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CAMPOS DE APLICACIÓN
DE LA MICROBIOLOGÍA
1
HISTORIA DE LA MICROBIOLOGIA
Fracastoro (1548): suguiere que los organismos invisibles
son los causantes de las enfermedades
ANTONI VAN LEEUWENHOEK
1675
Edad de Oro de la Microbiología







1857
1861
1864
1867
1876
1882
1887
Pasteur-Fermentación
Pasteur-Generación espontánea
Pasteur-Pasteurización
Lister-Antisépticos
Koch-Teoría de la enfermedad
Koch-cultivos y agar
Petri-Cajas Petri
Louis Pasteur
 Observó que la fermentación
de las frutas y de los granos
producía alcohol y lo
realizaban los microbios.
 Inicio el proceso de
Pasteurización.
 Descubre la vacuna contra la
rabia
Vacuna de la rabia
(1885)
www.icarito.cl
Pelczar y col.,1995
Joseph Lister

Obtiene cultivos puros de
bacterias por diluciones seriadas
en medios líquidos (1878)
Roberto Koch
 Realiza frotis y usa colorantes
 Utiliza agar para producir medios
sólidos para el aislamiento de colonias.
 Descubre el bacilo de la tuberculosis.
 Descubre las poblaciones mixtas y el
sinergismo.
ROBERT KOCH
1878 Comprueba que el antrax es
causado por Bacillus antracis
1881 Cultiva bacterias en gelatina
1882 Descubre el bacillus tuberculoso
1884 Publica su primer postulado
Postulados de Koch
1887 RICARDO PETRI descubre la caja de petri
1887 WINOGRADSKY Estudio las bacterias nitrificantes y
sulfuradas
1890 BEIJERINCK Aisló las bacterias de nódulos de raíces
Fungi
Animales
Plantae
Adsorcion
fotosintesis
1969 WHITTAKER Clasificación de
microorganismos en 5 reinos
ingestion
Protista
Monera
1987 WOESE Clasificación de microorganismos en 3 reinos
DOMINIO
•
Actualmente considerado el nivel taxonómico más alto.
bacteria?
HONGOS
Incluyen las setas,levaduras y
mohos.
Protozoarios
Biotecnología
microbiana:
Tecnología microbiana
tradicional:
 Fermentaciones
alcohólicas
 Producción de
productos
farmacéuticos, aditivos
alimentarios, enzimas
y sustancias químicas
industriales
 Biorremediación
Tecnología microbiana
con organismos
alterados mediante
procesos de ingeniería
genética:
• Fabricación de
hormonas
• Moduladores del
sistema inmune
• Vacunas
Microorganismos industriales
• No todos los microorganismos
tienen un uso industrial
• Microorganismos industriales
producen uno o más productos
específicos
• Microorganismos industriales son especialistas metabólicos
capaces de producir específicamente y con un alto
rendimiento, metabolítos particulares
• El microorganismo es modificado antes de ingresar a la
industria: se altera genéticamente por mutación o por
recombinación
• La fuente de todas las cepas industriales es el
ambiente natural
• Las cepas industriales se depositan en colecciones de
cultivos que sirven como almacén
Requisitos de un microorganismo industrial:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Producir la sustancia de interés
Crecer rápidamente en un medio de cultivo barato
Fabricar el producto en un período corto
Desarrollarse en cultivo puro y en gran escala
Ser estable genéticamente pero susceptible de
manipulación genética
Cultivos que se mantengan durante períodos largos
en laboratorio y en planta industrial
Facilidad para inocular en grandes fermentadores
No debe ser peligroso para el hombre o las plantas y
animales de interés económico
Posibilidad de retirar fácilmente las células del cultivo
Clases de productos industriales
Metabolitos
microbianos
• Alcohol
• Ácido acético
• Ácido láctico
• Aminoácidos
• Vitaminas
• Antibióticos
• Esteroides
• Alcaloides
Enzimas
Digestión de almidones, lípidos y proteínas
Síntesis de antibióticos semisintéticos
Células microbianas
• Proteína unicelular: levaduras, algas,
bacterias y hongos
• Células para la inoculación: bacterias
fijadoras de nitrógeno, micorrizas,
inóculos para la fermentación de lácteos
y embutidos
Clasificación de los productos
industriales según su uso:
• Productos farmacéuticos de origen
microbiano
• Biotecnología microbiana en
agricultura
• Sustancias químicas y aditivos
alimentarios
• Productos químicos comerciales y
producción de energía
• Biorremediación
Productos farmacéuticos de origen microbiano
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Antibióticos
Hormonas esteroides
Insulina
Hormona del crecimiento
Linfocinas
Péptidos neuroactivos
Factores de coagulación sanguínea
Activador del plasminógeno tisular
Vacunas
Anticuerpos monoclonales para diagnóstico y terapia
ANTIBIOTICO
El término antibiótico fue propuesto por Wasman,
descubridor de la estreptomicina, para definir sustancias
químicas producidas por un m.o. capaz de inhibir o destruir
a otro m.o. a bajas concentraciones
28
Determinación de la actividad
antimicrobiana
CMI
Microbiología Medica - 2005,
Enfermería
Rubén Moraga M.,
MSc.
