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Memoria 1997/98
CBMSO
1997/98 Report
Inmunología y Virología
Immunology and Virology
101
Memoria 1997/98
CBMSO
1997/98 Report
TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES A TRAVÉS DEL RECEPTOR
PARA EL ANTÍGENO DE CÉLULAS T
SIGNAL TRANSDUCTION THROUGH THE T CELL ANTIGEN
RECEPTOR
Jefe de Línea / Group Leader:
Becarios Postdoctorales
Postdoctoral Fellows:
Becarios Predoctorales
Graduate Students:
Balbino Alarcón
Aldo Borroto, Ester San José
Diana Gil, Pilar Delgado
Resumen de Investigación
Los linfocitos T desempeñan un papel central en la regulación de la respuesta
inmune. Reconocen y responden a antígenos a través de un receptor expresado en la
membrana plasmática y que está compuesto de al menos 6 subunidades. Las subunidades TCR-α y TCR-β (TCR-γ y TCR-δ en linfocitos γδ) son las encargadas del reconocimiento del antígeno asociado al complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Sin
embargo, debido a que sus dominios intracitoplásmicos son extremadamente cortos, la
transmisión de señales al interior celular debe descansar en las otras subunidades del
complejo: CD3-γ, CD3-δ, CD3-ε y CD3-ζ. Las tres primeras subunidades tienen cada
una un motivo YxxL/IxxxxxxxxYxxL/I conocido como ITAM y que cuando está fosforilado en tirosina es capaz de interaccionar con la tirosina quinasa ZAP70. CD3-ζ contiene tres ITAMs. Tenemos evidencia de que existe una especialización funcional dentro de las subunidades del complejo CD3 implicadas en la transducción de señales y así,
CD3-ζ parece ser necesaria para la inducción del programa de apoptosis en linfocitos T
maduros mientras que es prescindible para la inducción de la transcripción de los genes
de citoquinas. En este fenómeno juega un papel importante ZAP70 que no es reclutada
a la membrana plasmática cuando CD3-ζ está débilmente asociada al resto del complejo, por lo que pensamos que esta quinasa debe ser importante en la conexión entre el
complejo TCR/CD3 y la activación de la transcripción del ligando de CD95, implicado
103
en la inducción de apoptosis. Nos queda por dilucidar qué posibles rutas de activación
conectan ZAP70 con CD95L que sean defectuosas en nuestros mutantes.
Además del estudio de la especialización funcional del complejo TCR/CD3, estamos estudiando los mecanismos que regulan su ensamblación intracelular así como su
estequiometría. Hemos establecido un modelo de estequiometría mediante el estudio
de líneas celulares T mutantes y de ratones transgénicos para TCR-β. De acuerdo con
esto, el complejo TCR/CD3 no contiene uno sino dos heterodímeros TCRα/β que forman hemicomplejos con CD3-ε y CD3-γ por un lado y con CD3-ε y CD3-δ por el otro.
El homodímero de CD3-ζ sería necesario para unir ambas mitades del complejo. La presencia de dos heterodímeros α/β capaces de ligar sendas moléculas de MHC cargadas
con el péptido antigénico en el mismo complejo cambiaría la avidez de la interacción y
puede tener una importancia fundamental en la comprensión de los mecanismos de
reconocimiento del antígeno y de activación de los linfocitos T.
Otros estudios que se están realizando consisten en la utilización de una quimera
de CD4 que contiene una señal de retención intracelular de CD3-ε para inhibir la maduración de la glicoproteína de la envuelta de HIV y su empleo en terapia génica contra el
SIDA y en el estudio del efecto del antibiótico megalomicina en el transporte y maduración de glicoproteínas virales.
Research Summary
T cells play a central role in the regulation of the immune response. They recognize and respond to antigens via a membrane receptor composed of at least 6 subunits.
The TCR-α and TCR-β subunits (TCR-γ and TCR-δ in γδ T cells) directly interact with
the peptide antigen associated to the major histocompatibility complex (MHC).
However, due to their short cytoplasmic tails, signal transduction to the cytoplasm
must reside in the other components of the complex: CD3-γ, CD3-δ, CD3-ε and CD3-ζ.
The three first chains contain each a YxxL/IxxxxxxYxxL/I motif, known as
Immunoreceptor Tyrosine-Based Activation Motif (ITAM), that once phosphorylated
on tyrosine is able to interact with the ZAP70 tyrosine kinase. CD3-ζ contains 3 ITAMs.
We have evidence of a functional specialization within the subunits of the CD3 complex
104
in signal transduction and, thus, CD3-ζ seems to be necessary for the induction of the
apoptosis program in mature T lymphocytes whereas it is dispensable for the induction
of cytokine gene transcription. ZAP70 plays an important role in this phenomenon
since it does not become recruited to the plasma membrane when CD3-ζ is weakly associated to the other subunits of the complex. We thus think that ZAP70 is important in
connecting the TCR/CD3 complex to the transcription of the CD95 ligand (CD95L),
involved in the induction of apoptosis. We are now trying to decipher possible routes
of activation that connect ZAP70 with CD95L that could be defective in our mutants.
In addition to the study of the functional specialization of the TCR/CD3 complex,
we are studying the mechanisms that regulate its intracellular assembly and stoichiometry. We have established a model based on the study of mutant T cell lines and TCRβ transgenic mice. According to these data, the TCR/CD3 complex appears to have not
one but two TCRα/β heterodimers that form hemicomplexes with CD3-ε and CD3-γ on
one side and with CD3-ε and CD3-δ on the other. The CD3-ζ homodimer would be
necessary to link both halves of the complex. The presence of two α/β heterodimers in
the same complex with the capacity of each binding an antigen-loaded MHC would
change the avidity of interaction and could have a fundamental importance for understanding the mechanisms of antigen recognition and T cell activation.
Other studies that are being performed in our laboratory try to explore the possible gene therapy use of a CD4 chimera containing the intracellular retention signal of
CD3-ε to inhibit the maturation of the envelope glycoprotein of HIV and its use in AIDS
treatment. Finally, we are also studying the effect of the antibiotic megalomicin in the
transport and maturation of viral glycoproteins.
Publications / Publications
—
Dave, V., Cao, Z.S., Browne, C., Alarcón, B., Fernández-Miguel, G., Lafaille, J., de
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Bonay, P., Fresno, M. and Alarcón, B. Megalomicin disrupts lysosomal functions.
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105
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Borroto, A., Jiménez, M.A., Alarcón, B. and Rico, M. 1H-NMR analysis of CD3-ε
reveals the presence of turn-helix structures around the ITAM motif in an otherwise random coil cytoplasmic tail. Biopolymers 42, 75-88 (1997).
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Sun, J.Y., Pacheco-Castro, A., Borroto, A., Alarcón, B., Alvarez-Zapata, D. and
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reconstitution of CD3γ expression and T cell receptor surface expression and function in a CD3γ-deficient mutant T cell line. Hum. Gene Ther. 8, 1041-1048 (1997).
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Niedergang, F., San José, E., Rubin, B., Alarcón, B., Dautry-Varsat, A. and
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receptors internalized upon activation with superantigen or phorbol ester. Res.
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Alonso, M.A., Fan, L., Alarcón, B. Multiple sorting signals determine apical localization of a nonglycosylated integral membrane protein. J. Biol. Chem. 272, 3074830752 (1997).
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San José, E., Muñoz-Fernández, M.A. and Alarcón, B. Megalomicin inhibits HIV1 replication and interferes with gp160 processing. Virology 239, 303-314 (1997).
—
San José, E., Sahuquillo, A.G., Bragado, R. and Alarcón, B. Assembly of the
TCR/CD3 complex: CD3ε/δ and CD3ε/γ dimers associate indistinctly with both
TCRα and TCRβ chains. Evidence for a double TCR heterodimer model. Eur. J.
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—
Sahuquillo, A.G., Roumier, A., Teixeiro, E., Bragado, R. and Alarcón, B. TCR
engagement in apoptosis-defective, but IL-2 producing, T cells results in impaired
ZAP70/CD3-ζ association. J. Exp. Med. 187, 1179-1192 (1998).
—
Borroto, A., Mallabiabarrena, A., Albar, J.P., Martínez-A., C. and Alarcón, B.
Characterization of the region involved in CD3 pairwise interactions within the T
cell receptor complex. J. Biol. Chem. 273, 12807-12816 (1998).
106
—
San José, E., Muñoz-Fernández, M.A. and Alarcón, B. Retroviral vector-mediated
expression in primary human T cells of an endoplasmic reticulum-retained CD4
chimera inhibits HIV-1 replication. Hum. Gene Ther. 9, 1343-1355 (1998).
—
Dave, V.P., Keefe, R., Berger, M.A., Drbal, K., Punt, J.A., Wiest, D.L., Alarcón, B.
and Kappes, D.J. Altered functional responsiveness of thymocyte subsets from
CD3δ-deficient mice to TCR/CD3 engagement. Int. Immunol. 10, 1481-1490 (1998).
—
Bonay, P., Durán-Chica, I., Fresno, M., Alarcón, B. and Alcina, A. Anti-parasitic
effects of the intra-Golgi transport inhibitor megalomicin. Antimicrob. Agents
Chemother. 42, 2668-2673 (1998).
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Bartholeyns, J., Romet-Lemonne, J.L., Chokri, M., Buyse, M., Velu, T., Bruyns, C.,
Van de Winkel, J.J., Heeney, J., Koopman, G., Malmsten, M., De Groote, D.,
Monsigny, M., Midoux, P. and Alarcón, B. Cellular vaccines. Res. Immunol. 149,
647-649 (1998).
—
Alarcón, B. and Fresno, M. Transferrin receptor (CD71). En: Encyclopedia of
Immunology, second edition. Academic Press, London (1998).
