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Uso de la biodiversidad natural en biotecnología. Parte 1 Conceptos y Técnicas de Biotecnología 2do cuatrimestre 2013 Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular FCEN-­‐UBA Origen de la diversidad microbiana vías metabólicas
genes
procesos moleculares
reciclado de elementos
Desarrollo de la diversidad de metabolismos microbianos Metabolismo, replicación y herencia son inseparables del contexto ambiental
interacción de
presiones selectivas
habitat
Microorganismos
presión selectiva
recursos
evolución
tiempo
3.8×109 años Bacterias
Arqueas
Diversidad
fisiológica
Eucariotes
Clasificación metabólica según requerimientos de C y E Fuente de E química
luz
Quimiotrofos Fototrofos Fuente de C Fuente de C Comp. orgánicos
Comp. orgánicos
CO2
Quimioheterotrofos Quimiolitotrofos Aceptor final de electrones O2
oxidativo
No O2
Comp.
orgánicos
Fermentativo
Comp.
inorgánicos
-,
2-,
NO3 SO4
Fe(III), Mn(VI)
Bacterias
oxidantes de
S, Fe y CO
Fotoheterotrofos GNB, PNB
CO2
Fotoautotrofos Usa H2O para reducir CO2? Si
No
Fotosíntesis
oxigénica
Fotosíntesis
anoxigénica
La termodinámica predice que reacciones son energéDcamente favorables Tipos de reacción
Cambio de estado
Disolución/precipitación
Formación de complejos
Reactivos
Reacción ácido/base
Adsorción/desorción
Oxidación/reducción
Productos
!G = "!G productos # "!G reactivos
!G = !G 0 + RT
[C][D]
[A][B]
Reacciones redox, equilibrio químico y energía libre Reducción
A
B
A oxidado
Oxidación
Reacciones clave para generar ATP B reducido
Reacciones redox, equilibrio químico y energía libre Reducción
H+
H+
molécula
orgánica
con 2H
NAD+ (carrier
de electrones)
Oxidación
molécula
orgánica
oxidada
NADH + H+
(carrier de ereducido)
Las transformaciones en ambientes naturales dependen de la convergencia de 3 factores Termodinámica de la hemi-­‐reacción ConsRtuyentes geoquímicos Fisiología de microorganismos 1. Termodinámica de la hemi-­‐reacción Proceso
ΔG0 (kJ/ec)
Respiración aeróbica -125
Desnitrificación
-119
Reducción de manganeso -98
Reducción de hierro
-42
Fermentación
-27
Reducción de sulfato
-25
Metanogénesis
-23
Acetogénesis
-22
Potencial de reducción: medida de la tendencia a donar electrones en sistemas biológicos estado
oxidado
estado
reducido
La canRdad de energía que puede ser liberada de 2 hemi-­‐reacciones se puede calcular a parRr de la diferencia en los potenciales de reducción de las 2 reacciones y el número de electrones transferidos: !G = "nF!E
0'
'
0
Zehnder, A.J.B. and W. Stumm. 1988. Geochemistry and biogeochemistry of anaerobic habitats. A.J.B. Zehnder (ed.) Biology of Anaerobic Microorganisms, pp. 1–38 2. Presencia de consDtuyentes geoquímicos en el ambiente Proceso
ΔG0 (kJ/ec)
CH 2O + O2 ! CO2 + H 2O
Respiración aeróbica -125
5CH 2O + 4NO3! + 4H + " 5CO2 + 2N 2 + 7H 2O
Desnitrificación
CH 2O + 2MnO2 + 4H + ! CO2 + 2Mn 2+ + 3H 2O
Reducción de manganeso -98
-119
CH 2O + 4FeOOH + 8H + ! CO2 + 4Fe2+ + 7H 2O Reducción de hierro
-42
3CH 2O ! CO2 + CH 3CH 2OH
Fermentación
-27
2CH 2O + SO42! + 2H + " 2CO2 + H 2 S + 2H 2O
Reducción de sulfato
-25
2CH 2O ! CO2 + CH 4
Metanogénesis
-23
2CH 2O ! CO3COOH
Acetogénesis
-22
3. Fisiología de los microorganismos Aceptor terminal
