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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE YUCATÁN
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA
APLICACIÓN DE LA IMP
IMPEDANCIMETRÍA
EDANCIMETRÍA
ELECTROQUÍMICA PARA EL SEGUIMIENTO EN TIEMPO
TIEMP
REAL DEL CRECIMIENTO Y ACTIVIDAD DE BACTERIAS
BACTE
CON RESISTENCIA A CO
COMPUESTOS
MPUESTOS MERCURIALES
TESIS
presentada por
BLANCA ESTELA TORRES BAUTISTA
en opción al Título de
INGENIERO QUÍMICO INDUSTRIAL
Asesores
DRA. XOCHITL DOMÍNGUEZ BENETTON
DR. RAFAEL ANTONIO ROJAS HERRERA
M. C. PABLO ACERETO ESCOFFIÉ
Mérida, Yucatán, México
2010
Aunque un trabajo en opción a
titulación hubiere servido para el
Examen Profesional y hubiere sido
aprobado por el Sínodo, sólo su autor
o autores son responsables de las
doctrinas en él emitidas
Artículo 76 del Reglamento Interior de
la Facultad de Ingeniería Química de
la Universidad Autónoma de Yucatán
© Todos los Derechos Reservados, Blanca Estela Torres Bautista, Xochitl
Domínguez Benetton, Rafael Rojas Herrera, Pablo Acereto Escoffié, 2010.
De acuerdo con la Ley Federal de Derechos de Autor vigente en la República
Mexicana y de conformidad con los Tratados Internacionales sobre la materia, se
prohíbe la reproducción parcial o total de esta obra sin la autorización previa del
autor y al menos uno de los asesores del trabajo; esto aplica para todo tipo de
propósitos, aún cuando no se persiga un fin de lucro directo o indirecto. Los
titulares de los derechos de autor de esta obra autorizan su uso únicamente en el
ámbito académico o científico, siempre y cuando sea para utilizarse como
referencia, para lo cual deberá citarse la fuente completa.
DEDICATORIAS
A mis padres Roberto y Roberta por brindarme todo su cariño, por apoyarme y
estar siempre conmigo y por todo lo que me han dado.
A mis abuelitos que me apoyaron y ayudaron a salir adelante.
A mi hermano Oscar hacerme sonreír en los momentos de tensión.
A la Dra. Xochitl Domínguez quién más que una asesora es una amiga que me ha
encaminado al mundo de la investigación. Me ha orientado e impulsado a tomar
las mejores decisiones y me ha inculcado buenos valores
A mis compañeros de licenciatura, por su ayuda, su amistad, y por los buenos
momentos que pase a su lado.
AGRADECIMIENTOS
Me es grato expresar el más sincero agradecimiento a:
La Facultad de Ingeniería Química de la UADY por permitirme llevar a cabo este
trabajo de investigación y por la educación que recibí.
Todos mis profesores y asesores de tesis por su tiempo y paciencia.
Todas las personas del Laboratorio de Biotecnología de la FIQ que trabajaron
mientras realice mis actividades, por su ayuda, apoyo y orientación en los
momentos de duda.
Al Laboratorio de Química General y Análisis Instrumental de la FIQ que
colaboraron conmigo para llevar a cabo los experimentos.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por haber proporcionado el
financiamiento y beca para la realización de este trabajo, a través del proyecto de
ciencia básica 83132 “desarrollo de celdas de combustible bacterianas para la
remediación de efluentes residuales domésticos y su optimización mediante
bioelectrogénesis dirigida”.
Muchas gracias a todos.
Resumen
El mercurio es uno de los contaminantes más peligrosos, ocupa el sexto lugar en
la lista de compuestos más peligrosos; su peligrosidad radica en su alta toxicidad y
su facilidad para ser asimilado y acumulado por los seres vivos. La normatividad
mexicana indica que el nivel máximo de mercurio recomendado es de 0.001 mg/L
de Hg para aguas superficiales y de 0.2 mg/L para sedimentos, sin embargo, de
acuerdo con los resultados de la Red Nacional de Monitoreo de Calidad de Agua,
los niveles de mercurio están cerca o son superiores al máximo recomendable. La
biorremediación se considera como una alternativa de bajo costo y alta eficiencia.
En México no existen suficientes técnicas prácticas y costeables que permitan dar
seguimiento a los problemas ambientales relacionados con la contaminación por
mercurio. Por lo tanto, en la presente investigación se realizó un análisis de los
parámetros electroquímicos mediante la técnica de espectroscopía de impedancia
electroquímica con la finalidad de detectar y analizar fenómenos, en intervalos de
frecuencias característicos, de los procesos que ocurren durante el crecimiento de
bacterias resistentes a mercuriales disueltos. Se realizó la cuantificación por
absorción atómica de los compuestos mercuriales, además de la caracterización
dinámica del proceso. También, se caracterizaron bioquímica y molecularmente
las bacterias utilizadas.
Con los diagramas de Nyquist y de Bode se pudo inferir que la impedancia permite
detectar fenómenos y cambios que ocurren en los sistemas. Mediante el análisis
de circuitos eléctricos equivalentes se obtuvieron dos circuitos con los cuales se
pudieron ver los cambios con respecto al tiempo de cada uno de los sistemas,
dando una idea amplia de los fenómenos que ocurren en la interfaz y en el medio.
Finalmente se hizo un análisis de diferenciales con el cual se determinó las
frecuencias que son características para el crecimiento bacteriano y para la
remoción de mercuriales, pero se demostró que no se puede determinar
cuantitativamente con respecto al tiempo con los experimentos realizados.
CONTENIDO
Página
1. Introducción ...................................................................................................... 1
2. Objetivo general ............................................................................................... 3
2.1.
Objetivos específicos .................................................................................... 3
3. Antecedentes.................................................................................................... 4
3.1.1.
Contaminación ambiental por compuestos mercuriales ............................. 4
3.1.2.
Ciclo del mercurio y de las especies mercuriales ...................................... 5
3.1.3.
Situación internacional de la contaminación ambiental por mercuriales .... 7
3.1.4.
Contaminación ambiental por mercuriales en México ................................ 7
3.1.5.
Estrategias para la remediación de la contaminación ambiental por
mercuriales.............................................................................................................. 9
3.2.
Resistencia microbiana a compuestos mercuriales..................................... 10
3.2.1.
Estrategias de resistencia microbiana a mercuriales ............................... 10
3.2.2.
Mecanismos moleculares de resistencia microbiana a mercuriales......... 11
3.2.3.
Bacterias resistentes a compuestos mercuriales ..................................... 11
3.2.4.
Resultados previamente obtenidos por el grupo de investigación sobre la
resistencia microbiana a compuestos mercuriales ................................................ 12
3.3.
Métodos para el monitoreo en tiempo real del crecimiento y actividad
bacteriana ............................................................................................................. 14
3.3.1.
Espectroscopía de impedancia electroquímica ........................................ 14
3.3.2.
Aplicación de la impedancimetría electroquímica en microbiología ......... 18
4. Materiales y métodos...................................................................................... 20
4.1.
Estrategia general de trabajo. ..................................................................... 20
4.2.
Sistema con bacterias sin mercuriales ........................................................ 21
B: Biomasa, EIS: Mediciones de impedancia ........................................................ 21
4.3.
Sistema estéril sin mercuriales y con mercuriales ....................................... 21
4.4.
Sistema con bacteria en presencia de mercuriales ..................................... 22
B: Biomasa, Hg: Cuantificación de mercurio por vapor frío ................................... 22
4.5.
Curva de crecimiento .................................................................................. 22
i
4.6.
Determinación de mercurio mediante absorción atómica por vapor frío ..... 24
4.7.
Determinación de la cantidad de sustrato. .................................................. 26
4.7.1.
Preparación del DNS ............................................................................... 26
4.7.2.
Curva de calibración para la determinación de azúcares reductores ....... 26
4.7.3.
Preparación de la muestra para determinación de azúcares reductores . 27
4.8.
Caracterización bioquímica ......................................................................... 28
4.9.
Caracterización e identificación molecular de microorganismos resistentes a
compuestos mercuriales ....................................................................................... 30
4.9.1.
Extracción de ADN. .................................................................................. 30
4.9.2.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando iniciadores
universales. ........................................................................................................... 31
4.9.3.
Secuenciación y análisis de secuencias .................................................. 31
4.10.
Espectroscopia por impedancia electroquímica (EIS). ............................. 32
4.10.1.
Análisis de circuitos equivalentes con CPE. ......................................... 33
4.10.2.
Análisis de impedancia electroquímica con diferenciales. .................... 34
5. Resultados y Discusión .................................................................................. 36
5.1.
Curvas de crecimiento microbiano .............................................................. 36
5.2.
Seguimiento de la concentración de mercurio. ........................................... 38
5.3.
Determinación de azúcares reductores (DNS). ........................................... 41
5.4.
Caracterización bioquímica de las cepas resistentes a compuestos
mercuriales............................................................................................................ 43
5.5.
Extracción y visualización de ADN de microorganismos resistentes a
compuestos mercuriales ....................................................................................... 44
5.6.
Identificación de las bacterias seleccionadas y análisis de filogenia. .......... 45
5.7.
Resultados experimentales de impedancia ................................................. 48
5.8.
Análisis de impedancia con circuitos equivalentes ...................................... 56
5.9.
Análisis de impedancia con diferenciales .................................................... 63
6. Conclusiones .................................................................................................. 69
7. Recomendaciones .......................................................................................... 70
8. Rererencias .................................................................................................... 71
ii
ANEXO A: Diagramas de Nyquist y de Bode para las bacterias en presencia y
ausencia de mercurio ............................................................................................ 75
ANEXO B: Variación de los parámetros de los circuitos eléctricos equivalentes con
respecto al tiempo ................................................................................................. 79
ANEXO C: Diferenciales con respecto al tiempo. ................................................. 82
iii
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1. Ciclo biogeoquímico del mercurio . .......................................................... 6
Figura 2. Bacterias aisladas de muestras industriales con gasolina. .................... 13
Figura 3. Gráfica que representa una señal sinusoidal mediante la cual se obtiene
la impedancia. ................................................................................................ 14
Figura 4 Diagramas que se obtienen en las mediciones de impedancia para una
celda electroquímica. ...................................................................................... 16
Figura 5. Metodología general. ............................................................................. 20
Figura 6. Evaluación del número de McFarland para la determinación de biomasa
(curva tipo)...................................................................................................... 24
Figura 7. Estimación de la densidad celular mediante el método de McFarland
(curva tipo)...................................................................................................... 24
Figura 8. Equipo microondas MARS. .................................................................... 25
Figura 9. Curva de calibración para la determinación de sustrato residual mediante
el método de ácido dinitrosalicílico (DNS). ..................................................... 27
Figura 10. Sistema API 20A para la identificación de bacterias, la banda superior
muestra resultados negativos y la banda inferior resultados positivos. .......... 28
Figura 11. Representación del sistema electroquímico utilizado........................... 32
Figura 12. Programa ZView para el análisis de impedancia electroquímica con
circuitos equivalentes. .................................................................................... 33
Figura 13.Curva de crecimiento de los cultivos bacterianos en ausencia de
mercurio.......................................................................................................... 36
Figura 14. Curva de crecimiento de los cultivos bacterianos en presencia de
mercurio, donde (b) es una ampliación de lo que ocurre en (a) a bajas
densidades celulares. ..................................................................................... 38
Figura 15. Mercurio residual en el sobrenadante de las bacterias. ....................... 39
Figura 16. Mercurio en la pastilla bacteriana ........................................................ 40
Figura 17: Gráfica del seguimiento azúcares reductores para la bacteria Hg1 con y
sin mercurio. ................................................................................................... 41
iv
Figura 18. Gráfica del seguimiento azúcares reductores para la bacteria Hg2 con y
sin mercurio. ................................................................................................... 42
Figura 19. Gráfica del seguimiento azúcares reductores para la bacteria Hg3 con y
sin mercurio. ................................................................................................... 42
Figura 20. Gráfica del seguimiento azúcares reductores para la bacteria Hg4 con y
sin mercurio. ................................................................................................... 42
Figura 21. Gráfica del seguimiento azúcares reductores para la bacteria Hg5 con
y sin mercurio. ................................................................................................ 43
Figura 22. Visualización del ADN extraído de las bacterias Hg1-Hg5 mediante
electroforesis horizontal y marcador de peso molecular. ................................ 45
Figura 23. Gen ribosomal 16S obtenido mediante PCR de las bacterias Hg1 a Hg5
....................................................................................................................... 46
Figura 24. Árbol filogenético.................................................................................. 47
Figura 25. a) Diagrama de complejo de la bacteria Hg1 sin Hg, b) diagrama de
Bode de Hg1 sin Hg. ...................................................................................... 48
Figura 26. a) Diagrama de complejo de la bacteria Hg1 con Hg 20 ppm, b)
diagrama de Bode de Hg1 con Hg 20 ppm..................................................... 50
Figura 27. a) Diagrama de complejo de la bacteria Hg2 sin Hg, b) diagrama de
Bode de Hg2 sin Hg ....................................................................................... 51
Figura 28. a) Diagrama de complejo de la bacteria Hg2 con Hg 20 ppm, b)
diagrama de Bode de Hg2 con Hg 20 ppm..................................................... 52
Figura 29 a) Diagrama de complejo de la bacteria Hg5 sin Hg, b) diagrama de
Bode de Hg5 sin Hg ....................................................................................... 53
Figura 30. a) Diagrama de complejo de la bacteria Hg5 con Hg 20 ppm, b)
diagrama de Bode de Hg5 con Hg 20 ppm..................................................... 54
Figura 31. a) Diagrama de complejo de la bacteria Hg5 con Hg 400 ppm, b)
diagrama de Bode de Hg5 con Hg 400 ppm................................................... 56
Figura 32. Circuito eléctrico equivalente para los sistemas sin bacterias. ............ 56
Figura 33. Circuito eléctrico equivalente para los sistemas con bacterias ............ 57
Figura 34. Variación de la resistencia al electrolito con respecto al tiempo para los
sistemas sin mercurio ..................................................................................... 58
v
Figura 35. Variación del parámetro n del elemento de fase constante asociado a la
biopelícula con respecto al tiempo para los sistemas sin mercurio ................ 59
Figura 36. Variación de la resistencia a la biopelícula con respecto al tiempo para
los sistemas sin mercurio ............................................................................... 60
Figura 37. Variación del parámetro n del elemento de fase constante asociado a la
distribución de cargas en la interfaz con respecto al tiempo para los sistemas
sin mercurio .................................................................................................... 61
Figura 38. Variación de la resistencia a la transferencia de carga con respecto al
tiempo para los sistemas sin mercurio. .......................................................... 62
Figura 39. Diferenciales del sistema Hg1 sin mercurio con respecto al sistema
estéril usando el módulo de la impedancia como parámetro. ......................... 63
Figura 40: Relación entre la impedancia imaginaria y la densidad celular para la
bacteria Hg1 sin Hg ........................................................................................ 65
Figura 41: Relación entre la impedancia imaginaria y la concentración de mercurio
para la bacteria Hg2 a bajas frecuencias. ...................................................... 67
Figura 42: Relación entre la impedancia imaginaria y la concentración de mercurio
para la bacteria Hg2 a bajas frecuencias ....................................................... 68
Figura 43. a) Diagrama de complejo de la bacteria Hg3 sin Hg, b) diagrama de
Bode de Hg3 sin Hg ....................................................................................... 75
Figura 44. a) Diagrama de complejo de la bacteria Hg3 con Hg 20 ppm, b)
diagrama de Bode de Hg3 con Hg 20 ppm..................................................... 76
Figura 45. a) Diagrama de complejo de la bacteria Hg4 sin Hg, b) diagrama de
Bode de Hg4 sin Hg ....................................................................................... 77
Figura 46. a) Diagrama de complejo de la bacteria Hg4 con Hg 20 ppm, b)
diagrama de Bode de Hg4 con Hg 20 ppm..................................................... 78
Figura 47. Variación de la resistencia al electrolito con respecto al tiempo para los
sistemas con mercurio .................................................................................... 79
Figura 48. Variación del parámetro n del elemento de fase constante asociado a la
distribución de las propiedades de la biopelícula con respecto al tiempo para
los sistemas sin mercurio ............................................................................... 79
vi
Figura 49. Variación de la resistencia a la biopelícula con respecto al tiempo para
los sistemas con mercurio .............................................................................. 80
Figura 50. Variación del parámetro n del elemento de fase constante asociado a
la distribución de cargas en la interfaz con respecto al tiempo para los
sistemas sin mercurio ..................................................................................... 80
Figura 51. Variación de la resistencia a la transferencia de carga con respecto al
tiempo para los sistemas con mercurio .......................................................... 81
Figura 52. Diferenciales del sistema Hg2 sin mercurio con respecto al sistema
estéril .............................................................................................................. 82
Figura 53. Diferenciales del sistema Hg2 con mercurio 20 ppm con respecto al
sistema estéril................................................................................................. 82
Figura 54. Diferenciales del sistema Hg3 sin mercurio con respecto al sistema
estéril .............................................................................................................. 83
Figura 55. Diferenciales del sistema Hg3 con mercurio 20 ppm con respecto al
sistema estéril................................................................................................. 83
Figura 56. Diferenciales del sistema Hg4 sin mercurio con respecto al sistema
estéril. ............................................................................................................. 84
Figura 57. Diferenciales del sistema Hg4 con mercurio 20 ppm con respecto al
sistema estéril................................................................................................. 84
Figura 58. Diferenciales del sistema Hg5 sin mercurio con respecto al sistema
estéril. ............................................................................................................. 85
Figura 59. Diferenciales del sistema Hg5 con mercurio 20 ppm con respecto al
sistema. .......................................................................................................... 85
Figura 60. Diferenciales del sistema Hg5 con mercurio 400 ppm con respecto al
sistema estéril................................................................................................. 86
vii
ÍNDICE DE TABLAS
Página
Tabla 1: Principales fuentes de contaminación por mercurio en México................. 8
Tabla 2: Bacterias resistentes a compuestos mercuriales reportadas en la
literatura.......................................................................................................... 12
Tabla 3: Concentraciones mínimas inhibitorias en presencia de cloruro de mercurio
y metil-mercurio. ............................................................................................. 13
Tabla 4: Matriz experimental para el sistema con bacterias sin mercuriales. ....... 21
Tabla 5: Matriz experimental para el sistema con bacterias con mercuriales. ...... 22
Tabla 6: Estándares de McFarland ....................................................................... 23
Tabla 7: Concentraciones para la curva de calibración......................................... 27
Tabla 8: Parámetros evaluados por el sistema API 20-A ...................................... 29
Tabla 9: Características bioquímicas de las cepas resistentes a compuestos
mercuriales. .................................................................................................... 44
Tabla 10: Variación de los parámetros del circuito eléctrico equivalente del sistema
estéril sin mercurio con respecto al tiempo..................................................... 57
Tabla 11: Variación de los parámetros del circuito eléctrico equivalente del sistema
Hg1 con Hg 20 ppm con respecto al tiempo. .................................................. 62
Tabla 12: Frecuencias que presentan mayor correlación de Pearson para los
parámetros impedimétricos de los sistemas con bacterias. ........................... 64
Tabla 13: Frecuencias que presentan mayor correlación de Pearson para los
parámetros impedimétricos de los sistemas con mercurio. ............................ 66
viii
1. Introducción
Hoy en día, como consecuencia de las actividades diarias, el mercurio se ha
convertido en uno de los contaminantes más peligrosos del medio ambiente, ya
que su concentración se ha incrementado significativamente y se ha llevado a
niveles de potencial toxicidad para muchos organismos vivientes. Así, el mercurio
ocupa el sexto lugar en la lista de compuestos más peligrosos; su peligrosidad
radica en su alta toxicidad y su facilidad para ser asimilado y acumulado por los
seres vivos, hasta llegar al ser humano en quien puede causar graves problemas
de salud y, por ende, impactar en el desarrollo social.