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CBMSO
1997/98 Report
BASES MOLECULARES DE LA PATOGENICIDAD Y DEL
POTENCIAL ANTI-TUMORAL DE LOS PARVOVIRUS
MOLECULAR BASES PATHOGENICITY AND ANTI-TUMOUR
POTENTIAL OF PARVOVIRUSES
Jefe de Línea / Group Leader:
Personal Científico
Scientific Personnel:
Becarios Postdoctorales
Postdoctoral Fellows:
Becarios Predoctorales
Graduate Students:
Técnico de Investigación
Technical Assistance:
José M. Almendral
Mari P. Rubio
Eleuterio Lombardo, Juan C. Ramírez
Susana Guerra, Eva Hernando, Beatriz Maroto
José González
Resumen de Investigación
El análisis de las bases celulares y moleculares que determinan las patologías causadas por distintas cepas del parvovirus diminuto del ratón (Minute Virus of Mice,
MVM) en su hospedador natural, constituye un modelo para entender la patogénesis y
quizás prevenir infecciones, en humanos, de virus más complejos y peor conocidos. La
cepa MVMi, pero no la MVMp, muestra un tropismo claro por precursores hematopoyéticos y linfoides in vitro. Hemos estudiado recientemente la capacidad patogénica
del MVMi en ratones adultos inmunodeficientes que carecen de una respuesta inmune
específica (SCID). Los ratones SCID, inoculados intranasalmente por la ruta natural de
la infección, desarrollan una leucopenia muy severa dependiente de la dosis viral alrededor de 30 días pos-infección, aunque el número de plaquetas circulantes y eritrocitos
se mantuvo inalterado durante la enfermedad. En la médula ósea de cada ratón inoculado letalmente, una supresión profunda de progenitores clonogénicos CFU-GM y
BFU-E se correspondió con el máximo de multiplicación del MVMi. La infección indujo un drástico y duradero desequilibrio de la hematopoyesis medular, caracterizado por
la eliminación de células granulomacrofágicas (GR-1+, Mac-1+), y un aumento absoluto
108
de dos veces de células eritroides (TER-119+). Esta enfermedad inducida por MVMi en
ratones SCID que describimos (J. Virol. 73, 1774-84, 1999), aporta un modelo donde
ensayar inmunoterapia humoral y celular contra parvovirus, así como para evaluar la
capacidad de los parvovirus para evadir estos tratamientos.
En el análisis de funciones relevantes en las infecciones de parvovirus, hemos
buscado los determinantes de transporte nuclear en las proteínas VP1 y VP2 de la cápsida del MVMi, construyendo una serie de delecciones y mutaciones puntuales en un
plásmido infeccioso. La partícula de MVM está construida por sesenta subunidades de
las proteínas VP1 y VP2, que son idénticas en secuencia excepto por los primeros 142
aminoácidos del extremo N-terminal de VP1. Hemos encontrado que cada proteína
estructural lleva una señal de localización nuclear (NLS) con características propias.
VP1 contiene una NLS convencional en su secuencia específica amino-términal. Sin
embargo, la NLS no-convencional 528KGKLTMRAKLR538 se encontró que era necesaria
para el transporte nuclear de VP2. En la estructura de la cápsida icosahédrica de MVM,
esta secuencia forma parte de la lámina β I, y todos sus aminoácidos básicos están posicionados de forma contigua en la cara que en la subunidad no-ensamblada estarían
expuestos al solvente. El análisis mutacional demostró que la configuración así como la
carga básica neta de esta secuencia era esencial para el transporte nuclear de VP2 y para
el ensamblaje de la cápsida. Además, ambas proteínas están involucradas en interacciones citoplasmáticas cooperativas para el transporte nuclear. Estamos actualmente
investigando los dominios que median las interacciones, los cambios conformacionales
que desencadenan el transporte nuclear, así como los mecanismos reguladores celulares implicados.
Algunos parvovirus muestran un tropismo selectivo por células humanas transformadas. El uso potencial de los parvovirus como agentes anti-cáncer demanda un
conocimiento profundo de su oncotropismo. Con este objeto, hemos estudiado el significado biológico de la fosforilación de la cápsida del parvovirus MVMp en la infección
de células humanas transformadas. VP2, la proteína principal de la cápsida del MVMp,
se encontró fosforilada exclusivamente en residuos de serina y treonina. Mapas trípticos obtenidos por cromatografía bidimensional en capa fina de VP2 mostraron un
patrón reproducible de diez péptidos con fosforilación desigual. El péptido denomina109
do B, que contenía veinte veces más marca de 32P que cualquiera de los demás, se mapeó
en el extremo N-terminal de VP2, que es procesado durante la maduración de los viriones. Este péptido está fosforilado en tres residuos de serina consecutivos, y virus mutados en estos residuos mostraron una capacidad disminuida de progresar en células
humanas transformadas. Actualmente, estamos estudiando las kinasas celulares implicadas en la fosforilación del péptido B en células transformadas y no-transformadas
para desvelar este proceso esencial del oncotropismo de parvovirus.
Research Summary
The analysis of molecular and cellular basis that determine the pathologies caused
by different strains of parvovirus Minute Virus of Mice (MVM) in their natural host, provide a model to understand the pathogenesis and perhaps to prevent human infections
of more complex and poorly known viruses. The MVMi strain, but not MVMp, shows a
marked tropism for hemopoietic and lymphoid precursors in vitro. We have recently studied the pathogenic capacity of MVMi in adult immunodeficient mice lacking a specific
immune response (SCID). The SCID mice inoculated by the natural intranasal route of
infection developed a very severe leukopenia viral dose-dependent by 30days post-infection, even though the number of circulating platelets and erythrocytes remained unaltered throughout the disease. In the bone marrow of every lethally inoculated mouse, a
deep suppression of CFU-GM and BFU-E clonogenic progenitors was corresponded with
the maximal MVMi multiplication. The infection induced a sharp and lasting unbalance
of the marrow hemopoiesis, denoted by a marked depletion of granulomacrophagic cells
(GR-1+, Mac-1+), and a two fold absolute increase in erythroid cells (TER-119+). This
reported MVMi induced disease in SCID mice (J. Virol. 73, 1774-84, 1999) provides a
model where to assay humoral and cellular immunotherapy against parvoviruses, as
well as to study the capacity of the parvoviruses to evade these treatments.
In the analysis of relevant functions of parvovirus infections, we have sought the
determinants of nuclear transport in the VP1 and VP2 capsid proteins of MVMi by
constructing a set of deletions and point mutations in an infectious plasmid. The MVM
particle is built by sixty subunits of the VP1 and VP2 proteins that are identical in
sequence except for the first 142 aminoacids of the VP1 N-terminus. We found that each
110
structural protein carries a nuclear localization signal (NLS) with own features. VP1
contains a conventional NLS in its specific aminoterminal domain. However, the nonconventional NLS sequence 528KGKLTMRAKLR538 was found necessary for VP2 nuclear uptake. In the structure of the MVM icosahaedral capsid, this sequence forms part of
the β-strand I, and all its basic aminoacids are contiguously positioned at the face that
in the unassembled VP2 subunit would be exposed to the solvent. Mutational analysis
showed that the configuration as well as the net basic charge of this entire sequence was
essential for the VP2 nuclear transport and capsid assembly. Moreover, both proteins
are involved in cooperative cytoplasmic interaction for nuclear cotransport. We are
currently investigating the protein domains mediating these interactions, the conformational changes that trigger nuclear transport, as well as the regulatory cellular
mechanisms involved.
Some parvoviruses display a selective tropism for transformed human cells. The
potential use of parvoviruses as anti-cancer agents demands a comprehensive knowledge of this unique oncotropism. To this end, we have studied the biological significance of parvovirus MVMp capsid phosphorylation when infecting transformed
human cells. The major capsid protein of MVMp (VP2) was found phosphorylated
exclusively in serine and threonine residues. Tryptic maps obtained by two-dimensional thin-layer chromatography of VP2 showed a reproducible pattern of ten phosphopeptides unevenly phosphorylated. The peptide named B, harbouring twenty times
more 32P-label than any of the others, was mapped to the amino terminus of VP2, which
is cleavaged during virion maturation. This peptide is phosphorylated in three consecutive serine residues, and virus mutated on these residues showed an impaired capacity to progress in transformed human cells. We are currently studying the cellular
kinases involved in peptide B phosphorylation in transformed and non-transformed
cells to unravel this essential process of parvovirus oncotropism.
Tesis Doctorales/ Doctoral Theses
Eleuterio Lombardo de la Camara: “Transporte nuclear de las proteínas de la cápsida
del parvovirus MVMi: caracterización de un nuevo motivo de localización nuclear”.
Universidad Autónoma de Madrid. 1997. Calificación: Sobresaliente cum laude.
111
Beatriz Maroto López: “Química y biología del dominio principal de fosforilación de la
proteína VP2 del parvovirus MVMp”. Universidad Autónoma de Madrid. 1998.
Calificación: Sobresaliente cum laude.
Organización de Reuniones Científicas/ Organization of Scientific
Meetings
José M. Almendral: Simposio Internacional sobre Cáncer y Virus. SEV/FESEO.
Hospital Ramón y Cajal. Madrid. 1998.
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1997/98 Report
BIOLOGÍA DE LA INFECCIÓN DE CÉLULAS POR VIRUS
ANIMALES
BIOLOGY OF ANIMAL VIRUS INFECTION
Jefe de Línea / Group Leader:
Personal Científico
Scientific Staff:
Becarios Postdoctorales
Postdoctoral Fellows:
Becarios Predoctorales
Graduate Students:
Técnicos de Investigación
Technical Assistance:
Científicos Visitantes
Visiting Scientists:
Luis Carrasco
Elena Feduchi, Mª Eugenia González, Rosario
Guinea, José Antonio López
Angel Barco, Maria Boceta, Asier Etxarri, Alicia
Irurzun, Ivan Ventoso
Carlos Calandria, Beatriz González, Ana Oña, Celia
Perales
Carmen Hermoso, Miguel Angel Sanz
Mª José Abad (Universidad Complutense de
Madrid), Valerie Robin (Université de RENNES.
Francia).
Resumen de Investigación
La replicación de los virus animales produce en las células infectadas toda una
serie de alteraciones tanto morfológicas como metabólicas. Nuestro grupo está interesado en identificar las proteínas virales responsables de estas alteraciones y en el estudio
de su mecanismo de acción a nivel molecular. El sistema modelo utilizado para estos
estudios es la infección de células humanas por el virus de la polio. Además estamos
interesados en el estudio de proteínas citotóxicas de otros virus como son el virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH) el virus de la gripe y el virus del bosque Semliki.