de electrones
Aeróbico
Anaeróbico
Producto
Microorganismo
Diversidad catabólica: quimio-­‐
organotrofos Fermentación
Flujo de carbono
en respiración
Aceptores de
electrones
Comp orgánicos
Flujo de carbono
Transporte de eGeneración de pmf
aceptores
orgánicos
Respiración anaeróbica
Biosíntesis
Respiración aeróbica
Diversidad catabólica: quimio-­‐
litotrofos Transporte de eGeneración de pmf
Aceptores de
electrones
Biosíntesis
Respiración aeróbica
Respiración anaeróbica
Diversidad catabólica: Fotótrofos luz
Fotoheterótrofos
Compuestos
orgánicos
Fotoautótrofos
Dador
de eTransporte de
electrones
generación de pmf
y poder reductor
Biosíntesis
Biosíntesis
Diversidad metabólica y economía del crecimiento Los precursores, que son la fuente de
monómeros para todos los componentes
celulares, se originan en los pathways
centrales: gucólisis y ciclo del ácido
tricarboxílico (TCA)
glucólisis
bacteria
ciclo del
TCA
Todos los sustratos ingresan en los pathways
centrales luego de un número limitado de
reacciones, para proveer al organismo con los
metabolitos precursores
Una clasificación ecológica de bacterias Panikov, N.S. Microbial Ecology en Environmental Biotechnology (2010) Wang, L.K., Ivanov, V., Tay, J.H. Hung,Y.T. eds. Humana Press Una clasificación ecológica de bacterias oligotrofos
Acidobacteria
Betaproteobacteria
copiotrofos
Bacteroidetes
Fierer et al. (2007) Ecology 88: 1354–1364
El concepto de estrategas r y K r
K
El enriquecimiento selecDvo como mecanismo de adaptación en biotecnología ambiental Carga constante
Alta afinidad por sustrato limitante
Feast and famine
Alta tasa de crecimiento
OpDmización de compuestos bioacDvos a lo largo de la evolución interacción de
presiones selectivas
habitat
Microorganismos
evolución
tiempo
3.8×109 años Bacterias
Arqueas
Diversidad
fisiológica
Eucariotes
Cuanto conocemos de la biología de procariotas? 35
30
25
20
15
10
5
0
Almacenamiento
información
y procesamiento
de información
Procesos Metabolismo Funciones no
Procesos
No
celulares Metabolismo
caracterizadas
celulares
caracterizadas
Un conDnuo de especies a lo largo de gradientes ambientales Abundancia de especies
Factores ambientales pH Intensidad lumínica bajo
Salinidad Oxígeno disuelto Potencial redox Nutrientes Temperatura gradiente de factor ambiental
alto
Mínimo ecológico
23
Importancia del culDvo en biotecnología • 
Qué sustratos usan? • 
Qué metabolitos secundarios podrían ser liberados? • 
Qué clase de biotransformaciones serían posibles? Importancia del culDvo en el laboratorio Bioprospección
Metagenómica
Pre-genómica
Secuencia
del genoma
Fisiología
en cultivo
Post-genómica
Es importante el culDvo? Los microorganismos no culDvables The great plate count anomaly Achtman M, Wagner M (2008) Microbial diversity and the genetic nature of microbial species. Nat Rev Microbiol 6:31–440