30
FUENTES DE ANTIBIOTICOS
Bacterias y hongos
Micromonospora spp.
- Gentamicina
Bacillus spp.
- Polimixina
- Bacitracina
Penicillium spp.
- Penicilinas
- Griseofulvina
Streptomyces spp.
- Streptomicina
- Tetraciclinas
- Eritromicina
- Kanamicina
- Rifampicina
- Neomicina
- Nistatina
Cephalosporium spp.
- Cefalosporinas
AREAS DE APLICACIÓN DE LA MICROBIOLOGIA
Microbiología Agrícola
• Fijación de nitrógeno: asociaciones micorrízicas
• Reciclaje de nutrientes
AREAS DE APLICACIÓN DE LA MICROBIOLOGIA
Microbiología Agrícola
• Fitopatología: enfermedades en los cultivos
causadas por microorganismos
33
Biotecnología microbiana en agricultura
• Productos farmacéuticos
veterinarios de origen microbiano
• Inóculos radiculares
• Ingeniería genética de plantas
mediada por microorganismos como
portadores genéticos
FIJACION DE NITROGENO
Microbiología del suelo
Aislamiento de bacterias antagonistas del hongo
Sclerotium cepivorum que afecta a cultivos de cebolla.
BACTERIAS PRODUCTORAS DE ACC DESAMINASA DE
RIZÓSFERA Y SUELO SALINOS
AREAS DE APLICACIÓN DE LA MICROBIOLOGIA
Microbiología Industrial (Biotecnología)
• Producción de alimentos y bebidas
• Producción de medicamentos
• Producción de bio-combustibles
• Bio-remediación
39
AREAS DE APLICACIÓN DE LA MICROBIOLOGIA
Microbiología Alimentaria
Estudia las causas del deterioro de los alimentos
para evitarlo y prolongar su vida de anaquel
40
AREAS DE APLICACIÓN DE LA MICROBIOLOGIA
Microbiología Alimentaria
Estudia la inocuidad de los alimentos
42
Sustancias químicas y aditivos alimentarios
Sustancias especiales y aditivos alimentarios:
• Aminoácidos:
–
–
–
–
–
–
–
Glutamato: potenciar el sabor
Aspartato+alanina: modular el sabor de jugos de frutas
glicina: mejorar el sabor de alimentos dulces
Aspartame: endulzar
Lisina y metionina: aditivos nutrivos
Cisteína antioxidante de jugos de frutas
Triptofano + histidina: evita la rancidez de los alimentos
• Vitaminas: rivoflavina, vitamina B12, vitamina C
Productos químicos comerciales y
producción de energía
• Etanol (combustible para motores)
• Ácido acético
• Ácido láctico
• Glicerol
Producción de energía: Respiración
Proteínas
Carbohidratos
Lípidos
Glucosa
ATP
Glucolisis
Piruvato
Acetil-CoA
Ciclo de
Krebs
ATP
CO2
Electrones
ATP
O2
Fosforilacion oxidativa
H2O
Producción de energía: Fermentación
Carbohidratos
Glucosa
ATP
Glucolisis
Acido
pirúvico
ATP
Fermentación
Ácidos orgánicos
Alcoholes
Fermentación
láctica
Yogurt
Pasteurizar la leche a 85°C por 30 min
Enfriar a 43°C
Streptococcus
ácido fórmico, pH=5.5
Adiciona un cultivo madre
e incubar de 4-6 horas
Lactobacillus
ácido lactico, pH<4.5
Enfriar a 4°C
Verificar contenido de acidez = 0.85 – 0.9 %
Quesos madurados
• Penicillium roqueforti
• Penicillium camembertii
• Streptococcus lactis
• Propionibacterium shermanii
Queso roquefort (azul)
Queso Brie
Queso Cheddar (amarillo)
Queso suizo
Fermentación alcohólica
Productos de la fermentación
Acido
piruvico
Acido láctico
Lactobacillus
Streptococcus
Etanol
Saccharomyces
Acido acético
Acetobacter
Acido butírico
Clostridium
Etanol, acido
láctico, acido
succínico,
acido acético
CO2
E. coli
Salmonella
PRODUCTOS
A PARTIR
DE HONGOS.
