Download La microscopía láser confocal es una nueva técnica de observación

La microscopía láser confocal es una nueva técnica de observación microscópica
con la cual se logran excelentes resultados en diversas ramas de la ciencia (medicina, biología,
materiales, geología, etc.).
Ofrece indudables ventajas con respecto a
la microscopía óptica tradicional (mayor
nitidez y contraste en las imágenes, mejor
resolución vertical y horizontal, etc.) y,
principalmente,
permite
el
estudio
tridimensional de una muestra a través de la
obtención de "secciones ópticas". Posibilita
la
localización
e
identificación
de
componentes celulares específicos con la
particularidad de que al no ser una técnica
destructiva, permite una observación in
vivo. Además, con ella se pueden detectar
in situ moléculas conjugadas con un
fluorocromo excitable y estudiar procesos
biológicos en tiempo real.
El principio de la microscopía confocal se basa en eliminar la luz procedente de los
planos fuera de foco.
Descripción del equipo
Microscopio Láser Confocal espectral (CLSM) Leica modelo TCS SP2 equipado con tres
líneas de láser. Cuenta con un microscopio invertido DM IRE2 para campo claro en luz
transmitida y fluorescencia en luz incidente con componentes ópticos para contraste
interferencial de Nomarski (DIC).
La parte del microscopio de
fluorescencia convencional posee
tres filtros de fluorescencia:


I3 (excitación azul; emisión
verde)
N2.1
(excitación
verde;
emisión naranja-rojo)
 A (excitación
azul)
UV;
emisión
Módulo confocal
El módulo confocal espectral SP2 es un módulo con sistema de detección
espectral altamente sensible en el rango de 400 a 850 nm. Tiene tres canales
de detección para luz reflejada o fluorescencia. El sistema incluye tres fuentes
de láser: rojo (HeNe 633 nm), verde (HeNe 543 nm) y azul (Ar 458 nm, 476
nm, 488 nm y 514 nm).
El microscopio tiene dos objetivos:
 HC PL APO CS 20x 0.7 (seco)
 HCX PL APO 63x 1.2 (inmersión en agua)
La platina es motorizada de alta precisión y alta velocidad (variable) para
controlar el eje Z.
Adquisición y visualización
 Panel de control con 7 potenciómetros digitales para el ajuste de los
parámetros de exploración en directo.
Estación de trabajo:
 Software para el control de la exploración, adquisición de series
multidimensionales (x, y, z, t), visualización, procesado bidimensional y
cuantificación de las imágenes.
 Software para el análisis de colocalizaciones 2D y 3D.
 Software para FRET.
La técnica FRET (Transferencia de Energía por Resonancia Fluorescente) es una técnica importante para
investigar una gran variedad de fenómenos biológicos que implican la proximidad entre dos moléculas y que
permite caracterizar con enorme precisión la distancia entre 2 moléculas.
El mecanismo se basa en la presencia de 2 moléculas fluorescentes: un donante y un aceptor.
La molécula “donante “puede ser excitada a una longitud de onda especifica y a su vez , provocar la
excitación de la molécula “aceptora “que a su vez emitirá en una fluorescencia detectable.
Representación esquemática de la transferencia de energía de resonancia entre el donante D y
el aceptor A tras la excitación de la molécula donante, donde D y A son fluoróforos.
 Software para FRAP.
El
método
de
Recuperación
de
Fluorescencia Tras Fotoquemado (FRAP)
es una técnica para la observación del
movimiento intracelular mediante quemado
de la fluorescencia de una zona o molécula
de interés. Un área específica de la muestra
se quema mediante la acción del láser
confocal , la pérdida y recuperación de
fluorescencia es utilizada entonces para
determinar como se recupera esta
fluorescencia que se relaciona con la
difusión y/o desplazamiento de la molécula
“fotoquemada”
Los servicios que este microscopio brinda a la comunidad incluyen:
 Adquisición de imágenes de muestras
de origen animal, vegetal o mineral a
través
de
la
identificación
y
localización
de
componentes
celulares o moleculares específicos.
 Registro de imágenes Dic o de
Nomarski (contraste de interferencia).
 Análisis
de
intracelulares 2D.
 Estudios de actividad intracelular (pH
e iones) en el tiempo.
 Posibilidad de obtener imágenes a
diferentes longitudes de onda (λ) y
perpendiculares al plano xy (plano
xz).
colocalizaciones
 Software para FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) y FRAP
(Fluorescence Recovery After Photobleaching).
 Observación de la morfología o
de los defectos en sólidos como
componentes microelectrónicos,
polímeros, resinas, minerales,
cerámicas, metales, etc.
 Análisis de imágenes (realces,
medidas de intensidades y
morfométricas).
Imagen DIC o de Nomarsky (contraste interferencial) de
cristales de dextrinas mezcladas con una droga que permite
identificar diferentes formas y tamaños. A la derecha se
representa un gráfico 3D de la imagen 2 D de la izquierda.
Cloroplastos (en verde) y pared
celular (en rojo) en células de
tejido fotosintético.
Cultivos celulares
neurogliales ( neuronas
fotorreceptoras sobre células
gliales de sostén). Imagen que
muestra la localización de tres
moléculas en forma
simultánea ( en verde, en rojo
y en azul)
Autofluorescencia de estructuras de un
tardígrado (uno de los seres vivos más
resistentes del planeta). Se puede
observar con claridad la zona
mandibular y el aparato digestivo.