Los microorganismos no culDvables The great plate count anomaly Staley, J. T., and A. Konopka. 1985. Measurements of in situ acRviRes of nonphotosyntheRc microorganisms in aquaRc and terrestrial habitats. Annu. Rev. Microbiol. 39:321-­‐346. Por qué los microorganismos se resisten a crecer en culDvo? (i)  Incapacidad de crecer sobre sustratos del medio de culRvo (ii)  Infecciones por fagos (iii)  El culRvo en el laboratorio destruye interacciones presentes en ambientes naturales (iv)  La alta concentración de sustrato necesaria para obtener crecimiento detectable en el laboratorio puede ser tóxica (v)  Las prácRcas de laboratorio suelen ignorar los primeros ciclos de crecimiento en medio líquido que aparentemente no muestran crecimiento, debido a la falta de buenos métodos de detección de densidad celular y falta de paciencia Efecto del medio de culDvo y del Dempo de incubación VL55 medium-­‐Xylan-­‐Gellan Dilute Nutrient Broth-­‐Gellan VL55 medium-­‐Xylan-­‐Agar Cold-­‐ extracted Soil Extract Agar Winogradsky’s Salt-­‐soluRon Agar Tryptone Soy Agar Davis et al., Effects of Growth Medium, Inoculum Size, and Incubation Time on Culturability and Isolation of Soil Bacteria (2005)
Appl Environ Microbiol, 71, 826–834
Varios sustratos carbonáceos en combinación con diferentes aceptores de electrones Costa del Mar de Norte
Alta eficiencia de cultivo: 23% del número total de células en los 2 m
superficiales Kopke et al., Microbial Diversity in Coastal Subsurface Sediments: a Cultivation Approach Using Various Electron Acceptors and
Substrate Gradients (2005) Appl Environ Microbiol, 71, 7819-7830
Uso de aceptor de electrones alternaDvos: reductores de sulfato Widdel et al., Anaerobic degradation of hydrocarbons with sulfate as electron acceptor (2007) en Sulfate Reducing Bacteria, Barton
& Hamilton, eds. Cambridge
Formación bioloógica de metano en ambientes anóxicos Zengler et al., Methane formation from long-chain alkanes by anaerobic microorganisms (1999) Nature, 401, 266
Uso de compuestos que median comunicación entre bacterias N-­‐acyl homoserine lactones OHHL: N-­‐(oxohexanoyl)-­‐dl-­‐
homoserine lactone Monómero/óxico
Polímero/óxico
BHL: N-­‐(butyryl)-­‐dl-­‐homoserine lactone cAMP: AMP cíclico Polímero: almidón/
xilano/quiRna Monómero/anóxico
Polímero/anóxico
Monómero: glucosa/ aminoácidos Bruns et al., 2002
Ver también Bruns et al., Effect of Signal Compounds and Incubation Conditions on the Culturability of Freshwater Bacterioplankton
(2003) Appl Environ Microbiol, 69, 1980–1989
CulDvo y detección de microorganismos •  Mínima cantidad de nutrientes
•  Incubaciones largas (30d)
•  Protección de peróxidos
•  Ácidos húmicos
•  QS (AHL)
•  aeróbico
•  1-2% O2
•  anóxico
•  5% CO2
Stevenson et al., New Strategies for Cultivation and Detection of Previously Uncultured Microbes (2004) Appl Environ Microbiol, 70,
4748-4755
CulDvo y detección de microorganismos Acidobacteria Stevenson et al., New Strategies for Cultivation and Detection of Previously Uncultured Microbes (2004) Appl Environ Microbiol, 70,
4748-4755
CulDvo y detección de microorganismos Verrucomicrobia Stevenson et al., New Strategies for Cultivation and Detection of Previously Uncultured Microbes (2004) Appl Environ Microbiol, 70,
4748-4755
CulDvo de microorganismos en microgotas encapsuladas en gel + Dilución de células agarosa (40°C). 2,200 rpm suspensión aceite-­‐bacteria en hielo con a 1,100 rpm 107 microgotas d e gel (GMDs) 10% ocupadas por una única célula encapsulada Zengler et al. Cultivating the uncultured(2002) PNAS 99: 15681-15686
