observa con frecuencia cuando se demora la iniciación del tratamiento o cuando no hay cumplimiento del mismo [21, 22]. Por otra parte, el sobre-tratamiento con glucocorticoides es también un factor de riesgo para la talla baja, ya que se inducen transtornos en el sistema GH-IGF, en la absorción de calcio en el intestino y en el riñon, y en la función del cartílago de crecimiento [23]. En relación a la dosis de glucocorticoides, se han descripto tres períodos de edad especialmente susceptibles: 1) entre 6 y 12 meses, 2) entre 8 y 10 años, 3) durante el empuje puberal de crecimiento [18, 19, 24, 25]. No hay dudas de que los pacientes con pérdida de sodio deben ser tratados con mineralocorticoides. La necesidad de continuar con mineralocorticoides durante toda la prepubertad debe ser analizada en base a los niveles de renina y la presión arterial. Finalmente el uso de análogo de GnRH para el tratamiento de la pubertad precoz central, eventualmente combinado con terapia con rhGH puede ser útil para mejorar la talla final en algunos pacientes [27]. Recientemente el grupo de la Dra. Maria New, de New York, ha publicado datos de talla final, en 14 de estos pacientes [28], combinando una media de 4.4 años de tratamiento con rhGH con 4.2 años de tratamiento análogo de GnRH, obtienen un incremento medio de 1 SDS en los pacientes tratados, comparados con el grupo control. EL EJE GH-IGF La relación entre la GH y el cortisol es dinámica, y se ha publicado que existe una interacción bidireccional entre el eje GH-IGF y el eje hipotalámico-hipófiso-adrenal [29, 30]. También se ha descripto que hay una correlación positiva entre las secreciones espontáneas de cortisol y GH, y la modulación de IGFBP-1, IGFBP-2 e IGFBP-3, en niños normales [31]. La información sobre el sistema GH-IGF-1 en la HSC es escasa. Charmandari y co. [32] demostraron que los niños con HSC tienen un patrón de secreción de GH más regular, hay más sincronización secretoria dinámica entre la GH y el cortisol que sus contraparte normales. Probablemente esto sea el resultado de la administración exógena de hidrocortisona a dosis fijas y intervalos de tiempo específicos. Si bien la secreción de 24 horas de GH no estaba elevada en comparación con el grupo control, estos resultados necesitan ser confirmados ya que el grupo control estaba formado por pacientes con talla baja idopática con velocidad de crecimiento normal. No está establecido claramente en la HSC cuales son los valores de IGF-1 del suero [32-35]. En la publicación de Charmandari y co. [32], los pacientes con HSC tenían valores elevados de IGF-1 en el suero, pero la relación IGF-1/estatura no cambiaba. Sin embargo el valor biológico de esta relación no está establecido. Cavallo y co. [33] han descripto que los valores de IGF-1 del suero eran muy variables e inconsistentes con el control del tratamiento en los pacientes con HSC. Sin embargo, siendo conocido que los niveles altos de andrógenos pueden asociarse con niveles elevados de IGF-1, es dable esperar que los sujetos con HSC tratados con dosis sub- 10 óptimas de glucocorticoides, y por ende con andrógenos altos, tengan valores altos de IGF-1 e IGFBP-3. Ha sido descripto que los pacientes con HSC en tratamiento no tienen adrenarca [36]. Para explicarlo, ha sido propuesto que la terapia convencional con corticoides impide el proceso de maduración de los andrógenos suprarrenales. También se ha publicado que los niños con HSC tienen niveles altos de leptina e insulina en el suero y un aumento del índice de resistencia a la insulina [37]. Se ha propuesto que estos efectos sean secundarios a una hipofunción crónica de la médula suprarrenal durante la terapia con glucocorticoides. Nosotros hemos propuesto la hipótesis de que la inhibición de la DHEAS inducida por el tratamiento con glucocorticoides en la época de la adrenarca, podría influenciar el sistema al GH-IGF-1 y a la sensibilidad a la insulina (Guercio et al., enviado a publicar). Finalmente nuestro desafío como endocrinólogos pediatras es profundizar nuestros conocimientos en los factores aún no contemplados que podrían ser beneficiosos para mejorar el pronóstico de talla adulta. Cabe señalar que aún no disponemos de un consenso claro y preciso de las variables que deben ser contempladas para este fin. REFERENCIAS 1. White PC, New MI, Dupont B. Congenital adrenal hyperplasia. N Engl J Med 316:1519-24, 1580-6, 1987. 2. White PC, Speiser PW. Congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency. Endocr Rev 21:245-91, 2000 3. Miller WL, Levine LS. Molecular and clinical advances in congenital adrenal hyperplasia. J Pediatr 111:1-17, 1987 4. Nebert DW, Gonzalez FJ. 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