La normatividad mexicana indica que el nivel máximo de mercurio recomendado
es de 0.001 mg/L de Hg para aguas superficiales y de 0.2 mg/L para sedimentos.
Sin embargo, de acuerdo con resultados publicados por la Red Nacional de
Monitoreo de Calidad de Agua (RNM), los niveles de mercurio en diversos cuerpos
de aguas superficiales en México están cerca o son superiores al máximo
recomendable.
Se han identificado ocho tecnologías principales para tratar la contaminación por
mercurio en suelo, desechos y agua, a escala piloto o industrial. La
biorremediación supera al resto de las técnicas en cuanto a su bajo costo de
mantenimiento y buenos resultados, ésta consiste en el uso de microorganismos
para reducir, eliminar, contener o transformar a productos benignos o menos
tóxicos, los contaminantes presentes en suelos, sedimentos, agua y aire.
En México no se han tomado acciones concretas de remediación para los casos
graves de contaminación por mercurio, ni se ha evaluado en forma detallada la
generación y emisión de este metal al ambiente, o su distribución, puesto que no
existen suficientes técnicas prácticas y costeables que permitan dar seguimiento y
resolver los problemas ambientales relacionados con la contaminación por estos
compuestos.
1
El documento NMX-AA-064-1981 es la norma vigente para la determinación de
mercurio en aguas por el método de la ditizona; sin embargo, la redacción de
algunos de sus puntos no es clara, se requiere partir de una gran cantidad de
muestra y se ha comprobado que el método tal cual es descrito en la misma no
permite
una
adecuada
separación
de
los
compuestos
mercuriales.
En
consecuencia, es necesario evaluar la potencialidad de métodos novedosos, como
son los electroanalíticos, para llevar a cabo estas determinaciones, además de
permitir el seguimiento en tiempo real de los procesos microbianos que permiten la
biorremediación, sin que el usuario pueda estar expuesto a los compuestos
tóxicos que se desprenden durante el análisis con el método de la ditizona.
Por lo tanto, en la presente investigación se realizó un análisis de los parámetros
electroquímicos
mediante
la
técnica
de
espectroscopía
de
impedancia
electroquímica con la finalidad de detectar y analizar fenómenos, en intervalos de
frecuencias característicos, de los procesos que ocurren durante el crecimiento de
bacterias resistentes a mercuriales disueltos, sin requerir el contacto del usuario
con el efluente contaminado o sus vapores. Simultáneamente, se realizó la
cuantificación por absorción atómica de los compuestos mercuriales de una fase
acuosa conocida, además de la caracterización dinámica del proceso. También,
se caracterizaron bioquímica y molecularmente las bacterias utilizadas. Así, se
propone a la impedancia electroquímica como una estrategia potencial para el
monitoreo en tiempo real de la biorremediación de efluentes contaminados con
compuestos
mercuriales
en
una
media
celda
electroquímica
(ya
que
posteriormente se dará continuidad a este estudio en sistemas bioelectroquímicos
como son las celdas de combustible microbianas y celdas de electrólisis
microbiana), que además sea extrapolable a la biorremediación de efluentes
contaminados con otros metales pesados.
2
2. Objetivo general
Evaluar la espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS) como una técnica
potencial para el seguimiento en tiempo real del crecimiento y actividad de
bacterias con resistencia a compuestos mercuriales.
2.1. Objetivos específicos
•
Caracterizar las dinámicas de crecimiento bacteriano y de remoción de
mercurio disuelto, mediante los cambios en impedancia.
•
Cuantificar los compuestos mercuriales removidos de la fase acuosa por
absorción atómica.
•
Detectar frecuencias asociadas a cambios característicos de impedancia
electroquímica durante el crecimiento de bacterias resistentes a compuestos
mercuriales en ausencia y presencia de mercurio.
•
Mediante el análisis de diferenciales, determinar los parámetros dieléctricos
que,
a
las
frecuencias
características
detectadas,
pueden
usarse
potencialmente como elemento central de una estrategia para el monitoreo en
tiempo real de la biorremediación de efluentes contaminados con mercurio.
•
Caracterizar las bacterias resistentes a compuestos mercuriales utilizadas,
mediente pruebas bioquímicas y secuenciación del ADNr 16S.
3
3. Antecedentes
3.1.1. Contaminación ambiental por compuestos mercuriales
Las principales fuentes naturales de mercurio son las emisiones de los volcanes y
la evaporación desde los cuerpos de agua. No obstante gran parte del mercurio
encontrado en la atmósfera y en los ecosistemas hídricos proviene de actividades
antropogénicas.
El mercurio se ha usado durante miles de años debido a sus propiedades
químicas y físicas. Su uso y liberación al medio ambiente, combinado con su alta
toxicidad, producen un efecto de bioacumulación y biomagnificación en la cadena
alimentaria acuática, lo que lo convierte en un contaminante de especial cuidado
[U. S. EPA, 2002].
Una numerosa cantidad de industrias liberan mercurio al medio ambiente como
desecho de sus procesos, entre las cuales se encuentran las refinerías, minería,
plantas químicas, industria del papel, plantas de cemento, cal, etc. [INE, 2000].
Los problemas por contaminación con mercurio están latentes debido a su
extensión en cuanto a liberación. Basado en los factores meteorológicos, el
terreno, y las características del mercurio emitido a la atmósfera, éste puede ser
transportado y depositado a diferentes distancias, dando como resultado un
impacto a diferentes escalas [DTSC, 2002].
Dentro de los principales efectos que causan los compuestos mercuriales a la
salud humana se encuentran: daños irreversibles en la formación del sistema
nervioso fetal, disminución de capacidades de aprendizaje, atrofia muscular,
reducción del coeficiente intelectual, convulsiones y en casos severos retraso
mental [Rosas-Hernández, 2009].
4
3.1.2. Ciclo del mercurio y de las especies mercuriales
Existen cuatro formas de mercurio en el ambiente: el mercurio elemental Hg(0),
mercurio iónico o divalente Hg(II), mercurio absorbido en partículas Hg(p), y
mercurio orgánico R-Hg, en donde R representa un radical orgánico, por ejemplo
CH3Hg para el caso del metil-mercurio que es la forma más tóxica del mercurio
[Wang et al., 2004].
La mayoría de los compuestos inorgánicos (como el HgCl2) son polvos blancos o
cristales, algunos de los cuales son lo suficientemente volátiles para existir como
gas atmosférico [DTSC, 2002].
El mercurio elemental es un metal líquido a temperatura ambiente, inodoro, de
color gris-plateado brillante, que en la naturaleza aparece en diversas formas
químicas; a elevadas temperaturas (629.65 K) es transformado en un gas tóxico,
inodoro e incoloro. Su capacidad de conducción de calor es pequeña comparado
con otros metales; sin embargo es un buen conductor de electricidad. Forma
fácilmente aleaciones con muchos metales, como el oro y la plata, las cuales son
llamadas amalgamas [INE, 2000]. En la atmósfera, el mercurio elemental se
convierte a una forma soluble en agua (Hg2+), la cual cae con la precipitación y se
deposita en ambientes acuáticos o terrestres [Barkay, 2005].
El mercurio en el ambiente es constantemente reciclado a través de su ciclo
biogeoquímico (figura 1) el cuál comprende, en forma general, las siguientes
etapas [Rosas-Hernández et al., 2006]:
1. Emisión de mercurio gaseoso de rocas, suelos, aguas superficiales,
emisiones volcánicas y actividades antropogénicas.
2. Movimiento en forma gaseosa a través de la atmósfera.
3. Deposición de mercurio en suelos y aguas superficiales para después
seguir un proceso de migración.
4. Conversión del mercurio en sulfato de mercurio soluble, por vía microbiana.
5
5. Precipitación o bioconversión en formas del mercurio más solubles y
volátiles, como el metil-mercurio u otros compuestos organomercuriales.
6. Re-entrada a la atmósfera o bioacumulación en las cadenas alimenticias,
con la consecuente bio-aumentación y efectos tóxicos.
Figura 1. Ciclo biogeoquímico del mercurio [UNEP, 2004].
6
3.1.3. Situación internacional de la contaminación ambiental por
mercuriales
A lo largo de la historia y por todo el mundo se han presentado casos de
contaminación por mercurio y sus compuestos. Un caso sobresaliente es el que se
presentó en Minamata (Japón), donde los desechos de una planta de acetaldehído
contaminaron la bahía. Los habitantes comenzaron a presentar entumecimientos
en dedos, lengua y boca, marcha atáxica, defectos en el habla, disfagia, sordera y
constricción del campo visual, síntomas que después serían conocidos como la
enfermedad de Minamata. Los pacientes reconocidos oficialmente suman 2,252
de los cuales 1,043 han fallecido y se sospecha que más de 15,000 personas
están aún afectadas [Wang et al., 2004].
América es el continente que presenta mayor número de casos de contaminación
por mercurio, dentro de los cuales destaca Brasil, en donde se usa para la
extracción de oro por amalgamación. Se sabe que alrededor de 650,000 mineros
trabajan en más de 2,000 minas de oro. Se han encontrado altas concentraciones
de Hg en habitantes de regiones distantes a las zonas de explotación minera.
Mundialmente, estas actividades mineras liberan al ambiente alrededor de 170
toneladas anuales de mercurio [Soria, 1999].
En Estados Unidos se calculó una liberación anual de 107 toneladas métricas de
compuestos de mercurio para el año 1999, contaminando importantes cuerpos de
agua como el río Mississippi y el Golfo de México. La US-EPA ha reportado más
de 1,300 sitios contaminados con residuos peligrosos y en al menos 600 de ellos
se ha encontrado mercurio [US-EPA, 2007].
3.1.4. Contaminación ambiental por mercuriales en México
Se reconoce a México como uno de los países que posee mayores problemas de
contaminación, asociada principalmente al impacto de su crecimiento industrial y
demográfico. Algunos de los principales problemas ambientales a nivel nacional
7
que se han generado a raíz de estos factores se encuentran las descargas de
aguas residuales sin tratar. Las aguas residuales se distinguen por contener una
gran variedad de sustancias con altos índices tóxicos como son ácidos y bases,
hidrocarburos recalcitrantes y metales pesados (plomo, cadmio, mercurio, etc).
Las principales fuentes de mercurio que se han reportado en México se resumen
en la tabla 1 [Rosas-Hernández, 2009].
Tabla 1: Principales fuentes de contaminación por mercurio en México [Acosta et
al., 2001].
Fuente
Descripción
Principales consumidoras de mercurio. El inventario total de mercurio
Plantas de Cloro-Álcali
en estas plantas es de 275 toneladas aproximadamente con un
consumo de 5.7 toneladas por año.
Rellenos sanitarios municipales
Se utilizan casi 8 toneladas de mercurio al año en la manufactura de
(Instituto Nacional de Ecología,
diversos tipos de instrumentos y aparatos. Se estima que esa misma
INE)
cantidad se pierde al ambiente por la rotura de estos instrumentos.
En el Rio San Juan en Querétaro, Tula, Tepeji, El salto y Afajayucan
en Hidalgo y en el Rio salado en Coahuila se encontraron niveles
entre 0.5 y 1 µg/L de mercurio
Cuerpos de agua (Red Nacional
de Monitoreo de la Calidad de
Agua, RNM)
En la cuenca del Rio Coatzacoalcos y la costa del golfo de México en
Veracruz se detectaron niveles de mercurio de entre 3 y 63 µg/L en
aguas superficiales y de 0.62 a 57.94 µg/L en sedimentos.
Se detectaron niveles de 0.2 y 0.4 µg/L en aguas superficiales de las
lagunas del Carmen, Machona y Mecoacan en Tabasco, Laguna de
Atosta en Campeche y Laguna de Tampamachopo y Mandinga en
Veracruz.
Recientemente dos volcanes han mostrado cierto grado de actividad,
liberando mercurio al ambiente, el nevado de Colima y el
Popocatépetl cuyas emisiones se estiman en 440 kg/año.
Fuentes Naturales
Se sabe que los pozos geotérmicos son fuente de mercurio al
ambiente. En el campo cerro prieto se detectaron pérdidas de
mercurio al ambiente de 47 kg/año, estimándose que el 90% se
emiten a la atmósfera y el resto se quedaban en las descargas de
agua.
8
Los niveles de mercurio en varios sitios de México están por encima de la norma y
la técnica de cuantificación recomendada por la normatividad oficial presenta
numerosas problemáticas, por lo tanto, es relevante proponer y desarrollar
tecnologías propias orientadas a esta área. Los estudios reportados son
insuficientes en cuanto a caracterización de los sitios contaminados y no se han
aplicado técnicas para la remediación de los mismos, además de que no existe
ninguna de origen nacional.
3.1.5. Estrategias para la remediación de la contaminación ambiental
por mercuriales
Las principales estrategias que se presentan para la remediación de sitios
contaminados por mercurio, de acuerdo a los datos reportados por la US-EPA
(2007) son:
•
Biorremediación: Proceso en el cual los microorganismos degradan
compuestos encontrados en suelo o agua, convirtiéndolos en productos
más complejos o inocuos. Se presenta tanto de manera aerobia como
anaerobia.
•
Tratamiento químico: Sustancias químicas capaces de destruir compuestos
tóxicos, alcanza grandes porcentajes de eficiencia en corto tiempo.
•
Extracción con aire: Se inyecta vapor a través de acuíferos contaminados,
volatilizando los contaminantes y facilitando su fácil remoción.
