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XIII Jornadas Científicas de Biomedicina y Biotecnología Molecular
XIII Biomedicine and Molecular Biotechnology Scientific Meetings
DETERMINACIÓN DEL ESTADO DE METILACIÓN DE UNA ISLA CPG
CERCANA A LA REGIÓN PROMOTORA DEL GEN HSA-MIR-29C MEDIANTE LA
TÉCNICA HIGH RESOLUTION MELTING (HRM) EN PACIENTES CON
OSTEOARTRITIS DE RODILLA.
AUTORES: Emma Xochitl Rojas Toledo, Verónica Marusa Borgonio Cuadra, Rosa María RibasAparicio, Antonio Miranda Duarte.
DIRECCIÓN: Laboratorio de Biología Molecular, servicio de Genética del Instituto Nacional de
Rehabilitación (INR), Email: [email protected]
INTRODUCCIÓN
La metilación del DNA en dinucleótidos CpG es uno de los mecanismos epigenéticos implicados en
la regulación de la expresión génica. Patrones diferenciales de metilación en islas CpG en genes
que codifican para microRNAs son de gran interés debido a que estas moléculas tienen capacidad
para degradar el mRNA. Recientemente la técnica de High Resolution Melting (HRM) se ha utilizado
para evaluar regiones metiladas con base en las propiedades de fusión del DNA. Esta técnica es
altamente sensible y específica. Su implementación en muestras de pacientes con osteoartritis
(causa principal de discapacidad osteomuscular a nivel mundial), es de importancia ya que
representa un excelente método para evaluar nuevos biomarcadores. El objetivo del trabajo es
determinar el estado de metilación de una isla CpG ubicada cerca de la región promotora del gen
hsa-miR-29c en muestras de DNA de pacientes control y pacientes con osteoartritis (OA) de rodilla.
MATERIALES Y MÉTODOS
La búsqueda de islas CpG en la región promotora del gen hsa-miR-29c y la conversión virtual con
bisulfito se realizó mediante el software Meth primer y se diseñaron los iniciadores. Para realizar las
curvas de metilación se utilizó el kit EpiTec PCR Control DNA. La conversión con bisulfito de sodio
de 26 muestras de DNAg (8 controles y 18 casos) se realizó con el kit EpiTect Bisulfite. Los ensayos
de HRM se realizaron utilizando el kit EpiTect HRM-PCR y el equipo Rotor Gene de Qiagen.
DESARROLLO
Se buscó la secuencia de la región promotora del gen hsa-miR-29c y se ubicó la isla CpG, se convirtió
la secuencia virtualmente con bisulfito y se diseñaron los iniciadores para HRM, los cuales se
probaron utilizando controles de DNA. Se realizaron las curvas de metilación a diferentes porcentajes
(100, 75, 50, 25 y 0 %) por triplicado. Se realizó un ensayo con 26 muestras de DNA convertido con
bisulfito al duplicado, obteniéndose el análisis de HRM para cada muestra.
RESULTADOS
El estado de metilación se monitoreo en una isla CpG de 172 pb, los iniciadores diseñados amplifican
una región de 119 pb dentro de la isla. El análisis de HRM permitió observar que tanto las muestras
de pacientes control como de pacientes con OA presentaban un porcentaje de metilación de
alrededor del 75%.
DISCUSIÓN
Los iniciadores diseñados fueron adecuados para el análisis de HRM, permitiendo evaluar el estado
de metilación de la región de interés.
CONCLUSIONES
Se logró observar que tanto muestras de DNA de pacientes control como de pacientes con OA de
rodilla presentan un estado de metilación del aproximadamente el 75% en la región promotora del
gen hsa-miR-29c.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 1. Wojdacz TK, Dobrovic A. 2007: Methylation-sensitive high
resolution melting (MS-HRM): a new approach for sensitive and high-throughput assessment of
methylation, Nucleic Acids Res, 35:e41.
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