Download diagnostico microbiologico-i - Blog de Microbiología del Hospital

Pruebas para el diagnóstico
microbiológico de las
Enfermedades Infecciosas
empleadas en la práctica clínica (I)
Dr. Juan Carlos Rodríguez Díaz
S. Microbiología
Hospital General Universitario de Elche
E-mail: [email protected]
http://blogmicrobiologiahgue.wordpress.com/
Diagnóstico microbiológico
Pretende detectar e identificar el o los
microorganismos responsables del proceso
infeccioso y eso es esencial para:
• Correcto tratamiento del paciente
• Control de la difusión del patógeno
Diagnóstico microbiológico
Métodos directos:
• Detectan al microorganismo de
obtenida del lugar de la infección:
• Examen microscópico
• Cultivo
• Detección de antígenos
• Detección de ácidos nucléicos
la
muestra
clínica
Métodos indirectos:
• Permiten detectar la presencia de anticuerpos
frente al microorganismo en el suero del
paciente
No se aplican simultanéamente sino en función del
microorganismo
Toma de muestras
La toma de muestras
seminario monográfico
se
detallará
en
un
Puedes acceder al manual de toma de muestras
en el enlace:
http://blogmicrobiologiahgue.wordpress.com/docencia/practicas-
Diagnóstico de bacterias:
Examen microscópico
La muestra clínica se deposita en un portaobjetos
Puede visualizarse:
• Sin teñir (en fresco)
• Tras un proceso de tinción
• Gram: Divide a las bacterias en:
• Gram positivos: Color violeta (Staphylococcus)
• Gram negativos: Color rojo (Escherichia coli)
• Ziehl Neelsen: Divide a las bacterias en
• Acido-alcohol
tuberculosis)
resistentes:
Color
rosa
(Mycobacterium
Examen microscópico en
fresco
Trichomonas vaginalis
Candida albicans
Examen microscópico:
tinciones
Gram positivo
Ziehl Neelsen positivo
Gram negativo
Diagnóstico de bacterias:
cultivo
Siembra de la muestra en unos medios de cultivo
con los nutrientes necesarios para que se produzca
la proliferación bacteriana.
Sus principales utilidades son:
• Más sensibilidad que la tinción
• Permite identificar a los microorganismos
• Permite estudiar su sensibilidad antibiótica
• Permite estudiar la epidemiología de la infección
y el control de posibles brotes
Características del cultivo
Se utilizan diferentes tipos de medios:
Medios básicos: Agar Mueller Hinton
Medios enriquecidos:
• AgarSangre: Streptococcus pneumoniae
• AgarChocolate(Hemina y NAD) : Haemophilus
• BCYEα (L-cisteina): Legionella
• Medios selectivos:
•
•
•
Medio Thayer Martin: Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae
Mac Conkey: Bacterias Gram negativas
TCBS: Vibrio cholerae
• Medios diferenciales o cromógenos: CHROMAgar
• Medios de enriquecimiento:
•
Caldo selenito
Tipos de medios de cultivo
Agar sangre
Agar chocolate
TCBS
Hemocultivos
Procesamiento de los cultivos
Temperatura de incubación:
• Habitualmente se incuba a 35-37ºC
• Campylobacter en heces: 42ºC
Tiempo de incubación
El tiempo habitual es 24-48 h
Hay bacterias de crecimiento lento: Brucella
Atmósferas de incubación
Bacterias
aerobias
o
Staphylococcus aureus.