Muchos virus animales codifican para proteínas de pequeño tamaño, de carácter
hidrofóbico y que forman oligómeros. Estas proteínas, cuando se expresan individualmente en bacterias o en células animales, inducen profundos cambios en la permeabili113
dad celular. Por ello, a estas proteínas se las ha denominado de forma genérica “viroporinas”. Entre las proteínas virales que alteran la permeabilidad celular están las proteínas 2B, 2BC y 3A del virus de la polio, la 6K de los togavirus, la M2 del virus de la
gripe y la Vpu del VIH-1.
La proteína 2BC del virus de la polio además de aumentar la permeabilidad celular, también induce la proliferación de vesículas citoplasmáticas y altera el tráfico de glicoproteínas tanto en células animales como en levaduras. El uso de distintos mutantes
de la proteína 2BC ha servido para identificar las regiones de la proteína que están
implicadas en estas alteraciones.
Además de cambiar la permeabilidad celular, el virus de la polio inhibe la expresión genética en las células infectadas. La proteasa 2A del virus de la polio es responsable de la hidrólisis de un factor de la iniciación de la traducción, el eIF-4G. Mediante
la introducción de la proteasa purificada 2Apro en células intactas hemos conseguido la
hidrólisis del eIF-4G. Esto ha servido para estudiar el papel que juega el eIF-4G en la
traducción de mRNAs tanto celulares como virales. Nuestros estudios indican que el
eIF-4G se requiere para la traducción de los mRNAs sintetizados de novo en las células,
mientras que la reiniciación de los mRNAs que ya se están traduciendo no sería tan
dependiente del eIF-4G. Además de interaccionar la 2Apro con el eIF-4G, es probable que
esta proteína reconozca otros substratos celulares. Para descubrir estos substratos se ha
utilizado el sistema de los dos híbridos. Nuestros estudios indican que la 2A reconoce
otras proteínas celulares y, en este momento, se están caracterizando.
El hecho de que la expresión de la proteasa 2A resulte tóxica para las levaduras
ha servido de base para desarrollar un sistema genético para obtener una variedad de
mutantes de la 2A. La caracterización de estas proteínas 2A mutantes y su reconstitución en el virus de la polio han dado mas información sobre el funcionamiento de esta
proteasa y sobre las regiones implicadas en el reconocimiento de sustratos.
Por último, se han clonado y expresado las proteínas accesorias del VIH-1. Esto
ha servido no solo para identificar la capacidad permeabilizante de la proteína Vpu,
sino que también se ha descrito una nueva función para la proteína Nef. La función
exacta del gen nef ha sido objeto de controversia durante los últimos años, nuestros
114
estudios indican que Nef pertenece a la familia de las proteínas que unen RNA. Estos
resultados son de interés no solo para conocer mejor la función de las proteínas accesorias del VIH-1, sino que también pueden servir de base para el desarrollo de nuevas
estrategias dirigidas a bloquear de forma selectiva la multiplicación de este virus.
Research Summary
The replication of animal viruses in susceptible cells induces a number of morphological and metabolic alterations. Our group is interested in identifying the viral
proteins responsible for these alterations and in analyzing their mode of action at the
molecular level. The model system used for these studies consists of the infection of
human cells by poliovirus. In addition we are interested in the study of cytotoxic proteins from other viruses including human immunodeficiency virus (HSV), influenza
virus and Semliki Forest virus.
Many animal viruses encode proteins of low molecular weight, which are
hydrophobic and form oligomers. When these proteins are individually expressed in
bacteria or in animal cells, they induce profound modifications in cellular permeability.
These proteins therefore, proteins have been collectively termed as “viroporins”.
Amongst the viral proteins that enhance membrane permeability are poliovirus 2B, 2BC
and 3A, the togavirus 6K polypeptide, influenza M2 and Vpu from HIV-1.
Protein 2BC from poliovirus not only alters membrane permeability, but also
induces the proliferation of cytoplasmic vesicles and blocks glycoprotein trafficking
both in yeast and mammalian cells. The use of a number of 2BC variants has helped to
identify the regions of 2BC involved in these modifications.
In addition to increasing membrane permeability, poliovirus infection also blocks
gene expression in the infected cells. Poliovirus protease 2A is responsible for the
hydrolysis of the translation initiation factor eIF-4G. The internalization of purified
poliovirus 2Apro in intact HeLa cells leads to efficient hydrolysis of eIF-4G. This system
has been used to analyze the role this factor plays in the translation of both cellular and
viral mRNAs. Our findings indicate that eIF-4G is required for the translation of
mRNAs synthesized de novo, while the re-initiation of cellular mRNA already engaged
115
in translation does not depend on the integrity of eIF-4G. In addition to eIF-4G, 2Apro
may recognize other cellular substrates. To uncover these substrates the two-hybrid
system has been used. Our findings indicate that poliovirus 2Apro may interact with
several cellular proteins.
The fact that poliovirus 2Apro is toxic for yeast cells, has permitted the development of a genetic system for obtaining a variety of 2Apro variants. The characteristics of
these 2Apro mutants and the reconstitution of polioviruses mutated in this gene is providing additional information on the function of this protease in the poliovirus infectious cycle.
Finally, the HIV-1 accessory proteins have been cloned and expressed permitting
us to identify the membrane permeabilizing capacity of Vpu. Our studies have also
shown that the Nef belongs to the family of RNA-binding proteins suggesting a new
role for Nef in the replicative cycle of HIV. These results are of interest not only because they give a better understanding of HIV accessory proteins, but also in allowing the
development of new strategies for selectively blocking the replication of HIV.
Publicaciones / Publications
—
Irurzun, A., Nieva, J.L. and Carrasco, L. Entry of Semliki Forest virus into cells:
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117
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Asier Echarri: “Caracterización funcional de la proteína NEF del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)”. Universidad Autónoma de Madrid. 1997. Calificación:
Apto cum laude.
Maria Boceta: “Cambios de permeabilidad inducidos por las glicoproteínas del VIH-1”.
Universidad Autónoma de Madrid. 1997. Calificación: Apto cum laude.
Ivan Ventoso: “Análisis genético y bioquímico de la proteasa 2Apro de poliovirus”.
Universidad Autónoma de Madrid. 1998. Calificación: Apto cum laude.
Miguel Angel Sanz: “Caracterización funcional de la proteína 6K de alfavirus. El virus
Sindbis como vector de expresión”. Universidad Autónoma de Madrid. 1998.
Calificación: Sobresaliente cum laude.
Organización de Reuniones Científicas / Organization of Scientific
Meetings
M. Barbacid, E. Ródenas y L. Carrasco. IV Encuentros en Segovia. 1997. El virus del
SIDA.
Colaboraciones con la Industria / Collaborations with Industry
—
118
Contrato de investigación con Bristol Myers-Squibb. 1997
Memoria 1997/98
CBMSO
1997/98 Report
VARIABILIDAD GENÉTICA DEL VIRUS RNA
GENETIC VARIABILITY OF RNA VIRUSES
Jefe de Línea / Group Leader:
Personal Científico
Scientific Personnel:
Becarios Postdoctorales
Postdoctoral Fellows:
Becarios Predoctorales
Graduate Students:
Técnicos de Investigación
Technical Assistance:
Científicos Visitantes
Visiting Scientists:
Esteban Domingo
Cristina Escarmís, Luis Menéndez-Arias
Eric Baranowski, Antonio Mas, Noemí Sevilla
Juan Francisco García-Arriaza, Mónica GutierrezRivas, Nonia Pariente, Carmen M. Ruiz-Jarabo,
Saleta Sierra, Miguel Toja
Mercedes Dávila, Gema Gómez-Mariano
Wendy Fernández-Ochoa, Nuria Verdaguer (CID,
CSIC, Barcelona), Eva Borrás, María Luz Valero
(Univ. Barcelona)
Resumen de Investigación
Nuestro grupo de trabajo está interesado en las bases moleculares e implicaciones
biológicas de la elevada variabilidad genética de virus RNA. Con el virus de la fiebre
aftosa (VFA) se han estudiado los siguientes problemas: i) Variaciones antigénicas y de
tropismo celular del virus sometido a distintas pautas de evolución (pases seriados
masivos, diferencias de multiplicidad de infección, etc.). ii) Mecanismo de neutralización de la infectividad, abordado por métodos bioquímicos y estructurales. iii) Bases
moleculares de la ganancia de eficacia biológica de virus RNA. En particular hemos
completado un estudio sobre la rápida superación por el VFA de la resistencia impuesta por células que coevolucionaron con el virus durante una infección persistente. Este
proyecto se ha realizado en colaboración con el grupo de la Dra. Maria Teresa Franze
(CEVAN, Buenos Aires, Argentina). iv) Estructura tridimensional de complejos virusanticuerpo, combinando técnicas de difracción de rayos X y crio-microscopía electrónica. Este proyecto se ha realizado en colaboración con los grupos de los Dres. I. Fita y N.
119
Verdaguer (CID, Barcelona) y Dres. E. Giralt y D. Andreu (Univ. Barcelona). v) Un
experimento masivo de vacunación de bóvidos con péptidos sintéticos que incorporaron epítopos B y T del VFA. Se han identificado varias mutaciones de escape del virus
asociados a la falta de protección. Este proyecto se ha realizado en colaboración con los
grupos del Dr. E.L. Palma (INTA, Buenos Aires, Argentina) y Dr. F. Sobrino (CISAINIA, Valdeolmos, Madrid).
Una de las razones de la elevada variabilidad genética de los virus RNA es la limitada fidelidad de copia de las replicasas víricas. El estudio de las bases moleculares de
la fidelidad de polimerasas se está abordando con la retrotranscriptasa (RT) del virus
de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1). Mediante mutagénesis dirigida se han
obtenido RTs con cambios de aminoácido que afectan a residuos próximos al centro
catalítico de la enzima. Asimismo, se han obtenido variantes con deleciones en el extremo C-terminal de p66 que presentan menor afinidad por el molde-iniciador.
