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Introducción.‐ Actualmente se considera que la principal familia de enzimas responsables de favorecer la progresión del tumor son las metaloprotesas, para estas enzimas dependientes de zinc; se han descrito 24 genes distintos que codifican diferentes MMPs. Su clasificación clásica se basa en la especificidad del sustrato (colagenasas, gelatinasas, estromelisinas, matrisilinas). La clasificación en base a la función de su estructura enzimática, se distinguen ocho grupos, cinco de MMPs secretadas y tres MMPs asociadas a la membrana (Egeblad y Werb, 2002; Folgueras y cols., 2004). Las MMP se sintetizan como zimógenos (inactivos) y es necesario activarlas con un corte proteolítico en el propéptido del dominio aminoterminal. El proceso de activación de las proMMP varía según la enzima, pero suelen intervenir otras proteasas, como el activador de plasminógeno del tipo urocinasa (uPA) y las propias MMPs. La actividad enzimática de las MMPs es controlada por distintas moléculas capaces de inhibir su acción, como los inhibidores tisulares de MMPs (TIMPs) e inhibidores plasmáticos entre otros medios. Las células más abundantes del corazón son los fibroblastos, los cuales son la principal fuente de metaloproteasas. En estados patológicos, como infartos agudos al miocardio, estas MMP se liberan y activan en la matriz extracelular, generando cambios en las adhesiones intercelulares, en la formación de colágena, en la comunicación y propagación de impulsos eléctricos. Puesto que entre los factores que activan estas enzimas se encuentran la hiperglucemia, el estrés oxidativo, la isquemia o hipoxia (todos estos factores presentes en pacientes con diabetes mellitus) se genera la teoría de que los pacientes con esta enfermedad tienden a mayor daño y remodelación cardiaca. Por tanto, entender mejor los mecanismos de producción y control de MMPs en el corazón del paciente diabético permitirá implementar tratamientos farmacológicos diseñados a prevenir las enfermedades cardiovasculares. Métodos y materiales.‐ Se utilizaron ratas Wistar macho del bioterio de la Escuela Superior de Medicina. Por métodos convencionales de cultivo celular primario, se aislaron fibroblastos cardiacos de ratas con y sin diabetes mellitus inducida con estreptozotozina intraperitoneal amortizada en buffer de citrato (ver composición más adelante). Del lisados de éstas células, se logró cuantificar la presencia de metaloproteasas, con un incremento en aquellas provenientes de ratas diabéticas. Aunque los niveles de estas MMPs varian mucho, cabe señalar que es el balance relativo y no la cantidad total la que genera diferencias funcionales en el corazón. Inmunohistoquímica Se realizaron cortes de 2 μm de los bloques de parafina, se desparafinaron en xileno y se rehidrataron en alcohol. La exposición de los epítopes se realizó en citrato de sodio 0.1 M (pH 6.0) por 10 min., las muestras se bloquearon con peroxidasa endógena H2 O2 3% por 5 min. y se incubaron por 1hr. a temperatura ambiente con los anticuerpos MMP 1 (collagenase‐1) Ab7 anticuerpo policlonal‐conejo, MMP‐9 (92kDa Collagenasa IV) Ab‐9 anticuerpo policlonal‐conejo ambas con dilusion 1:100, MMP‐2 (72kDa Collagenase IV) Ab‐
4 anticuerpo monoclonal‐ratón, MMP‐3 (Stromelysin‐1) Ab‐2 anticuerpo monoclonal‐
ratón, MMP‐7 (Matrilysin) Ab‐1 anticuerpo monoclonal‐ratón, , MMP‐11(stromelysin‐3) Ab‐5 anticuerpo monoclonal‐ratón, MMP‐13 (Collagenase‐3) Ab‐1 anticuerpo monoclonal‐
ratón, TIMP‐1 Ab‐2 anticuerpo monoclonal‐ratón, TIMP‐2 Ab‐5 anticuerpo monoclonal‐
ratón todas con una dilusion 1:50, todos estos de NeoMarkers, se adicionó el anticuerpo secundario marcado con biotina (LSAB + Sistem HRP Universal Dako Cytomation) por 15 min a temperatura ambiente, se adicionó streptavidina conjugada con peroxidasa y LSAB + Sistem HRP Universal marca Dako Cytomation, fueron revelados con diaminobenzidina (Liquid DAB Marca DakoCytomation) y se contrateñidos con hematoxilina de Mayer´s. Criterios para la evaluación de la inmunoreacción de las enzimas La valoración de la expresión de cada enzima, en las distintas áreas seleccionadas, fue realizada por dos observadores (AMG y LSR) sin conocimiento de datos clínicos. Los casos considerados positivos fueron los que presentaron más del 20% de células cardiacas y fibroblastos con expresión en el citoplasma de moderada a intensa, en un total de cinco campos de alta resolución (400x). Como control positivo de la técnica se utilizaron casos de tejido placentario normal. Como control basal de la intensidad de expresión se utilizo corazón sano (Arora y cols., 2005; Tsai y cols., 2003). Cultivo celular: se siguieron los lineamientos previamente publicados (Asbun J, Manso AM, Villarreal FJ. Profibrotic influence of high glucose on cardiac fibroblast functions: effects of angiotensin II and vitamin E. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2005 Jan;288(1):H227‐34) Análisis estadístico El análisis estadístico incluyó el uso de la prueba de X2 y exacta de Fisher, para contraste entre la expresión de cada una de las MMPs y TIMPs, utilizando el programa SigmaStat versión 3. El valor de P menor a 0.05 fue considerado como estadísticamente significativo. Resultados.‐ Desarrollo de DM en ratas: la aplicación intraperitoneal de estreptozotozina, como se reporta en la literatura, genera una diabetes mellitus tipo I a las 24 horas post‐exposición. Sin embargo, en nuestras condiciones de trabajo, sólo el 30% de los animales inyectados mostraron cifras de glucosa por arriba de 200 mg/dl. El resto de los animales se mantuvieron euglucémicos. Cultivo celular: Los fibroblastos procedientes de corazón de ratas DM tenían, en promedio, una expresión de MMPs mayor que las de ratas normales. Sin embargo, la gran variabilidad entre las diferentes MMPs involucradas no permite conclusión sobre cual es la principal responsable de la remodelación cardiaca asociada a hiperglucemia. Impacto.‐ La principal causa de muerte en México son las enfermedades cardiovasculares y la diabetes mellitus. Ésta última, siendo una enfermedad crónico‐degenerativa, reduce y encarece la expectativa de vida. El adecuado tratamiento y prevención permitirá incrementar la expectativa de vida de este grupo poblacional. El entendimiento de los mecanismos de lesión involucrados facilita identificar blancos terapéuticos (receptores, células, vías metabólicas) para diseñar tratamientos novedosos (medicamentos, biotecnológicos). CITRATE BUFFER; PH 3.0–6.2, PKA = 6.40 Citrate buffer (Gomori, 1955) stock
solutions: A: 0.1 M citric acid; B: 0.1 M sodium citrate. Use x ml A + y ml B and dilute to
100 ml with 50 ml DI.