•
Fitorremediación: Proceso en el cual se utilizan plantas para la remoción,
transferencia, estabilización, y/o destrucción de contaminantes en suelo y
sedimentos.
•
Barreras reactivas permeables: Paredes que se construyen bajo la
superficie del terreno para eliminar la contaminación de las aguas
subterráneas. Estas son impermeables a las sustancias químicas toxicas.
9
•
Extracción con vapores: Proceso en el cual aire es bombeado por debajo
de la superficie del terreno y las sustancias químicas contaminantes se
evaporan rápidamente lo cual facilita su eliminación.
La biorremediación presenta varios aspectos favorables para la recuperación de
sitios contaminados debido a su amplia gama de aplicación y bajo costo. No
obstante, presenta la limitante de requerir un diseño de proceso de alta calidad
para que se asegure una buena transferencia y homogeneidad del medio a
remediar [US EPA, 2007].
3.2. Resistencia microbiana a compuestos mercuriales
3.2.1. Estrategias de resistencia microbiana a mercuriales
Una amplia variedad de bacterias resistentes son capaces de utilizar los
compuestos del mercurio como fuentes de carbono (organomercuriales) o sales
mono y divalentes como fuentes de energía para producir compuestos menos
tóxicos, lo cual puede ocurrir a través de los siguientes mecanismos: a) reducción
enzimática (con ayuda de la enzima mercurio reductasa) a mercurio elemental y
su posterior volatilización, b) formación del compuesto insoluble HgS, que es
precipitado, c) biomineralización de Hg2+ como complejos sulfuro-mercuriales
diferentes de HgS, se cree que es debido a la producción aeróbica de compuestos
tioles volátiles y d) quelación de iones de mercurio en la matriz exopolimérica de
una biopelícula [Essa et al., 2002]. La reducción enzimática de compuestos
mercuriales ha sido encontrada en levaduras como Cryptococcus spp., Candida
albicans y Saccharomyces cerevisiae [Capolino et al. 1997], así como en las
microalgas Chlamydomonas sp. y Chlorella pyrenoidosa. Esto ocurre bajo
condiciones aerobias facilitando que el mercurio sea removido debido a su baja
presión de vapor y alta solubilidad en agua, sin impedir el crecimiento celular
[Rosas-Hernández, 2009].
10
3.2.2. Mecanismos
moleculares
de
resistencia
microbiana
a
mercuriales
Como respuesta a los compuestos tóxicos de mercurio ampliamente distribuidos
por
actividades
geológicas
y
antropogénicas,
los
microorganismos
han
desarrollado una peculiar variedad de sistemas de resistencia para superar los
ambientes desfavorables con mercurio. Uno de los sistemas de resistencia mejor
entendidos se basa en genes agrupados en un operon (operon mer), el cual
permite a las bacterias reducir Hg2+ a mercurio metálico volátil mediante enzimas.
Los determinantes mer en estas bacterias son a menudo localizados en plásmidos
o transposones y también pueden ser encontrados en cromosomas. En general se
considera que hay dos clases de resistencia al mercurio: la de espectro estrecho,
que incluye la resistencia a compuestos inorgánicos del mercurio; y la de amplio
espectro que incluye la resistencia a compuestos organomercuriales, codificada
por el gen mer. Las determinantes de resistencia al mercurio han sido encontradas
en un amplio rango de bacterias Gram negativas y positivas aisladas de diferentes
ambientes [Nascimento, 2003].
3.2.3. Bacterias resistentes a compuestos mercuriales
En la tabla 2 se pueden observar una amplia variedad de bacterias que pueden
crecer en presencia de compuestos de mercurio, algunas de las cuales forman
biopelículas, produciendo un gradiente de concentración de mercuriales como
medio de protección ante su toxicidad [Rosas-Hernández, 2009].
11
Tabla 2: Bacterias resistentes a compuestos mercuriales reportadas en la literatura
[Sorkhoh et al., 2010].
Bacteria
Gordonia alkanivorans
Vibrio tasmaniensis
Alcanivorax borkumensis
Bacillus asahii
Marinobacter hydrocarbonoclasticus
Psychrobacter celer
Arthrobacter crystallopoietes
Pseudomonas stutzeri
Detzia maris
Planomicrobium akeanokoites
Halomonas taeheungii
Ornithinimicrobium casienolyticus
Pseudomonas pseudoalcaligenes
Pseudomonas stutzeri
Citrobacter freundii
Citrobacter sp.
Exiguobacterium aurantiacum
Pseudomonas putida
Máxima
concentración
de mercurio
que resiste
(ppm)
100
100
50
100
100
100
450
400
450
450
400
450
600
600
600
800
800
800
3.2.4. Resultados previamente obtenidos por el grupo de investigación
sobre la resistencia microbiana a compuestos mercuriales
Como antecedente a este trabajo [Rosas-Hernández, 2009] se aislaron y
estabilizaron ocho consorcios facultativos, a partir de sistemas de distribución de
gasolina, resistentes a 4 ppm de HgCl2, HgO y Hg[NO3]2H2O. El 80% de las
bacterias aisladas de estos consorcios sugirieron mecanismos de remoción de
mercurio
en
medio
líquido.
Posteriormente
se
purificaron,
evaluaron
y
seleccionaron cinco bacterias con mayor crecimiento en presencia de HgCl2
(figura 2).
12
Figura 2.. Bacterias aisladas de muestras industriales con gasolina [RosasHernández, 2009].
Las cinco bacterias seleccionadas se expusieron a distintas concentraciones de
cloruro de mercurio con la finalidad de determinar la concentración mínima
inhibitoria (CMI). La tabla 4 presenta los resultados en donde se observa que
qu la
CMI de las cepas Hg1, Hg2, Hg3 y Hg4 es de 20 ppm, mientras que para Hg5 es
de 400 ppm.
Tabla 3:: Concentraciones mínimas inhibitorias en presencia de cloruro de mercurio
y metil-mercurio.
Concentración
2
(ppm) →
4
5
10
20
25
50
100
200
400
Cepa↓
C
M
C
M
C
M
C
C
C
C
C
C
C
Hg1
b
b
b
b
Hg2
b
b
b
b
b
Hg3
b
b
b
b
Hg4
b
b
b
Hg5
b
b
b
b
b
b
b
b
b
C=HgCl2, M=CH3ClHg, b=forma biopelícula, =resistente, =no
=no resistente
Se realizaron cinéticas de crecimiento y se llevó a cabo el seguimiento de la
concentración de mercurio. En todos los casos se observó la disminución de
13
mercurio, para: Hg1 de 42%, Hg2 de 40%, Hg3 de 32%, Hg4 de 48%, Hg5 de 36%
a las 48 horas de cultivo en medio con glucosa y con extracto de levadura.
Las bacterias derivadas de dicha investigación fueron las utilizadas para efectos
de la presente tesis.
3.3. Métodos para el monitoreo en tiempo real del crecimiento y actividad
bacteriana
3.3.1. Espectroscopía de impedancia electroquímica
La impedancia electroquímica (EIS) en una técnica en la cual se analiza la
respuesta en frecuencia de un sistema electroquímico a una señal alterna, usando
una función de transferencia entre una señal de entrada (voltaje, E) y una de
salida (corriente, I) las cuales está desfasadas (por un ángulo de fase, ) (figura
3). Esto permite seguir, mediante un barrido de potenciales aplicados a diferentes
frecuencias, las cinéticas y mecanismos de respuesta, fenómenos de transporte y
fenómenos de distribución electroquímica que ocurren dentro de un sistema; las
medidas a diferentes frecuencias, constituyen un espectro de impedancia
[Domínguez-Benetton, 2007].
Figura 3. Gráfica que representa una señal sinusoidal mediante la cual se obtiene
la impedancia [Domínguez-Benetton, 2007].
14
A la entrada del sistema, para el caso de pruebas potenciostáticas, se impone una
perturbación sinusoidal en potencial E(t) de baja amplitud E0 (por ejemplo 10 mV),
sobre el electrodo de trabajo, en un dominio de frecuencias (ω) entre los 10 mHz y
100 MHz:
= sin Ec. 1
La respuesta obtenida para cada frecuencia es una corriente sinusoidal I(t) de fase
y de amplitud I0:
= sin + Ec. 2
Donde ω representa la pulsación (igual a 2πf, siendo f la frecuencia en Hz).
El desarrollo matemático de la teoría que fundamenta la técnica de EIS permite
describir la impedancia de un sistema en términos de un componente real y un
componente imaginario [Tribollet et al., 2008]. Mediante las ecuaciones anteriores
se construye la función de transferencia de la impedancia, definida como la
relación de la señal de entrada con respecto a la señal de salida Z=E/I, que una
vez simplificada y separada en sus componentes real (ReZ) e imaginaria (Im Z),
puede representarse de la siguiente forma:
= + Ec. 3
Matemáticamente, el ángulo de fase se representa por la relación:
= Ec. 4
Y el módulo de la impedancia por:
|| = + 15
Ec. 5
A partir de estas ecuaciones, se obtienen 3 diagramas (figura 4), que son los
comúnmente utilizados para el análisis de la respuesta en frecuencia del sistema
electroquímico.
Figura 4 Diagramas que se obtienen en las mediciones de impedancia para una
celda electroquímica [Domínguez-Benetton, 2007].
El Diagrama de Nyquist (figura 4a) se refiere a la gráfica de la parte real de la
impedancia contra el negativo de la parte imaginaria y describe la relación entre
los diferentes componentes que están presentes en el sistema electroquímico, ya
que estos pueden tener un comportamiento análogo a uno resistivo, cuya
magnitud aumenta sobre el eje real de la impedancia, mientras que aquellos
elementos que tienen un comportamiento análogo a uno capacitivo se manifiesta
en la componente imaginaria [Tribollet et al., 2008].
16
El diagrama de módulo de la impedancia (figura 4b, izquierda) permite identificar
las constantes de tiempo debidas al sistema de estudio. Esta variable representa
la magnitud del vector conformado por las partes real e imaginaria, conjuntas en
una sola función, como un valor absoluto de la variable compleja [Tribollet et al.,
2008]
En el diagrama del ángulo de fase (figura 4b, derecha) se puede observar el
desfasamiento entre la señal de entrada y la señal de salida. Físicamente, una
forma de interpretar las variaciones del ángulo de fase, se logra al comprender el
hecho
de
que
la
energía
aplicada
al
sistema
debe
ser
almacenada
(analógicamente a un término capacitivo) o disipada (términos resistivos). Si el
sistema de estudio es análogo a únicamente un capacitor la corriente se adelanta
del potencial por !#2 radianes; es decir, la diferencia de potencial es de 90°, sin
embargo, si el sistema de estudio es análogo a únicamente un resistor, el ángulo
de fase es 0° [Domínguez-Benetton, 2007].
Los espectros de impedancia obtenidos suelen ser analizados mediante circuitos
eléctricos, tales como resistencias (R), capacitancias (C), inductancias (L), etc.,
combinados de tal manera que reproduzcan los espectros de impedancia
medidos. Estos circuitos eléctricos son denominados “circuitos eléctricos
equivalentes” [Mendoza-Flores, 2000].
Entre las desventajas del uso de los circuitos equivalentes, es que existe un
número infinito de combinaciones de elementos pasivos que pueden reproducir el
mismo comportamiento, esta problemática puede resolverse seleccionando aquel
arreglo que permita una explicación física acorde con el sistema de estudio
17
3.3.2. Aplicación
de
la
impedancimetría
electroquímica
en
microbiología
En la actualidad se requieren métodos confiables, rápidos, convenientes y seguros
que permitan monitorear el crecimiento bacteriano. Los métodos tradicionales de
conteo celular tales como el conteo en placa, espectrofotometría y observaciones
microscópicas pueden llevar mucho tiempo. Los requerimientos de un método de
conteo seguro han llevado al desarrollo de sensores para el monitoreo del
crecimiento bacteriano en tiempo real.
Anteriormente se han desarrollado varios sistemas para monitoreo in situ, tales
como la medición de pH, oxígeno disuelto, dióxido de carbono y densidad óptica.
Asimismo, se han utilizado varias metodologías para el monitoreo en tiempo real
del crecimiento microbiano y otros parámetros relacionados con el cultivo. Algunos
de
estos
métodos
son
las
mediciones
impedimétricas,
los
sensores
piezoeléctricos, los métodos ópticos y el monitoreo por intercambio de calor [Kim
et al., 2009].
Desde un punto de vista electroquímico, la espectroscopia de impedancia ha sido
ampliamente usada para el estudio de sistemas biológicos. En 1957, Schwan usó
la espectroscopia de impedancia para caracterizar las propiedades dieléctricas de
las suspensiones celulares y tejidos. En 1970-1980 Cady y Firstenberg-Eden
iniciaron el uso de las mediciones de impedancia para medir los cambios de
conductividad causados por el metabolismo de las bacterias y, finalmente, para
cuantificar la biomasa [Tribollet et al., 2008].
La espectroscopia de impedancia es un método relativamente nuevo para estas
aplicaciones y poderoso para caracterizar ciertas propiedades eléctricas de
materiales y sus interfaces mediante electrodos. Éste es un método de medición
rápido comparado con los métodos tradicionales tales como densidad óptica y
mediciones de peso seco [Kim et al., 2009].
18
En la microbiología de impedancia, los cambios son medidos típicamente usando
un par de electrodos sumergidos en un medio de cultivo o en una solución de
reacción resultante del crecimiento bacteriano. Los procesos de liberación de
iones, causan cambios en la composición y distribución iónica del medio y en
consecuencia cambios en la conductividad, lo cual es la base para las mediciones
de las variaciones relativas de impedancia [Yang et al., 2003]. La impedancia
electroquímica permite ver la distribución de fenómenos y procesos de una
interfaz.
En años pasados, se han investigado nuevos aspectos que incluyen el uso de
diferentes sistemas de electrodos y el análisis de los componentes de impedancia
usando circuitos equivalentes para una mejora en el sistema de detección.
Actualmente se han realizado estudios en los que se lleva a cabo la medición de
las propiedades impedimétricas de una solución bacteriana, comparando los
valores de impedancia de muestras de medios diferentes para determinar los
efectos metabólicos, del crecimiento bacteriano y sus propiedades eléctricas en la
solución del medio de cultivo con el propósito de desarrollar un sensor que permita
seguir el crecimiento bacteriano in situ y en tiempo real [Kim et al., 2009].
Es así que se considera que la impedancia electroquímica puede ser
potencialmente útil para la caracterización de sistemas microbianos con
actividades específicas, como es el caso de la remoción de compuestos
mercuriales.
19
4. Materiales y métodos
La presente investigación se realizó en el Laboratorio de Biotecnología de la
Facultad de Ingeniería Química de la Universidad Autónoma de Yucatán, con el
apoyo del Laboratorio de Química para el uso del equipo de impedancia y del
Laboratorio de Análisis Instrumental para la cuantificación de mercuriales. Se
usaron 5 bacterias facultativas previamente aisladas de sistemas mexicanos de
distribución de gasolina premium [Rosas-Hernández, 2009]. Se realizaron curvas
de crecimiento, mediciones de impedancia y determinación de mercuriales.
4.1. Estrategia general de trabajo.
Cuantificación de sutrato
residual mediante el método
DNS
Determinación de la curva de
crecimiento con McFarland
Degradación de compuestos
mercuriales mediante vapor
frío
Análisis mediante circuitos
eléctricos equivalentes con
CPE
Caracterización de los
cultivos microbianos
Caracterización mediante EIS
Anáiisis de EIS con
diferenciales y correlación
con las concentraciones de
mercuriales en el medio
Caracterización bioquímica
Caracterización molecular
Extracción de ADN
Figura 5. Metodología general.
20
Secuencia y análisis
Se analizaron cuatro sistemas de interés utilizando en todos los casos un medio
de glucosa (10 g/L) y extracto de levadura (10 g/L):
•
Sistema con bacterias sin mercuriales.
•
Sistema estéril sin mercuriales.
•
Sistema con bacterias con mercuriales.
•
Sistema estéril con mercurio.
4.2. Sistema con bacterias sin mercuriales
Se realizaron curvas de crecimiento bacteriano en ausencia de mercurio,
monitoreando a las 0, 3, 6, 24, 27, 30, 45 y 48 horas. Al mismo tiempo se
realizaron mediciones de EIS (espectroscopía de impedancia electroquímica). En
la tabla 4 se muestra la matriz experimental para este sistema.
Tabla 4: Matriz experimental para el sistema con bacterias sin mercuriales.