anaerobias
facultativas:
Escherichia
Bacterias anaerobias: Clostridium, Bacteroides
Bacterias microaerófilas: Campylobacter, Helicobacter
Necesitan 5-10% CO2: Neisseria gonorroheae
coli,
Incubación de los medios
Incubador de hemocultivos
Atmósfera de incubación
Identificación bacteriana
Definición:
• Se basa en el estudio de la actividad bioquímica,
sensibilidad a determinadas sustancias y
crecimiento en presencia o ausencia de oxígeno
Métodos:
• Pruebas bioquímicas clásicas
• Pruebas en microplaca
Identificación bacteriana
Detección de antígenos
Definición:
• Permite demostrar la presencia de un
microorganismo en una muestra clínica a través
de la detección de sus antígenos específicos
Patógenos en los que se utiliza:
• Legionella
• Streptococcus pneumoniae
• Aspergillus
• Cryptococcus
Detección de antígenos
Definición:
• Se basa en la detección mediante métodos
inmunológicos (reacción antígeno-anticuerpo) de
algunas sustancias segregadas por el patógeno
Patógenos en los que se utiliza:
• Legionella
• Streptococcus pneumoniae
• Aspergillus
• Cryptococcus
Secuenciación del gen 16S rRNA e ITS
Definición:
• Estos dos genes están presentes en todas las
bacterias (16S rRNA) y hongos (ITS) pero su
secuencia es diferente en función de la especie
Procedimiento:
• Secuenciación de estos genes y comparación con
bases de datos internacionales (Gen Bank u
otros)
• Útil para identificar microorganismos con
identificación clásica compleja
Secuenciación del gen 16S rRNA e ITS
Espectrometría de masas (malditof)
Definición:
• Estudia el perfil proteico del microorganismo
(proteoma) mediante la comparación del perfil
con una base de datos de los microrganismos
más frecuentemente aislados
• Un rayo laser ioniza las proteinas cristalizadas y
son aceleradas por un campo electromagnético.
• Las proteinas se separan en función del tamaño
y la carga
Utilidad:
• Identificación rápida de los microorganismos
más habituales
Espectrometría de masas (malditof)
Diagnóstico de la infección
urinaria
Definición: Presencia de microoorganismos en
orina
• Cistitis: infección de vías bajas
• Pielonefritis: Infección de vías altas
Etiología más frecuente
• Bacterias de la flora intestinal:
• Escherichia coli
• Proteus
• Klebsiella
• Enterococcus
Diagnóstico de la infección
urinaria
Muestras:
• Muestra: Frasco estéril con orina recién
recogida o mantenida a 4ºC
• Adultos: Segunda parte de la micción tras
limpieza de los genitales externos
• Pacientes sondados: Pinchar la sonda con
jeringa en el lugar establecido para ello
• Niños pequeños: Bolsa colectora que debe
retirarse cada 30 minutos
Diagnóstico de la infección
urinaria
Métodos diagnósticos:
• Sedimento urinario: Es de gran valor para
valorar la calidad de la muestra y la presencia
de leucocitos
• Leucocitos sin bacterias (Cultivo negativo)
• En tratamiento antibiótico
• Uretritis por Chlamydia o Micoplasma que
no se diagnostican por los métodos
habituales
• Tuberculosis renal
Diagnóstico de la infección
urinaria
Métodos diagnósticos:
• Sistemas de cribado rápido:
• Tiras reactivas
• Detección de nitratasa bacteriana
• Detección de esterasa leucocitaria
• Recuento de lecucocitos y bacterias por
citometría de flujo de forma automatizada
Diagnóstico de la infección
urinaria
Métodos diagnósticos:
• Cultivo: Se inocula de forma cuantitativa la
orina en una serie de medios de cultivo:
• Agar sangre: Medio enriquecido para el
aislamiento de los patógenos más frecuentes
• Agar CLED y Agar Mac Conkey: Medio
diferencial que ayuda a la identificación
preliminar
Diagnóstico de la infección
urinaria
Interpretación del recuento en el cultivo:
• Debe hacerse en función de:
•
•
•
•
Forma de recogida de la muestra
Clínica del paciente
Presencia de piuria
Microorganismo aislado
• En muestras tras punción suprapúbica o
directamente del riñón: Cualquier recuento
es significativo
• Sondaje vesical: 103 bacterias/mililitro
• Bacteriuria con piuria: 103 bacterias/mililitro
• Bacteriuria asintomática: 105 bacterias/mililitro
Diagnóstico de la infección
urinaria
Medios de cultivo
Diagnóstico de la infección
urinaria
Sedimento urinario
Tiras reactivas
Citometría de flujo
Diagnóstico de la neumonía
bacteriana
•
Definición: Infección del parénquima pulmonar
• Tienen etiología muy variada en función de la
edad, del estado inmunológicos y de otros
factores
• En personas previamente sanas es frecuente:
• Streptococcus pneumoniae
• Micoplasma pneumoniae
• En personas con factores predisponentes
• Pseudomonas aeruginosa
• Staphylococcus aureus
• Enterobacterias
Diagnóstico de la neumonía
bacteriana
•
Diagnóstico de la neumonía
bacteriana
•
Diagnóstico de la neumonía
bacteriana
Cultivo:
• Muestra de esputo de buena calidad (Tinción de Gram con
presencia de leucocitos) o muestras invasivas (BAS, BAL,
cepillado bronquial)
• Cultivo en:
• Agar
sangre.