Actualmente también estamos analizando la estabilidad de varios virus que incorporan
las mutaciones de la RT durante su replicación en cultivos celulares. Estas investigaciones sobre viabilidad de mutantes de VIH-1 se están realizando en colaboración con los
grupos de los Dres. C. López-Galíndez (Ito. de Salud Carlos III, Majadahonda) y M.A.
Martínez (Fundación IRSI-Caixa, Badalona).
El grupo colabora también en la caracterización molecular de aislados de VIH-1,
a fin de identificar mutaciones de resistencia a inhibidores, seleccionadas en la proteasa y RT en virus de pacientes sometidos a terapia agresiva. Los objetivos de estas colaboraciones son entender mejor la dinámica de las cuasiespecies de VIH-1 in vivo y tratar de aconsejar posibles cambios de terapia, a la vista del repertorio de mutaciones de
resistencia en los virus de cada paciente. Estos estudios se realizan en colaboración con
los grupos de los Dres. V. Soriano (Hospital Carlos III, Madrid) y M. Leal (Hospital
Virgen del Rocío, Sevilla).
El grupo mantiene también colaboraciones con los Dres. J.J. Holland, Profesor
Emérito de la Universidad de California en San Diego; Dra. Olga Lavrik, Institute of
Bioorganic Chemistry, Novosibirsk, Rusia; Dr. Alain Favre, Institut Jacques Monod
(CNRS, Universidad de Paris); y Dr. K. McCullough, Institut für Viruskrankheiten und
Immunprophylaxe, Suiza.
120
Finalmente durante 1997 y 1998 varios componentes del grupo fueron coautores
de artículos de revisión sobre cuasiespecies víricas y enfermedades emergentes, todos
ellos por invitación.
Research Summary
Our group has been interested in the molecular basis and biological implications
of the high genetic variability of RNA viruses. We have employed foot-and-mouth disease virus (FMDV) to approach the following questions: i) Alterations of antigenicity and
cell tropism of virus subjected to different evolutionary regimens massive population
(passages, differences in multiplicity of infection, etc.). ii) Mechanism of neutralization
of infectivity, studied by structural and biochemical methods. iii) Molecular basis of fitness gain of RNA viruses. Specifically, we have completed an analysis of the genetic
changes associated to infection by FMDV of highly resistant cells. These cells had become resistant, specifically to FMDV, as a result of coevolution with the virus in the course of a persistent infection in cell culture. This project has been carried out in collaboration with the group od Dr. Maria Teresa Franze (CEVAN, Buenos Aires, Argentina). iv)
Three-dimensional structure of antigen-antibody complexes, by combining X ray diffraction techniques and cryo-electron microscopy. This project has been carried out in
collaboration with the groups of Drs. I. Fita, N. Verdaguer (CID, Barcelona) and Drs. E.
Giralt, D. Andreu (Univ. Barcelona). v) A massive experiment of cattle vaccination
using synthetic peptides which included B- and T-cell epitopes of FMDV. We have
identified escape-mutations associated with lack of protection. This project has been
carried out in collaboration with the groups of Dr. E.L. Palma (INTA, Buenos Aires,
Argentina), and Dr. F. Sobrino (CISA-INIA, Valdeolmos, Madrid).
One of the reasons for the large genetic variability of RNA viruses is the limited
copying fidelity of viral replicases. The study of the molecular basis of polymerase fidelity is being pursued employing reverse transcriptase (RT) of human immunodeficiency
virus type 1 (HIV-1). Using site-directed mutagenesis we have obtained RTs with amino
acid substitutions at residues located in the vicinity of the catalytic site of the enzyme.
Also, variant RTs with deletions at the C-terminal end of p66 have been synthesized.
These altered enzymes show a decreased affinity for the template-primer. The copying
121
fidelity of all these RTs has been analyzed. Currently we are also studying the stability,
upon propagation in cell culture, of several engineered HIV-1s which have incorporated the mutations in their RTs. Research on viability of RT mutants is carried out in
collaboration with the groups of Drs. C. López-Galindez (Ito. Salud Carlos III,
Majadahonda) and M.A. Martínez (Fundación IRSI-Caixa, Badalona).
Our group contributes also to the molecular characterization of natural isolates of
HIV-1, with the aim of identifying inhibitor-resistant replacements, selected in the protease and RT of viruses from patients subjected to highly active antiretroviral therapy.
The objectives of these collaborations are a better understanding of the HIV-1 quasispecies dynamics in vivo, and to try to advise on possible changes of therapy, in view of
the repertoire of resistant mutations found in the virus of individual patients. These studies are carried out in collaboration with the groups of Drs. V. Soriano (Hospital Carlos
III, Madrid) and M. Leal (Hospital Virgen del Rocio, Sevilla).
Our group maintains collaborations also with Drs. J.J. Holland, Emeritus
Professor, Univ. of California, San Diego; Dr. Olga Lavrik, Institut of Bioorganic
Chemistry, Novosibirsk, Rusia; Dr. Alain Favre, Institut Jaques Monod (CNRS-Univ. de
Paris); and Dr. K. McCullough, Institut für Viruskrankheiten und Immunoprophylaxe,
Switzerland. Finally, during 1997 and 1998, members of our team have coauthored a
number of review articles on viral quasispecies and emerging infections, which were
requested to us.
Publicaciones / Publications
—
Holguín, A., Hernández, J., Martínez, M.A., Mateu, M.G. and Domingo, E. Differential
restrictions on antigenic variation among antigenic sites of foot-and-mouth disease
virus in the absence of antibody selection. J. Gen. Virol. 78, 601-609 (1997).
—
Taboga, O., Tami, C., Carrillo, E., Núñez, J.I., Rodríguez, A., Saiz, J.C., Blanco, E.,
Valero, M.-L., Roig, X., Camarero, J.A., Andreu, D., Mateu, M.G., Giralt, E.,
Domingo, E., Sobrino, F. and Palma, E.L. A large scale evaluation of peptide vaccines against foot-and-mouth disease: lack of solid protection in cattle and isolation of escape mutants. J. Virol. 71, 2606-2614 (1997).
122
—
Domingo, E. and Holland, J.J. RNA virus mutations and fitness for survival.
Annu. Rev. Microbiol. 51, 151-178 (1997).
—
Martín-Hernández, A.M., Gutierrez-Rivas, M., Domingo, E. and Menéndez-Arias,
L. Mispair extension fidelity of human immunodeficiency virus type 1 reverse
transcriptase with amino acid substitutions affecting Tyr-115. Nucleic Acids Res.
25, 1383-1389 (1997).
—
Lee, C.H., Gilbertson, D.L., Novella, I.S., Huerta, R., Domingo, E. and Holland, J.J.
Negative effects of chemical mutagenesis on the adaptive behavior of vesicular
stomatitis virus. J. Virol.71, 3636-3640 (1997).
—
Medrano Soria, L., Menéndez-Arias, L. and Nájera Morrondo, R. Proteasa del
VIH e inhibidores de interés terapéutico. Publicación Oficial de la Sociedad Española
Interdisciplinaria del S.I.D.A. 8, 662-669 (1997).
—
Hewat, E.A., Verdaguer, N., Fita, I., Blakemore, W., Brookes, S., King, A.,
Newman, J., Domingo, E., Mateu, M.G. and Stuart, D. Structure of the complex of
an Fab fragment of a neutralizing antibody with foot-and-mouth disease virus:
Positioning of a highly mobile antigenic loop. EMBO J. 16, 1492-1500 (1997).
—
Domingo, E., Menéndez-Arias, L., Quiñones-Mateu, M.E., Holguín, A., GutierrezRivas, M., Martínez, M.A., Quer, J., Novella, I.S. and Holland, J.J. Viral quasispecies and the problem of vaccine-escape and drug-resistant mutants. Progress in
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Giralt, E. A cyclic disulfide peptide reproduces in solution the main structural features of a native antigenic site of foot-and-mouth disease virus. Int. J. Biol.
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Menéndez-Arias, L., Tözsér, J. and Oroszlan, S. Moloney murine leukemia virus
retropepsin. In: Handbook of Proteolytic Enzymes, A.J. Barrett, N.D. Rawlings
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Escarmís, C., Carrillo, E.C., Ferrer, M., García, Arriaza, J.F., López, N., Tami, C.,
Verdaguer, N., Domingo, E. and Franze-Fernández, M.T. Rapid selection in modified BHK-21 cells of a foot-and-mouth disease virus variant showing alterations
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Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Noemí Sevilla Hidalgo: “Variaciones genéticas y fenotípicas de un virus persistente en
infecciones citolíticas: Implicaciones evolutivas y antigénicas”. (Tesis dirigida por el Dr.
E. Domingo). Universidad Autónoma de Madrid. 1997. Calificación: Apto cum laude por
unanimidad y Premio Extraordinario.
Miguel Toja Aguirre: “Caracterización molecular de un virus de la fiebre aftosa y de
sus derivados persistentes. Construcción de un clon infeccioso” (Tesis codirigida por
los Dres. E. Domingo y C. Escarmís). Universidad Autónoma de Madrid. 1997.
Calificación: Apto cum laude por unanimidad.
127
Premios y Distinciones / Prizes and Distinctions
Esteban Domingo:
—
Editor del Journal of General Virology (1998-2002) / Editor of Journal of General
Virology (1998-2002).
—
Miembro de la Academia Europaea / Member of Academia Europaea.
—
Miembro Honorario de la Sociedad Europea de Virología Veterinaria / Honorary
Member of the European Society of Veterinary Virology.
—
Miembro del comité editorial de Archives in Virology, Virologie (Francia) y AIDS
Cyber Journal / Member of the editorial board of Archives in Virology, Virologie
(France) and AIDS Cyber Journal.
Luis Menéndez-Arias:
—
Miembro del comité editorial del AIDS Cyber Journal / Member of the editorial
board of AIDS Cyber Journal.