Tiempos de seguimiento (h)
Cepa
0
3
6
24
27
30
45
48
Hg1
B, EIS
B, EIS
B, EIS
B, EIS
B, EIS
B, EIS
B, EIS
B, EIS
Hg2
B, EIS
B, EIS
B, EIS
B, EIS
B, EIS
B, EIS
B, EIS
B, EIS
Hg3
B, EIS
B, EIS
B, EIS
B, EIS
B, EIS
B, EIS
B, EIS
B, EIS
Hg4
B, EIS
B, EIS
B, EIS
B, EIS
B, EIS
B, EIS
B, EIS
B, EIS
Hg5
B, EIS
B, EIS
B, EIS
B, EIS
B, EIS
B, EIS
B, EIS
B, EIS
B: Biomasa, EIS: Mediciones de impedancia
4.3. Sistema estéril sin mercuriales y con mercuriales
Los sistemas estériles se monitorearon a las 0, 3, 6, 24, 27, 30, 45, 48 horas,
manejando para el sistema con mercurio concentraciones de 0, 20 y 400, que
fueron seleccionadas de acuerdo con las concentraciones previamente reportadas
21
para las baterías en cuestión [Rosas-Hernández, 2009] y se realizaron mediciones
de EIS.
4.4. Sistema con bacteria en presencia de mercuriales
Se realizaron cinéticas de crecimiento a concentraciones mínimas inhibitorias, de
20 ppm de HgCl2 y adicionalmente de 400 ppm para la bacteria denominada como
Hg5, monitoreando a las 0, 3, 6, 24, 27, 30, 45, 48 horas. Se llevaron a cabo
mediciones de espectroscopia por impedancia electroquímica y determinación de
mercuriales La matriz experimental para el sistema con bacterias con mercuriales
se presenta en la tabla 5.
Tabla 5: Matriz experimental para el sistema con bacterias con mercuriales.
Tiempos de seguimiento (h)
Cepa
0
3
6
24
20
23
38
48
Hg1
B, Hg
B, Hg
B, Hg
B, Hg
B, Hg
B, Hg
B, Hg
B, Hg
Hg2
B, Hg
B, Hg
B, Hg
B, Hg
B, Hg
B, Hg
B, Hg
B, Hg
Hg3
B, Hg
B, Hg
B, Hg
B, Hg
B, Hg
B, Hg
B, Hg
B, Hg
Hg4
B, Hg
B, Hg
B, Hg
B, Hg
B, Hg
B, Hg
B, Hg
B, Hg
Hg5
B, Hg
B, Hg
B, Hg
B, Hg
B, Hg
B, Hg
B, Hg
B, Hg
B: Biomasa, Hg: Cuantificación de mercurio por vapor frío
4.5. Curva de crecimiento
El cálculo del número de células que existen en una suspensión se puede llevar a
cabo mediante el recuento celular (microscopía, número de colonias, etc.), masa
celular (peso seco, medida del nitrógeno celular, turbidimetría, etc.) o actividad
celular (grado de actividad bioquímica con relación al tamaño de la población). Los
métodos de dispersión de luz son las técnicas más utilizadas para monitorear el
crecimiento de cultivos bacterianos.
22
Para estimar el número de microorganismos totales o el número de
microorganismos viables de las suspensiones bacterianas se utilizó como
parámetro de comparación un estándar de McFarland. En microbiología, los
estándares de McFarland se preparan mezclando una solución de cloruro de bario
dihidratado (BaCl2•2H2O) al 1.175% con una solución de ácido sulfúrico (H2SO4)
1%, que se relacionan con las absorbancias de los cultivos celulares a 600 nm
(tabla 6). A partir del número de McFarland, las absorbancias y las
concentraciones microbianas proporcionadas por el producto, se construyen
curvas tipo (figuras 6 y 7) para la obtención de las concentraciones microbianas
mediante la interpolación de los valores obtenidos con el espectrofotómetro
[Rosas-Hernández, 2009].
Tabla 6: Estándares de McFarland
Solución
Solución
BaCl2*2H2O
H2SO4
1.175%
1%
0
0
0
0
0
0.5
0.05
9.95
0.125
1.5
0.75
0.075
9.925
0.193
2.25
1
0.1
9.9
0.276
3
1.5
0.15
9.85
0.4
4.5
2
0.2
9.8
0.478
6
2.5
0.25
9.75
0.646
7.5
3
0.3
9.7
0.711
9
3.5
0.35
9.65
0.818
10.5
4
0.4
9.6
0.878
12
No. De
McFarland
23
Abs
(600 nm)
Densidad celular
aproximada.
8
(1x10 UFC/ml)
Absorbancia (600nm)
1
y = 0.2242x + 0.0322
R² = 0.99
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0
1
3
No.2de McFarland
4
5
Figura 6. Evaluación del número de McFarland para la determinación de biomasa
Densidad celular aproximada
(1x108 UFC/ml)
(curva tipo).
14
12
10
8
6
4
2
0
y = 13.249x - 0.37
R² = 0.99
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
Absorbancia (600 nm)
Figura 7. Estimación de la densidad celular mediante el método de McFarland
(curva tipo).
4.6. Determinación de mercurio mediante absorción atómica por vapor frío
La determinación de mercuriales se hizo mediante absorción atómica por vapor
frio. Para ello, la muestra se centrifugó a 16000 xg durante diez minutos y se
separó el sobrenadante. Para la cuantificación de mercuriales en la pastilla
sedimentada se realizó la digestión de la muestra en microondas MARS (figura 8),
usando vasos HP 500 plus. Previo a la digestión se hizo el lavado de células con
24
una solución isotónica y se resuspendió en 2 ml de la misma. Posteriormente se
agregó la muestra resuspendida al vaso de digestión y se añadieron 5 ml de ácido
nítrico (HNO3) concentrado y 2 ml de peróxido de hidrógeno (H2O2) al 30%. Se
sometió a una rampa de calentamiento desde temperatura ambiente hasta 180°C
en un intervalo de 10 minutos, manteniendo posteriormente a 180°C durante 15
minutos a una potencia de 1200 watts al 100% [Clesceri et al., 1998].
Figura 8. Equipo microondas MARS.
Para el lavado de los vasos de digestión se añadieron a cada vaso 5 ml de HNO3
al 15% y se colocaron en el equipo MARS a 180 °C durante 5 minutos.
Para manejar el equipo MARS se debe tener un peso menor a 0.2 g base seca, la
temperatura no debe sobrepasar los 210°C y la presión debe ser menor a las 350
psi, de acuerdo con las especificaciones del equipo.
Para realizar la determinación de mercuriales mediante absorción atómica por
vapor frío se requirió de una solución madre de mercurio de 1000 µg/ml.
Posteriormente se preparó la solución diluyente para la solución intermedia de
mercurio (1µg/ml) que consistió en ácido nítrico (HNO3) al 1.5% con 5 gotas de
permanganato de potasio KMnO4 al 5%. La solución diluyente para los estándares
y para la muestra consistió en una solución de ácido nítrico al 1.5%, ácido sulfúrico
al 1.5% y algunas gotas de permanganato de potasio al 5%. Se manejó un
25
volumen final de 10 ml para concentraciones de mercurio de µg/L (ppb). Como
agente reductor se usó NaBH4 al 3% diluido en NaOH al 1% y como gas
acarreador argón 99.99% de pureza.
Se prepararon estándares de 0, 5, 10, 20, 40 y 60 µg/L (ppb) previo a la
cuantificación, tanto del sobrenadante como de la pastilla bacteriana digerida.
4.7. Determinación de la cantidad de sustrato.
Se empleó el método de ácido dinitrosalicílico (DNS), para cuantificar el sustrato
residual presente en el medio de cultivo. En presencia de calor, el ácido 3,5dinitrosalicílico se reduce a ácido 3-amino-5-nitrosalicílico por los azúcares
reductores presentes, desarrollándose un color amarillo-café. La densidad óptica
se lee en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 575 nm. Se conoce la
concentración de azúcares reductores presentes interpolando en una curva patrón
de glucosa, graficando la absorbancia contra concentración [Miller, 1959].
4.7.1. Preparación del DNS
Se disolvieron 1.87 g de DNS en 250 ml de agua destilada, se agregaron 3.53 g
de NaOH, 1. 41g de fenol fundido, 54.03 g de tartrato de sodio y potasio
tetrahidratado y finalmente 1.41 g de bisulfito de sodio.
Se requiere adicionar los reactivos en el orden descrito y dejar que se disuelvan
completamente uno por uno, una vez que se hayan disuelto todos, la solución se
deberá mantener en agitación durante 20 min. La solución se debe conservar en
un frasco ámbar a temperatura ambiente [Contreras-Pinzón, 2004].
4.7.2. Curva de calibración para la determinación de azúcares
reductores
Se prepararon 8 tubos de acuerdo a la tabla 7 por duplicado con una solución
estándar de glucosa 1 mg/ml. Se adicionaron a cada tubo 1.5 ml de reactivo DNS
26
y se calentaron los tubos con las mezclas en ebullición durante 10 minutos. Se
leyó la absorbancia a una longitud de onda de 550 nm [Contreras-Pinzón, 2004].
Tabla 7: Concentraciones para la curva de calibración
Glucosa (mg/ml)
Solución stock de
H2O (µl)
Reactivo DNS
Absorbancia (550
(ml)
nm)
glucosa (µl)
0
1000
1.5
0
0.1
100
900
1.5
0.498
0.13
130
870
1.5
0.760
0.16
160
840
1.5
0.961
0.18
180
820
1.5
1.181
0.2
200
800
1.5
1.334
0.3
300
700
1.5
2.144
0.4
400
600
1.5
2.716
Concentración de glucosa
(mg/ml)
0
0.5
0.4
y = 0.1388x + 0.0173
R² = 0.9916
0.3
0.2
0.1
0
0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000
Absorbancia (550 nm)
Figura 9. Curva de calibración para la determinación de sustrato residual mediante
el método de ácido dinitrosalicílico (DNS).
4.7.3. Preparación de la muestra para determinación de azúcares
reductores
Se tomaron 100 µl de muestra completando a 1 ml con agua destilada (900 µl) y
se depositaron en un tubo, posteriormente se adicionó 1.5 ml de reactivo DNS a
27
cada uno. Se calentaron los tubos con las mezclas a ebullición por 5 minutos y se
dejaron enfriar para posteriormente aforar a 10 ml con agua destilada libre de CO2.
Se leyó la absorbancia a una longitud de onda de 550 nm [Contreras-Pinzón,
2004].
4.8. Caracterización bioquímica
Se llevaron a cabo pruebas bioquímicas para las cinco bacterias, para ello se
utilizó el sistema API 20A, dada la naturaleza facultativa de las bacterias y su
capacidad para crecer en condiciones anaerobias. El análisis de estas pruebas
bioquímicas es de utilidad en la identificación microbiana preliminar. El sistema
API 20A consiste en 20 microtubos (figura 10) conteniendo sustancias
deshidratadas que se inoculan con las bacterias en suspensión y reconstituyen el
medio. Durante la incubación el metabolismo de las bacterias produce cambios en
la coloración de manera directa o indirecta (con la adición de reactivos).
Figura 10. Sistema API 20A para la identificación de bacterias, la banda superior
muestra resultados negativos y la banda inferior resultados positivos.
Las pruebas realizadas se resumen en la tabla 8. El procedimiento utilizado para
llevar a cabo estas pruebas bioquímicas es el sugerido por el proveedor
[BioMérieaux, 2007] y el resultado se observa y registra de 24-48 horas de
incubación.
28
Tabla 8: Parámetros evaluados por el sistema API 20-A
Parámetro de la
prueba
1. IND
2. URE
3. GLU
4. MAN
5. LAC
6. SAC
7. MAL
8. SAL
9. XYL
10. ARA
11. GEL
12. ESC
13. GLY
14. CEL
15. MNE
16. MLZ
17. RAF
18. SOR
19. RHA
20. TRE
Componente
activo
Actividad
Resultados
Negativo
Positivo
L- Triptofano
Formación de Indol
Amarillo
Rojo
Urea
Ureasa
Amarillo
Rojo
D-Glucosa
Acidificación
(Glucosa)
Púrpura
Verde
D-Manitol
Acidificación (Manitol)
Púrpura
Verde
Púrpura
Verde
Púrpura
Verde
Púrpura
Verde
Púrpura
Verde
Púrpura
Verde
Púrpura
Verde
No difusión
Difusión
Amarillo
MaroonBlack
Púrpura
Verde
Púrpura
Verde
Púrpura
Verde
Púrpura
Verde
Púrpura
Verde
Púrpura
Verde
Púrpura
Verde
Púrpura
Verde
D-Lactosa
D-Sacarosa
D-Maltosa
D-Saltosa
D-Xylosa
L-Arabinosa
Gelatina
Esculina
Glicerol
D-Celobiosa
D-Manosa
D-Melizitosa
D-Rafinosa
D-Sorbitol
L-Ramnosa
D-Trealosa
Acidificación
(Lactosa)
Acidificación
(Sacarosa)
Acidificación
(Maltosa)
Acidificación
(Saltosa)
Acidificación (Xylosa)
Acidificación
(Arabinosa)
Acidificación
(Gelatina)
Acidificación
(Esculina)
Acidificación
(Glicerol)
Acidificación
(Celobiosa)
Acidificación
(Manosa)
Acidificación
(Melizitosa)
Acidificación
(Rafinosa)
Acidificación
(Sorbitol)
Acidificación
(Ramnosa)
Acidificación
(Trealosa)
29
4.9. Caracterización e identificación molecular de microorganismos
resistentes a compuestos mercuriales
4.9.1. Extracción de ADN.
Los microorganismos fueron cultivados en un medio de agar (15 g/L), glucosa (10
g/L), extracto de levadura (10 g/L) mediante la técnica de estría cruzada, se
incubaron a 30° C durante 2 días.
Se añadió 1 ml de buffer TEN a la muestra y se agitó en vortex por 20 segundos,
posteriormente se agregaron 20 µl de solución de lisozima a la muestra y se
incubó a 37 °C por una hora, agitando suavemente cada 10 minutos. Se incubó 10
minutos en un baño de hielo/alcohol y después 5 minutos en un baño a 65°C, este
ciclo se repitió tres veces. Se añadió 100 µl de SDS (sulfato de sodio dodecil) 20%
y se agitó en vortex por un minuto, se incubó 30 minutos a 30°C, posteriormente
se centrifugó 10 minutos a 10000xg a temperatura ambiente y se paso el
sobrenadante a un tubo de microcentrífuga nuevo añadiendo 500 µl de acetato de
potasio 5 M incubando 5 minutos a 64°C y 20 minutos en baño de hielo. Se
centrifugó 30 minutos a 20000 xg a 4°C pasando el sobrenadante a un nuevo tubo
de microcentrífuga, se añadió 200 µl de una suspensión de SiO2. Se agitó por
inversión durante 3 minutos y se centrifugó 2 minutos a 16000 xg a temperatura
ambiente. Se desechó el sobrenadante.
La pastilla se lavó dos veces con 1 ml de etanol al 70% (no se agitó) centrifugando
cada vez 2 minutos a 16000xg a temperatura ambiente, dejando evaporar el
alcohol manteniendo los tubos abiertos por 2 minutos sobre la mesa. La pastilla
fue resuspendida en 50 µl de agua destilada estéril. Se incubó 5 minutos a 55°C
con agitación ocasional y se centrifugó 5 minutos a 16000xg a temperatura
ambiente. Se pasó el sobrenadante a un tubo nuevo cuidando de no tomar sílice.
La visualización del ADN se realizó en una cámara de electroforesis horizontal
para lo cual se mezclaron 5 µl de muestra de ADN con 3µl de buffer de carga y se
aplicaron en los pozos correspondientes del gel de agarosa, el marcador
30
molecular se colocó en el primer pozo. La cámara de electroforesis se ajustó a 70
Voltios durante 1 hora. Se observó el desplazamiento de las muestras a través de
un transiluminador y se registró la imagen en un fotoaumentador [Rojas-Herrera et
al., 2008].
4.9.2. Reacción
en
cadena
de
la
polimerasa
(PCR)
utilizando
iniciadores universales.
La amplificación del gen 16S rARN se realizó utilizando la técnica de reacción en
cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés). Esta técnica consiste en
amplificar las secciones del ARN mediante el uso de una enzima, logrando
obtener grandes cantidades de la sección en específico [Hogg, 2005].
Para llevar a cabo la reacción de PCR se agregó 1 µl de ADN a un tubo de
plástico para microcentrífuga, el cual fue llevado a un volumen final de 25 µl con
0.2 mM de dNTPs, 0.8 µm de cada primer (16SS, 16SR), 3 mM de MgCl2, 1
Unidad de BioTaq DNA polimerasa y finalmente 0.6x de buffer de reacción
completando el volumen final con agua Pisa estéril. La amplificación de los
productos de PCR se realizó en un Termociclador utilizando el siguiente programa:
desnaturalización inicial a 94°C durante 5 minutos, seguido por 30 ciclos de 94°C
por 30 segundos, 49°C por 1 minuto y 72°C por 1 minuto 30 segundos, teniendo
una incubación final de 72°C durante 7 minutos [Zhu, 2003].