CulDvo de microorganismos en microgotas encapsuladas en gel Zengler et al. Cultivating the uncultured(2002) PNAS 99: 15681-15686
Separación celular por citometría de flujo Cell complexity or granularity CulDvo de microorganismos en microgotas encapsuladas en gel (Approximate cell size) Zengler et al. Cultivating the uncultured(2002) PNAS 99: 15681-15686
CulDvo de microorganismos en microgotas encapsuladas en gel Zengler et al. Cultivating the uncultured(2002) PNAS 99: 15681-15686
CulDvo de microorganismos GMDs problemas y soluciones Alain, K., Querellou, J. (2009) Cultivating the uncultured: limits, advances and future challenges. Extremophiles, 13, 583–594
CulDvo de microorganismos marinos en cámaras de difusión microorganismos de sedimentos dilución seriada membrana
mezcla con agar Rbio en agua de mar agar
Kaeberlein et al., Isolating Uncultivable Microorganisms in Pure Culture in a Simulated Natural Environment (2002) Science, 70,
1127-1129
CulDvo de microorganismos marinos en cámaras de difusión sedimento
membrana
agar
La mayoría es invisible a simple vista
Dependencia de co-cultivo
Kaeberlein et al., Isolating Uncultivable Microorganisms in Pure Culture in a Simulated Natural Environment (2002) Science, 70,
1127-1129
CulDvo de microorganismos en cámaras de difusión Los mútiples pasajes en
cámaras de difusión permiten
la adaptación al cultivo in vitro
Bollmann et al. Incubation of Environmental Samples in a Diffusion Chamber Increases the Diversity of Recovered Isolates (2007)
Appl Environ Microbiol, 73, 6386–6390
Cámaras de difusión en formato de alto rendimiento: Ichip agua de mar suelo Nichols et al. Use of Ichip for High-Throughput In Situ Cultivation of Uncultivable Microbial Species (2010) Appl Environ Microbiol,
76, 2445–2450
Otros métodos con membranas Soil Substrate Membrane System Ferrari et al Cultivating previously uncultured soil bacteria using a soil substrate membrane system (2008) Nature Protocols 3,
1261-1264
Microplaca de Petri: un millón de cámaras de culDvo óxido de
aluminio poroso
7 x 7µm
Ingham et al. (2007) The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms.
PNAS 104, 18217–18222
Microplaca de Petri: un millón de cámaras de culDvo chip de 8x36 mm
recubierto en Pt
180.000 cámaras
20µm x 20µm
Ingham et al. (2007) The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms.
PNAS 104, 18217–18222
Los chips pueden ser uDlizados para recuento de UFC Imagen de microscopio invertido mostrando el
crecimiento de L plantarum (círculos claros) en
cámaras de 20 x 20 µm
Ingham et al. (2007) The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms.
PNAS 104, 18217–18222
Screening de 200.000 aislamientos basados en el metabolismo de un organofosforado 1.  Incubación 6 días
2.  Recuento: 200.000 c
3.  Screening
fluorescein 3,6-­‐diphosphate fluoresceina 4.  Identificación
Ingham et al. (2007) The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms.
PNAS 104, 18217–18222
Ley de Moore de duplicación del número de transistores en un circuito integrado Duplica cada 18 meses
Ley de Moore
Procesador Intel
Ley de Moore para la miniaturización de culDvos microbianos Se aplica al volumen de cultivo pero no
al número de aislamientos obtenidos!