Aislamiento
de
Streptococcus
pneumoniae, Moraxella catarrhalis
• Agar Mac Conkey: Enterobacterias,
Acinetobacter
Pseudomonas y
• Agar chocolate:Haemophilus influenzae
• Medio BCYEα: Legionella pneumophila.
• BAL y Cepillado bronquial se hace cultivo cuantitativo en
Agar chocolate
Diagnóstico de la neumonía
Detección de antígenos:
Muestra a procesar:
Muestras respiratorias:
Virus respiratorio sincitial
Gripe A, gripe B
Pneumocystis carinii
Aspergillus
Orina:
Streptococcus pneumoniae
Legionella pneumophila
Diagnóstico de la neumonía
Detección de anticuerpos:
Muestra a procesar:
Suero del paciente
Estudios a realizar:
Detección de IgM
Estudio de seroconversión: Incremento de la cantidad
de anticuerpos al estudiar dos sueros del enfermo
separados 3-4 semanas
De positivo bajo a positivo alto
De negativo a positivo alto
Microorganismos: Micoplasma pneumoniae, Legionella
pneumophila, Coxiella burnetti, Chlamydophila pneumoniae
Diagnóstico de la neumonía
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR):
Muestra a procesar:
Muestras respiratorias
Estudios a realizar:
Detección del genoma del microorganismo en la
muestra
Microorganismos:
Hay sistemas de PCR múltiple que detectan muchos
patógenos
Mycobacterium tuberculosis
Gripe
Citomegalovirus
Diagnóstico de la neumonía
bacteriana
Streptococcus pneumoniae
Legionella pneumophila Mycoplasma pneumoniae
Diagnóstico de las infecciones del
sistema nervioso central
Procesos más frecuentes:
Meningitis/encefalitis
Abscesos cerebrales
La etiología de las meningitis/encefalitis puede ser
muy variada:
Bacterias:
Neisseria
meningitidis,
Streptococcus pneumoniae
Virus: Enterovirus, virus herpes 1 y 2, arbovirus
Hongos: Cryptococcus neoformans
Parásitos: Amebas de vida libre
Diagnóstico de las infecciones del
sistema nervioso central
Diagnóstico de las infecciones del
sistema nervioso central
Diagnóstico de las infecciones del
sistema nervioso central
Diagnóstico de las infecciones bacterianas:
• Tinción de Gram del LCR:
• Método rápido y orientativo de la etiología
• Cultivo del LCR:
• Confirmación de la tinción y estudio de la
sensibilidad antibiótica
• Agar sangre, chocolate y Thayer Martin
• Detección de antígenos en el LCR: Streptococcus
pneumoniae
• Reacción en cadena de la polimerasa: S. pneumoniae,
Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes,
Mycobacterium tuberculosis
• HEMOCULTIVO
Diagnóstico de las infecciones del
sistema nervioso central
Diagnóstico de las infecciones viricas:
• Los cultivos celulares son técnicas complicadas y
lentas
• Reacción en cadena de la polimerasa:
• Enterovirus
• Herpes 1 y 2
• Varicella
• Virus JC
• Arbovirus
Diagnóstico de las infecciones del
sistema nervioso central
Diagnóstico de las infecciones fúngicas:
La etiología más frecuente es Criptococcus
neoformans
Procedimiento diagnóstico:
Cultivo en agar saboureaud
Detección de antígeno en LCR y sangre:
Criptolatex
Diagnóstico de las infecciones parasitarias:
Toxoplasma: Detección del genoma por PCR
Amebas de vida libre:
Tinción
Cultivo
PCR
Diagnóstico de las infecciones del
sistema nervioso central
Diagnóstico serológico:
La búsqueda de anticuerpos en LCR es una
técnica útil en algunos casos
Neurobrucelosis: Rosa de bengala y aglutinación
Neurosífilis: VDRL
Sarampión: Presencia de Ac de producción intratecal