4.9.3. Secuenciación y análisis de secuencias
Los fragmentos amplificados se enviaron a secuenciar por servicio externo
(Macrogen, Corea) con los mismos cebadores con los que fueron obtenidos.
Para los análisis de secuencias se utilizaron diferentes programas disponibles en
la Internet. El manejo y refinado de las secuencias se realizó con el programa
BioEdit; la clasificación taxonómica en las bases de datos RDP [Maidak et al.,
1997; Cole et al., 2003] y GenBank usando el programa BLAST [Altschul et al.,
1997]. Los vecinos más cercanos de las secuencias se calcularon en la base de
31
datos del Ribosoma Database Project (RDP) (versión 10.0) [Maidak et al., 1997;
Cole et al., 2003]. El análisis filogenético de las secuencias obtenidas se realizó
mediante el método de máxima parsimonia con un test de remuestreo (bootstrap)
con 100 repeticiones, utilizando el programa Winclada [Nixon, 1999].
4.10.
Espectroscopia por impedancia electroquímica (EIS).
Para las mediciones de impedancia se utilizó una celda de dos electrodos (figura
11). Las celdas fueron selladas con tapones de goma butírica para mantener las
condiciones de esterilidad. Como electrodo de trabajo y contraelectrodo se usaron
electrodos de Pt/Au 95%/5% de 27 cm2 de área superficial, el contra electrodo
funcionó como electrodo de pseudo-referencia. Los electrodos utilizados tenían
cobertura de teflón, exceptuando la cara expuesta al electrolito de estudio. Se
utilizó la interfaz electroquímica Voltalab 80 en modo potenciostato y en modo de
analizador de la respuesta en frecuencia. Las mediciones de EIS se realizaron
tomando logarítmicamente (5 puntos/década), a una amplitud de 10 mV, sobre el
valor del potencial de circuito abierto, y el intervalo de frecuencias a utilizar fue de
100 kHz a 10 mHz [Domínguez-Benetton, 2007]. Se programó el equipo de
impedancia para que realizara cinco repeticiones por punto, integrando los últimos
cuatro valores para obtener el valor reportado.
Figura 11. Representación del sistema electroquímico utilizado.
32
Una vez teniendo los datos de impedancia, concentración de mercuriales, sustrato
residual y microorganismos, se analizó el efecto de los materiales biológicos en las
mediciones de impedancia. Para ello se realizaron dos tipos de análisis, análisis
con circuitos eléctricos equivalentes y análisis por diferenciales.
4.10.1.
Análisis de circuitos equivalentes con CPE.
El análisis de circuitos equivalentes se llevó a cabo mediante el programa ZView
(figura 12), en donde los datos fueron ajustados a un circuito, el cual se mostrará
en la sección de resultados. Posteriormente se llevó a cabo un análisis de
sensibilidad por medio de simulaciones mediante el cual se buscó observar los
cambios en los resultados obtenidos con base a variaciones de sus principales
parámetros [Domínguez-Benetton, 2007].
Figura 12. Programa ZView para el análisis de impedancia electroquímica con
circuitos equivalentes.
Los elementos de fase constante se han usado extensivamente en circuitos
eléctricos equivalentes para el ajuste de los datos experimentales de impedancia.
Los resultados de impedancia para una interfaz electrodo/electrolito a menudo
revela una dispersión de frecuencia que no puede ser descrita por elementos
simples como resistencias, capacitancias, inductancias, etc. La dispersión de
33
frecuencia es generalmente atribuida a una “dispersión de capacitancia”
expresada en términos de un elemento de fase constante (CPE). La ecuación de
un elemento de fase constante de acuerdo a Zoltowski (1998) es la siguiente:
$%& = '()
*
Ec. 6
Se ha considerado que para el parámetro n = 1 del elemento de fase constante, el
circuito adquiere un comportamiento de capacitor, para n = 0 de un resistor y para
n = -1 como un inductor. Es este caso, el CPE se transforma en un parámetro de
ajuste extremadamente flexible.
El comportamiento de CPE puede ser cuantificado graficando la parte imaginaria
de la impedancia como una función de la frecuencia en coordenadas logarítmicas.
Como la parte imaginaria de la impedancia es independiente de la resistencia del
electrolito, la pendiente es constante en toda la gama de frecuencias. Así la
pendiente obtenida se relaciona con el parámetro n del elemento de fase
constante, el cual se puede obtener directamente sin la regresión de circuitos
equivalentes [Jorcin, J. B. et al.; 2006; Domínguez Benetton, 2007].
4.10.2.
Análisis de impedancia electroquímica con diferenciales.
Se requirió de un valor relativo que permita comparar los efectos de las bacterias
en presencia y ausencia de mercurio y los efectos del mercurio en presencia y
ausencia de bacterias:
∆∝ = -
|2 1 |
1
. × 100%
Ec. 7
Donde m1 es el valor del parámetro impedimétrico que se toma del sistema de
referencia y m2 es el valor del mismo parámetro medido del sistema que se quiere
evaluar. De esta manera se obtuvieron los parámetros dieléctricos que a
34
frecuencias características pueden ser utilizados para detectar el crecimiento
bacteriano o la remoción de compuestos mercuriales [Kim et al. 2009].
Posteriormente se seleccionaron las frecuencias características que presentaron
variaciones lineales con respecto al tiempo, verificando que se cumplan mediante
una regresión lineal, graficando ∆∝ con respecto al tiempo para las frecuencias
seleccionadas. Una vez teniendo la frecuencia que presenta mayor R2, se les hizo
una correlación relacionando el parámetro impedimétrico seleccionado con
respecto a las variaciones en la concentración de mercuriales y la concentración
bacteriana.
35
5. Resultados y Discusión
5.1. Curvas de crecimiento microbiano
A continuación se presentan los resultados del crecimiento de vida libre de las
bacterias estudiadas capaces de resistir 20 ppm de mercuriales y 400 ppm para la
Densidad celular aproximada
(1x108 UFC/ml)
bacteria Hg5.
10
8
Hg1
6
Hg2
4
2
Hg3
0
Hg4
0
10
20
30
40
50
Hg5
Tiempo (horas)
Figura 13.Curva de crecimiento de los cultivos bacterianos en ausencia de
mercurio.
Como se puede observar en la figura 13, en ausencia de mercurio ocurre una fase
de adaptación de las bacterias de aproximadamente seis horas, en la mayoría de
los casos. Se llega a la fase estacionaria en un periodo aproximado de 20 a 30
horas con todas las bacterias. Se observó que cuando las bacterias Hg1 a Hg5
crecen en ausencia de mercurio, el tipo de crecimiento predominante es de vida
libre, es decir, las bacterias crecen dispersas en el medio de cultivo, siendo
representativas las mediciones obtenidas por el método de McFarland para
evidenciar el crecimiento. Sin embargo, no ocurre lo mismo con el sistema en que
las bacterias crecen en presencia de mercurio a 20 ppm (figura 14). En presencia
de mercurio se observa aproximadamente la misma tendencia en las curvas de
crecimiento que con ausencia de mercurio, pero la magnitud de la densidad celular
en fase libre disminuye considerablemente. Se evidenció durante el cultivo la
formación de agregados microbianos y precipitados en el sistema, lo cual sugiere
36
que las bacterias forman biopelícula cuando son expuestas a 20 ppm de HgCl2. En
el caso particular de la bacteria Hg5 se observó que el incremento de la
concentración de mercurio a 400 ppm (figura 14) favorece significativamente su
crecimiento, en comparación con 20 ppm alcanzando incluso niveles de
crecimiento similares a los observados en ausencia de mercurio (figura 13),
aunque también en el caso de 400 ppm se observó la formación de pequeños
agregados y precipitados de color café.
La concentración letal de HgCl2 reportada para bacterias de crecimiento libre no
resistentes a compuestos mercuriales es de 4 ppm. Las bacterias de vida libre que
crecen en presencia de 10-25 ppm de HgCl2 se reconocen como altamente
resistentes a compuestos mercuriales, mientras que para bacterias resistentes a
CH3ClHg se han reportado concentraciones de 0.25 a 50 ppm [Rosas-Hernández,
2009]. Las bacterias utilizadas en el presente estudio se consideran altamente
resistentes al HgCl2 y CH3ClHg y su resistencia podría estar estrechamente ligada
a su capacidad para formar biopelículas. Se ha reportado que bacterias que
forman biopelículas son potencialmente capaces de tolerar concentraciones hasta
600 veces más elevadas que las bacterias en estado planctónico [Teitzel, 2003].
La formación de biopelículas implica el atrapamiento de las células bacterianas en
una masa de sustancias poliméricas extracelulares, generando un gradiente de
concentraciones como mecanismo de protección ante la toxicidad de diferentes
compuestos [Costerton et al., 1999; Davey et al., 2000].
De acuerdo con lo reportado en la literatura, el precipitado café oscuro sugiere la
mineralización de los compuestos mercuriales a una forma potencialmente
insoluble de sulfuro de mercurio (HgS) con el azufre mineral o presente en
compuestos orgánicos como proteínas, y, dado que aparece también la formación
de biopelícula, se considera la potencial quelación de mercurio insoluble en la
matriz polimérica extracelular [Essa et al., 2002]. En conjunto, estos agregados y
precipitados serían el factor determinante en la reducción del crecimiento
microbiano de vida libre de las bacterias estudiadas en presencia de HgCl2.
37
Densidad celular aproximada
(1x108 UFC/ml)
6
5
Hg1-20 ppm
4
Hg2-20 ppm
3
Hg3-20 ppm
2
Hg4-20 ppm
1
Hg5-20 ppm
0
0
10
20
30
40
Hg5-400 ppm
50
Tiempo (horas)
Densidad celular
aproximada (1x108 UFC/ml)
(a)
2
1.5
1
0.5
0
0
10
20
30
40
50
Tiempo (horas)
(b)
Figura 14. Curva de crecimiento de los cultivos bacterianos en presencia de
mercurio, donde (b) es una ampliación de lo que ocurre en (a) a bajas densidades
celulares.
5.2. Seguimiento de la concentración de mercurio.
En la figura 15 se observa el comportamiento dinámico de la concentración de
mercurio para un sistema sin bacterias y los sistemas con las bacterias Hg1 a Hg5
en el sobrenadante. Se observa que en ausencia de bacterias, la concentración de
HgCl2 permanece constante en la fase líquida con respecto al tiempo. En el
sobrenadante se observó una reducción en las concentraciones de cloruro de
mercurio, con Hg1 15%, Hg2 23%, Hg3 9%, Hg4 53% y Hg5 35% para un periodo
de 48 horas, con respecto al sistema estéril.
38
Se puede observar que la
concentración en el sobrenadante se encuentra por debajo de la línea estéril
Concentración de Hg (ppm)
(figura 15).
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
20 ppm
Hg1 sobrenadante
Hg2 sobrenadante
Hg3 sobrenadante
Hg4 sobrenadante
Hg5 sobrenadante
0
10
20
30
40
50
60
Tiempo (horas)
Figura 15. Mercurio residual en el sobrenadante de las bacterias.
La pérdida de la concentración de mercurio en las soluciones puede atribuirse a
que el mercurio es un compuesto muy volátil que requiere estar en un medio
oxidado para permanecer en solución, de lo contrario se puede perder
considerablemente de las soluciones. De otro modo puede también formar
precipitados
por
medio
de
su
oxidación
química.
Sin
embargo,
independientemente del fenómeno que ocurre, en algunas bacterias se observa
que la concentración de la pastilla con respecto al tiempo disminuye de las 0 a las
25hrs, pero se incrementa de las 25 a las 48 hrs, lo cual se atribuye a que
conforme pasa el tiempo y se incrementa la concentración de bacterias, estas
participan activamente en el atrapamiento de pequeñas cantidades de mercurio.
Por otra parte, se observa que la concentración en la pastilla (figura 16) en todos
los casos es ligeramente mayor que en la fase acuosa, lo cual puede asociarse a
que en las bacterias pueden retenerse una cantidad de mercurio ligeramente
mayor que en el medio abiótico.
39
Concentración de Hg (ppm)
25
20
20 ppm
15
Hg1 pastilla
10
Hg2 pastilla
Hg3 pastilla
5
Hg4 pastilla
0
Hg5 pastilla
0
10
20
30
40
50
60
Tiempo (horas)
Figura 16. Mercurio en la pastilla bacteriana
El mercurio total puede determinarse por la suma en las concentraciones de
mercurio en el sobrenadante y la pastilla, el resto del mercurio pudo haberse
perdido por volatilización o precipitación formando agregados heterogéneos. Lo
anterior se puede explicar considerando que el cloruro de mercurio en el medio
puede exhibir tres posibles caminos en el sistema, el primero es que no haya
interacción con las células, el segundo es que sea captado por la célula y
expulsado de nuevo al medio y el tercero es que se mantenga en la célula al
momento de hacer el análisis [Robles et al., 2000].
La disminución de HgCl2 disuelto puede deberse a varios factores, entre ellos la
quelación del mercurio en biopelículas, la precipitación de compuestos mercuriales
por los microorganismos o la volatilización del mismo como un mecanismo de
eliminación de este compuesto en su medio de crecimiento [Essa et al., 2002],
aunque determinar que mecanismo es el que ocurre está fuera de los alcances de
la presente tesis.
40
5.3. Determinación de azúcares reductores (DNS).
En las siguientes gráficas se muestran los resultados de la prueba para determinar
azúcares reductores en los medios de cultivo en presencia y ausencia de
mercurio.
En la figura 18 se puede observar que la concentración de glucosa para la bacteria
Hg1 con mercurio disminuyó aproximadamente un 18% y sin mercurio 12%, esto
nos indica que hay un mayor consumo de sustrato en el sistema con mercurio
después de 48 hrs.
Concentración (g/L)
12
11
10
Con 20 ppm Hg
Sin Hg
9
Blanco
8
0
10
20
30
40
50
Tiempo (horas)
Figura 17: Gráfica del seguimiento azúcares reductores para la bacteria Hg1 con y
sin mercurio.
El consumo de glucosa para las bacterias sin mercurio Hg2 es de 31%, Hg3 33%,
Hg4 17% y Hg5
27.2%
el cual es mayor que para la mismas bacterias en
presencia de mercurio los cuales fueron de 3.3% para Hg2, 2.7% para Hg3, 8%
para Hg4, 2% para Hg5 a 20 ppm y 3% para Hg5 a 400 ppm (figuras
(figura 19-22), lo
cual se puede deber a que hay una mayor inhibición de crecimiento por la
presencia de sustancias tóxicas para el microorganismo.
41
Concentración (g/L)
12
11
10
Con 20 ppm Hg
9
8
Sin Hg
7
Blanco
0
10
20
30
40
50
Tiempo (horas)
Figura 18.. Gráfica del seguimiento azúcares reductores para la bacteria Hg2 con y
sin mercurio.
Concentración (g/L)
12
11
10
9
Con 20 ppm Hg
8
Sin Hg
7
Blanco
6
0
10
20
30
40
50
Tiempo (horas)
Figura 19.. Gráfica del seguimiento azúcares reductores para la bacteria Hg3 con y
sin mercurio.
Concentración (g/L)
12
11
10
9
Con 20 ppm Hg
8
Sin Hg
7
Blanco
6
0
10
20
30
40
50
Tiempo (horas)
Figura 20.. Gráfica del seguimiento azúcares reductores para la bacteria Hg4 con y
sin mercurio.
42
Concentración (g/L)
12
11
10
Con 400 ppm Hg
9
Con 20 ppm Hg
8
Sin Hg
7
Blanco
6
0
10
20
30
40
50
Tiempo (horas)
Figura 21.. Gráfica del seguimiento azúcares reductores para la bacteria Hg5 con
y sin mercurio.
La bacteria que tuvo mayor remoción de glucosa en presencia de mercurio
comparado con el medio sin mercurio fue la bacteria Hg1. E
En
n el resto de las
bacterias la remoción fue mayor en los sistemas sin mercurio, sin embargo dentro
de éstas la bacteria que tuvo mayor consumo de glucosa en el medio con mercurio
fue la bacteria Hg4. Lo anterior podría deberse a que la bacteria Hg1 en presencia
pre
de mercurio tiene que consumir una mayor cantidad de sustrato para poder
efectuar su mecanismo de resistencia al medio tóxico en el que se encuentra. En
casi todos los casos el mayor consumo de sustrato se realizó a partir de las 25 a
las 30 hrs, que
e puede ser el tiempo en el que la bacteria se adapta al medio.