0.1 M citric
acid
46.5
43.7
40.0
37.0
35.0
33.0
31.5
28.0
25.5
23.0
20.5
18.0
16.0
13.7
11.8
9.5
7.2
0.1 M
sodium
citrate
3.5
6.3
10.0
13.0
15.0
17.0
18.5
22.0
24.5
27.0
29.5
32.0
34.0
36.3
38.2
41.5
42.8
pH
3.0
3.2
3.4
3.6
3.8
4.0
4.2
4.4
4.6
4.8
5.0
5.2
5.4
5.6
5.8
6.0
6.2
Citric acid (H C H O · H O MW 210.14)
0.1 M Dissolve 21.01 grams of citric acid to a final volume of 1 liter.
MMP ASSAY (OmniPro) 1) Use 6‐well plates with rat CF in 100% confluence 2) Starve 24 hours (to synchronize the cells) with serum‐free media 3) Treatment will be low vs high glucose (maybe also L‐glucose) for 72 hours with working media (DMEM 1% PSF, 0.5% FBS, 0.1% HI‐FBS) 4) Treat with 1 mL of serum‐deprived media per well for the last 24 hours (with high or low glucose, of course) 5) Sample media (you’ll need 50 μl for the assay, collect all you can) 6) Scrap cells with ice‐cold fluorescence assay buffer a. 50 mM tris, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.2 mM NaN3, pH 7.6** or b. 50 mM tris‐HCl, 3.1 mM sucrose 1 mM DTT, 10 μg/ml leupopetin, 2 μg/ml aproptinin, 0.1% triton x‐100 (preferred) 7) Centrifuge samples at top speed in a microcentrifuge for 5 minutes at 4oC. Sonic samples if needed or passed them through a needle. 8) Supernatant is recovered and total protein concentration is determined by Bradford assay. 9) Load 96‐well plates for fluorescence with 50 μl of sample, 149 μl of Enzcheck buffer** and 1 μl of the probe (Omni‐MMP substrate). This probe must be diluted from its original 20 mM to reach 2 mM (10x) with DMSO. Using 1 μl in the assay, the final concentration of probe would be 10 μM. 10) RUN control with MMP2, using 50 μl instead of the sample volume with 1 μg/ml of stock. 11) To test for MMP activity, a non‐specific MMP inhibitor is used in parallel experiments, Phenantroline, using a final concentration of 1 mM. Sometimes you’ll find it as a 0.2 M stock solution with ethanol. Then, you should use 1 μL per well 12) Fluorescence measurements are performed with an excitation of 340 nm, and an emission wavelength of 405 nm. Kinetic measurements would be taken at 3‐minute intervals for a total of 3 hours EnzyChek Buffer (ice‐cold fluorescence assay buffer) adjusted pH to 7.6** Mol Weight 1 L 100 mL 50 mL 50 mM Tris‐base 121.14
6.057 g 0.606 g 0.303 g 150 mM NaCl 58.44
8.766 g 0.876 g 0.438 g 5 mM CaCl2 147.02
0.735 0.073 g 0.0365 g NaN3 65.01
0.013 0.0013 g 0.00065 g Lysate buffer for MMP’s Mol Weight 1 L 100 mL 50 mL 50 mM Tris HCl 157.64 7.882 0.788 0.394 3.1 mM sucrose 342.30 1.061 0.106 0.053 1 mM DTT 154.25 0.154 0.015 0.007 0.1% Triton X‐100 625.00 1 0.1 0.05 [depends] 10 μg/ml Leupeptin [depends] 2 μg/ml Aprotinin Leupeptin (actual lot) has 50 mg/10.5 mL. That is, 10 mM. So, for 10 mL of buffer I need 21 μl of this stock solution. Aprotinin (actual lot) is 10,000 KIU/mL and 7500 KIU/mg. Therefore, for 10 mL of buffer I need 15 μl of this stock solution Must be added at the end, and kept in ice.