Gefen & Balaban (2010) The Moore s Law of microbiology – towards bacterial culture miniaturizaRon with the micro-­‐Petri chip. Trends in Biotechnology 26 , 345-­‐347 Requisitos el para culDvo de no culDvables Stewart, E. Growing Unculturable Bacteria (2012) Journal of Biacteriology, 194: 4151– 4160 CulDvo de no culDvables : resumen de estrategias Alain, Querellou (2009) CulRvaRng the uncultured: limits, advances and future challenges. Extremophiles 13:583 EsDmaciones de la diversidad microbiana La diversidad genética en 1 g de suelo coresponde
aproximadamente 4,000 genomas diferentes
59
Torsvik et al. 1990 Appl. Environ. Microbiol. 56: 782-787
Qué es una especie bacteriana? Otros términos:
Ecotipo: definido por el ambiente
Filotipo: definido por el grupo filogenético
Ribotipo: definido por la secuencia del ARN ribosomal
Unidad Taxonómica Operacional (OTU)
Science (2009) 323, 741-­‐746 60
Cuanta diversidad? Es improbable que el muestreo sea 100% efecRvo EsRmamos el total basado en el subset muestreado 61
Cuanta diversidad? Muestrear
Reconocer (diferenciar)
Identificar
62
Indices de diversidad Index
Discriminant
ability
Sample
Size
Sensititivy
Richness,
Evenness,
Widely
Dominance
Calculation
used?
Sensitivity
to abund
models
Log a
Good
Low
Richness
Simple
Yes
N (?)
Log Normal l
Good
Moderate
Richness
Complex
N
Yes
Q
Good
Low
Richness
Complex
N
N
S
Good
High
Richness
Simple
Yes
N
Margalef
Good
High
Richness
Simple
N
N
Shannon
Moderate
Moderate
Richness
Intermediate
Yes
N
Brillouin
Moderate
Moderate
Richness
Complex
N
N
McIntosh U
Good
Moderate
Richness
Intermediate
N
N
Simpson
Moderate
Low
Dominance
Intermediate
Yes
Yes
Berger-Parker
Poor
Low
Dominance
Simple
N
N
Shannon E
Poor
Moderate
Evenness
Simple
N
N
Brillouin E
Poor
Moderate
Evenness
Complex
N
N
McIntosh D
Poor
Moderate
Dominance
Simple
N
N
= Desirable Traits in an Index!
63
Magurran, A.Ecological diversity and its measurements
Análisis basado en 16S rRNA Universal
Regiones conservadas y variables
Útil sobre un amplio rango de distancias filogenéticas
Cambio sobre inserciones o deleciones
Tamaño adecuado
64
Análisis pre-­‐genómico: el ciclo completo del 16S rRNA 1995
{
DGGE/TGGE
t-TFLP
SSCP
ARISA
ARDRA
Bibliotecas de clones
65
Biblioteca de clones Extracción
de DNA
Generación
de árboles
filogenéticos
Amplificación
por PCR
Alineamiento con
secuencias de
bases de datos
Purificación
de amplicón
Secuenciación
de insertos
Clonado
Extracción de
plasmidos
Tranformación
en E coli
Preparación
de libraries
66
decano
petróleo
crudo
pristano
mezcla de
alcanos
hexadecano
naftaleno
67
McKew et al., Environmental Microbiology (2007) 7, 165–176 68
Electroforesis en geles con gradientes desnaturalizante (DGGE) 69
Electroforesis en geles con gradientes desnaturalizante (DGGE) 70
fibras
Water Research (2010) 44 1785-­‐1796 71
Water Research (2010) 44 1785-­‐1796 benceno
MTBE
72
FingerprinDng: terminal RestricDon Fragment Length Polymorphism ( t-­‐RFLP) 73
74
Reactor I, pH 2.2
Reactor II, pH 4.0-4.5
75
Limitaciones del análisis basado en 16S rRNA T a b l e1 . Examples of the unique and disparate phenotypiccharacteristics of closely related organisms in the Proteobacteria
Organism
Aerobicity
I d e n t i f y i nm
ge t a b o l i s m
Fermentation
Electron
acceptors
utilized
Ferribacterium
limneticum
Strict anaerobe
Fe(III) reduction
Non-fermentive
Ferric iron, nitrate,
fumarate
Rhodocyclustenuis
Facultative anaerobe
Phototrophy
Ferments storage
polysaccharides
Oxygen
