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Rev. Salud Anim. Vol. 28 No. 3 (2006): 147-157
Artículo reseña
VIRUS DE LA INFLUENZA AVIAR: CARACTERÍSTICAS GENÉTICAS,
ANTIGÉNICAS Y DIAGNÓSTICO ACTUAL
Julia Noda
Dpto. de Virología, Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA), Apartado 10, San José de las lajas,
La Habana, Cuba. Correo electrónico: [email protected]
RESUMEN: Los virus de la influenza aviar (VIA), pueden ser devastadores para la producción avícola
a la vez que se relacionan con las pandemias de influenza en humanos. Estos virus han sido objeto de
estudio sus características antigénicas y patogénicas, pero aun no son totalmente conocidos los aspectos
biológicos que determinan el potencial patogénico y la capacidad de cruzar la barrera entre especies.
Esta situación ha motivado que en los últimos años se hayan realizado múltiples trabajos de investigación
que han aportado mayor conocimiento sobre la estructura y la biología molecular de estos virus. El
conocimiento de las características de los virus IA es fundamental para comprender la variabilidad
antigénica, las bases moleculares de la patogenicidad, el mecanismo que determina su capacidad para
infectar, producir enfermedad en varias especies, fundamentalmente la humana y su importancia para
el desarrollo y producción de vacunas más eficaces y seguras, así como sustancias antivirales de amplio
espectro. En este trabajo se resumen los conocimientos actuales sobre la composición del virus; su
estructura proteica, antigénica y genética y su influencia en las características biológicas.
(Palabras clave: virus influenza aviar; genoma; virulencia; características antigénicas; diagnóstico)
AVIAN INFLUENZA VIRUS: ANTIGENICS AND GENETICS CHARACTERISTICS AND
UPDATE DIAGNOSTICS
ABSTRACT: Avian Influenza viruses (AIV) can be devastables for poultry industry and are associated
to human influenza pandemic as well. Both antigenic and pathogenic characteristics of AIV have been
deeply studied, but biological aspects determining pathogenic potential and ability of crossing barriers
among species are no completed understood. This situation has propitiated several research works
about the structure and molecular biology of AIV in the last years. Such knowledge is crucial to
understand antigenic variability, pathogenicity molecular base and the mechanisms involved it the ability
to infect and cause disease in several species, including human. All these aspects are essential for
developing safer and more effective vaccines as well as broad effective antiviral drugs. In this work the
current knowledge about AIV composition, protein structure, antigenic and genetic characteristics and
its influence on the characteristics is summarized.
(Key word: Avian Influenza Virus; genome; virulence; antigenic characteristics; diagnosis)
INTRODUCCIÓN
La influenza aviar conocida también como gripe
aviar es una enfermedad infecciosa de las aves que
puede cursar desde una forma asintomática, hasta la
forma clínica severa con mortalidad elevada, lo cual
está en dependencia de la virulencia del virus y la
susceptibilidad de las aves que afecta (64). En pollos
y pavos se presenta en dos formas: una forma caracterizada por reducción de la producción de huevos y/
o leve afectación del sistema respiratorio y otra muy
aguda con signos neurológicos y entéricos severos,
muy contagiosa y mortalidad de hasta 100%, debido
a que invade múltiples tejidos y órganos internos donde provoca hemorragias de forma masiva (1, 22). Esta
forma altamente patógena descrita por primera vez
148
en Italia en 1978, se le denominó peste aviar y posteriormente recibió la denominación de influenza aviar
altamente patógena (IAAP), en el primer Simposio
Internacional en Influenza Aviar (1). Esta denominación se mantuvo durante varios años hasta que se le
aplicó el término de Influenza Aviar Notificable (IAN)
en la Organización Mundial de Salud Animal, de las
siglas en inglés OIE (44).
El agente etiológico se demostró que era un virus
en 1955, el cual presentaba características similares
al virus de la influenza humana A, sin embargo no fue
hasta 1965 que se identificó como influenza tipo A
(23). Posteriormente, se reconocieron a los serotipos
H5 y H7 del virus IA, como los causantes de la peste
aviar y se determinó que el principal determinante de
la virulencia, de estos dos serotipos se encontraba en
el sitio del procesamiento proteolítico de la
hemoaglutinina (10). Aunque hasta la actualidad se
han reconocido 16 serotipos diferentes de
hemoaglutinina (H) y 9 serotipos de neuroaminidasa
(N), todos ellos se han aislado de aves acuáticas silvestres (1, 24), sin embargo sólo son asociadas con
la influenza aviar altamente patógena (IAAP), las cepas de los serotipos H5 y H7, las que presentan múltiples aminoácidos básicos en el sitio de procesamiento proteolítico de la hemoaglutinina, mientras que el
resto de los serotipos y las cepas de los serotipos H5
y H7 que no muestran esas características se los reconoce como de baja patogenicidad (IABP) (45).