5.4. Caracterización bioquímica de las cepas resistentes a compuestos
mercuriales.
En la tabla 9 se pueden observar los resultados de la caracterización bioquímica.
En general se puede ver activid
actividad
ad positiva de ureasa en todas las bacterias
excepto en Hg3, formación de indol en Hg4, acidificación de glucosa en todas y
actividad negativa de acidificación de lactosa melizitosa, rafinosa y sorbitol.
43
Tabla 9: Características bioquímicas de las cepas resistentes a compuestos
mercuriales.
Cepa
Hg1
Hg2
Hg3
Hg4
Hg5
Formación de Indol
-
-
-
+
-
Ureasa
+
+
-
+
+
Acidificación (Glucosa)
+
+
+
+
+
Acidificación (Manitol)
+
-
+
-
-
Acidificación (Lactosa)
-
-
-
-
-
Acidificación (Sacarosa)
+
+
-
+
-
Acidificación (Maltosa)
+
+
-
+
-
Acidificación (Xylosa)
+
-
-
-
+
Acidificación (Arabinosa)
+
-
-
-
-
Hidrólisis (Proteasa, Gelatina)
+
+
-
+
-
Hidrólisis (β-glucosidasa, Esculina)
+
+
+
+
-
Acidificación (Glicerol)
+
-
-
-
-
Acidificación (Celobiosa)
+
-
+
-
-
Acidificación (Manosa)
+
-
+
-
+
Acidificación (Melizitosa)
-
-
-
-
-
Acidificación (Rafinosa)
-
-
-
-
-
Acidificación (Sorbitol)
-
-
-
-
-
Acidificación (Ramnosa)
-
-
+
-
-
Acidificación (Trealosa)
+
+
+
+
-
Catalasa
+
+
+
+
+
En base a lo anterior se pudo definir las condiciones de crecimiento de las
bacterias, estableciendo la fuente de carbono (glucosa) que se utilizó como común
denominador para los microorganismos estudiados. Así mismo se conoció la
actividad bioquímica y de esta forma se pudo complementar la información que se
tiene de las bacterias.
5.5. Extracción y visualización de ADN de microorganismos resistentes a
compuestos mercuriales
En la figura 23 se observa el ADN obtenido de los cultivos microbianos puros. Las
bandas fluorescentes corresponden al ADN separado de acuerdo al peso
44
molecular del mismo. Se observa que de las 5 muestras bacterianas y M para el
marcador de peso molecular, se obtuvo suficiente cantidad de ADN para las
reacciones de PCR.
CR. La cuantificación de la concentración del ADN corresponde al
menos a 80 ng cuando este es comparado con el patrón proporcionado por el
fabricante.
Figura 22.. Visualización del ADN extraído de las bacterias Hg1
Hg1-Hg5
Hg5 mediante
electroforesis
lectroforesis horizontal y marcador de peso molecular.
El ADN extraído se utilizó como base para la amplificación del gen ribosomal 16S
por medio de la reacción en cadena de la polimesara (PCR, por sus siglas en
inglés).
5.6. Identificación de las bacterias se
seleccionadas
leccionadas y análisis de filogenia.
En la Figura 24 se puede observar el producto de PCR para las bacterias y el
marcador de peso molecular M, con un peso aproximado de 1500 pares de
bases.
45
Figura 23.. Gen ribosomal 16S obtenido mediante PCR de las bacterias Hg1 a Hg5
El microorganismo Hg4 no alineó en RDP por lo que no se consideró para el
árbol. Presuntivamente se cree que puede tratarse de una archea y no de una
bacteria.
El análisis filogenético se realizó mediant
mediante
e el método de máxima parsimonia de las
secuencias del gen 16S rR
rRNA de los aislamientos [Nixon, 1999].
46
Figura 24. Árbol filogenético.
De un total de 2096 caracteres en el alineamiento, solo 196 (9.3%) fueron
filogenéticamente informativos. El árbol que se muestra es el consenso estricto de
10 árboles igualmente parsimoniosos (L = 362). El índice de consistencia se
refiere a la relación entre los cambios, con respecto a los conservados y la
retención es el número de cambios observados en relación a un número máximo
de cambios, estos fueron de 0.75 y 0.89, respectivamente. Los números sobre las
ramas indican el valor de soporte (bootstrap) de 1000 repeticiones. Entre
paréntesis se indican los números de accesión de las secuencias utilizadas como
vecinos en el análisis filogenético. Como grupo externo se utilizó la secuencia del
gen 16S rRNA de E. coli. unc: no cultivada.
Se obtuvieron cuatro bacterias, tres de las cuales pertenecen al Filum Firmicute,
familia Bacillaceae (Hg2, Hg3 y Hg5). Hg3 pertenece al género Bacillus, Hg1
podría ser una bacteria nueva, lo mismo que Hg2 y Hg5.
47
5.7. Resultados experimentales de impedancia
A continuación se mustran los diagramas de Nyquist y de Bode para tres de las
bacterias estudiadas en presencia y ausencia de mercurio, por ser representativas
para la descripción de los resultados. El resto de las gráficas se presentan en el
apéndice A.
450
0.01 Hz
0 hrs
300
-Zi [kohm]
30
6 hrs
45 hrs
-Zi [kohm]
27 hrs
150
25
20
15
10
5
48 hrs
1 Hz
0
0
0
150
300
0
450
5
10 15 20 25 30
Zr [kohm]
Zr [kohm]
(a)
80
70
60
0 hrs
Ф
50
40
6 hrs
30
27 hrs
20
45 hrs
10
48 hrs
0
0.01
1
100
log f
10000
(b)
Figura 25. a) Diagrama de complejo de la bacteria Hg1 sin Hg, b) diagrama de
Bode de Hg1 sin Hg.
48
En las figuras 26 y 27 se pueden observar los diagramas correspondientes a las
bacteria Hg1 en ausencia y presencia de mercurio respectivamente. En el primer
caso se pueden observar visualmente los cambios con respecto al tiempo,
teniendo variaciones en las tendencias de los diagramas de Nyquist a altas y bajas
frecuencias (figura 26). A altas frecuencias (figura 26a, derecha) se observa una
tendencia de semicírculo que muestra una influencia de los fenómenos de
activación que pudiera estar asociada a las reacciones microbianas asociadas con
el fenómeno de oxido-reducción de sustratos y productos metabólicos, el diámetro
del semicírculo se incrementa conforme pasa el tiempo, lo cual es un indicativo de
que disminuye la velocidad de los fenómenos de activación en el electrolito
[Domínguez-Benetton, 2007]. A bajas frecuencias se perciben fenómenos
difusivos que se acentúan con el paso del tiempo y que pueden atribuirse a la
formación de agregados microbianos, asi mismo en el diagrama de Bode (figura
26b) se observan cambios en el ángulo de fase a altas y bajas frecuencias con
respecto al tiempo, habiendo un punto intermedio donde convergen los datos, lo
que nos puede indicar que los cambios se deben a fenómenos diferentes. Schwan
define tres regiones α, β y γ, donde la región β que va de 100 Hz a 10 MHz es
considerada la más compatible para estimar la concentración celular debido a la
doble capa fosfolipídica de la membrana celular de las bacterias que tiene una
influencia significativa en la impedancia eléctrica [Kim et al., 2009]. Por lo tanto, la
región β para los resultados obtenidos pueden atribuirse al incremento de la
concentración celular de vida libre, puesto que la impedancia eléctrica, a diferencia
de la impedancia electroquímica, estudia los fenómenos en el electrolito y no los
interfaciales.
En el caso del sistema con mercurio (figura 27a) la tendencia en los diagramas de
Nyquist se mantiene a altas y bajas frecuencias habiendo cambios visuales con
respecto al tiempo a bajas frecuencias en la pendiente tendiendo a tener un
comprotamiento de semicírculo, que se puede deber a los fenómenos
electroquímicos relacionados con las células y su medio.
49
200
0 hrs
3 hrs
50
6 hrs
40
24 hrs
100
30
27 hrs
30 hrs
50
45 hrs
48 hrs
-Zi [kohm]
-Zi [kohm]
150
20
10
0
0
0
50
100
150
0
200
10
20
30
40
50
Zr [kohm]
Zr [kohm]
φ
(a)
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0 hrs
3 hrs
6 hrs
24 hrs
27 hrs
30 hrs
45 hrs
48 hrs
0.01
1
100
10000
Log f
(b)
Figura 26.. a) Diagrama de complejo de la bacteria Hg1 con Hg 20 ppm, b)
diagrama de Bode de Hg1 con Hg 20 ppm
50
250
40
0 hrs
150
3 hrs
6 hrs
100
24 hrs
50
27 hrs
-Zi [kohm]
-Zi [kohm]
200
30 hrs
0
30
20
10
0
45 hrs
0
50
100
150
200
250
0
10
20
30
40
48 hrs
Zr [kohm]
Zr [kohm]
Ф
(a)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0 hrs
3 hrs
6 hrs
24 hrs
27 hrs
30 hrs
0.01
1
100
10000
log f
45 hrs
48 hrs
(b)
Figura 27.. a) Diagrama de complejo de la bacteria Hg2 sin Hg, b) diagrama de
Bode de Hg2 sin Hg
51
200
0 hrs
3 hrs
150
6 hrs
30
27 hrs
100
30 hrs
45 hrs
50
48 hrs
-Zi [kohm]
-Zi [kohm]
24 hrs
20
10
0
0
50
100
150
0
200
0
10
20
30
Zr [kohm]
Zr [kohm]
(a)
80
70
0 hrs
3 hrs
6 hrs
24 hrs
27 hrs
30 hrs
45 hrs
48 hrs
60
φ
50
40
30
20
10
0
0.01
1
100
10000
Log f
(b)
Figura 28.. a) Diagrama de complejo de la bacteria Hg2 con Hg 20 ppm, b)
diagrama de Bode de Hg2 con Hg 20 ppm
La bacteria Hg2 muestra un comportamiento similar a la bacteria Hg1 (figuras
(figura 28 y
29), en el sistema sin mercurio se obervan los cambios a altas y bajas frecuencias
de los fenómenos de activación y difusión (figura 28a). En en el sistema con
mercurio se ven cambios difusivos a altas frecuencias con una tendencia a la
activación a bajas frecuencias. La magnitud de la impedancia disminuye en el
sistema con mercurio con respecto al sistema sin merc
mercurio
urio para la bacteria Hg1 y
Hg2, lo cual podría deberse a que la presencia de mercurio reduce la resistencia
global del sistema (figura 29
29a).
52
250
0 hrs
200
50
6 hrs
24 hrs
100
27 hrs
30 hrs
50
40
-Zi [kohm]
-Zi [kohm]
3 hrs
150
0
48 hrs
0
50
100
150
200
20
10
45 hrs
0
30
250
0
Zr [kohm]
10
20
30
40
50
Zr [kohm]
(a)
90
80
0 hrs
3 hrs
6 hrs
24 hrs
27 hrs
30 hrs
45 hrs
48 hrs
70
60
φ
50
40
30
20
10
0
0.01
1
100
10000
Log f
(b)
Figura 29 a) Diagrama de complejo de la bacteria Hg5 sin Hg, b) diagrama de
Bode de Hg5 sin Hg
La bacteria Hg3 (apéndice A) presenta el mismo comportamiento que la bacteria
Hg1 y Hg2 en ausencia de mercurio
mercurio, teniendo en los diagramas de Nyquist
N
la
formación del semicírculo a altas frecuencia y el cambio a tendencias difusivas a
bajas frecuencias. Para el sistema con mercurio se ve una tendencia a la
activación.
53
180
160
0 hrs
140
3 hrs
6 hrs
100
24 hrs
80
50
27 hrs
60
30 hrs
40
45 hrs
20
48 hrs
0
40
-Zi [kohm]
-Zi [kohm]
120
30
20
10
0
20 40 60 80 100 120 140 160 180
0
Zr [kohm]
0
10
20 30 40
Zr [kohm]
50
(a)
90
80
0 hrs
3 hrs
6 hrs
24 hrs
27 hrs
30 hrs
45 hrs
48 hrs
70
60
50
φ
40
30
20
10
0
0.01
1
100
10000
Log f
(b)
Figura 30.. a) Diagrama de complejo de la bacteria Hg5 con Hg 20 ppm, b)
diagrama de Bode de Hg5 con Hg 20 ppm.
La bacteria Hg5 muestra comportamientos similares para el sistema sin mercurio y
con 20 ppm de mercurio, teniendo una tendencia a la difusión a altas frecuencias
fre
y
fenómenos de activación a bajas frecuencias. La tendencia de los fenómenos en
el sistema con 400 ppm muestra que es de activación a altas y bajas frecuencias,
frecuencia
cambiando ligeramente con respecto al tiempo a fenómenos de difusión. En el
diagrama de Bode
ode (figura 32b)
32b), a bajas frecuencias se pueden distinguir
54
notablemente los cambios en relación al tiempo
tiempo,, notándose que la magnitud del
ángulo de fase se increment
incrementa en un intervalo que se puede asociar,
asociar en los
diagramas de Nyquist,, a las frecuencias que tienden más a los fenómenos de
difusión. Se puede apreciar con mayor claridad, que lla
a magnitud de impedancia
disminuye conforme se incrementa la concentración de mer
mercurio
curio para la bacteria
(figura 30, 31 y 32) y este comportamiento se presenta en todas los
microorganismos estudiados
estudiados, lo que permite asumir que la impedancia es una
técnica sensible a la variación en las concentraciones de mercurio.
60
0 hrs
3 hrs
10
6 hrs
30
24 hrs
30 hrs
15
7.5
Zi [kohm]
27 hrs
5
45 hrs
2.5
48 hrs
0
0
15
30
45
0
60
0
Zr [kohm]
2.5
5
Zr [kohm]
(a)
80
70
0 hrs
3 hrs
6 hrs
24 hrs
27 hrs
30 hrs
45 hrs
48 hrs
60
50
φ
Zi [kohm]
45
40
30
20
10
0
0.01
1
100
Log f
(b)
55
10000
7.5
10
Figura 31. a) Diagrama de complejo de la bacteria Hg5 con Hg 400 ppm, b)
diagrama de Bode de Hg5 con Hg 400 ppm.
5.8. Análisis de impedancia con circuitos equivalentes
En la figura 33 se muestra el circuito eléctrico equivalente que representa los
sistemas abióticos.
Figura 32. Circuito eléctrico equivalente para los sistemas sin bacterias.
En la tabla 10 se puede observar que no hay cambios significativos en la
resistencia al electrolito conforme al tiempo, es decir, el electrolito se mantiene en
condiciones casi estables para el periodo estudiado, por lo que se infiere que la
oxidación abiótica de los compuestos del medio no es significativa, considerando
los parámetros estadísticos que arroja el programa de simulación al respecto. De
igual forma las variaciones en el elemento de fase constante (Q1) son mínimas,
teniendo los valores del parámetro n cercanos a uno, lo que nos indica que hay
comportamiento que pasa de ser un sistema más heterogéneo a uno con la
distribución de propiedades más homogéneas. Ello es congruente con que el
sistema a tiempos cortos se muestra inestable debido a la presencia de un gran
número de especies electroactivas, pero conforme pasa el tiempo las posibles
interacciones químicas y físicas de los componentes del medio se habrán agotado,
56
al no encontrarse agitado ni sujeto a catálisis química o electroquímica la
resistencia a la transferencia de carga se incrementa de las 0 horas a las 48 horas
en un 48%, es decir, la resistencia a la transferencia de carga es la que
mayoritariamente contribuye al cambio en la impedancia.
Tabla 10: Variación de los parámetros del circuito eléctrico equivalente del sistema
estéril sin mercurio con respecto al tiempo.
Resistencia a la
Resistencia al electrolito
Q1
transferencia de carga
Tiempo (horas)
(kohm.cm²)
(Farads)
n1
(kohm.cm²)
0
0.23922
0.06867
0.85896
382.8
3
0.25821
0.06229
0.87186
319.7
6
0.25038
0.06178
0.87395
321.3
24
0.25215
0.05803
0.87695
590
27
0.25372
0.05758
0.8776
603.7
30
0.24633
0.05803
0.87857
583.4
45
0.21767
0.06177
0.87758
623.5
48
0.25589
0.05803
0.87775
735.9
En la figura 34 se presenta el circuito eléctrico equivalente que se usó para
representar los sistemas con bacterias
Figura 33. Circuito eléctrico equivalente para los sistemas con bacterias
57
Los parámetros del sistema con la bacteria Hg1 sin mercurio sugieren que hay un
incremento en la resistencia al electrolito y la resistencia a la transferencia de
carga aumenta considerablemente. El valor de la resistencia a la biopelícula
también se incrementa de las 0 a las 48 horas. El parámetro n del elemento de
fase constante se asocia a la distribución de las propiedades de la biopelícula que
es heterogénea y conforme pasa el tiempo esa heterogeneidad va aumentando,
según los valores de n1 y n2, especialmente el último.