128
Memoria 1997/98
CBMSO
1997/98 Report
ACTIVACIÓN DEL SISTEMA INMUNE
ACTIVATION OF THE IMMUNE SYSTEM
Jefe de Línea / Group Leader:
Personal Científico
Scientific Personnel:
Becarios Postdoctorales
Postdoctoral Fellows:
Becarios Predoctorales
Graduate Students:
Técnico de Investigación
Technical Assistance:
Científico Visitante
Visiting Scientist:
Manuel Fresno
Pedro Bonay
Iñigo Angulo, Cedric Burg, Nuria Gironès, Oscar
Goñi, Miguel Angel Iñiguez
Pilar Alcaide, Angel Garcia, Ester González San
Martín, Carmen Punzón, Clara I. Rodriguez, Belén
San Antonio, Virginia Vila
Mª de los Angeles de Chorro y de Villa-Ceballos
Felipe Kierzembaum (Michigan University. USA)
Resumen de Investigación
Las citoquinas juegan un papel muy importante en la respuesta inmune. Hemos
estudiado la regulación de la activación de linfocitos T y macrófagos por citoquinas y
caracterizado su mecanismo molecular y celular de acción. Además hemos aplicado
estos estudios a 2 patologías infecciosas: a) la relación entre la infección por HIV-1 y la
activación T; b) la infección por Trypanosoma cruzi, parásito intracelular de macrófagos
que afecta a su capacidad de producir citoquinas y activarse.
La activación de los linfocitos T por TcR/CD3 depende de la secreción autocrina
de TNF, que controla la segunda fase de la activación del factor de transcripción NFκB.. Esta segunda fase depende principalmente de c-rel y no de otros miembros de la
familia NF-κB. TNF controla la síntesis y activación/translación nuclear de c-rel probablemente a través de su fosforilación. También hemos aislado, clonado y caracterizado,
un nuevo factor de transcripción de la familia “basic-Helix-Loop-Helix” (bHLH), denominado Cha 912, que se expresa de modo constitutivo en linfocitos T en reposo y su
129
expresión desaparece tras la activación por TcR.CD3. Hemos determinado exactamente la secuencia “E-box” en el DNA a la que se une y comprobado que heterodimeriza
con otros miembros de la familia como son USF-1 y USF-2 regulando negativamente la
activación T. La cicoloxigenasa 2 (cox-2) se había descrito como una enzima inducible
por estímulos proinflamatorios en macrófagos. Hemos demostrado por vez primera
que cox-2 es un gen inmediatamente temprano de activación de linfocitos T, cuya
expresión viene regulada por los factores de transcripción NFAT y AP-1.
Sorprendentemente cox-2 controla múltiples pasos de activación T ya que metabolitos
de la cox-2 se requieren para la completa activación de NF-κB en linfocitos T.
La patogénesis del SIDA esta relacionada con la activación de linfocitos T. La activación por TcR/CD3 de linfocitos T infectados por HIV-1 induce la transcripción de
HIV. Mediante el uso de inhibidores específicos hemos demostrado que tanto NF-κB
como NF-AT controlan la replicación de HIV. La producción autocrina de TNF controla la replicación de HIV en linfocitos T debido a su efecto sobre los niveles de c-rel NFκB. La activación T solo requiere la mínima activación de p65/p50 NF-κB mientras que
la replicación de HIV-1 requiere de la activación de c-rel. Ese requerimiento diferencial
de NF-κB por linfocitos y HIV-1 así como por NFAT puede permitir diseñar nuevas
estrategias terapéuticas contra el SIDA. Por otra parte la proteína tat de HIV ejerce un
efecto inmunosupresor en la activación T debido a regular negativamente la transcripción de citoquinas como IL—2. Tat disminuye la activación de NF-κB, aunque aumenta la actividad de NFAT. También hemos estudiado el efecto de las citoquinas producidas por células Th1 (IFN-γ y TNF) vs Th2 (IL-4, IL-10) en la activación de macrófagos,
IFN-γ y TNF inducen de modo sinérgico la oxido nitrico sintasa (iNOS), mientras que
IL-4 e IL-10 desactivan macrófagos actuando de modo diferencial sobre la iNOS
La enfermedad de Chagas, causada por Trypanosoma cruzi, afecta a 24 millones de
personas en America Central y del Sur. Nuestro objetivo primordial es estudiar las complejas relaciones hospedador-parásito especialmente la relación entre la infección por T.
cruzi y la activación inmune con el objeto de entender la patología de esta enfermedad.
Hemos caracterizado una mucina deT. cruzi , (AgC10) es que se une a L-selectina en la
membrana de los macrófagos y afecta la capacidad microbicida y la activación de los
mismos. Además, ejerce efectos inmunosupresores en células T. También hemos
demostrado que Cha 912 es un autoantígeno dominante en la infección por T. cruzi.
130
Research Summary
Cytokines play a very important role in controlling the immune response. We
have studied the regulation by cytokines of the T and macrophage cell activation and
characterized their molecular and cellular mechanisms of action. Besides, we have
applied those studies to 2 infectious models: a) the relationship between HIV-1 infection and T lymphocyte activation, b) Infection by Trypanosoma cruzi, an intracellular
parasite of macrophages, able to alter activation and cytokine secretion by those cells.
T cell activation by TcR/CD3 depends on the autocrine secretion of TNF that promotes the second phase of activation of transcription factor NF-kB. This second phase
mainly depends on the family members, c-rel/p50. TNF controls the synthesis of c-rel
and its activation/translocation most likely by phosphorylation. On the other hand, we
have isolated, cloned and characterized a new transcription factor form the “basicHelix-Loop-Helix” (bHLH) family named as Cha 912. This factor is constitutively
expressed in resting T cells and its synthesis is repressed after TcR/CD3 activation. We
have determined its exact “E-box” binding site in the DNA and shown that heterodimerizes with others bHLH members, as USF-1 y USF-2, negatively controlling T cell
activation. Cycloxigenase 2 (cox-2) has been previously described as an enzyme induced in macrophages by proinflammatory stimuli We have shown that cox-2 is an immediate early gene in T cell activation. NFAT and AP-1 transcription factors regulate its
expression. Surprisingly, cox-2 controls many aspects of T cell activation, since their
metabolites are required for complete NF-κB activation in T cells.
AIDS pathogenesis in intimately related with T cell activation. TcR/CD3 activation in HIV-1-infected T cells leads to HIV transcription. By using specific inhibitors, we
have demonstrated the involvement of NF-κB and NFAT in controlling HIV replication
in T cells. Autocrine TNF control HIV replication in T cell due to its effect on c-rel NFκB. T cell activation only requires a minimal translocation of p65/p50 NF-κB, whereas
HIV-1 replication requires of c-rel function. This differential requirement of NF-κB activation as well as NFAT may allow to design new therapeutic strategies against AIDS.
On the other hand, HIV-1 tat downregulates T cell activation by suppressing cytokine
secretion, mainly IL-2. Tat inhibits NF-κB but enhance NF-AT activation. In addition we
have studied the effects of Th1 cytokines (IFN-γ y TNF) vs Th2 (IL-4, IL-10) on macrop131
hage activation. IFN-γ y TNF synergistically induce nitric oxide synthase (iNOS). whereas IL-4 e IL-10 deactivate macrophages differentially acting on iNOS.
Chagas’ disease caused by Trypanosoma cruzi, afects to 24 million people in
Central and South America. Our main goal is to study the complex host-parasite relationship especially the relationship between T. cruzi and immune activation aiming to
understand the pathology of this disease. We have characterized a T. cruzi, mucin
(AgC10), that bind to L-selectin in the macrophage membrane and affects their activation and therirmicrobicidal activity. Besides, we have demonstrated that Cha 912 is
dominant autoantigen in Chagas’disease.
Publicaciones / Publications
—
Gómez, J., García, A., Borlado, L., Bonay, P., Martinez, C., Fresno, M., Carrera, A.,
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Colaboraciones con la Industria / Collaborations with Industry
Glaxo-Wellcome; Laboratorios del Dr. Esteve
134
Memoria 1997/98
CBMSO
1997/98 Report
REPLICACIÓN DEL DNA Y CICLO CELULAR: Geminivirus
DNA REPLICATION AND CELL CYCLE: Geminiviruses
Jefe de Línea / Group Leader:
Becarios Postdoctorales
Postdoctoral Fellows:
Becarios Predoctorales
Graduate Students:
Científicos Visitantes
Visiting Scientists:
Crisanto Gutiérrez
M. Beatrice Boniotti, Corinne Fründt, Riccardo
Missich, Qi Xie
María del Mar Castellano, Elena Ramírez-Parra,
Andrés P. Sanz-Burgos
Alejandro Luque (IBCG, Burdeos), Javier Plasencia
(UNAM, Mexico)
Resumen de Investigación
Nuestro interés general es el estudio de la replicación del DNA, de los factores
celulares implicados y de su conexión con el ciclo celular, especialmente en plantas.
Utilizamos como modelo los geminivirus (virus del enanismo del trigo, WDV) ya que
su ciclo replicativo, excepto por la proteína viral Rep, depende absolutamente de factores celulares. Su genoma, (ssDNA, 2750 nucleótidos) codifica 4 proteínas, de las que
RepA y Rep intervienen en la replicación del DNA viral y en su conexión con el ciclo
celular. Recientemente, hemos clonado el cDNA de una proteína de maíz de la familia
de retinoblastoma (Rb), relacionada con la Rb humana supresora de tumores. Nuestro
trabajo se ha centrado en estudiar (1) la replicación del DNA de WDV, y (2) la ruta de
Rb en plantas.
La replicación del DNA de WDV ocurre a través de un mecanismo de círculo
rodante. Utilizando vectores derivados de WDV que replican en células de trigo, hemos
demostrado que su amplificación depende del tamaño del vector y de la estructura del
origen de replicación (localizado en la región intergénica grande, LIR). Hemos identificado el origen mínimo de replicación (core), absolutamente necesario, y dos regiones
135
auxiliares que lo flanquean y que estimulan su actividad. La replicación depende de la
interacción de la proteína iniciadora, Rep, con el origen, mediante la formación de, al
menos, un complejo que hemos analizado mediante retraso en gel y microscopía electrónica, y que se forma a unos 140 pb upstream del sitio de iniciación de la replicación.
