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Amplificación de genes: la reacción de la polimerasa en cadena
( Publicado en Revista Creces, Agosto 1990 )
Un sistema de duplicación del DNA que utiliza una enzima de un microorganismo
termofílico, ha provocado una verdadera revolución en las aplicaciones prácticas de la
genética molecular. Con este método se pueden obtener miles de copias de un mismo
gen, a partir de sólo unas pocas células.
Las técnicas de manipulación genética han experimentado en el último tiempo un
progreso notable.
Ya no nos extraña conocer un nuevo gen que ha sido aislado. Tampoco saber que hay
otra enfermedad cuya base molecular ha sido develada.
Un aporte significativo a este progreso proviene de la posibilidad que hoy tenemos de
aislar genes desde el genoma celular, y luego "secuenciarlos". Esto es, describir la
secuencia en que se ordenan las moléculas (bases nitrogenadas) que los constituyen.
Obtener esto no ha sido nada fácil, dado que depende de condiciones experimentales
que recién ahora se comienzan a aclarar.
Uno de los problemas más agudos que los genetistas moleculares deben resolver es la
obtención de muestras de DNA lo suficientemente abundantes para permitir desarrollar
tanto la parte analítica de la secuenciación del gen como su posible inserción en otro
organismo o célula. En condiciones de cultivo de microorganismos, este problema se
obvia produciendo enormes cantidades de material vivo, para luego purificar, por
métodos convencionales, algunos microgramos de DNA. Esta situación, por supuesto,
no representa el caso más frecuente. Generalmente se dispone de una cantidad
pequeñísima de muestra de algún gen, por lo que resulta perentorio multiplicar el
número de copias de que se dispone, y eso fue precisamente lo que lograron científicos
de Cetus Corporation hace algo más de dos años.
Ciclos sobre caliente
La amplificación génica referida se logró a través del método de la Reacción de
Polimerasa en Cadena, basada en tres simples reacciones que se repiten en forma
cíclica. Las tres reacciones ocurren en el mismo tubo de ensayos y con reactivos
estables a la temperatura. En un experimento tipo se incuban trozos del DNA a
amplificar, dos trozos del DNA pequeños complementarios al DNA base (que actúan
como partidores), una gran cantidad de nucleótidos que constituyen la materia prima o las unidades estructurales del DNA- y la enzima DNApolimerasa Tac aislada del
bacterio termofílico Thermus Aquaticus. Sin duda, la mayor singularidad del método es
que, dada que la enzima responsable proviene de un microorganismo termofílico, es
posible trabajar a una temperatura lo suficientemente alta como para mantener
permanentemente abierta la doble hebra del DNA.
La primera reacción del ciclo consiste, precisamente, en la apertura de las hebras de
DNA, al incrementar la temperatura de la reacción de modo de romper los enlaces de
hidrógeno que unen ambas cadenas. En esta etapa, quedan expuestas regiones del
DNA que pueden alinear otros trozos de la misma molécula de un modo
complementario. (Figura 1)
En la segunda etapa de la reacción - que se realiza a temperatura más baja- dos
pequeños trozos de DNA se alinean en las hebras opuestas del DNA blanco, con lo que
quedan definidos los dos extremos del gen a amplificar. Un requisito indispensable para
que el sistema funcione con fidelidad es que los dos pequeños trozos de DNA que
cumplen esta función "partidora" no se alineen entre sí y que se ubiquen a una
distancia tal que permitan la función de la polimerasa.
La tercera etapa del ciclo es la reacción de polimerización propiamente tal, en que la
enzima Tac sintetiza una nueva hebra de DNA a partir del extremo libre de ambos DNA
partidores.
Un hecho esencial en este procedimiento es que cada producto recién sintetizado pueda
actuar como molde para otro ciclo de reacciones, con a que se obtiene una
amplificación geométrica del nuevo DNA. La automatización del proceso se logra
ciclando también las temperaturas: luego de obtener la primera extensión de los
partidores y finalizado el primer ciclo, la temperatura se vuelve a elevar, de modo de
convertir todas las dobles hebras en especies simples. Luego se baja a temperatura
para permitir el alineamiento y se reinicia el proceso que, por lo general, se repite unas
30 veces. El éxito del proceso global dependerá, entre otras cosas, de la
termoestabilidad de los elementos en juego, tales como partidores, nucleótidos,
enzimas etc., y, además, de la fidelidad con que se realicen los primeros alineamientos.
Aplicaciones
Un procedimiento tan revolucionario, que permite obtener muchas copias de un gen a
partir de cantidades minúsculas del mismo, ha mostrado en el corto tiempo de su
aplicación un amplio campo de usos.
Una de las áreas en la que la técnica de amplificación ha mostrado más utilidad es la
medicina forense. Una de las mayores dificultades para realizar peritajes es la escasez
de material biológico que permita aclarar hechos delictuales o de otro tipo. A través del
funcionamiento de esta técnica, utilizando muestras de sangre, espermios e incluso un
folículo piloso, se puede amplificar genes que permitan identificar el origen de dichas
muestras. A la fecha se ha resuelto una gran cantidad de casos de violación en que se
han amplificado genes propios del sospechoso y con ello se ha verificando su
culpabilidad.
Otro ámbito en que la amplificación genética está jugando un papel preponderante es
la detección precoz de enfermedades genéticas. En la medida en que se han ido
identificando genes responsables de enfermedades hereditarias, ha mejorado la
posibilidad de realizar exámenes moleculares buscando estos genes defectuosos en
células embrionarias. De nuevo, una limitante seria de estas pruebas es la cantidad de
células disponibles para el examen. La técnica de amplificación genética descrita ha
permitido multiplicar el gen hasta un número tal que hace posible detectar su anomalía
por métodos más o menos convencionales.
Algunos investigadores han planteado la utilización de esta técnica en combinación con
la fertilización in vitro. Una vez obtenidos los huevos fertilizados, será posible extraer
un número muy pequeño de células trofoblásticas del embrión para, luego de la
amplificación genética, detectar la presencia del gen anómalo. Así se podrá seleccionar
huevos "sanos" de huevos portadores de la enfermedad, e implantar aquellos con los
que no se corre riesgo alguno.
Obviamente, este procedimiento conlleva importantes implicancias morales, pero
pareciera ser que intervenir en este tipo de procesos, ineludiblemente nos lleva a hacer
este tipo de opciones.
Finalmente, digamos que una parte importante de la investigación que se realiza hoy
en el mecanismo de infección del virus del SIDA utiliza esta técnica. Diversas formas de
virus que permanecen silentes han sido identificadas mediante la reacción de la
Polimerasa en cadena. Los ejemplos de la gran utilidad de esta reacción son muchos y
más variados que los que hemos resumido en este artículo. Lo más probable es que se
multipliquen y muy pronto estemos dando otro paso adelante en la detección de los
secretos más íntimos de la célula, para bien de la salud y el bienestar de la especie
humana.
Dr. Fernando Mönckeberg B.
INTA. Universidad de Chile.
Para saber más
1- "The polymerase chain reaction: A new method of using molecular genetics for
medical diagnosis", Barry J. Eisenstein.
The new England Journal of Medicine, 322: 178 -183. (1990).
2- "Is DNA fingerprinting ready for the court?". New Scientist, marzo 31, 1990.
Artículo extraído de CRECES EDUCACIÓN - www.creces.cl