En la figura 35 se puede observar el cambio de la resistencia al electrolito con
respecto al tiempo para el sistema sin mercurio, Para la bacteria Hg1 se
incrementa la resistencia conforme pasa el tiempo, sin
embargo ocurre lo
contrario para la bacteria Hg2, es decir, disminuye. Para las bacterias Hg3, Hg4 y
Hg5 los valores no exhiben variaciones significativas con respecto al tiempo, pero
los valores para las últimas dos son menores que el resto lo que puede indicar que
en su medio hay especies que como producto de su metabolismo facilitan el paso
de la señal y se mantiene en equilibrio.
1.4
1.2
R1
1
Hg1
0.8
Hg2
0.6
Hg3
0.4
0.2
Hg4
0
Hg5
0
10
20
30
40
50
60
Tiempo (horas)
Figura 34. Variación de la resistencia al electrolito con respecto al tiempo para los
sistemas sin mercurio
58
1
0.9
CPE1 - n
0.8
0.7
Hg1
0.6
Hg2
0.5
Hg3
0.4
Hg4
0.3
Hg5
0.2
0
20
40
60
Tiempo (horas)
Figura 35. Variación del parámetro n del elemento de fase constante asociado a la
biopelícula con respecto al tiempo para los sistemas sin mercurio
Para las bacterias Hg1, Hg2 y Hg3, la distribución de las propiedades son
heterogéneas incrementando esta tendencia con respecto al tiempo, lo cual nos
puede indicar hay una mayor aglomeración bacteriana la cual no es uniforme. En
el caso de las bacterias Hg4 y Hg5
tienen una distribución más homogénea
manteniéndose relativamente constante con respecto al tiempo (figura 36).
59
160
140
120
Hg1
80
Hg2
60
Hg3
R2
100
40
Hg4
20
Hg5
0
-20 0
20
40
60
Tiempo (horas)
20
R2
15
10
5
0
0
20
40
60
Tiempo (horas)
Figura 36. Variación de la resistencia a la biopelícula con respecto al tiempo para
los sistemas sin mercurio
En la figura 37 se puede ver que la resistencia a la biopelícula se incrementa con
respecto al tiempo para todos los casos, pues al incrementarse la aglomeración de
partículas en la biopelícula y los productos que conlleva a su formación se debe
incrementar la resistencia. Se muestran cambios representativos en la bacteria
Hg4, es decir, que
para este microorganismo además de incrementarse
significativamente
resistencia,
la
presenta
homogénea.
60
una
distribución
relativamente
1
CPE2 - n
0.8
Hg1
0.6
Hg2
0.4
Hg3
0.2
Hg4
0
Hg5
0
20
40
60
Tiempo (horas)
Figura 37. Variación del parámetro n del elemento de fase constante asociado a la
distribución de cargas en la interfaz con respecto al tiempo para los sistemas sin
mercurio
Todas las bacterias presentan distribución constante con respecto al tiempo con
excepción de la bacteria Hg4, que pasa de ser heterogéneamente distribuido a
uno más homogéneo (figura 38).
Las bacterias Hg1, Hg2 y Hg3 están fuertemente determinadas por la resistencia a
la transferencia de carga, puesto que sus valores son altos y hay cambios
significativos con respecto al tiempo. Los cambios en las bacterias Hg5 se
mantienen relativamente constantes para la resistencia a la transferencia de carga
(figura 39).
61
1.2E+20
R3
1E+20
8E+19
Hg1
6E+19
Hg2
4E+19
Hg3
2E+19
Hg4
0
-2E+19 0
20
40
Hg5
60
Tiempo (horas)
15000
10000
R3
5000
0
0
10
20
30
40
50
60
Tiempo (horas)
Figura 38. Variación de la resistencia a la transferencia de carga con respecto al
tiempo para los sistemas sin mercurio.
Tabla 11: Variación de los parámetros del circuito eléctrico equivalente del sistema
Hg1 con Hg 20 ppm con respecto al tiempo.
Tiempo (horas) R1
CPE1-Q
CPE1-n
R2
CPE2-Q
CPE2-n
R3
0
0.23492 0.062236
0.90861
6.965 0.013252
0.94526
606
3
0.2229 0.070982
0.88241
19.52 0.003824
1.186
690.2
6
0.22516 0.059254
0.91459
5.532 0.013219
0.93605
639
24
0.23318 0.056525
0.9119
6.65 0.011641
0.93909
625.3
27
0.23666 0.056163
0.91398
7.456 0.012323
0.94366
646.4
30
0.24437 0.055422
0.91462
7.896 0.012118
0.94755
710.9
45
0.24248 0.054618
0.91889
5.051 0.012165
0.93509
684.9
48
0.26613
0.92121
0.93864
967.7
0.05199
62
5.61
0.01121
En el sistema con mercurio de la bacteria Hg1 (tabla 11)
la resistencia al
electrolito se mantiene relativamente constante, la resistencia a la biopelícula
incrementa y disminuye con el tiempo teniendo un valor a las 48 horas menor que
el inicial. La distribución de la biopelícula y de la interfaz es similar a un capacitor y
no presenta cambios significativos con respecto al tiempo.
5.9. Análisis de impedancia con diferenciales
En la figura 40 se muestran diferenciales con respecto al tiempo usando al módulo
de la impedancia como parámetro de comparación, se pueden observar las
frecuencias en las cuales se observa un comportamiento lineal, y que son útiles
para hacer la correlación con la concentración de mercuriales o la concentración
bacteriana, según sea el caso. Se puede ver a bajas frecuencias el intervalo en el
cual se presenta una tendencia de incremento lineal (0.01 a 0.63 Hz), sin embargo
a 25000 Hz también se observa una tendencia lineal. Para comprobar que
efectivamente existe esta tendencia, se determinó el coeficiente de correlación de
Pearson de las diferenciales de los parámetros impedimétricos con respecto al
tiempo a las frecuencias propuestas, y se seleccionó aquel que fue mayor.
250
200
48 hrs
45 hrs
150
Δα
30 hrs
27 hrs
100
24 hrs
50
6 hrs
3 hrs
0
2.50E-02
1.00E-01
4.00E-01
1.58E+00
Frecuencia Hz
6.33E+00
2.50E+01
1.00E+02
4.00E+02
1.58E+03
6.33E+03
2.50E+04
0 hrs
Figura 39. Diferenciales del sistema Hg1 sin mercurio con respecto al sistema
estéril usando el módulo de la impedancia como parámetro.
63
Tabla 12: Frecuencias que presentan mayor correlación de Pearson para los
parámetros impedimétricos de los sistemas con bacterias.
Bacteria sin Hg
Sistema →
|Z|
Zi
Zr
AF
Bacteria con Hg
Coeficiente
Coeficiente
Frecuencia
Frecuencia
de
de
Hz
Hz
correlación
correlación
Hg1
0.91289711
25000
0.90221807
15823
Hg2
0.89771494
0.01
0.72263428
6.3291
Hg3
0.82966065
0.01
0.95405506
0.015823
Hg4
0.78940912
0.01
0.79431072
0.015823
Hg5
0.77401905
0.01
0.80439147
0.015823
Hg5 400 ppm
-
-
0.92067721
1
20 ppm
-
-
-
-
400 ppm
-
-
-
-
Hg1
0.96541918
6329.1
0.76167109
0.015823
Hg2
0.90903004
0.01
0.74985313
25
Hg3
0.84882895
0.01
0.96214581
0.015823
Hg4
0.9095034
0.015823
0.85566419
0.015823
Hg5
0.80050012
1000
0.94077589
63.291
Hg5 400 ppm
-
-
0.92139058
2.5
20 ppm
-
-
-
-
400 ppm
-
-
-
-
Hg1
0.94627918
0.25
0.64103703
1000
Hg2
0.92111729
0.1
0.95163927
0.1
Hg3
0.85217359
0.25
0.96214581
0.015823
Hg4
0.95813836
0.025
0.63956961
0.015823
Hg5
0.93301036
0.1
0.86613528
0.1
Hg5 400 ppm
-
-
0.89638015
0.25
20 ppm
-
-
-
-
400 ppm
-
-
-
-
Hg1
0.92551659
0.1
0.9445096
0.015823
Hg2
0.99362012
0.1
0.6813323
1.5823
Hg3
0.85272825
0.025
0.75983455
15.823
Hg4
0.91763474
0.015823
0.77212081
15.823
Hg5
4000
-
0.92758577
0.015823
Hg5 400 ppm
0.86464183
-
20 ppm
-
-
0.9139255
-
63.291
-
400 ppm
-
-
-
-
64
En la tabla 12 se muestra que el parámetro que presentó mejor coeficiente de
correlación de Pearson para la mayoría de las bacterias tanto en el sistema sin
mercurio y con mercurio fue la impedancia imaginaria. Se seleccionó el parámetro
que mostró un comportamiento lineal, de tal forma que se pueda detectar el
crecimiento bacteriano en presencia y ausencia de mercurio e identificar el
intervalo de frecuencias en el que se puede realizar la determinación.
De acuerdo a la tabla 12, el rango de frecuencias que muestra un comportamiento
más lineal para la mayoría de los parámetros y que por lo tanto puede asociarse al
crecimiento bacteriano va de 0.01 Hz a 1 Hz.
3
2.5
0.01 Hz
Zi
2
0.025 Hz
1.5
0.063291 Hz
1
0.15823 Hz
0.5
0.4 Hz
0
1 Hz
0
1
2
3
4
5
6
Densidad celular aproximada (1x108 UFC/ml)
Figura 40: Relación entre la impedancia imaginaria y la densidad celular para la
bacteria Hg1 sin Hg
Se tomaron los valores de impedancia imaginaria y concentración celular a esa
frecuencia y se graficaron para verificar si la correlación es directa y estrictamente
asociada al crecimiento microbiano y se determinó que aunque si se evidencia el
crecimiento
microbiano,
no
puede
determinarse
cuantitativamente
la
concentración celular mediante los datos de impedancia, aunque si son
directamente proporcionales (figura 41).
65
Tabla 13: Frecuencias que presentan mayor correlación de Pearson para los
parámetros impedimétricos de los sistemas con mercurio.
Hg sin bacterias
Sistema →
|Z|
Zi
Zr
AF
Hg con bacterias
Coeficiente
Coeficiente
Frecuencia
Frecuencia
de
de
Hz
Hz
correlación
correlación
Hg1
-
-
0.93194165
2500
Hg2
-
-
0.84740765
250
Hg3
-
-
0.72323051
0.4
Hg4
-
-
0.8473617
100
Hg5
-
-
0.71860131
0.025
Hg5 400 ppm
-
-
0.95064164
0.015823
20 ppm
0.91778789
0.01
-
-
400 ppm
0.87355628
0.025
-
-
Hg1
-
-
0.93867108
4000
Hg2
-
-
0.95271165
158.23
Hg3
-
-
0.82439718
25000
Hg4
-
-
0.85766523
1582.3
Hg5
-
-
0.78220027
2500
Hg5 400 ppm
-
-
0.96570384
0.015823
20 ppm
0.89871179
0.01
-
-
400 ppm
0.92420653
1000
-
-
Hg1
-
-
0.93174505
1582.3
Hg2
-
-
0.89503298
0.063291
Hg3
-
-
0.68864447
100
Hg4
-
-
0.94012574
0.015823
Hg5
-
-
0.81908128
0.025
Hg5 400 ppm
-
-
0.9111704
0.01
20 ppm
0.9762544
0.015823
-
-
400 ppm
0.91071538
-
0.015823
-
-
-
Hg1
0.87804576
4000
Hg2
-
-
0.99271699
0.063291
Hg3
-
-
0.8338508
25000
Hg4
-
-
0.94394974
0.025
Hg5
-
-
0.78892527
0.025
Hg5 400 ppm
-
-
20 ppm
0.65043896
2500
0.9668495
-
0.01
-
400 ppm
0.88090617
0.015823
-
-
66
Para el sistema con mercurio se hizo el mismo análisis. Se buscaron aquellas
frecuencias que con el tiempo presentaran un comportamiento lineal.
En la tabla 13 se muestra que el parámetro que presentó mejor coeficiente de
correlación de Pearson para la mayoría de las bacterias tanto en el sistema sin
bacterias y con bacterias fue la impedancia imaginaria. Se seleccionó el parámetro
que mostró un comportamiento lineal, de tal forma que se pueda detectar la
concentración de mercurio en presencia y ausencia de bacterias e identificar el
intervalo de frecuencias en el que se puede realizar la cuantificación.
De acuerdo a la tabla 13, se detectaron dos rangos de frecuencias que muestra
un comportamiento más lineal para la mayoría de los parámetros y que por lo
tanto puede asociarse a la detección de compuestos mercuriales con respecto al
tiempo, uno va de 0.1 Hz a 0.4 Hz y el otro de 1000 a 25000 Hz
0.6
0.5
Zi
0.4
0.01 Hz
0.3
0.025 Hz
0.2
0.063291 Hz
0.1
0.15823 Hz
0.4 Hz
0
0
2
4
6
8
Concentración de mercurio (ppm)
.
Figura 41: Relación entre la impedancia imaginaria y la concentración de mercurio
para la bacteria Hg2 a bajas frecuencias.
67
Zi
1
0.995
0.99
0.985
0.98
0.975
0.97
0.965
0.96
0.955
25000 Hz
10000 Hz
4000 Hz
1000 Hz
0
2
4
6
8
Concentración de mercurio (ppm)
Figura 42: Relación entre la impedancia imaginaria y la concentración de mercurio
para la bacteria Hg2 a bajas frecuencias
Tomando los valores de impedancia imaginaria y concentración de mercurio con
respecto al tiempo a esas frecuencias, se graficaron para verificar si la correlación
es directa y estrictamente asociada a la remoción de mercuriales y se determinó
que si se puede percibir una tendencia que disminuye según disminuye la
concentración de mercurio por lo que aunque si hay disminución, no se puede
determinar cuantitativamente la remoción de mercuriales mediante los datos de
impedancia (figura 42 y 43).
68
6. Conclusiones
Se analizaron los datos de impedancia para los sistemas en presencia y ausencia
de mercurio a diversos tiempos.
Con los diagramas de Nyquist y de Bode obtenidos experimentalmente, se
pudieron observar los cambios y asociar fenómenos que ocurren en los sistemas,
infiriendo que la impedancia permite detectar dichos fenómenos.
Se obtuvieron dos circuitos con los cuales, mediante su ajuste y simulación
asociado al sistema, se pudieron ver cambios con respecto al tiempo de cada uno
de los sistemas, dando una mejor idea de los fenómenos que ocurren en la
interfaz y en el medio.
Mediante el análisis de diferenciales se pudieron determinar las frecuencias en las
cuales se efectúan los fenómenos estudiados. A pesar de que efectivamente se
pueden detectar frecuencias que son características tanto para el crecimiento
bacteriano como para la remoción de mercuriales, no se puede determinar
cuantitativamente con respecto al tiempo con los experimentos realizados.
Se obtuvieron cuatro bacterias, tres de las cuales pertenecen al Filum firmicute,
familia Bacillaceae (Hg2, Hg3 y Hg5). Hg3 pertenece al género Bacillus
licheniformis, Hg1 podría ser una bacteria nueva, lo mismo que Hg2 y Hg5.
Ninguna de las bacterias anteriores esta reportada como resiste a compuestos
mercuriales.
69
7. Recomendaciones
Se recomienda hacer una evaluación de sistemas a diferentes concentraciones de
mercurio sin el efecto del tiempo y efectuar el mismo análisis con diferenciales
para determinar si de esta forma es posible hacer una cuantificación de los
compuestos removidos del medio con la técnica de impedancia. Así mismo se
propone realizar el análisis estadístico con los datos obtenidos para evaluar la
validez del método.
Posteriormente, en investigaciones que den continuidad a este estudio, con las
frecuencias características que permiten la cuantificación se pretende diseñar un
sensor
impedimétrico
que
permita
monitorear
la
disminución
concentraciones de mercuriales en efluentes acuosos contaminados.
70
de
las
8. Rererencias
•
Acosta
y
Asociados.
(2001).
“Inventario
Preliminar
de
Emisiones
Atmosféricas de Mercurio en México”. Comisión para la Cooperación
Ambiental. Pp 6 -38
•
Altschul, S. F., Madden, T. L., Schaffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller,
W. and Lipman, D. J. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new
generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research
25 (in press).