Es imprescindible analizar los resultados con un estudio
de los mismos marcadores en suero para:
Confirmar la infección por el patógeno
Confirmar
la
integridad
de
la
barrera
hematoencefálica mediante el estudio del cociente
entre la albúmina o la IgG entre suero y líquido
Diagnóstico de la meningitis
bacteriana
Streptococcus pneumoniae
Neisseria meningitidis
Listeria monocytogenes
Diagnóstico de las enfermedades
del tracto genital
Patógenos más importantes:
Diagnóstico de las enfermedades
del tracto genital
Patógenos más importantes:
Diagnóstico de las enfermedades
del tracto genital
Diagnóstico de Treponema pallidum (sífilis)
• Sífilis primaria: Observación del Treponema pallidum
(chancro):IFD ,tinción con plata ,Campo oscuro
• Diagnóstico serológico:
• Pruebas no treponémicas: RPR y VDRL
• Pruebas treponómicas: TPHA (aglutinación) , FTA
(inmunofluorescencia), ELISA IgG e IgM
• Criterios:
• Todos los resultados positivos de pruebas no
treponémicas deben ser confirmados por
pruebas treponémicas
• En caso de sospecha de sífilis primaria o
terciaria, hay que hacer siempre una prueba
treponémica
Diagnóstico de las enfermedades
del tracto genital
Diagnóstico de Neisseria gonorrhoeae (gonorrea)
• Cultivo en agar Thayer Martin
• Tinción de Gram: en el hombre la presencia de
diplococos gramnegativos es diagnostica (95%)
• Exige transporte rápido al laboratorio e incubación en
atmósfera con CO2
• Detección de genoma del microorganismo por PCR
• Diagnóstico de Chlamydia trachomatis (uretritis no
gonocócica)
• Sólo puede cultivarse en cultivos celulares y no se
hace habitualmente
• Detección de genoma del microorganismo por PCR
Diagnóstico de las enfermedades
del tracto genital
Diagnóstico del protozoo Trichomonas vaginalis
• Cultivo en medio Roiron
• Visualización en fresco de la muestra recién extraída:
Observación de la motilidad del parásito
• Exige transporte rápido al laboratorio
• Diagnóstico del virus herpes genital
• Detección de genoma del microorganismo por PCR
• Habitualmente la etiología se asocia a herpes 2
• Diagnóstico del papilomavirus
• Detección de genoma del microorganismo por PCR
• Genotipificación ya que hay genotipos con diferente
patogenicidad: verrugas genitales o promotores de
procesos cancerosos
Diagnóstico de las enteritis
Etiología más frecuente
Diagnóstico de las enteritis
Etiología más frecuente
Diagnóstico de las enteritis
bacterianas
Salmonella
Cultivo en medio SS y enriquecimiento en caldo selenito
Identificación fenotípica y serotipificación: Múltiples
serotipos
Campylobacter
Cultivo en medios especificos (Skirrow): Incuba a 42ºC en
atmósfera microaerófila
Shigella. Cultivo en medios específicos (Mc Conkey y SS)
Yersinia: Cultivo en medios específicos (CIN)
Escherichia coli enteropatógenos: Detección del genoma
de los serotipos patógenos por PCR
Vibrio cholerae (TCBS y enriquecimiento)
Diagnóstico de las enteritis
bacterianas
Clostridium difficile
Cultivo en medio anaerobio: Sólo se realiza en centros de
referencia debido a su complejidad
Detección de Antígenos del patógeno
Detección de las toxinas producidas por el mismo
Detección del genoma del microorganismo por PCR
Otros microorganismos productores de toxinas: El
diagnóstico se realiza detectando la toxina preformada por
métodos serológicos
Staphylococcus aureus
Bacillus cereus
Clostridium perfringens
