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FERMENTACION DE FRUCTOOLIGOSACÁRIDOS (FIBRAS DIETÉTICAS)
POR BACTERIAS DEL TRACTO GASTROINTESTINAL
Patricia Martínez*, L. Mayorga, A. Roldán, A. Azaola, E. Barranco, P. Bustamante
Departamento de Sistemas Biológicos, CBS. Universidad Autónoma Metropolitana
Xochimilco. Calzada del Hueso 1100, Col. Villa Quietud, C.P. 04960, México, D.F.
*e-mail: [email protected]
RESUMEN
Los microorganismos del tracto gastrointestinal humano juegan un papel determinante en la salud del
huésped, debido a la interacción que existe entre las distintas bacterias que lo habitan. En niños recién
nacidos amantados, las bacterias amigables son dominantes debido a que la leche materna contiene
sustancias que estimulan el crecimiento de las mismas. Sin embargo, su número disminuye con el cambio
de dieta por lo que es necesario llevar a cabo mayores estudios para evaluar el efecto de fibras no
asimiladas por el organismo humano (fibras dietéticas) pero si por las bacterias amigables intestinales.
Nuestro objetivo fue determinar la población bacteriana a partir de las heces de un recién nacido amantado,
utilizando fructooligosacáridos (fibras dietéticas funcionales) y glucosa como fuentes de carbono en
presencia y ausencia de oxígeno. Nuestros resultados mostraron que el empleo de fibras funcionales
dietéticas estimularon el crecimiento de bacterias amigables, particularmente bifidobacterias, sobre todo
cuando se producen bajo condiciones anaerobias, mientras que los lactobacilos incrementaron su población
empleando glucosa, lo que es de gran importancia debido a los efectos benéficos que éstas presentan para la
salud. Por otro lado, microorganismos potencialmente patógenos como las enterobacterias, Clostridium y
estafilococos mostraron un crecimiento limitado.
Palabras clave: fibras dietéticas, fructooligosacáridos, bacterias amigables, bifidobacterias.
1. INTRODUCCIÓN
Los microorganismos contenidos en el intestino humano constituyen un ecosistema donde muchas
especies distintas de bacterias participan en ciclos vitales interrelacionados. En la actualidad se sabe que
al menos 50 géneros bacterianos residen en el tracto digestivo, lo que implica 10 12 bacterias por cada
gramo del intestino4. El aparato gastrointestinal del recién nacido es inoculado por la flora vaginal y fecal
de la madre durante el nacimiento16, inicialmente predominan especies de Escherichia coli o
Enterococcus17, 9. Sin embargo, se ha reconocido que existen diferencias con respecto a la composición
microbiana del intestino debido a la alimentación del infante, en este sentido, los Lactobacillus y
Bifidobacterium tienen mayor incidencia cuando los niños son alimentados con leche materna con solo
aproximadamente el 1% de Enterococcus. En contraste, cuando los infantes son alimentados con leche de
fórmula, la composición bacteriana gastrointestinal es más variada, con Bifidobacterium, Bacteroides,
Clostridium y Streptococcus9. Después del destete, los microorganismos intestinales presentan un patrón
que se asemeja a la flora del adulto en la cual las especies que predominan son Bacteroides, Eubacterium
y Streptococcus14. Dentro de los microorganismos del tracto gastrointestinal, existen especies patógenas
como Clostridium, Enterococcus y Estafilococcus que son capaces de generar daño hepático,
infecciones, cáncer y diarrea entre otros efectos dañinos. Sin embargo, otras especies bacterianas como
Bifidobacterium y Lactobacillus, son capaces de inhibir el crecimiento de bacterias exógenas patógenas,
estimular la respuesta inmune, favorecer la digestión y/o absorción de alimentos, restaurar la microbiota
intestinal normal durante la terapia con antibióticos y producir vitaminas 4, 3 por lo que se consideran
bacterias amigables.
Las bacterias amigables son denominadas “probióticos” y están constituidos por microorganismos vivos
que si se ingieren en cierta cantidad pueden proporcionar efectos benéficos para el huésped 1, 12, 5. Existen
sustancias que estimulan el crecimiento y la actividad de las bacterias amigables tales como las fibras
dietéticas funcionales (como los fructooligosacáridos) que son denominadas “prebióticos” y que se
encuentran en algunos vegetales. Estas fibras después de un corto periodo de ingesta, permiten la
proliferación particularmente de Bifidobacterium 2, 4, 13, 11.