En los últimos 5 años se ha producido un incremento notable en la presentación de brotes de esta
enfermedad por diferentes cepas de estos dos
serotipos, los que han provocado pérdidas cuantiosas a la avicultura, como la ocurrida en Italia en el
2000 por el serotipo H7N1 (11), en Holanda en el 2003
por el serotipo H7N7 (Fouchier et al., 2004 y la del
Sudeste asiático en el 2004 que involucró múltiples
países (14) y el virus causal (H5N1) fue capaz de sobrepasar la barrera ínter especies e infectar directamente, causar enfermedad y la muerte de personas
(8). En la actualidad esta situación se ha agravado al
extenderse a varios países de Europa, África y Medio
Oriente con la afectación de aves silvestres y domésticas y con el riesgo creciente de dar lugar a una nueva pandemia de Influenza (67, 70).
Un interés principal ha cobrado el conocimiento
de las características de los virus de la influenza aviar
basado en los aspectos moleculares, lo cual ha permitido profundizar en los cambios que han hecho posible que este virus proveniente de pollos infecte directamente y cause enfermedad en varias especies
de mamíferos y el hombre (53, 67). A la vez que han
contribuido a incrementar la eficacia y rapidez del diagRev. Salud Anim. Vol. 28 No. 3 (2006)
nóstico y el desarrollo de vacunas efectivas para su
utilización en aves y humanos, para una mejor preparación frente a una posible pandemia de Influenza.
Con este trabajo hacemos un resumen de las características genéticas, antigénicas y patogénicas de los
virus de la influenza aviar.
CLASIFICACIÓN Y CARACTERÍSTICAS
MORFOLÓGICAS
Los virus de la influenza aviar inicialmente clasificados en el género Influenza virus y en el tipo
antigénico A de la familia Orthomixoviridae (36), fueron posteriormente constituidos en el género Influenza virus tipo A, basado en las características de la
nucleoproteína (NP) y la proteína de la matriz (M) (20).
Morfológicamente los virus influenza A en general, se
caracterizan por ser esféricos con diámetro entre 80120 nm, aunque pueden presentar formas
filamentosas o pleomórficas que pueden alcanzar
entre 400-800 nm de largo. La forma esférica es adquirida con el incremento del número de pases y los
virus de origen aviar son más frecuentemente esféricos. Estructuralmente presentan una nucleocápsida
formada de 8 segmentos con simetría helicoidal y de
9 nm en diámetro, la cual está constituida por dos
componentes internos la ribonucleoproteína (RNP o
NP) y el ARN viral al cual se unen 3 polipéptidos PB1,
PB2 y PA con actividad polimerasa (69) La envoltura
está compuesta de una bicapa lipídica derivada de la
célula hospedera que presenta proyecciones en la
superficie de aproximadamente 16 nanómetros de
largo, en forma de espículas denominadas
peplómeros que están constituidas por dos proteínas
la Hemoaglutinina (H) y la Neuroaminidasa (N), las
que se encuentran ancladas en dicha estructura en
una relación de 4-5 a 1 y forman la partícula viral 500
moléculas de H y 100de N. La H presenta una forma
bacilar y emerge como un trímero de 135Å en tanto
que la N, tiene aspecto de hongo y forma un tetrámero
de 60Å (Fig.1) (36). Ambas participan del proceso de
infección y definen la especificidad de subtipo.
En la parte interna, la envoltura viral está recubierta
por la proteína matriz (M), la cual esta representada
por dos tipos de proteínas M1 y M2 (Fig.1). La M1 es
la proteína mayoritaria y junto con la NP le dan las
características antigénicas específicas de grupo (tipo
A) y la diferencia de género, la M2 se encuentra en la
superficie de la envoltura y forma un canal iónico para
la entrada del virus a la célula (52).
Los virus Influenza tienen un genoma multipartito
representado por 8 segmentos de ácido nucleico
(ARN) de cadena simple y de polaridad negativa (Fig.
149
Hemoaglutinina (H)
Neuroaminidasa (N)
M2
M1
NP+ARN
FIGURA 1. Representación esquemática de la estructura
del virus de la influenza aviar./ Schematic representation
of the avian influenza virus structure.
1). La talla total de todos los segmentos es de 13600
nucleótidos (nt) los cuales portan la información genética
para las 10 proteínas virales identificadas (40, 36). Todos los segmentos del genoma tienen altamente conservado los extremos terminales 5' y 3', y están constituido por una secuencia común de 12-13 nucleótidos
(5’AGUAGAAACAAGG) para el género Influenza tipo A
(30) y en el extremo 3’ una secuencia conservada en
muchos segmentos (3’UCGUUUUCGUCC) y diferencian los virus humano del tipo A y del tipo B. Esta secuencia se relaciona con la señal para la traducción en
la replicación del ARN viral.