Strain SIUL
Facultative anaerobe
Perchlorate reduction
Non-fermentative
Oxygen, chlorate,
perchlorate
Strain RCB
Facultative anaerobe
Chlorate reduction
Non-fermentative
Oxygen, nitrate
Strain WD
Microaerophile
Perchlorate reduction
Non-fermentative
Oxygen, nitrate,
chlorate
Magnetospirillum
gryphiswaldense
Microaerophile
Magnetosome production
Not determined
Not determined
76
Achenbach and Coates., 2000 ASM News 65: 3697-3704
Asociar idenDdad a función: Stable Isotope Probing •  Marcar DNA
•  Extraer DNA
•  Separar fracciones livianas y pesadas por ultracentrifugación
•  Amplificar DNA (PCR)
•  Analizar usando tecnicas como DGGE, T-RFLP, clonado y sequenciación
Muestra
ambiental
Extracción de DNA
Fraccionamiento
(Ultracentrifugacion)
Microorganismos responsables de la
degradación de un contaminante
77
Radajewski et al. Nature 2000 403:646-9
RNA Stable Isotope Probing Cultivo en MM + fenol-13C6
24 h
P. putida
P. chlororaphis
48 h
Crecimiento en fenol
P. putida
P. chlororaphis
+
-
78
Manefield et al., 2002, Appl. Environ. Microbiol. 68: 5367-5373
Polaromonas naphthalonivorans PNAS November 11, 2003 100: 13591–13596 "
RNA vs DNA •  más abundante
•  mayor turnover
•  no depende de la
replicación
80
Manefield et al., 2002, Appl. Environ. Microbiol. 68: 5367-5373
Degradación de naealeno en un acuífero analizado por SIP-­‐DGGE Acidovorax : alta afinidad
revelado en SIP-DGGE
P. fluorescence: baja afinidad
obtenida por cultivo
81
Huang et al., 2009 Appl Environ Microbiol, 75, 234–241
Limitaciones de SIP •  Necesita altas concentraciones de sustrato (bias de culRvo) •  Largos Rempos de incubación -­‐  Enriquecimiento de poblaciones minoritarias -­‐  Condiciones ex-­‐situ no refleja necesariamente los ambientes in situ 82
Manefield et al., 2002, Appl. Environ. Microbiol. 68: 5367-5373
Fluorescence in situ hybridizaDon FISH 83
FISH revela alta diversidad en barros acDvados Amann et al., 1996 In Situ VisualizaRon of High GeneRc Diversity in a Natural Microbial Community J. Bacteriol. 178: 3496–3500 84
PrácDca de FISH: problemas y soluciones Wagner et al. Fluorescence in situ hybridisaRon for the idenRficaRon and characterisaRon of prokaryotes. Curr Opinion Microbiol 2003, 85
6:302–
309 PrácDca de FISH: problemas y soluciones Wagner et al. Fluorescence in situ hybridisaRon for the idenRficaRon and characterisaRon of prokaryotes. Curr Opinion Microbiol 2003, 86
6:302–
309 Microautoradiograha (MAR) •  Se expone la emulsión a la
radioactividad y se revela
•  Las células que degradan el
sustrato aparecen como
puntos negros, que pueden
ser contados
•  El número de células totales
se determina con DAPI o NA
Ito et al., Appl. Environ. Microbiol., 68, 356-364, 2002
87
Microautoradiograpía combinada con FISH: MAR-­‐FISH 88
Combinación de técnicas 89
Limitaciones de MAR-­‐FISH •  No se pueden detectar varios elementos simultáneamente •  No ofrece buena resolución celular en agregados densos •  Requiere el uso de isótopos radioacRvos •  Algunos elementos no posees isótopos con vidas medias apropiadas (e.g. O y N) •  La cuanRficación de incorporación es complicada •  Las células fijadas y cubiertas por emulsión no se pueden manipular para hacer genómica de células individuales 90
Espectroscopía Raman Diagrama de Jablonski
A mayor masa mayor energía
del desplazamiento de
Stokes
fenilalanina
91
Wagner, M. Anal. Rev. Microbiol 2009, 63, 411-429
Microscopía Raman confocal Imagen 100X
Espectro típico de
una célula individual
92