La Rb de plantas posee en su “pocket A/B” una significativa conservación de
aminoácidos con otros miembros de la familia. El residuo C653, homólogo del C706 de
la Rb humana, mutado frecuentemente en tumores, es crítico para la interacción de la
Rb de plantas con ciclina D y con la proteína RepA de geminivirus, a través de su motivo LxCxE. Hemos demostrado que RepA, pero no Rep, interacciona con la Rb, aunque
Rep posee también un motivo LxCxE. Esta diferencia parece deberse a que el dominio
C-terminal de Rep oculta su motivo LxCxE. Para identificar proteínas que interaccionan
con Rb (RbIPs), hemos realizado un screening de dos híbridos en levadura de una genoteca de cDNA utilizando Rb como blanco. De la colección de clones positivos, hemos
aislado uno que codifica una proteína de la familia E2F, actualmente en estudio. La
expresión de la proteína Rb está regulada durante el desarrollo de las hojas, acumulándose a medida que las células se diferencian. Estamos estudiando su nivel de fosforilación a lo largo del ciclo celular y durante la diferenciación.
Nuestros objetivos inmediatos se centran en (1) estudiar la replicación del DNA de
geminivirus y su relación con la de la célula, (2) identificar los factores celulares que constituyen el complejo de iniciación y su función, (3) estudiar la oligomerización de las proteínas virales RepA y Rep, (4) identificar los genes que se expresan de forma dependiente de las proteínas virales y del complejo Rb/E2F, y (5) determinar la función de los componentes de la ruta Rb durante el ciclo celular, el crecimiento y el desarrollo de la planta.
Research Summary
Our general interest is the study of DNA replication, the cellular factors involved
and its coupling to cell cycle regulation, with especial emphasis in plants. We use geminiviruses as model systems (wheat dwarf virus, WDV) because their replicative cycle,
except for the viral Rep protein, depends absolutely on cellular functions. The WDV
genome (ssDNA, 2750 nt) encodes for only 4 proteins, of which Rep and RepA participate in viral DNA replication and its coupling to cell cycle control. Recently, we have
136
cloned a cDNA encoding a maize protein which belongs to the human retinoblastoma
(Rb) family of tumor suppressors. Our work has been focused, so far, on (1) WDV DNA
replication, and (2) the Rb pathway in plants.
WDV DNA replication occurs by a rolling-circle mechanism. By using WDVderived replicons which can be amplified in cultured wheat cells, we have shown that
replication efficiency is largely affected by vector size and origin structure. We have
identified the minimal DNA replication origin (core), absolutely required, within the
WDV large intergenic region (LIR), and two flanking auxiliary regions which stimulate viral DNA replication. WDV DNA replication depends on the interaction between
the initiator Rep protein and the minimal origin. One of the complexes identified by gelshift assays and electron microcopy maps ~140 bp upstream from the site where DNA
replication starts. Other complexes are now under study.
Plant Rb exhibits, within its A/B pocket domain, a significant amino acid conservation with animal members of the family. We have shown that the residue C653,
homologous to the C706 of human Rb, frequently mutated in human tumors, is critical
for plant Rb-cyclin D (cycD) interaction as well as for geminivirus RepA-Rb interaction,
through a LxCxE motif present in cycD and RepA. Interestingly, RepA, but not Rep
which also contains a LxCxE motif, binds to Rb. This distinctive feature is likely due to
hindrance of the Rb-binding motif by the C-terminal domain of Rep. To identify Rbinteracting proteins (RbIPs), we have carried out a yeast two-hybrid screening of a
cDNA library using maize Rb as a bait. From the positive clones, we have isolated a
cDNA clone encoding a member of the E2F family of transcription factors, which is
currently under study. Rb protein expression is regulated during leaf development,
and accumulates in differentiated leaves. We are analyzing the phosphorylation level
during the cell cycle and differentiation.
Our immediate research objectives are (1) the study of geminivirus DNA replication and its relationship to cellular DNA replication, (2) the identification of cellular factors involved in the assembly of a viral DNA initiation complex, (3) the study of oligomerization of viral RepA and Rep proteins, (4) the effects of RepA, Rep and Rb/E2F on
cellular gene expression, and (5) the identification of components of the Rb pathway
and the elucidation of its function during plant cell cycle, growth and development.
137
Publicaciones / Publications
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Suárez-López, P., Gutiérrez, C. DNA replication of wheat dwarf geminivirus vectors: effects of origin structure and size. Virology 227, 389-399 (1997).
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Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Andrés P. Sanz-Burgos: “Regulación de la replicación del DNA del virus del enanismo
del trigo (WDV, Geminiviridae)”. Universidad Autónoma de Madrid. 1998.
Calificación: Sobresaliente cum laude.
Patentes / Patents
—
Gutiérrez, C., Xie, Q., Sanz-Burgos, A. (1997) “Plant GRAB proteins”, CSIC-BTG,
PCT / ES97 / 01292 (España-Europa-USA-Canadá-Japón).
—
Gutiérrez, C., Ramirez-Parra, E., Xie, Q. (1998) “Transgenic plants - E2F”, CSICBTG, P9800975 (8 mayo, España).
—
Gutiérrez, C., Ramirez-Parra, E., Xie, Q. (1998) “Transgenic plants - E2F”, CSICBTG, P9800981 (11 mayo, España).
Premios y Distinciones / Prizes and Distinctions
Crisanto Gutiérrez:
—
Miembro Electo de la European Molecular Biology Organization (Octubre, 1998)
/ Elected Member of the European Molecular Biology Organization (October,
1998)
—
Premio de la “Fundación Domingo Martínez” (Curso académico 1998-99) / Prize
of the “Fundación Domingo Martinez” (Academic course 1998-99).
139
Memoria 1997/98
CBMSO
1997/98 Report
INMUNOLOGÍA DE LOS ANTÍGENOS DE
HISTOCOMPATIBILIDAD
IMMUNOLOGY OF HISTOCOMPATIBILITY ANTIGENS
Jefe de Línea / Group Leader:
Becarios Postdoctorales
Postdoctoral Fellows:
Becarios Predoctorales
Graduate Students:
José Antonio López de Castro Alvarez
Stefan Krebs, Mercé Martí Ripoll
Iñaki Alvarez Pérez, Fernando García Martínez,
Marina García-Peydró, José Ramón Lamas López,
David Obeso Domingo, Alberto Paradela Elizalde,
Manuel Ramos Alvarez-Buylla, Jesús Yagüe
Gallardo
Resumen de Investigación
HLA-B27 y enfermedad
Las proteínas HLA de clase I presentan péptidos endógenos a los linfocitos T
citotóxicos (CTL). El polimorfismo de HLA modula la especificidad de unión de péptidos y el reconocimiento por CTL. HLA-B27 está fuertemente asociado a la espondilitis
anquilosante (EA) y a otras espondiloartropatías mediante un mecanismo desconocido
pero probablemente relacionado con la presentación de péptidos.
HLA-B27 es estructuralmente heterogéneo y algunos subtipos no están asociados
a EA. Por tanto, el efecto del polimorfismo de HLA-B27 sobre la presentación de péptidos es probablemente un aspecto crítico de la asociación de este antígeno a enfermedad.
Nuestro grupo ha efectuado un análisis comparativo de los repertorios peptídicos, buscando las propiedades que son comunes a los subtipos asociados a enfermedad
y están ausentes en los subtipos que no determinan susceptibilidad. Además de determinar algunas propiedades diferenciales de los repertorios peptídicos de HLA-B27 que
se correlacionan con enfermedad, estos estudios han revelado nuevos efectos del polimorfismo de HLA sobre la especificidad de unión de péptidos. Algunos de los princi140
pales resultados son los siguientes: 1) algunos subtipos de HLA-B27 presentan in vivo
un péptido derivado de la proteolisis de esta molécula, que posee homología con proteínas de bacterias gram-negativas; aunque algunas de estas bacterias inducen artritis
reactiva asociada a HLA-B27, la presentación de este péptido no se correlaciona con
enfermedad; 2) una importante diferencia entre B*2704, que está asociado a EA, y
B*2706, que no lo está, es la mucho menor preferencia de este subtipo por péptidos con
Tyr C-terminal. Esta es la primera diferencia funcional conocida entre dos subtipos de
HLA-B27 asociados diferencialmente a enfermedad; 3) prácticamente todos los péptidos unidos a HLA-B27 poseen Arg en posición 2; este residuo interacciona con una
región de HLA-B27, llamada cavidad B, conservada entre subtipos. Sin embargo, en
B*2701, posiciones polimórficas localizadas fuera de esta cavidad modifican su especificidad, permitiendo la entrada de residuos de Gln, lo que altera considerablemente el
repertorio peptídico de este subtipo; 4) B*2703 tiene una mutación que afecta el anclaje
del extremo peptídico N-terminal a HLA-B27. Sin embargo este efecto se compensa parcialmente por el reforzamiento de la interacción de HLA-B27 con la Arg2. Estos resultados revelan una complejidad inesperada en la modulación de la unión de péptidos
por el polimorfismo de HLA.
A pesar de sus diferencias, los subtipos de HLA-B27 unen muchos péptidos en
común. Por tanto, una cuestión esencial es si la antigenicidad de los péptidos se mantiene en el contexto de los diferentes subtipos. Que esto no es necesariamente así lo
sugiere el hecho de que B*2710 y B*2705, que presentan una reactividad cruzada muy
baja con CTL, unen repertorios peptídicos similares. Por tanto, analizamos si los CTL
pueden reconocer peptídos específicos presentados por distintos subtipos asociados a
enfermedad. Para ello determinamos el péptido específicamente reconocido por un clon
de CTL alorreactivo anti-B*2705, que reaccionaba cruzadamente con B*2702 y B*2703, y
demostramos que esta reacción cruzada era debida al reconocimiento del mismo péptido en los tres subtipos. La capacidad de varios subtipos asociados a enfermedad de presentar un mismo péptido a los CTL es un requisito crítico si el mecanismo de asociación
de HLA-B27 a enfermedad implica presentación antigénica y reconocimiento por CTL.
141
Evolución de HLA-B39 en Africa: ¿está condicionada por la malaria?