Los segmentos 1, 2 y 3 codifican para tres proteínas
internas con actividad polimerasa (46), el segmento 1
compuesto de 2350 nucleótidos es el segmento de
mayor longitud y codifica para la proteína PB2, la cual
es esencial para la síntesis del ARN mensajero viral (36),
en tanto que el segmento 2 de 2350 nt lleva la información de la polimerasa PB1 y el 3 con 2250 nt lo hace
para la polimerasa PA. Estas proteínas forman un complejo con la NP el cual se localiza en el interior de la
partícula viral y son importantes en la replicación del
genoma viral (43). Las proteínas estructurales H, NP y
N son codificadas por los segmentos 4, 5 y 6 (1780,
1575 y 1420 nt, respectivamente, en tanto que el segmento 7 de 1027 nt porta los genes para las proteínas
M1 y M2 y el 8 (890 nt) los de la información genética
para las proteínas no estructurales NS1 y NS2 o NEP,
las que se relacionan con el ensamblaje del virus y la
respuesta antiviral, respectivamente (36, 52, 55).
Basado en la naturaleza segmentada del ARN de
los virus influenza se ha señalado que se pudieran
producir teóricamente 256 combinaciones del genoma
por el entrecruzamiento de los ocho segmentos que
lo componen (31), aunque en la naturaleza hasta la
actualidad son pocas las combinaciones que logran el
número de genes con potencialidad para ser viables.
Esta característica del ARN de estos virus permite el
reordenamiento (“reassorment”) de genes o su
recombinación cuando una célula es infectada con dos
o más virus diferentes y de esta forma dar origen a nuevas cepas de virus que difieren de las progenitoras (63,
66). Este mecanismo ha hecho posible el intercambio
genético entre virus de influenza de diferentes especies
animales o del hombre como entre los virus de origen
humano y aviar, las cuales han ocurrido por coinfección
en cerdos respecto a virus del serotipo H3 (35). Esto se
ha encontrado también en los virus H5N1 y H9N2 surgidos en el Sudeste de Asia, procedentes de humanos,
pollos y aves acuáticas (48) los cuales mostraron genes
similares y sugieren que los pollos pueden actuar como
hospedero intermedio en la transmisión a humanos.
Otra evidencia de este mecanismo de intercambio genético se ha revelado por el análisis filogenético,
de los virus influenza H5N1 aislados de humanos y
pollos en 1997, donde se encontró genes internos con
características genéticas similares a los aislados
H9N2 de codorniz (Codorniz/Hong Kong/G1/97) (26).
Estos hallazgos unido a la incidencia de infección por
virus H6N1 que presentan los genes internos y el de
la NA genéticamente indistinguibles de los virus H5N1
de 1997 (17) y junto a la susceptibilidad demostrada
por esta especie a la infección con 14 serotipos diferentes de virus de la influenza aviar, sugieren que las
codornices potencialmente pueden actuar como
mezcladores de genes de estos virus y dar lugar al
surgimiento de nuevas cepas con incremento en la
probabilidad de la transmisión ínter especies (51).
Los estudios de secuenciación y el análisis
filogenético realizado principalmente del gen de la NP
de cepas del virus de la influenza aviar y los que afectan otras especies animales incluyendo al hombre,
han revelado la divergencia en linajes específicos relacionados con el hospedero: dos linajes de caballos,
uno de gaviotas, uno de aves de Norteamérica, uno
de aves Euroasiática, uno de cerdo y uno de humanos (65). Con respecto al gen M, el cual se ha considerado un determinante de especificidad de especie
de los virus influenza, (68) encontraron en el análisis
de la secuencia de nucleótidos de este gen de los
virus influenza aislados de gaviotas y pájaros y de las
secuencias reportadas, un principal linaje de virus influenza A asociado a hospederos en particular: uno
de humano y de cerdo clásico, uno de virus gaviota,
otro de virus aviar no gaviota y virus equino, mientras
que los virus aviares se dividían en dos linajes
Euroasiático y Norteamérica, los que a su vez fueron
separados en sublinajes diferentes. Estos autores
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sugieren, que en las aves acuáticas se mantienen diversas ramas de evolución de los virus influenza y
concluyen que los genes M de los virus procedentes
de gaviotas, pájaros de costa y patos pueden ser potencialmente los precursores de los virus que causan
brotes en la avicultura comercial (68). También encontraron recombinación genética de este gen entre
virus procedentes de Eurasia y Norteamérica
La secuencia de nucleótidos del segmento 4 que codifica para la H de los serotipos H1-H16, ha sido objeto
de estudio y se han podido establecer diferencias y
homologías entre los mismos (24). Los análisis
filogenéticos realizados por Banks y Alexander (5) a partir
de la secuencia del gen de la H de diferentes cepas de
los serotipos H5 y H7, revelaron también divergencia en
dos linajes aviares del serotipo H7 distintos
geográficamente, uno de Norteamérica y otro de los virus
de Eurasia, África y Australia. En los virus del serotipo H5
se encontró divergencia también en dos linajes, el norteamericano y euroasiático y estos divergieron a su vez en
sublinajes de virus históricos y aislados recientes.