Ecología microbiana
Estudia de la estructura y funcionamiento
de las comunidades microbianas en los
ecosistemas
54
CALIDAD BACTERIOLÓGICA DEL AIRE Y RIESGOS A LA
SALUD DE LA POBLACIÓN
USUARIA DE LA VIA
RECREACTIVA DEL CENTRO DE LA CIUDAD DE
GUADALAJARA, MÉXICO.
UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA, MEXICO.
BIOL. BEATRIZ RODRÍGUEZ PÉREZ.
RESULTADOS
300
INVIERNO
250
PRIMAVERA
200
150
100
50
0
SEM
DOM
MINERVA
SEM
DOM
ZAPOPAN
Promedio de UFC / m3 de aire por punto de las vías Minerva y
Zapopan invierno y primavera.
RESULTADOS
•
De los puntos analizados se encontró en promedio EN INVIERNO
para la ruta Minerva bacterias Gram negativas 38 % y Gram
positivas 62% y para la ruta Zapopan Gram negativas 36% y Gram
positivas 64% NO HAY DIFERENCIAS SIGNIFICATIVAS
70
60
50
40
30
20
10
0
VIA
VALLARTA
VIA
MINERVA
VIAZAPOPAN
ZAPOPAN
VIA
Gram positivas
Gram negativas
RESULTADOS
•
De los puntos analizados se encontró en promedio EN PRIMAVERA
para la ruta Minerva bacterias Gram negativas 41 % y Gram
positivas 59% y para la ruta Zapopan Gram negativas 38% y Gram
positivas 62% NO HAY DIFERENCIAS SIGNIFICATIVAS
70
60
50
40
30
20
10
0
VIA
VIAMINERVA
MINERVA
VIA ZAPOPAN
ZAPOPAN
Gram positiva
Gram negativa
AREAS DE APLICACIÓN DE LA MICROBIOLOGIA
Microbiología Médica
Identificación, tratamiento y prevención de
enfermedades transmitidas por microorganismos
59
Producción de productos
de mamíferos por microorganismos
modificados por ingeniería genética
Desarrollo de un proceso biotecnológico:
• Si el gen o los genes que codifican para la
producción de una proteína de mamífero se
pueden clonar dentro de un microorganismo
• Si se obtiene una buena expresión de este
gen
Productos biotecnológicos fabricados
por DNA recombinante
Proteínas de sangre para:
– Disolver coágulos
– Promover la coagulación sanguínea
– Desarrollar glóbulos rojos
Hormonas para:
–
–
–
–
–
Tratamiento de diabetes
Regulación del calcio
Alivio del dolor
Osteoporosis
Diuréticos y antihipertensivos
• Vacunas:
–
–
–
–
–
–
Prevención de infección
Hepatitis B
Sarampión
Cólera
Rabia
Sida (¿?)
Moduladores inmunes:
– Estimulantes de las células T
– Activador de células B
– Agentes antivirales, anticancerígenos,
antitumorales, antiinflamatorios
– Tratamiento de infecciones
Influencia de las bifidobaterias en la salud humana
Actuan como
inmunomoduladores.