Aunque se admite que la evolución del polimorfismo HLA de clase I está influido por los antígenos ambientales, es extremadamente difícil establecer una correlación
entre presiones de selección concretas y cambios específicos en HLA. En áreas de Africa
donde la malaria es endémica, los individuos generan respuestas de CTL específicas
contra antígenos pre-eritrocíticos de Plasmodium falciparum. Algunos de los antígenos
peptídicos inmunodominantes que han sido identificados tienen Pro en posición 2. Uno
de ellos, que es presentado específicamente por HLA-B53, genera respuestas de CTL
que protegen contra la malaria.
HLA-B39 (B*3901) presenta péptidos con Arg2 o His2 y es por tanto funcionalmente diferente de los alotipos relacionados con respuestas anti-malaria. Sin embargo,
un subtipo de origen africano, B*3910, difiere de B*3901 en un solo aminoácido.
Estudios de nuestro laboratorio han revelado que esta mutación altera drásticamente la
especificidad peptídica, de forma que B*3910 une solamente péptidos con Pro2. Por
tanto esta mutación ha aproximado HLA-B39 en Africa a HLA-B53 y a otros alotipos
HLA-B implicados en respuestas de CTL contra malaria.
Research Summary
HLA-B27 and disease
HLA class I proteins bind endogenous peptides and present them to cytotoxic T
lymphocytes (CTL). HLA polymorphism modulates peptide binding and T-cell recognition. HLA-B27 is strongly associated to ankylosing spondylitis (AE) and other
spondyloarthropathies through an unknown mechanism that is probably related to the
peptide presenting function of this molecule.
HLA-B27 is structurally heterogeneous, and some subtypes are not associated to
AS. Therefore the effect of HLA-B27 polymorphism on peptide presentation is probably
a critical pathogenetic feature.
Our group has undertaken a comparative analysis of subtype-bound peptide
repertoires, looking for features that are common to disease-associated subtypes and
absent among subtypes not associated to disease. Besides finding some differences bet142
ween HLA-B27-bound repertoires that correlate with disease susceptibility, these studies have shed new light on the effect of HLA polymorphism on peptide specificity.
Some of the main findings are the following: 1) several HLA-B27 subtypes present in
vivo a peptide derived from proteolytic processing of its own molecule with homology
to proteins from gram-negative bacteria; although some of these bacteria induce B27associated reactive arthritis, presention of this peptide does not correlate with disease;
2) a major difference between the disease-associated B*2704 and the non-associated
B*2706 is the much lower preference of this subtype for peptides with C-terminal Tyr.
This is the first known functional feature distinguishing between two HLA-B27 subtypes differentially associated to disease; 3) virtually all HLA-B27-bound peptides have
Arg at position 2. This residue interacts with a region of HLA-B27 (called pocket B) that
is conserved among subtypes. However, in B*2701 long range effects of polymorphic
positions located outside this pocket modify its specificity, allowing Gln residues to
enter the pocket. This has large consequences on the B*2701-bound peptide repertoire;
4) B*2703 has a mutation that affects anchoring of the peptidic N-terminus to HLA-B27.
However, its detrimental effect was partially compensated by reinforcement of interactions involving Arg2. Together these findings reveal unexpected complexities in the
modulation of peptide specificity by HLA polymorphism.
In spite of their differences, HLA-B27 subtypes have overlapping peptide repertoires. Thus, a critical question is whether peptide antigenicity is maintained upon presentation by different subtypes. That this is not necessarily the case was suggested
because B*2710 and B*2705, which show very low T-cell crossreaction, had nevertheless
similar peptide repertoires. Thus, we analysed whether peptide-specific CTL would
recognise a peptide epitope when presented by various disease-associated subtypes.
We determined the peptide recognised by an alloreactive CTL clone raised against
B*2705, which crossreacted with B*2702 and B*2703, and demonstrated that this crossreaction was due to recognition of the same peptide on the three subtypes. The capacity
of various disease-associated subtypes to present the same peptide to CTL is a critical
requirement if the mechanism of association of HLA-B27 to disease involves antigen
presentation and T-cell recognition.
143
HLA-B39 evolution in Africa: is it driven my malaria?
Although it is generally admitted that the evolution of HLA class I polymorphism
is antigen-driven, establishing precise relationships between particular selective pressures and specific HLA changes is extremely difficult. In areas of Africa where malaria
is endemic, individuals mount CTL responses against pre-erythrocytic-stage antigens
of Plasmodium falciparum. Several of the immunodominant peptide antigens that have
been identified have Pro at position 2. One of them, which is specifically presented by
HLA-B53, elicits CTL responses that protect against malaria.
HLA-B39 (B*3901) presents peptides with Arg2 or His2, and is therefore distinct
from malaria-related allotypes. However, an HLA-B39 subtype of African origin,
B*3910, was shown to differ from B*3901 by a single amino acid change. Studies in our
laboratory revealed that this mutation dramatically altered the peptide specificity, so
that B*3910 binds only peptides with Pro2. Therefore this mutation has functionally
approached HLA-B39 in Africa to HLA-B53 and other HLA-B allotypes involved in
CTL responses against the malaria parasite.
Publicaciones / Publications
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Premio Euskadi de Investigación en Ciencia y Tecnología, 1998.
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CBMSO
1997/98 Report
REGULACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN EN LA ACTIVACIÓN
ENDOTELIAL Y LINFOCITARIA
TRANSCRIPTIONAL REGULATION DURING ENDOTHELIAL
AND LYMPHOCYTE ACTIVATION
Jefe de Línea / Group Leader:
Becario Postdoctoral
Postdoctoral Fellow:
Becarios Predoctorales
Graduate Students:
Juan Miguel Redondo
Angel Luis Armesilla
Pablo Gómez del Arco, Elisa Lorenzo Alvarez, Janet
Lynn Maldonado, Sara Martínez-Martínez
Resumen de Investigación
Nuestro interés científico se centra en el estudio de los factores de transcripción y
la regulación de la expresión génica en la activación de linfocitos y células endoteliales.
Estamos analizando los mecanismos que integran la transducción de señales extracelulares con la activación de factores de transcripción, a su vez encargados de regular programas específicos de inducción génica.
En el proceso de activación linfocitaria hemos estudiado el papel de distintos factores de transcripción en la inducción de genes como el de la Interleukina-2 (IL-2), cuyo
promotor génico hemos usado como modelo por su propiedad de integrar señales provenientes de distintas rutas de señalización. Usando agentes antioxidantes e inmunosupresores hemos diseccionado la contribución relativa de los factores de transcripción
NF-κB, AP-1 y NF-AT en el control del promotor de IL-2. Este análisis nos ha permitido identificar antioxidantes que actúan inhibiendo la activación linfocitaria interfiriendo con el factor de transcripción NF-AT a través de mecanismos diferentes a los que
ejercen las drogas inmunosupresoras convencionales ciclosporina A y FK506.
Asimismo, este abordaje nos ha conducido a estudiar la función de la familia de la
kinasas activadas por mitógenos (MAPKs) en la desactivación de NF-AT.
147
Un objetivo básico de este trabajo es caracterizar los mecanismos que regulan la
localización subcelular de familia de factores de transcripción NF-AT. Esta familia está
constituida por al menos 4 miembros, los cuales residen en el citoplasma en células en
reposo y se translocan al núcleo en respuesta a aumentos intracelulares de calcio producidos durante la activación celular. Si bien este proceso esta relativamente caracterizado y conlleva la defosforilación de NF-AT mediada por la fosfatasa calcineurina, más
tarde, una vez cesan las señales de calcio y NF-AT ha ejercido sus funciones transactivadoras, el factor es exportado al citoplasma por la acción de kinasas nucleares aún
poco caracterizadas. Mediante diferentes abordajes hemos identificado MAPKs cuya
activación o inhibición conduce a la respectiva exclusión o retención de NF-AT en el
núcleo. Nos planteamos delimitar las regiones de los NFATs que interaccionan con
MAPKs, mutagenizar los residuos fosforilados por las MAPKs e identificar aquellos
cuya mutación origine cambios que afecten la importación/exportación de NFATs.
Estos estudios podrían ayudar a identificar mecanismos de desactivación de factores de
transcripción eucarióticos, y contribuir a la identificación de nuevas dianas terapéuticas
en inmunosupresión.
En células endoteliales estamos analizando las rutas de señalización y el papel de
distintos factores de transcripción en la respuesta al factor de crecimiento del endotelio
vascular (VEGF).VEGF no es solo un mitógeno muy potente de células endoteliales,
también es un factor con marcada actividad proangiogénica. Recientemente, hemos
determinado que la respuesta del endotelio humano a VEGF conduce a la activación
transcripcional y unión al ADN de AP-1 y NFAT1, factores que median la inducción del
promotor y expresión del gen del factor tisular. Esta implicación de NF-AT y AP-1 nos
va a permitir diseccionar las rutas de señalización de VEGF mediante experimentos de
cotransfección usando vectores reporteros dirigidos por NF-AT y AP-1 y vectores de
expresión (constitutivamente activos o dominantes negativos) de distintas kinasas o
GTPasas. La caracterización de estas rutas permitirá estudiar los mecanismos de interferencia de distintos antiangiogénicos con la señalización de VEGF y su efecto activador
sobre AP-1 y NF-AT. Finalmente, estamos desarrollando modelos de apoptosis en células
endoteliales para analizar el papel de distintos inhibidores de angiogénesis en procesos de
sensibilización e inducción de apoptosis en las células endoteliales este tipo celular.
148
Research Summary
Our research interest is focused on the study of transcription factors and the regulation of gene expression in the lymphocyte and endothelial activation processes. We are
analyzing the mechanisms that integrate extracellular signal transduction with the activation of transcription factors which in turn regulate specific gene expression programs.
We are analyzing the relative roles of different transcription factors in the inducible gene expression program of lymphocyte activation. For this purpose, we are using
the Interleukin-2 (IL-2) promoter as a model given its capacity to integrate signals from
different transduction cascades. By using immunosuppressive and antioxidant agents
we have dissected the relative contributions of NFκB, AP-1 and NF-AT to the transcriptional activation of the IL-2 promoter. These analyses have allowed the identification of antioxidant agents that inhibit lymphocyte activation by interfering with NF-AT
through mechanisms different from those exerted by the immunosuppressive drugs
cyclosporin A or FK-506. In addition, this experimental approach has led us to the characterization of a role of MAPKs in the deactivation of NF-AT.