Los estudios tempranos de la secuencia de los
genes PB1 y PB2 y el análisis filogenético realizado
por Lin et al., han revelado también la divergencia en 4
linajes de los virus influenza relacionado con el gen
PB1: uno de virus humano y los clásicos de cerdo, uno
virus equino y otros de virus de aves de Norteamérica
y otro de aves de Asia (38). En este último linaje se
agruparon los virus humano pandémicos H2N2 y H3N2
y se sugiere el origen aviar de los genes PB1 de estos
virus, mientras que los resultados obtenidos por estos
autores con los genes NS revelaron dos linajes designados como alelos A y B, en el A se incluyen los virus
de humano, cerdo, equino y pocos virus aviares y el B
sólo virus aviares que se subdividen en otros dos: norteamericano y euroasiático (38).
Todos estos estudios evidencian el importante papel de la diversidad de los genes de los virus influenza en las aves acuáticas silvestres donde se ha encontrado por el análisis filogenético de estos genes la
separación también de los virus aislados en linajes
euroasiático y norteamericano lo cual indica la importancia de la migración longitudinal en el proceso de
evolución de estos virus.
Los virus influenza tienen además gran variabilidad
genética, con una elevada tasa de mutaciones > de
5x10-5 cambios de nucleótidos y ciclo de replicación (20,
63) lo cual está relacionado con la utilización para su
replicación de una polimerasa ARN dependiente viral
que por una parte presenta errores de copia y por otra
tiene poca capacidad correctora. Esta variabilidad se
traduce en sustituciones de aminoácidos en las proteíRev. Salud Anim. Vol. 28 No. 3 (2006)
nas de la envoltura viral, fundamentalmente la H y N,
que pueden dar origen al surgimiento de virus variantes antigénicos o en patogenicidad (4, 33, 50,62). Este
fenómeno ocurre en los epitopes de menor magnitud y
de forma gradual por la selección de mutantes.
Los estudios moleculares y los análisis
filogenéticos realizados sobre el gen H a los aislados
del serotipo (H5N1) obtenidos hasta el 2001 en Hong
Kong, los clasificaban en cinco genotipos de acuerdo
a la fuente de cada uno de los segmentos del genoma,
los cuales se nombraron como A, B, C, D y E (27). Sin
embargo, los estudios posteriores realizados con aislados de este serotipo, responsable de la
reemergencia en el 2003 de la enfermedad altamente patógena en pollos y su capacidad de provocar
enfermedad y muerte en humanos en varios países
del Sureste de Asia; han revelado la emergencia de 8
nuevos genotipos nombrados V, W, X1, X2, X3, Y, Z y
Z + (37). En tanto que del análisis realizado a la secuencia de todos los segmentos del genoma de seis
aislados del serotipo H5N1 obtenidos de humanos en
Tailandia se evidenció que se corresponden con el
genotipo Z y por la H y N en el sublinaje Gs/Gd (53).
Por los estudios de secuencias de nucleótidos del
gen H se ha determinado también, que las cepas altamente patógenas de los virus de la influenza aviar no
constituyen linajes diferentes de estos virus. Ellas derivan de cepas de baja patogenicidad que en su multiplicación en pollos adquieren mutaciones en el segmento que codifica el sitio de procesamiento proteolítico de
la proteína por las endonucleasas celulares, siendo la
condición fundamental de la patogenicidad en los
serotipos H5 y H7 y un marcador de virulencia (61).
De todos estos estudios se ha considerado la hipótesis de que el gen H de los serotipos H5 y H7 tienen distintiva estructura secundaria de su ARN que
puede favorecer la mutación por varios mecanismos:
a) Inserción de nucleótidos (duplicación de codones)
por copias repetidas de la polimerasa viral de una
secuencia rica en purinas que codifica el sitio de procesamiento proteolítico de la H (49); b) Sustitución de
nucleótidos o recombinación que permiten la introducción de residuos de aminoácidos adicionales (61).
Particular interés presenta los virus influenza del
serotipo H9N2 aislados de humanos y de aves en
Hong Kong, los que por análisis filogenéticos de los
genes H y NP, muestran diferencias con los de
Norteamérica y se han dividido en tres linajes que presentan diferencias en patogenicidad para el pollo y en
producir infección de varias especies animales, lo que
se ha relacionado también con la presencia de genes
similares a los virus H5N1 de 1997 (28).