Promueven el ataque contra
células malignas
Niveles de
colesterol
sanguíneo más bajo
Producen vitaminas,
por ejemplo las del
grupo B, ácido fólico
BIFIDOBACTERIAS
Reducen los niveles de
amonio sanguíneo
Inhiben el crecimiento de
patógenos potenciales
Restablecen la flora
durante una terapia
con antibióticos
Prebiótico
Un ingrediente selectivamente fermentado
que permite cambios específicos tanto en
la composición y/o actividad de la
microbiota gastrointestinal, que confiere
beneficios.
(Gibson y Roberfoid, 2008)
Bacterias ácido lácticas (BAL)
Géneros: Lactobacillus, Bifidobacterium y Streptococcus
Inmunomodulación
Prevención y
tratamiento de
infecciones
Mejor
absorción Ca y
Mg
Reducción
cáncer de colon
Incremento
BAL
Supresión
sustancias
putrefactivas.
Disminuye
lípidos en
sangre.
Reduce
Enf. de Crohn y colitis
Reduce
constipación
intestinal
CARACTERIZACIÓN DE OLIGOSACÁRIDOS PRESENTES
EN SEMILLAS DE Lupinus, Y SU ACTIVIDAD
PREBIÓTICA EN EMBRIONES DE POLLO
Leticia Maya Zepeda
Objetivo general
Caracterizar los oligosacáridos presentes en semillas de
Lupinus elegans, L. montanus y L. rotundiflorus, y evaluar su
actividad prebiótica en embriones de pollo.
El problema con Salmonella
A partir de la década de los 80s se ha manifestado un
aumento mundial de casos de infecciones por Salmonella en
aves comerciales
Pérdidas económicas a la industria avícola
Salmonella Enteritidis (SE) principal agente patógeno
asociado con la producción de huevo y carne de pollo
SE esta frecuentemente involucrado en brotes de ETAs
(Mastroeni y Maskell, 2006, Guard-Peter, 2001.CDC 2011,
FAO, 2005, Molback y Neimann, 2002 ; Prado y col. 2002).
Semillas de Lupinus
Extracto
α-galactósidos
Primera etapa
Identificar
cuantificar
Evaluación efecto
prebiótico
Dosis
Tiempo
Segunda etapa
Dosis /tiempo óptimo
Efecto protector vs
patógenos
Efecto prebiótico
RFOs de lupinos
(L. elegans, L. montanus y L. rotundiflorus)
Concentación
0.000, 0.1763, 0.8815 y 1.7630
mg/200 μL Ringer
L. exaltatus
Huevos fértiles de pollo de Chick Pollo, S.A. de C.V.
Aplicación día 12 y 17
*
Linea Ross
n=10
2 días de nacido
Diseño factorial
4x2x10
UFC de bifidobacterias
Dosis y Tiempo óptimo
* (Villaluenga et al., 2004; Lisowski et al., 2003; Reyes, A.S.C. 2006).
Placa TPY LiCl+ dicloxacilina
ANOVA multifactorial
(pba. rangos múltiples)
Dosis y Tiempo
óptimo
*
T1
Control
T2
RFOs
Enrofloxacina 250 mg/Kg pollo
Vía oral
ANOVA unifactorial
A= antibiótico
RFOs= oligosacáridos
S= Salmonella (vía oral)
* Para cada especie de Lupinus
*
*
T3
Salmonella
T4
RFOs+S
Incubación
Aislar, Contar e Identificar
Salmonella Enteritidis
Efecto protector de oligosacáridos
T5
A+S
T6
A + RFOs+S
Agar SS
37o C 24 a 48 hrs
Diseño factorial
6 x 10 x 3
Identificación Bifidobacterium
• Morfología
• Gram +
• Bioquímicas
Bacteriana
• Catalasa • MIO movilidad –
• TSI
– fermentación carbohidratos +
– CO2 -
• F6PPK confirma Bibidobacterium
• PCR (primer específicos de género) confirma Bibidobacterium
• API 20A confirma Bibidobacterium
Colonial
UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA
Doctorado en Ciencias Biomédicas.