Huang et al., Raman Microscopic Analysis of Single Microbial Cells Anal. Chem. 2004, 76, 4452-4458
El corrimiento al rojo provocado por el uso de 13C se puede calibrar 93
Huang et al., Raman Microscopic Analysis of Single Microbial Cells Anal. Chem. 2004, 76, 4452-4458
Las diferencias espectrales se deben al % de 13C-­‐glucosa en el medio 13C
94
Huang et al., Raman Microscopic Analysis of Single Microbial Cells Anal. Chem. 2004, 76, 4452-4458
Degradación de naealeno en un acuífero Control estéril
13C-naftaleno
Formación de
salicilato
12C-naftaleno
95
Huang et al., 2009 Appl Environ Microbiol, 75, 234–241
Degradación de naealeno en un acuífero analizado por SIP-­‐Raman bacteria total
Pseudomonas sp Acidovorax sp FISH
96
Huang et al., 2009 Appl Environ Microbiol, 75, 234–241
Secondary Ion Mass Spectrometry (SIMS) 97
Wagner, M. Anal. Rev. Microbiol 2009, 63, 411-429
Secondary Ion Mass Spectrometry (SIMS) Comunidad microbiana degradadora de fenol en suelo
98
DeRito,C. M. Appl. Environ. Microbiol 2005, 71, 7858-7865
SIMSISH usando NanoSIMS El reactivo fluorescente usado en FISH es reemplazado por una
molécula conteniendo isótopos estables o elementos raramente
presentes en la biomasa, e.g. halógenos
E. coli culRvadas en un medio con 99% de 13C mezcladas con B. subHlis con abundancia isotópica natural. E. coli se pre-­‐hibridó con la sonda I6-­‐Eub338-­‐Cy3 Imagen secundaria 12C Imagen secundaria 13C
Imagen secundaria 127I Imagen secundaria 32S
Biomasa cont proteína
Li et al., Environ. Microbiol 2008, 10, 580-588
A great challenge now lies in integraRng this new knowledge into conceptual frameworks that enable us to predict the consequences of manipulaRng environments in specific ways for ecosystem funcRon. IntegraRng the knowledge acquired through the methods reviewed here should guide us in resolving issues such as how to manipulate acRvated sludge, contaminated soil or decentralised composRng systems to improve ecological services and minimise the negaRve impacts of human acRvity. Other issues to resolve include how to increase the acRvity of phosphate accumulaRng bacteria, reduce bulking by filamentous bacteria, achieve more efficient denitrificaRon and fayy acid and protein removal in wastewater treatment plants. Likewise, important quesRons to explore are for example: can we enhance in situ biodegradaRon of pollutants by facilitaRng or inhibiRng specific microbial taxa? Can we favour specific methanogens over sulphate or nitrate reducing clades in anaerobic digestors? The vast amount of informaRon gained from applying these sophisRcated methods will most certainly result in addressing these issues and quesRons in an effecRve way. GuRerrez Zamora + Manefield, 2010 An appraisal of methods for linking environmental processes to specific microbial taxa Rev Environ Sci Biotechnol 9:153–185 100
Bibliograha adicional Pham, V.H.; Kim, J. (2012) CulRvaRon of unculturable soil bacteria. Trends in Biotechnology, 30:475-­‐84 Stewart, E. Growing Unculturable Bacteria (2012) Journal of Biacteriology, 194: 4151– 4160 McMahon, K.D., Garcia MarRn, K.D., Hugenholtz, P. (2007) IntegraRng ecology into biotechnology. Current Opinion in Biotechnology, 18: 287–292 Alain K, Querellou J.(2009) CulRvaRng the uncultured: limits, advances and future challenges. Extremophiles 13: 583-­‐594 Neufeld JD, Wagner M, Murrell JC. (2007) Who eats what, where and when? Isotope-­‐labelling experiments are coming of age. The ISME Journal, 1:103-­‐10