151
La secuencia de nucleótidos del segmento 6 del
genoma que codifica la neuroaminidasa(N) también
ha sido objeto de estudio para la caracterización de
cepas relacionadas sobre el origen de los virus influenza, las diferencias en patogenicidad y en la sensibilidad al efecto de los antivirales inhibidores de esta enzima (6, 36). Avances en el conocimiento se han obtenido por generación experimental de cepas altamente
patógenas a partir de las de baja patogenicidad y por la
genética inversa, a partir de estos estudios se ha determinado la influencia de algunos genes o deleciones
de ellos y se ha concluido que en la virulencia de estos
virus están involucrados otros segmentos de genes
además de la H y la N, los que pueden variar con la
cepa viral y el hospedero que infecta (60, 66).
Todos estos cambios en el genoma pueden llegar
a producir cambios en las proteínas las que muestran
modificaciones relacionadas con variaciones
antigénicas o en patogenicidad cuando se producen
en el gen de la hemoaglutinina y la neuroaminidasa,
mientras que en los genes internos se traducen en
cambios en la patogenicidad y la potencialidad para
la transmisión entre diferentes especies animales.
CARACTERÍSTICAS ANTIGÉNICAS
La diversidad antigénica de los virus de la influenza
aviar se ha evidenciado en todas las combinaciones
posibles de las proteínas de la envoltura la
hemoaglutinina (H) y la neuroaminidasa (N) y se describen hasta la actualidad 16 serotipos antigénicos diferentes de H y 9 de N (24) los que pueden originar 144
posibles combinaciones. La variabilidad antigénica se
ha podido conocer tempranamente por el análisis de la
secuencia deducida de aminoácidos realizada a virus
de los serotipos del H1 al H12, donde se pudo revelar
que en el péptido señal se presentaban las mayores
diferencias entre los subtipos evidenciado por tener una
longitud variable y menor homología de los diferentes
serotipos con 20-74% de variación entre los mismos (4).
Todos estos serotipos se han encontrado en aves acuáticas silvestres, las que actúan como reservorios naturales y genéticos de estos virus donde se originan las
mezclas de diferentes poblaciones virales (1,38,27). En
tanto que las especies galliformes y los mamíferos son
considerados huéspedes no habituales.
De las dos proteínas estructurales principales de la
envoltura es la H la de mayor importancia, tiene la función de unirse a los sialo-liposacáridos de los receptores que están presentes en la membrana citoplasmática
de las células, ya que presenta el dominio de fusión
que es necesario para la liberación del ARN en la célula huésped en el proceso de la replicación viral, lo cual
es vital para la transmisión viral y el principal determinante del rango de hospedero (41).
Los estudios de la primera fase de la replicación
viral de los virus influenza aviar han demostrado que
los virus de origen aviar tienen una mayor afinidad por
los receptores celulares de ácido siálico Ü 2-3 que es
dominante en células epiteliales en tejidos del pulmón
y tracto intestinal (25), mientras que los virus adaptados a humanos la tienen por Ü 2 -6 galactosa presente
en células epiteliales no ciliadas del tracto respiratorio
humano, lo cual puede actuar como barrera entre especies. No obstante, el hecho de encontrarse ambos
tipos de receptores en células de cerdos y codornices
considerados los mezcladores de cepas de virus humanos y aviares hace posible la transmisión entre especies y el surgimiento de virus pandémicos (48, 51).
Se ha señalado también la importancia del sitio o posición una leucina L216Q (L226Q en la numeración de
H3) para la especificad de la unión al receptor, la cual
está presente en los virus humanos y cerdos mientras
que es sustituida por glutamina en los virus aviares (66).
En el análisis de aislados del serotipo H9 procedentes
de aves acuáticas de China se ha encontrado que contienen leucina en este sitio lo cual puede favorecer la
unión a células de mamíferos y explicar la capacidad
de estas cepas para la infección en humanos (34).
La H es una proteína glucosilada y acilada,
estructuralmente forma homotrímeros sobre la superficie viral y presenta 4-5 epitopes o sitios antígénicos
dominantes que son los responsables de la inducción
de anticuerpos neutralizantes específicos al virus y protectores contra la enfermedad y en ella se encuentra la
actividad hemaglutinante (23, 33, 34). Esta proteína
presenta 562-566 aminoácidos y está formada por dos
cadenas polipetídicas H1 y H2 unidas por dos puentes
disulfuro, las cuales derivan de la proteólisis de una
molécula precursora (H0), debido a la acción de las
proteasas presentes en las células huésped. Este sitio
de procesamiento proteolítico en la hemoaglutinina es
esencial para la infectividad viral y se relaciona estrechamente con la patogenicidad (10, 62).