Orientación en Inmunología
ESTUDIO DEL EFECTO PROTECTOR E INMUNOMODULADOR DE Lactobacillus casei EN
UN MODELO MURINO DE CÁNCER COLORRECTAL Y SU ASOCIACIÓN CON LOS
NIVELES DE POLIAMINAS EN ORINA
Cesar Antonio Irecta Najera
Directora: Dra. Anne M.H. Santerre
Codirectora: Dra. Josefina Casas Solis
Asesora:
Dra. Galina P. Zaitseva
Cáncer de colon
Es una neoplasia de tipo carcinoma en la que se encuentran células
cancerosas en tejidos del colon, recto y apéndice.
La OMS estima que es la 2ª neoplasia en
incidencia después del cáncer de
pulmón.
Es el 4º cáncer más frecuente que causa
mortalidad.
¿ Que nos predispone?
•
•
•
•
•
Dieta rica en carnes rojas
Enfermedades inflamatorias intestinales
Factor genético
Edad avanzada
Resistencia a la insulina
Transverso
A
s
c
e
n
d
e
n
t
e
D
e
s
c
e
n
d
e
n
t
e
Tanaka, 2009
Gaceta Mexicana Oncología, 2008
INEGI, 2013
MODELO EXPERIMENTAL DE CÁNCER DE COLON
Cicasina
1-2 Dimetilhidrazina
Metilación del DNA
Mutaciones del Oncogen
– Kras y APC
Transición de GC-AT
Hipermetilación de los
genes MGMT
Erosión de la mucosa e
infiltrado inflamatorio
Herold et al., 2009.
PROBIÓTICOS
Microorganismos vivos que confieren un beneficio de
salud al receptor interactuando de forma directa o
indirecta a través de sus metabolitos
Cepas bacterianas más utilizadas como probiótico
Galdeano et al., 2007.
Riina Kekkonen, 2008
Probióticos en la
prevención de cáncer
Alteración de las vías metabólicas de la microbiota patógena
Hand book of prebiotics and probiotics ingredientes , 2010
Unión y degradación de carcinógenos
Enju Park et al., 2007
Producción de componentes antimutagénicos
Emaneker et al., 2005
Modificación de las condiciones fisiológicas del colon
Brown et al., 2004
Modulación de la respuesta antitumoral
Schiffer et al., 2011
Probióticos y Cáncer
Inhibitory effect of yogurt on Aberrant Crypt Focy formation in the rat colon and colorectal tumorigenesis in RasH2 Mice
Disminuye el número de tumores al ser tratados con probióticos en modelos de CaCo in vivo
Narushima et al., 2010
Efecto de los probióticos sobre la respuesta inmune en la mucosa intestinal
Riina Kekkonen, 2008
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
• El cáncer colorrectal es la segunda neoplasia más frecuente a nivel
mundial, su detección y diagnostico se suelen hacer en fases avanzadas
de la enfermedad y los tratamientos actuales resultan ineficientes y
agresivos por lo que se requiere el desarrollo de alternativas terapéuticas
y propuestas profilácticas.
•
Existen numerosos reportes que en el tracto digestivo, las bacterias acido
lácticas, estimulan la respuesta inmune del hospedero e inducen la
muerte de células tumorales a través de la apoptosis. Sin embargo, es
necesario estudiar los parámetros del sistema inmune involucrados en la
inhibición del desarrollo tumoral asociados a la administración del
probiótico L. casei para entender sus mecanismos de acción.
•
En el presente estudio se evaluó el efecto protector e inmunomodulador
de L. casei, así como la asociación de las poliaminas con el desarrollo del
cáncer de colon en un modelo murino.
OBJETIVO GENERAL
Estudiar el efecto protector e inmunomodulador de Lactobacillus
casei en un modelo murino de cáncer de colon y su asociación
con los niveles de poliaminas.