En la actualidad es importante llevar a cabo mayores estudios para evaluar el efecto que ejercen las fibras
dietéticas funcionales sobre los microorganismos del tracto grastrointestinal, por lo que nuestro objetivo fue
determinar la población bacteriana en una muestra de materia fecal de un recién nacido amamantado,
llevando a cabo fermentaciones en donde se emplearon fructooligosacáridos (FOS) o glucosa como
sustratos. Los experimentos se llevaron a cabo en presencia o ausencia de oxígeno para determinar la
tolerancia de los microorganismos a éste ya que las bifidobacterias son especies que crecen en condiciones
anaerobias (sin oxígeno) o a concentraciones muy bajas de dicho elemento.
2. METODOLOGÍA
Preparación y procesamiento de las muestras fecales. Se recolectaron heces de un neonato femenino
de 2 meses de edad, nacida por parto normal y amamantada. Las heces se transportaron inmediatamente
al laboratorio donde se preparó una suspensión de heces en leche descremada al 10% en glicerol y se
congelaron a -70°C.
Cultivo. Los cultivos se adaptaron en medio TPY y se llevaron a cabo en condiciones anaerobias
administrando CO2 o microaerobias con un flujo de aire de 0.06 vvm10. Se empleó un fermentador New
Brunswik de 1 l con 500 ml de medio TPY a 100 rpm, 37°C y con 10% del inóculo. Se utilizó glucosa y
FOS (raftilina, Orafti) al 0.5% como fuentes de carbono.
Análisis de las muestras. Se tomaron muestras cada 2 hr en condiciones estériles y se les determinó el
crecimiento microbiano por densidad óptica (DO600) y el pH. Para el análisis microbiológico las muestras
se diluyeron decimalmente en tubos con 9 ml de solución peptonada y se adicionaron 100l de cada
dilución en medios selectivos: agar MRS (Bioxon) para el aislamiento de lactobacilos, agar Columbia
modificado6 para bifidobacterias,, agar estreptocel (Bioxon) empleado para el aislamiento de
estreptococos, agar Salmanitol (Bioxon) para estafilococos, agar MacConkey (Bioxon) para aislar
enterobacterias y agar DCA15 para Clostridium. Las cajas con medio Columbia modificado se incubaron
a 37º C durante 48 horas en una cámara de anaerobiosis, mientras el medio DCA se incubó a temperatura
ambiente durante 24-48 h en la cámara anaerobia. Los demás medios se incubaron a 37º C durante 24 h
en una estufa microbiológica. Los cultivos bacterianos se identificaron en base a su morfología, reacción
de Gram así como a su crecimiento en los medios selectivos en donde se contaron las unidades
formadoras de colonias (UFC) para calcular su proporción en las heces.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se comparó el pH y el crecimiento total de las bacterias contenidas en las heces empleando fibras dietéticas
funcionales (FOS) o glucosa como fuente de carbono (Fig. 1 y Fig. 2 respectivamente). Se observa que los
microorganismos crecen en prácticamente la misma proporción al emplear condiciones anaerobias o
microaerobias: el crecimiento logarítmico se presenta entre las primeras 9 horas de cultivo y posteriormente
la biomasa microbiana se mantiene casi constante (en un promedio de DO 600=2.0). Sin embargo, si se
observaron diferencias en los valores de pH ya que éste disminuyó hasta 5.1 y 5.6 con FOS (Fig. 1) y hasta
5.2 y 4.2 con glucosa (Fig. 2). Lo anterior se atribuyó a que las bacterias sintetizan ácidos orgánicos que
acidifican el medio, al respecto, existen referencias de que las bacterias amigables tienden a producir ácidos
como acetato, propionato, butirato, lactato y succinato7 , los cuáles a nivel gastrointestinal pueden limitar y/o
inhibir el crecimiento de algunas especies patógenas. Estos resultados son similares a los obtenidos por
Gibson y Roberfroid (1995)4, quienes obtuvieron un pH con glucosa de 6.08 en las primeras 6 h y
posteriormente disminuyó hasta 5.3 a las 24 h, mientras que empleando FOS alcanzaron un pH de 6 en las
primeras 6 h y a las 24 h se registró un pH de 5.5.