La neuroaminidasa (N) es una sialidasa que evita
la formación de agregados de los viriones que
emergen de la membrana celular, lo cual realiza por
remoción del ácido siálico de la superficie celular y
digestión de los enlaces del ácido neuroamínico entre las membranas del virus y la célula, lo cual favorece la liberación viral (36). El dominio enzimático de la
N se encuentra en el polipéptido del pedúnculo que
emerge de la envoltura viral y que puede ser de diferente talla, un pedúnculo corto se asocia con ineficiente
desagregación y liberación de la progenie viral debido a que no puede acceder a su sustrato (7). Otros
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cambios importantes en esta proteína se relacionan
con residuos de aminoácidos que están asociados
con la resistencia a inhibidores de la neuroaminidasa,
como la sustitución de arginina (R) por lisina (K) en el
residuo 292 que determina la resistencia al oseltamivir
y zanamivir (6).
Variaciones antigénicas también se producen en
esta proteína aunque en menor magnitud que la
hemoaglutinina, lo cual se expresa en los 9 diferentes serotipos de N detectados (1, 36). La N aunque
induce anticuerpos los que inhiben la actividad
enzimática de forma específica, sólo induce protección parcial cuando se utiliza sólo esta proteína. En la
actualidad para la introducción de un programa de
control mediante vacunación se ha considerado la
estrategia de diferenciar vacunados de infectados
sobre la base de revelar la presencia de anticuerpos
contra una neuroaminidasa heteróloga en la cepa
vacunal utilizada respecto al virus circulante (12).
La proteína M2 resulta indispensable en la infección por virus influenza y está determinado por su
actividad al formar un canal iónico con incremento de
la concentración de iones dentro de la partícula viral,
reduce el pH y facilita la fusión a la membrana del
endosoma por la H activada y ARN viral puede ser
liberado al interior de la célula (9). Esta actividad de la
proteína M2 puede ser inhibida por la amantadina,
rimantadina y sustancias relacionadas, sin embargo
en los estudios moleculares de varias cepas de H5N1
obtenidas de origen de pollos y de humanos de brotes de la enfermedad en el sureste de Asia se han
encontrado sustituciones de aminoácidos como
aspargina en lugar de serina en el residuo 31 en la
cepa aislada en Tailandia, indicativo de resistencia
frente al tratamiento con estas drogas (53, 60). Los
anticuerpos inducidos por esta proteína aunque no
son neutralizantes reducen la penetración viral y por
tanto pueden producir protección parcial.
La proteína NS1 (no estructural) sólo es producida
durante la infección viral, que tiene como función inhibir la
transportación del ARNm de la célula permitiendo el
transporte del ARN viral a los ribosomas para su traducción su actividad se relaciona con la evasión a la respuesta inmune innata debido a que inhibe y es antagonista del interferón alfa (INFa) (47). Además, es capaz de
inducir la producción de anticuerpos que puede ser utilizado para diferenciar también aves infectadas de vacunadas en un programa de control por vacunación (2).
CARACTERÍSTICAS PATOGÉNICAS.
Las características de mayor virulencia o
patogenicidad observada particularmente en cepas de
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los serotipos H5 y H7, está determinada por la presencia de múltiples aminoácidos básicos (arginina y/
o lisina) en el sitio de partición enzimática (SPE) de la
H (originada por mutaciones o por duplicación de
nucleótidos en el gen H), lo que permite el procesamiento proteolítico por diferentes proteasas celulares
(54, 49) y no sólo del tipo de la tripsina, lo cual hace
posible una mayor capacidad de estos virus para infectar los tejidos internos y provocar una infección
generalizada con mortalidad en las aves.
Los estudios realizados por análisis de la secuencia traducida de aminoácidos de la H, a los aislados
de los brotes de influenza altamente patógena ocurridos en México por el serotipo H5N2 y en Italia por el
serotipo H7N1, han demostrado la presencia de múltiples aminoácidos básicos en el SPE en estas cepas, las cuales derivaron de cepas de baja
patogenicidad presentes en un período previo a la
aparición de la enfermedad (49, 11). Por lo que basado en estos resultados se ha sugerido la hipótesis de
que estos cambios se deben al mecanismo de inserción o duplicación de nucleótidos el cual está
influenciado por la estructura secundaria del ARN que
flanquea este sitio en los serotipos H5 y H7 (62) y
estos cambios son considerados como marcadores
de virulencia de aislados de estos serotipos del virus
de la influenza aviar (50), la determinación de la secuencia de nucleótidos de este segmento del genoma
y la traducida de aminoácidos ha sido indicada entre
las pruebas a realizar para predecir la patogenicidad
junto a las pruebas de patogenicidad en pollos (45).