Clostridium botulinum
Diagnóstico de las enteritis viricas
Virus gastrointestinales
Rotavirus
Adenovirus
Norovirus
Astrovirus
Diagnóstico
Microscopía electrónica: Técnica poco usada por su
complejidad
Detección de antígenos
Detección del genoma viral por PCR
Diagnóstico de las enteritis
parasitarias
Protozoos
Giardia
Entamoeba histolytica
Cryptosporidium
Helmintos: Ascaris, Taenia, Enterobius vermicularis
Diagnóstico
Microscopía tras proceso de concentración de las heces
Necesidad de procesar un mínimo de tres muestras
Tinciones especiales: Cryptosporidium
Detección del genoma por PCR: Entamoeba
Técnica de Graham: Enterobius vermicularis (oxiuros)
Protozoos: flagelados
Protozoos flagelados: Amebas
Protozoos ciliados
Protozoos: Apicomplexa
Cryptosporidium spp
Isospora belli
Protozoos: Microspora
Enterocytozoon spp
Platelmintos: cestodos
Platelmintos: tremátodos
Nemátodos
Trichuris trichiura
Nemátodos
Nematodos
Strongyloides stercoralis
Diagnóstico de bacteriemia
• Presencia de bacterias en sangre de forma persistente
• Antes del tratamiento antimicrobiano se inoculan, con sangre
del paciente sin anticuagulante 2 o 3 parejas de botellas de
hemocultivos (aerobias y anaerobias)
• Es muy importante descontaminar la piel ante de las
extracciones de sangre para prevenir la contaminación de los
frascos con flora bacteriana de la piel
• Los hemocultivos se incuban a 37ºC en sistemas automáticos
que detectan crecimiento microbiano.
• En caso de positividad : Tinción Gram (cuyo resultado se
informa de inmediato ) y subcultivo a medios sólidos.
Diagnóstico de bacteriemia
Infecciones por microorganismos anaerobios
• Se asocian a las siguientes infecciones:
– Gangrenas
– Peritonitis y otras infecciones
intraabdominales
– Neumonías por aspiración
– Abscesos
– Bacteriemias
– Abscesos cerebrales
Infecciones por microorganismos anaerobios
•
Los microorganismos se mueren en contacto con el oxígeno, por lo
tanto:
– El cultivo debe hacerse lo más rápidamente posible, si no es
posible, hay que inocular las muestras en medios de transporte
– Se requieren medios de cultivo específicos e incubación en
atmósfera sin oxígeno
– Las torundas no son aceptables, es imprescindible que las
muestras se tomen con jeringa o mediante biopsia
– Los géneros más importantes son:
• Clostridium
• Bacteroides
• Prevotella
• Fusobacterium
Cultivo de microorganismos
anaerobios
• Están presentes en la flora normal de la piel o
mucosas de las personas sanas por tanto no tienen
interés clínico si se aíslan de estas localizaciones:
– Esputos
– Exudados vaginales
– Heces
– Piel
Infecciones sistémicas por
hongos filamentosos
• Los hongos más frecuentemente implicados
son:
– Aspergillus
– Mucor
– Fusarium
• Diagnóstico:
– Cultivo de las muestras: Poca sensibilidad y
especificidad. Necesidad de confirmación en
varias muestras y con datos clínicos
– Detección de antígenos de Aspergillus:
galactomanano
Infecciones por Candida
• C. albicans es la más patógena. Otras
especies implicadas son:
– C. parasilopsis
– C. tropicalis
– C. krusei
• Produce:
– Infección de piel y mucosas
– Candidiasis sistémica en inmunodeprimidos
Infecciones por Candida
• En caso de sospecha de infección sistémica:
hemocultivos
• En otras infecciones:
– Tinción de Gram como método rápido
– Cultivo de las lesiones en medio de Saboureaud.