Por otro lado, cuando se aislaron las bacterias en medios selectivos (Fig. 3), se observó un aumento de éstas
cuando se utilizó glucosa como fuente de carbono en condiciones anaerobias exceptuando a los estafilococos
cuya población disminuyó aunque las bifidobacterias y lactobacilos crecieron en menor proporcion (49% y
76% respectivamente) que las enterobacterias y Clostridium quienes aumentaron hasta un 102% y 59%
respectivamente lo cual no es muy favorable si consideramos la importancia de las bacterias amigables y la
patogenicidad de las segundas. Sin embargo, en condiciones microaerobias con glucosa, solo crecieron los
estreptococos, lactobacilos y bifidobacterias (en un 48%, 34% y 23%), mientras que las enterobacterias y
Clostridium disminuyeron drásticamente su concentración debido a que son microorganismos anaerobios.
7
1.5
6
1
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0.5
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0
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Crecimiento (DO600 )
2
6.5
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6
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1
5
0.5
4.5
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4
0
10
tiempo (h)
Fig. 1. Cinética de crecimiento de las bacterias fecales
con FOS. Crecimiento microaerobio (□), Crecimiento
anaerobio (●), pH microaerobio (∆), pH anaerobio (▲).
pH
2
pH
Crecimiento (DO600 )
7
20
tiempo (h)
30
40
Fig. 2. Cinética de crecimiento de bacterias fecales con
glucosa. Crecimiento microaerobio (□), Crecimiento
anaerobio(●), pH microaerobio (∆), pH anaerobio (▲).
Cuando se utilizan FOS en el cultivo (Fig. 4), se favorece el crecimiento de la mayoría de las bacterias
empleando las dos atmósferas aunque es importante hacer énfasis en las condiciones anaerobias las cuáles
repercuten de manera importante en el crecimiento de bifidobacterias (64%) en relación a las enterobacterias
y Clostridium quienes incrementan su población solo en un 39% y 12% respectivamente bajo las mismas
condiciones. Los resultados generados en este estudio son similares a Rossi y col (2005) 8, quienes un
aumento del 56% en bifidobacterias empleando FOS en cultivos anaerobios.
Crecimiento (%)
120
100
80
60
40
20
En
te
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ba
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0
Fig. 3. Incremento porcentual de las bacterias fecales crecidas en cultivo con Glucosa.
Condiciones aerobias(□) , Condiciones anaerobias(■).
De acuerdo a la Fig. 5, al analizar la proporción de bacterias patógenas (enterobacterias, Clostridium y
estafilococos) en relación a las amigables (bifidobacterias y lactobacilos), se observa que aunque las
primeras crecieron en un 44% empleando glucosa en anaerobiosis, en general las bacterias amigables
tienen mayor capacidad para crecer en cultivo ya sea empleando FOS (con incrementos del 47% y 49%) o
Glucosa (donde aumentan en un 61.5% y 28%) en condiciones anaerobias o microaerobias lo que es
importante debido a los efectos benéficos en el huésped. Es importante destacar que el incremento en
biomasa cuando se emplean FOS se debe primordialmente a las bifidobacterias (Fig. 4), sobre todo
empleando condiciones anaerobias mientras que al utilizar glucosa, el aumento de bacterias amigables se
atribuye prioritariamente a los lactobacilos (Fig. 3).
70
Crecimiento (%)
60
50
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30
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ria
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Fig. 4. Incremento porcentual de las bacterias fecales crecidas en cultivo con FOS.
Condiciones aerobias(□) , Condiciones anaerobias (■).
Crecimiento (%)
70
60
50
40
30
20
10
0
FOS
anaerobio
FOS
microaerobio
Glucosa
anaerobio
Glucosa
microaerobio
Fig. 5. Crecimiento porcentual de las bacterias fecales crecidas en FOS o glucosa
en ambientes anaerobios o aerobios. Bacterias patógenas (□), Bacterias amigables (■).
4. CONCLUSIONES. Aunque el tipo de sustrato (fibras dietéticas funcionales o glucosa) así como la
atmósfera (aerobia o anaerobia) no tienen efecto en la cinética de crecimiento microbiano de las bacterias
fecales crecidas en cultivos, el pH se ve afectado ya que tiende a acidificarse sobre todo empleando glucosa.
En cuanto al crecimiento en medios selectivos, las bacterias amigables (bifidobacterias y lactobacilos)
tienden a aumentar su número en mayor proporción en comparación a las patógenas (enterobacterias,
Clostridium y estafilococos). El empleo de fructooligosacáridos (fibras dietéticas funcionales o prebióticos),
estimulan en mayor proporción el crecimiento de bifidobacterias mientras que la glucosa promueve la
proliferación de lactobacilos. Los resultados obtenidos podrían ser la base para la selección y producción de
cepas bacterianas amigables (probióticos).
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