No obstante, se han encontrado otros cambios en
la estructura de la H, relacionados con los sitios de
glicosilación en el segmento H1, la presencia de varios sitios cercanos al receptor se han asociado con
un incremento en la virulencia de los virus influenza
virus, debido a que pueden facilitar la entrada del virus
a la célula huésped y acelerar la salida desde las células (50). También, la presencia en la N de variabilidad
de glicosilación se ha relacionado con supresiones en
el pedúnculo de esta proteína, lo cual se ha asociado
con un incremento de la virulencia en una variedad de
cepas y se ha encontrado que ciertas mutaciones en la
H requieren de mutaciones en la neuroaminidasa para
una mayor virulencia de los virus influenza (32). Esta
interacción afecta la rapidez conque las partículas de
virus son liberados de las células y favorece la diseminación a todos los tejidos del ave.
Trabajos más recientes indican la importancia de
la proteína no estructural NS1, la cual tiene funciones
de regulación en el proceso de replicación viral y mutaciones en el gen NS que pueden afectar la actividad
antagónica contra el interferón alfa/beta (IFN a/ß) (47).
153
Los estudios realizados sobre los genes de las cepas
de IA H5N1/97 de Hong Kong, han demostrado que
cambios de el gen NS1 pueden ser determinantes para
la patogenicidad en mamíferos (39).Todo lo cual ha
evidenciado que la virulencia de los virus de la influenza en general y los de origen aviar en particular puede estar determinada por cambios en varios genes
(66), por lo que estudios más profundos aún serán
necesarios para esclarecer las características
patogénicas que diferencian los serotipos H5 y H7 y
otros serotipos que han logrado pasar la barrera interespecies e infectar humanos.
DIAGNÓSTICO ACTUAL
El incremento del impacto de la Influenza aviar,
tanto en la producción avícola como la salud humana
a nivel mundial, ha requerido del desarrollo de las
capacidades de diagnóstico en múltiples laboratorios
en el mundo, dirigido a la detección rápida de
antígenos específicos o el ARN viral pero de forma
paralela con los métodos clásicos o convencionales
(45). La metodología convencional se basa en el aislamiento viral en embrión de pollo considerado como
el estándar de oro para el diagnóstico de influenza
aviar debido a su elevada sensibilidad, sin embargo
presenta algunos problemas ya que no siempre provoca mortalidad del embrión (depende del patotipo) y
no produce lesiones características del embrión (42),
por lo que la forma de revelar la multiplicación viral en
el líquido alantoideo es a través de la hemoaglutinación
de glóbulos rojos de pollo, lo cual requiere de la presencia de 106.0 partículas de virus para que ocurra
dicho fenómeno y son necesarios dos o más pases
en embrión de pollo, sobre todo para el aislamiento
de cepas de baja patogenicidad (IABP). Con las de
alta patogenicidad (IAAP) con un segundo pasaje se
lograría la producción óptima de virus para la
hemoaglutinación (29). Una vez obtenido el aislamiento de un virus hemoaglutinante se identifican el
serotipo de hemoaglutinina (H) por la prueba de inhibición de la hemoaglutinación (IHA) para lo cual se
necesitan antisueros mono-específicos contra los 16
serotipos de H. Además se deben utilizar antisueros
contra los subtipos de paramyxovirus aviares que tienen también actividad hemoaglutinante (45).
De revelarse algún serotipo H de virus IA se determina el subtipo de neuroaminidasa (N) con antisueros
específicos de las 9 N (71). La determinación del tipo
de N en aislados de H5 y H7 reviste gran importancia,
la que se relaciona con estrategias de control mediante
vacunación con el empleo de virus vacunal con N
heteróloga respecto a los virus causantes del brote
de la enfermedad y que permite diferenciar las aves
vacunadas de infectadas, conocido con las siglas DIVA
(12, 15). Particular cuidado se debe tener en esta prueba cuando se utilizan antisueros contra el virus completo pues los anticuerpos a la H pueden enmascarar o
bloquear de forma no específica actividad N, así como
también reactividad cruzada entre los subtipos de N (71).
Una vez que se tiene identificado un aislado del virus de la IA es necesario determinar su virulencia o
patogenicidad para los pollos, sobre todo con los
serotipos H5 y H7 en los que se reconocen cepas altamente patógenas para el pollo y está indicado el índice
de patogenicidad intravenosa (IPIV) para determinar el
patotipo de los mismos. Esta prueba se realiza por inoculación de 10 pollos de 6 semanas de edad por la vía
intravenosa con el aislado multiplicado en embrión de
pollo y es considerado como altamente patógeno si
causa 75% o más de mortalidad dentro de los 10 días
de observación o un IPIV >1,2 (45). Si bien esta metodología aunque efectiva en el diagnóstico junto con la
determinación del patotipo, tiene la desventaja del tiempo prolongado (10-15 días) que se necesita para obtener los resultados que demuestren la presencia de los
virus altamente patógenos.