Crecen en 1-2 días. Pueden crecer en agar sangre
o agar chocolate
– Identificación de la especie por métodos
fenotípicos o genotípicos
Candida spp.
Candida spp.
Candida spp.
Candida spp.
Candida spp.
Infecciones por dermatofitos
Llamadas comunmente tiñas:
Tinea corporis
Tinea crucis
Tinea barbae
Onicomicosis
Pie de atleta
Trichophyton, Microsporum, Epidermophytum
Se adquieren a partir de personas enfermas,
de animales domésticos o a partir del suelo
Infecciones por dermatofitos
Diagnóstico rápido: Prueba del KOH
(visualización directa de las lesiones)
Cultivo en medio de Saboureaud y micosel
(Saboureaud y actidiona) durante 30 días a
30/37ºC
Identificación del hongo aislado en cultivo
mediante tinción de azul de lactofenol y
algunas pruebas bioquímicas (urea)
Dermatofitos
Dermatofitos
Dermatofitos
Dermatofitos
Dermatofitos
Otras infecciones por hongos
Pitiriasis versicolor (Malassezia furfur)
Diagnóstico clínico
Esporotricosis (Sporothrix)
Por infección de heridas con esporas presentes en el
suelo o en vegetales
Hongo dimórfico: Cultivo en saboureaud y BHI
durante 30 días a 30/37ºC respectivamente
Identificación mediante microscopía y demostración
de dimorfismo(levadura, hongo filamentoso)
Sporothrix
Sporothrix
Infecciones por Leishmania
•
Leishmaniasis visceral: Kala azar
•
•
Muestra a procesar. Médula osea
Lesiones cutaneas o mucocutáneas (Botón de oriente,
uta, espundia, etc)
•
•
•
Muestra a procesar: Aspirado o biopsia de la lesión
Asociado muchas especies del género, en función de la zona
geográfica y de la clínica: L. infantum, L. donovani, L.
peruviana, L. amazonensis, etc.
Diagnóstico por:
•
Visualización del parásito en las lesiones por tinción de Giemsa
•
Cultivo en medio NNN
•
PCR.
•
Serología (útil en L. visceral)
Leishmania
Leishmania
Leishmania
Leishmania
Leishmania
Phebotomus y Lutzomya
Infecciones por Plasmodium
• Produce la malaria o el paludismo
• Enfermedad muy frecuente en el trópico
• Necesidad de diagnóstico rápido
– No crece en los medios para bacterias:
hemocultivos
– Métodos específicos:
• Visualización del parásito en tinción de Giemsa de los
hematies de la sangre periférica
• Detección de antígeno
• Detección del genoma del protozoo por PCR
Infecciones por Plasmodium
Infecciones por Toxoplasma
• Se asocia
• Inmunocompetentes: Generalmente asintomático
o fiebre con adenopatías
• Gestante: Infección congénita
• HIV: Cuadro neurológico por reactivación de
quistes cerebrales
• Diagnóstico:
• Inmunocompetentes: Estudios serológicos (IgM,
seroconversión y avidez de la IgG)
• Gestantes: Serología de la madre y PCR en líquido amniótico
• Inmunodeprimidos: Detección del genoma por PCR
Infecciones por Toxoplasma
Infecciones por Schistosoma
• 2º enfermedad tropical más prevalente (después del
paludismo)
• Se transmite por la entrada de larvas a través de la
piel cuando se introduce en agua
• Diagnóstico:
• Visualización de los huevos en la orina o en las heces del
paciente