•
Barkay, T. and hyphen, t. g. (2005). Microbial Transformations of Mercury:
Potentials, Challenges, and Achievements in Controlling Mercury Toxicity in
the Environment. (Ed. I. L. Allen.) pp. 1-52. BioMérieux. “Galerias API”.
•
Camargo, Julio A. (2002). Contribution of Spanish-American silver mines
(1570-1820) to the present high mercury concentrations in the global
environment: a review. Chemosphere 48, 51-57.
•
Capolino, Elena, Tredici, Mario, Pepi, Milva, and Baldi, Franco (1997).
Tolerance to mercury chloride in Scenedesmus strains. BioMetals 10, 8594.
•
Clarkson, Thomas W., Magos, Laszlo, and Myers, Gary J. (2003). The
Toxicology of Mercury - Current Exposures and Clinical Manifestations. The
New England Journal of Medicine 1731-1737.
•
Clesceri, L. S. A., A. E. Greenberg y A. D. Eaton. (1998). Standard methods
for the examination of water and wastewater. 20th edition, American Public
Health Association, Washington, D.C., USA.
•
Cole, J., B. Chai, R. Farris, Q. Wang, S. Kulam, D. McGarrell, G. Garrity,
and J. Tiedje. 2005. The Ribosomal Database Project (RDP-II): sequences
and tools for high-throughput rRNA analysis. Nucl.Acids Res. 33:D294-D296
•
Contreras-Pinzón
M. E. (2004) "Diseño conceptual de un proceso de
fermentación para la elaboración de una bebida de jugo de aloe vera con
bacterias lácticas". Tesis de Licenciatura, Facultad de Ingeniería Química,
UADY, Mérida, Yucatán.
71
•
Costerton J., Stewar T. & Greenberg E. (1999). “Bacterial biofilms: A
common cause of persistenace infections.” Science. Pp. 1318-1322.
•
Davey M. & O’ Toole G. (2000). “Microbial Biofilms: From Ecology to
Molecular Genetics.” Microbiology and Molecular Biology Reviews. Pp.847867
•
De la Rosa, D. A., Volke-Sepúlveda, T., Solórzano, G., Green, C., Tordon,
R., and Beauchamp, S. (2004). Survey of atmospheric total gaseous
mercury in Mexico. Atmospheric Environment , 4839-4846.
•
DTSC. Department of Toxic Substances Control. “Mercury Report”. (2002).
Pp. 31 -44.
•
Dominguez-Benetton, X. (2007). “Biocomplexity and Bioelectrochemical
Influence of Gasoline Pipelines Biofilms in Carbon Steel Deterioration: A
Transmission Lines and Transfer Functions Approach.” PhD Thesis,
Instituto Mexicano del Petróleo. México D.F.
•
Essa, A. M. M., Macaskie, L. E., and Brown, N. L. (2002). Mechanisms of
mercury bioremediation. Biochem.Soc.Trans. 30, 672-674.
•
Hogg, Stuart. (2005). Essential Microbiology. Ed. John Wiley and Sons.
333-335
•
INE. Instituto Nacional de Ecología. (2000). “Diagnóstico del Mercurio en
México”. Pp 7-10.
•
Jaysankar, De. (2004) Mercury - resistant marine bacteria and their role in
bioremediation of certain toxicants. National Institute of Oceanography.
•
Jorcin, Jean-Baptiste; Orazem, Mark, Pébère, Nadine; Tribollet, Bernard
(2006). CPE analysis by locla electrochemical impedance spectroscopy.
Electrochimica Acta. 1473-1479.
•
Kim, Young Hun, Park, Jae Sung, and Jung, Hyo Il (2009). An impedimetric
biosensor for real-time monitoring of bacterial growth in a microbial
fermentor. Sensors and Actuators B: Chemical 138, 270-277.
•
Maidak, B., G. Olsen, N. Larsen, R. Overbeek, M. McCaughey, and C.
Woese. 1997. The RDP (Ribosomal Database Project). Nucleic Acids Res
25:109-111.
72
•
Mendóza-Flores, Juan; Romero-Durán, Rubén; Genescá-Llongueras Joan.
(2000). Espectroscopía de Impedancia Electroquímica en Corrosión, IMPUNAM.
•
Miller, G. L. (1959). Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determiantion of
Reducing Sugar. Anal. Chem. 426-428.
•
Muñoz-Berbel, X.; Vigu, N.;
Jenkins, A. T. A.; Mas, J., y Muñoz, F. J.
(2008). Impedimetric approach for quantifying low bacteria concentrations
based on the changes produced in the electrode-solution interface during
the pre-attachment stage. Biosensors and Bioelectronics 23, 1540-1546.
•
Nascimento, Andréa M. A. and Chartone-Souza Edmar (2003). Operon mer:
bacterial resistance to mercury and potential for bioremediation of
contaminated environments. Genetics and Molecular Research.
•
Nixon, K. C. (1999). The Parsimony Ratchet, a New Method for Rapid
Parsimony Analysis. Cladistics 15:407-414.
•
Rojas H., R.; Narváez Z., J.; Zamudio M., M.; Mena M., M. E. (2008). A
Simple Silica-based Method for Metagenomic DNA Extraction from Soil and
Sediments. Mol Biotechnol 13-17.
•
Rosas
Hernández,
I.
(2009).
Identificación
y
Caracterización
de
Microorganismos con Resistencia a Compuestos Mercuriales, Tesis de
Maestría, CIIEMAD, IPN, México.
•
Robles, L. C.; Feo, J. C. y Aller A. J. (2000). Selective preconcentration of
phenyl-mercury by living Escherichia coli and its determination by cold
vapour atomic absorption spectrometry. Analytica Chimica Acta.
•
Soria.L. (1999) Metodología para la prevención de accidentes y daños a la
salud y el ambiente ocasionados por mercurio o sus compuestos.
CENAPRED. 39-90.
•
Sorkhoh, N. A.; Ali, N.; Dashti, N.; Al-Mailem, D. M.; Awadhi, H.; Eliyas, M.;
Radwan, S. S.; (2010). Soil bacteria with the combined potential for oil
utilization,
nitrogen
fixation,
and
mercury
Biodeterorioration and Biodegradation 226-231.
73
resistance.
International
•
Teitzel G. & Parsek M. (2003). “Heavy Metal Resistance of Biofilm and
Planktonic
Pseudomonas
aeruginos”.
Applied
and
Environmental
Microbiology. Pp. 2313–2320.
•
Tribollet, Bernard, Orazem, Mark (2008). Electrochemical Impedance
Spectroscopy, CNRS.
•
UNEP. United Nations Environment Programme. (2002). Chemicals. “Global
mercury assessment.” Pp. 24-29.
•
US EPA. Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos. (2000).
“Metodo 6010c Inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry”.
Pp 1-34.
•
US EPA. Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos. (2002). “A
Citizen’s guide to Bioremediation”. Pp. 1-2.
•
US EPA. Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos. (2006).
“Water and Soil Remediation Technologies Workshop”.
•
US EPA. Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos. (2007).
“Treatment Technologies For Mercury in Soil, Waste, and Water”.
•
Wang, Qianrui, Kim, Daekeun, Dionysiou, Dionysios D., Sorial, George A.,
and Timberlake, Dennis (2004). Sources and remediation for mercury
contamination in aquatic systems--a literature review. Environmental
Pollution 131, 323-336.
•
Yang, Liju and Bashir, Rashid (2003). Electrical/electrochemical impedance
for rapid detection of foodborne pathogenic bacteria. Biotechnology
Advances 26, 135-150.
•
Zhu, Xiang; Lubeck, John; Kilbane. (2003) Characterization of Microbial
Communities in Gas Industry Pipelines. Applied an Environmental
Microbiology.
74
ANEXO A: Diagramas de Nyquist y de Bode para las bacterias en presencia y
ausencia de mercurio
300
20
0 hrs
3 hrs
200
6 hrs
150
24 hrs
27 hrs
100
30 hrs
50
45 hrs
0
48 hrs
0
50
100
150
200
250
15
-Zi [kohm]
-Zi [kohm]
250
10
5
0
300
0
5
10
15
20
Zr [kohm]
Zr [kohm]
(a)
Ф
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0.01
0 hrs
3 hrs
6 hrs
24 hrs
27 hrs
30 hrs
45 hrs
1
100
10000
48 hrs
log f
(b)
Figura 43.. a) Diagrama de complejo de la bacteria Hg3 sin Hg, b) diagrama de
Bode de Hg3 sin Hg
75
200
0 hrs
40
3 hrs
6 hrs
24 hrs
100
27 hrs
30 hrs
50
-Zi [kohm]
-Zi [kohm]
150
30
20
45 hrs
48 hrs
0
10
0
0
100
50
150
200
0
Zr [kohm]
10
20
Zr [kohm]
30
40
(a)
90
80
0 hrs
3 hrs
6 hrs
24 hrs
27 hrs
30 hrs
45 hrs
48 hrs
70
60
φ
50
40
30
20
10
0
0.01
1
100
Log f
10000
(b)
Figura 44.. a) Diagrama de complejo de la bacteria Hg3 con Hg 20 ppm, b)
diagrama de Bode de Hg3 con Hg 20 ppm
76
200
0 hrs
3 hrs
50
6 hrs
100
40
24 hrs
27 hrs
30 hrs
50
-Zi [kohm]
-Zi [kohm]
150
45 hrs
48 hrs
0
0
50
100
150
30
20
10
0
0
200
10
20
30
40
50
Zr [kohm]
Zr [kohm]
(a)
φ
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0.01
0 hrs
3 hrs
6 hrs
24 hrs
27 hrs
30 hrs
45 hrs
1
100
10000
48 hrs
Log f
(b)
Figura 45.. a) Diagrama de complejo de la bacteria Hg4 sin Hg, b) diagrama de
Bode de Hg4 sin Hg
77
200
0 hrs
40
3 hrs
6 hrs
30
24 hrs
100
27 hrs
30 hrs
50
45 hrs
48 hrs
0
-Zi [kohm]
-Zi [kohm]
150
20
10
0
0
100
50
150
200
0
Zr [kohm]
10
20
30
40
Zr [kohm]
(a)
90
80
0 hrs
3 hrs
6 hrs
24 hrs
27 hrs
30 hrs
45 hrs
48 hrs
70
60
φ
50
40
30
20
10
0
0.01
1
100
10000
Log f
(b)
Figura 46.. a) Diagrama de complejo de la bacteria Hg4 con Hg 20 ppm, b)
diagrama de Bode de Hg4 con Hg 20 ppm
78
ANEXO B: Variación de los parámetros de los circuitos eléctricos
equivalentes con respecto al tiempo
0.3
0.25
R1
0.2
Hg1
0.15
Hg2
0.1
Hg3
0.05
Hg4
0
0
20
40
60
Tiempo (horas)
Figura 47. Variación de la resistencia al electrolito con respecto al tiempo para los
sistemas con mercurio
2.5
CPE1 - n
2
1.5
Hg1
1
Hg2
0.5
Hg3
Hg4
0
0
10
20
30
40
50
60
Tiempo (horas)
Figura 48. Variación del parámetro n del elemento de fase constante asociado a la
distribución de las propiedades de la biopelícula con respecto al tiempo para los
sistemas sin mercurio
79
25
20
15
R2
Hg1
Hg2
10
Hg3
5
Hg4
0
0
10
20
30
40
50
60
Tiempo (horas)
Figura 49. Variación de la resistencia a la biopelícula con respecto al tiempo para
los sistemas con mercurio
1.4
1.2
CPE2 - n
1
0.8
Hg1
0.6
Hg2
0.4
Hg3
Hg4
0.2
0
0
10
20
30
40
50
60
Tiempo (horas)
Figura 50. Variación del parámetro n del elemento de fase constante asociado a
la distribución de cargas en la interfaz con respecto al tiempo para los sistemas sin
mercurio
80
1400
1200
1000
R3
800
Hg1
600
Hg2
400
Hg3
Hg4
200
0
0
10
20
30
40
50
60
Tiempo (horas)
Figura 51. Variación de la resistencia a la transferencia de carga con respecto al
tiempo para los sistemas con mercurio
81
ANEXO C: Diferenciales con respecto al tiempo.
250
200
48 hrs
150
Δα
45 hrs
30 hrs
27 hrs
100
24 hrs
6 hrs
50
3 hrs
0 hrs
2.50E-02
1.00E-01
4.00E-01
1.58E+00
6.33E+00
2.50E+01
1.00E+02
4.00E+02
1.58E+03
6.33E+03
2.50E+04
0
Frecuencia Hz
Figura 52. Diferenciales del sistema Hg2 sin mercurio con respecto al sistema
estéril
8
7
6
Δα
48 hrs
5
45 hrs
4
30 hrs
27 hrs
3
24 hrs
2
6 hrs
3 hrs
1
0 hrs
2.50E-02
1.00E-01
4.00E-01
1.58E+00
6.33E+00
2.50E+01
1.00E+02
4.00E+02
1.58E+03
6.33E+03
2.50E+04
0
Frecuencia Hz
Figura 53. Diferenciales del sistema Hg2 con mercurio 20 ppm con respecto al
sistema estéril.
82
250
200
48 hrs
150
Δα
45 hrs
30 hrs
27 hrs
100
24 hrs
6 hrs
50
3 hrs
0 hrs
2.50E-02
1.00E-01
4.00E-01
1.58E+00
6.33E+00
2.50E+01
1.00E+02
4.00E+02
1.58E+03
6.33E+03
2.50E+04
0
Frecuencia Hz
Figura 54. Diferenciales del sistema Hg3 sin mercurio con respecto al sistema
estéril
4
3.5
3
48 hrs
45 hrs
30 hrs
2
27 hrs
1.5
24 hrs
1
6 hrs
0.5
3 hrs
0 hrs
2.50E-02
1.00E-01
4.00E-01
1.58E+00
6.33E+00
2.50E+01
1.00E+02
4.00E+02
1.58E+03
6.33E+03
0
2.50E+04
Δα
2.5
Frecuencia Hz
Figura 55. Diferenciales del sistema Hg3 con mercurio 20 ppm con respecto al
sistema estéril
83
1.8
1.6
1.4
48 hrs
1.2
45 hrs
Δα
1
30 hrs
0.8
27 hrs
0.6
24 hrs
0.4
6 hrs
3 hrs
0.2
0 hrs
2.50E-02
1.00E-01
4.00E-01
1.58E+00
6.33E+00
2.50E+01
1.00E+02
4.00E+02
1.58E+03
6.33E+03
2.50E+04
0
Frecuencia Hz
Figura 56. Diferenciales del sistema Hg4 sin mercurio con respecto al sistema
estéril.
4
3.5
3
48 hrs
45 hrs
2
30 hrs
27 hrs
1.5
24 hrs
1
6 hrs
0.5
3 hrs
0 hrs
2.50E-02
1.00E-01
4.00E-01
1.58E+00
6.33E+00
2.50E+01
1.00E+02
4.00E+02
1.58E+03
6.33E+03
0
2.50E+04
Δα
2.5
Frecuencia Hz
Figura 57. Diferenciales del sistema Hg4 con mercurio 20 ppm con respecto al
sistema estéril.
84
1.8
1.6
1.4
48 hrs
1.2
45 hrs
Δα
1
30 hrs
0.8
27 hrs
0.6
24 hrs
0.4
6 hrs
3 hrs
0.2
0 hrs
2.50E-02
1.00E-01
4.00E-01
1.58E+00
6.33E+00
2.50E+01
1.00E+02
4.00E+02
1.58E+03
6.33E+03
2.50E+04
0
Frecuencia Hz
Figura 58. Diferenciales del sistema Hg5 sin mercurio con respecto al sistema
estéril.
3.5
3
2.5
48 hrs
45 hrs
Δα
2
30 hrs
1.5
27 hrs
24 hrs
1
6 hrs
3 hrs
0.5
0 hrs
2.50E-02
1.00E-01
4.00E-01
1.58E+00
6.33E+00
2.50E+01
1.00E+02
4.00E+02
1.58E+03
6.33E+03
2.50E+04
0
Frecuencia Hz
Figura 59. Diferenciales del sistema Hg5 con mercurio 20 ppm con respecto al
sistema.
85
6
5
4
48 hrs
Δα
45 hrs
3
30 hrs
27 hrs
2
24 hrs
6 hrs
3 hrs
1
0 hrs
2.50E-02
1.00E-01
4.00E-01
1.58E+00
6.33E+00
2.50E+01
1.00E+02
4.00E+02
1.58E+03
6.33E+03
2.50E+04
0
Frecuencia Hz
Figura 60. Diferenciales del sistema Hg5 con mercurio 400 ppm con respecto al
sistema estéril
86