En caso de sospecha o presencia de un brote de
influenza aviar la identificación rápida es de vital importancia para la toma de medidas específicas de
control, a fin de reducir la diseminación del virus actuante y las pérdidas que pueda producir como consecuencia de la enfermedad altamente patógena.
Debido a esto se han desarrollado métodos de diagnóstico dirigidos a la identificación del ARN viral y de
antígeno, los que pueden ser utilizados conjuntamente con los métodos convencionales (13, 45).
Para revelar la presencia de virus influenza e identificar el serotipo se han empleado múltiples métodos
basado en la detección del ARN viral por reacción en
cadena de la polimerasa con transcripción inversa
conocido con las siglas RT-PCR, dirigidos a la identificación de virus IA tipo A, la determinación del serotipo
de H y la secuenciación del genes relacionadas con
la virulencia y/o el origen del virus presente. En la
detección del ARN tipo A se ha utilizado cebadores
que amplifican regiones conservadas del gen que
codifica la proteína M (58,59), los que han logrado
amplificar cepas y aislados de los serotipos H5 y H7
evaluados, también del gen de la nucleoproteína (NP)
(21), los que permiten identificar cualquier virus influenza tipo A específico, aspecto también importante
para la detección de nuevos serotipos emergentes (24)
y para determinar el origen por estudios filogenéticos.
Respecto a la detección del tipo de H se han empleado también varios RT-PCR para la identificación
Rev. Salud Anim. Vol. 28 No. 3 (2006)
154
fundamentalmente de H5 y H7 que han permitido el diagnóstico rápido con la introducción del PCR anidado,
NASBA y el de tiempo real (18, 19, 58, 59,61). Con
relación a la N también se ha logrado el diagnóstico por
RT-PCR que permiten la identificación más rápida que
el ensayo convencional sobre todo en la detección del
actual virus potencialmente pandémico H5N1 (30, 24).
dología por tanto forma parte del algoritmo de diagnóstico la IA incorporado al actual Programa de Prevención de esta enfermedad del IMV ante la sospecha de enfermedad respiratoria o nerviosa en las aves.
La determinación temprana del patotipo es otro de
los aspectos fundamentales para el diagnóstico de IA,
lo cual requiere para la toma de medidas más drásticas de control y/o el empleo de la vacunación (45) (Manual OIE, 2005), por lo que la predicción del patotipo
por RT-PCR y secuenciación del segmento del gen de
la H que codifica el sitio de procesamiento proteolítico,
permite revelar la presencia de múltiples aminoácidos
básicos en este sitio lo cual se relaciona con las cepas
altamente patógenas de los serotipos H5 y H7 (56, 62).
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El diagnóstico de IA por estas técnicas tiene ventajas sobre el aislamiento viral en rapidez cuando se
realiza directamente de la muestra clínica al no
requerirse del aislamiento viral inicial. Respecto a la
prueba de patogenicidad la cual demorar un tiempo
mayor de 10 días, con la aplicación de las técnicas
moleculares para la predicción del patotipo se puede
obtener el resultado en menos de 3 días (61), además de facilitar el diagnóstico diferencial simultáneo
con la enfermedad de Newcastle que provoca semejantes signos clínicos, mortalidad y que también se
emplea similar metodología (57, 3).
Aunque se han empleado también otros métodos
para la detección del virus IA y la identificación del serotipo
como los ensayos inmunoenzimáticos de captura de
antígeno (16) directamente en muestras clínicas, estos
no superan al aislamiento viral y al RT-PCR en sensibilidad, lo cual es muy importante, pues basado en este
diagnóstico se deben tomar las medidas de control para
evitar la propagación del virus entre las aves.
En nuestro país, se realiza de forma sistemática
la vigilancia epizootiológica de influenza aviar por
monitoreos serológicos de las poblaciones de aves
comerciales, relacionadas con las zonas de riesgos,
aves centinelas de los asentamientos de aves
migratorias según lo establecido en el programa de
vigilancia y control del Instituto de Medicina Veterinaria (IMV) para esta enfermedad. No obstante ante la
situación internacional con la IA desde el 2002 en
nuestro laboratorio se han realizado trabajos que han
permitido la puesta a punto de los métodos
moleculares RT- PCR y la secuenciación de la H para
la detección rápida a partir de la muestra clínica, lo
cual ofrece una mayor seguridad al no requerir de la
multiplicación previa en embrión de pollo. Esta metoRev. Salud Anim. Vol. 28 No. 3 (2006)
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