Diseño experimental
Control sano
Control
L. casei
Administración de Lactobacillus casei:
- 1x106 UFC
- 2 veces a la semana
- vía oral durante 31 semanas
DMH
Ratones BALB/C
n=60
L. casei
preventivo
L. casei
a la par
L. casei
tardio
Inducción de CCR experimental:
- 1-2 dimetilhidrazina
- Subcutáneo 20 mg/Kg de peso
- Semanal durante 24 semanas
Diseño experimental
Toma de muestras
Orina quincenal
Heces quincenal
PAs por HPLC
UFC de L. casei por
cuantificación en placa
Suero sanguíneo a la
semana 31
IL-2,IL-4, IL-6,, IL17, IFNy Y TNFα
por citometría
Identificación bioquímica de las bacterias por el Kit API CH-50 y un
software API WEB
Sacrificios
Colon a la
semana 31
ODC por
Western blot
FCA en cortes
histológicos
Bazo a la
semana 31
Células NK, T .
Regs, CD8, CD4
por citometría
de flujo
Cambios histológicos de las porciones colónicas en ratones tratados con DMH
Semana 7
*
B
A) Microfotografía de criptas del colon normales H y E 40X, B) ) Se observan agregados linfoides (↨), actividad
mitósica leve (↑) y aparente apoptosis de intensidad moderada C) Inflamación crónica severa con un absceso
críptico (ac), frecuente contracción núcleo-citoplasma compatible con apoptosis (*), H y E, 40x, D)Tenue
depleción mucosecretora y franca apoptosis (*) con detritus intraluminales, H y E 40x E) displasia multifocal
leve y moderada (d), inflamación crónica con agregados linfoides (↨), H y E, 40x. F) Observar adenocarcinoma
intra-mucoso y focal con datos de displasia en glándulas criptas adyacentes y agregados linfoides. H y E 10x
Cambios histológicos y cuantificación de FCA en las
porciones colónicas de ratones BALB/C a la semana 31
*
Sin tratamiento
83 FCA/mm2
72 FCA/mm2
*
23 FCA/mm2
72 FCA/mm2
*
L. casei
´
´
Cambios histológicos de las porciones colónicas de ratones
BALB/C a la semana 31 de
experimentación. A) Microfotografia de criptas de colon correspondientes al grupo
control sano (λ) ´H y E 40X. B) Criptas normales sin alteraciones en el grupo control L.
casei, C) Inflamación severa y múltiples focos displásicos, microadenomas (θ)
correspondientes al grupo DMH.
´ D) Escasas Lesiones pre-neoplásicas en el grupo L.
´
casei preventivo (θ).
Número de Focos de Criptas Aberrantes (FCA) en las porciones colónicas
de ratones BALB/C a la semana 31 de experimentación. Representación
de medias ± desviación estándar. * indica diferencia estadística
(p<0.05), prueba de ANOVA de una vía y Post-hoc de Bonferroni.
Discusión
L. casei previene la formación de lesiones pre neoplásicas-transición a adenocarcinoma.
Degradación de sales de metil diazonio contra el número de mutaciones.
Park y colaboradores 2007 demuestran que Bacillus polyfermentum disminuye la formación de FCA en ratones
tratados con DMH.
Enzimas reductoras de
Glucoronidasa
Peroxidas
Glutation S transferasa
Mecanismo de unión
de probióticos
DMH (Procarcinógeno)
Carcinógeno (sales de metildiazonio)
Colonocitos
FCA
Manifestaciones neoplásicas
Formación de adenocarcinoma
Narushima 2010
Park, 2007
CONCLUSIONES
La administración preventiva de L. casei posee un efecto protector en ratones ya que disminuye la
aparición de lesiones pre-neoplásicas FCA.
Los ratones administrados con DMH, tienen una actividad inflamatoria elevada, ya que
histológicamente presentan infiltrado inflamatorio severo, se encuentran niveles elevados de
TNFα e IL-6 en suero, además de un incremento en la expresión de fenotipos de las células T
CD4+, TCD8+ y NK en bazo.
El L .casei administrado de forma preventiva presenta un efecto inmunomodulador en ratones,
debido a que modula la producción de IL-6 y TNFα. Además mantiene la expresión de células T
CD4+ similar a los valores normales y aumenta la expresión de células T reg. en bazo de ratón.
.
¡GRACIAS!
[email protected]