A major goal of our research is the characterization of the molecular mechanisms
that control the subcellular localization of the NF-AT family members of transcription
factors. This family is composed of at least four members that are found in the cytoplasm of resting cells and translocate to the nucleus in response to calcium signals triggered upon cell activation. Although this process is relatively well characterized and
involves the calcineurin-mediated dephosphorylation of NF-AT, later on , once calcium
signals are curtailed and NF-AT has already exerted its transactivation functions, the
transcription factor is exported from the nucleus to the cytoplasm through the action of
nuclear kinases yet poorly understood. By using different experimental approaches, we
have identified MAPKs whose activation or inhibition results in the nuclear exclusion
or accumulation of NF-AT, respectively. We are mapping the NF-AT regions that interact with MAPKs to perform site-directed mutagenesis of the NF-AT sites phosphorylated by MAPKs and to further identify the mutants that result in changes in the shuttling of NF-AT members. These analyses may help to define new mechanisms by which
eukaryotic transcription factors are deactivated and contribute to the identification of
new therapeutic targets for immunosuppression.
149
In endothelial cells, we are analyzing the signalling pathways and the role of
transcription factors involved in the activation induced by Vascular Endothelial
Growth Factor (VEGF). VEGF is a very potent mitogen for endothelial cells and also
has a marked activity as a pro-angiogenic factor. Recently, we have found that VEGF
induces the transcriptional activation and DNA-binding activity of AP-1 and NF-AT in
human endothelial cells. As a result, VEGF induces Tissue Factor (TF) gene expression
and the binding of NF-AT and AP-1 to functional sites within the TF gene promoter.
The involvement of NF-AT and AP-1 in the VEGF-mediated response opens the possibility of dissecting the signalling pathways triggered by VEGF by cotransfection experiments using NF-AT- and AP-1-driven reporter constructs together with expression
vectors encoding constitutively active or dominant negative versions of kinase cascade
components or small GTPases. Such an analysis may also further elucidate the level at
which antiangiogenic agents interfere with VEGF-induced signal transduction and NFAT- and AP-1 transcriptional activation.
Finally, we are developing models to analyze endothelial apoptosis in order to
investigate the role of different antiangiogenic agents in the sensitisation to and induction of apoptosis in endothelial cells.
Publicaciones / Publications
—
Gómez del Arco, P., Martínez-Martínez, S., Calvo, V., Armesilla, A.L. and
Redondo, J.M. Redox pathways in AP-1 activation. Immunobiol. 197, 247-252.
(Review) (1997).
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—
González-Amaro, R., Portales-Pérez, D., Baranda, L., Redondo, J.M., MartínezMartinez, S., Yáñez-Mó, M., García-Vicuña, R. and Sánchez-Madrid, F.
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150
—
Lara-Pezzi, E., Armesilla, A.L., Majano, P.L., Redondo, J.M. and López-Cabrera,
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—
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Organización de Reuniones Científicas / Organization of Scientific
Meetings
Juan Miguel Redondo
—
II Jornadas Nacionales sobre Transcripción Génica. Córdoba. Septiembre 1998.
—
Workshop on “Transcription Factors in Lymphocyte development and function.
Fundación Juan March. Madrid. Octubre 1998.
151
Memoria 1997/98
CBMSO
1997/98 Report
REPLICACIÓN Y TRANSCRIPCIÓN DEL DNA DEL
BACTERIÓFAGO Ø29
REPLICATION AND TRANSCRIPTION OF BACTERIOPHAGE
Ø29
Jefe de Línea / Group Leader:
Personal Científico
Scientific Personnel:
Becarios Postdoctorales
Postdoctoral Fellows:
Becarios Predoctorales
Graduate Students:
Técnicos de Investigación
Technical Assistance:
Margarita Salas
Luis Blanco, Alicia Bravo, Ana Camacho, Montserrat
Elías, José Miguel Hermoso
Ana Bonnin, Paola Crucitti, Belén Illana, Wilfried
Meijer, María Monsalve,Verónica Truniger
Ana Abril, Belén Calles, Irene Gascón, Víctor
González-Huici, José A. Horcajadas, Javier Saturno,
Alejandro Serna, Miguel de Vega
José M. Lázaro, Mª Angeles Martínez, Laurentino
Villar
Resumen de Investigación
Replicación del DNA de ø29
El objetivo del trabajo es profundizar en el conocimiento del mecanismo de iniciación de la replicación del DNA de ø29 mediante proteína terminal (TP), y de las proteínas implicadas en replicación.
Se ha demostrado que el dominio N-terminal de la DNA polimerasa de ø29 se
requiere, no solo para la actividad 3’-5’ exonucleasa y para desplazamiento de cadena,
sino también para interaccionar con la TP y con el DNA “primer”, así como para la estimulación de la reacción de iniciación por la proteína p6. El residuo Ser122 del dominio
N-terminal, que es un ligando de DNA de banda simple, también se requiere para interaccionar con la TP. Por otra parte, el motivo conservado YxGG/A, localizado entre los
152
dominios N- y C-terminales, está también implicado en la interacción con TP. Se ha
caracterizado el primer Asp (Asp456) del motivo YxDTDS en el dominio C-terminal
como un ligando de metal en la síntesis de DNA utilizando TP o DNA como “primer”.
Asimismo, el Asp456 es crítico durante la transición en el uso del DNA respecto a TP
como “primer”. Se ha caracterizado que el residuo Tyr254 del motivo Dx2SLYP está
implicado en la discriminación de ribonucleótidos.
Se ha estudiado el mecanismo de activación por la SSB de ø29 de la replicación
mediada por la DNA polimerasa de ø29 y se han comparado las propiedades de las
SSBs de los fagos Nf y GA-1 relacionados con ø29. Solamente la SSB de ø29 estimula la
velocidad de replicación del DNA de M13 mientras que las tres SSBs estimulan la cantidad de DNA sintetizado. Las SSBs de ø29 y de Nf son monómeros en solución, mientras que la de GA-1 es un hexámero. De acuerdo con esto, los parámetros de interacción
con el DNA de la SSB de GA-1 difieren de los de las SSBs de ø29 y Nf. Así, la SSB de
GA-1 compacta 5 veces el DNA de M13 de banda simple (en colaboración con el Dr.
Crisanto Gutiérrez, Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, CBMSO).
La proteína p6, que se une a los extremos del DNA de ø29 para activar la iniciación de la replicación, interacciona para formar dímeros in vivo. Mediante el uso de un
sistema de dos híbridos se han localizados dos zonas en p6 implicadas en la interacción
proteína-proteína. Cuando la p6 se entrecruza con glutaraldehido y se estudia al
microscopio electrónico se observan estructuras en forma de bastoncillos y de rosquillas. Por procesamiento de imagen (en colaboración con los Dres. Sergio Marco y José L.
Carrascosa, Centro Nacional de Biotecnología, CNB) las rosquillas corresponden a dos
bastoncillos unidos cabeza-cola y podrían constituir el núcleo proteico del complejo p6DNA. Después de un mes a 4ºC las estructuras anteriores dan lugar a filamentos que
recuerdan a los que se observan en la enfermedad de Alzheimer. La proteína p17, implicada en replicación, que se sintetiza inmediatamente después de la infección, interacciona con la p6 y facilita la unión de ésta a los orígenes de replicación del DNA de
ø29. La proteína p1, también implicada en replicación, que se encuentra asociada a
membranas, polimeriza en hojas de protofilamentos cuya estructura se parece a la tubulina eucariótica y a los polímeros de la proteína bacteriana FtsZ, implicada en división
celular. La estructura formada por la p1 podría suministrar un sitio de anclaje para la
153
maquinaria de replicación del DNA viral. La proteína p16.7, cuyo gen está contiguo al
17 y se expresa inmediatamente después de la infección, contiene un dominio transmembrana, forma dímeros e interacciona con DNA de doble cadena de un modo no
específico. La región C-terminal presenta homología con el homeodominio de la proteína Antennapedia. Utilizando técnicas de fluorescencia (en colaboración con el Prof.
J. Errington, Universidad de Oxford) se ha localizado la proteína p16.7 en los polos de
la célula. Para ello, parece requerir las proteínas virales de replicación, TP, DNA polimerasa, p1, p6 y p17.
Transcripción del DNA de ø29
Se ha estudiado la unión de la proteína p4, que reprime el promotor temprano
A2c de ø29, a dicho promotor. En ausencia de RNA polimerasa (RNAP) la p4 se une a
una región centrada en la posición -39 respecto al sitio de iniciación de la transcripción,
mientras que en presencia de RNAP se une a la posición -71 estabilizándose dicha unión
(en colaboración con el Dr. F. Rojo, CNB). En presencia de proteína p4, la proteína p6
reprime al promotor A2c, desplazando a la RNAP del mismo. Este efecto de p4 requiere la presencia del promotor tardío A3.
Se ha estudiado el papel que juega el motivo “-10 extendido” en varios promotores de ø29. Mutantes en dicho motivo afectan la unión de la RNAP disminuyendo la formación de complejos cerrados y abiertos. Sin embargo, en promotores que tienen región
-35, se obtiene un aumento en la transcripción, indicando que el motivo “-10 extendido” suministra puntos de contacto para la RNAP con un papel restringido a los primeros pasos de la transcripción.
Se ha estudiado la regulación de la transcripción del DNA del fago GA-1 por la
proteína p4 (p4G). A diferencia de ø29, la RNAP inicia la transcripción del promotor
tardío A3 en ausencia de p4G. Evidencia preliminar indica que p4G se comporta como
anti-represor cuya función sea inhibir un posible represor celular del promotor tardío
A3 (en colaboración con el Dr. F. Rojo, CNB).
154
Research Summary
ø29 DNA Replication
The aim is to get a further insight in the mechanism of initiation of ø29 DNA replication primed by the terminal protein (TP) and of the proteins involved in replication.
We have shown that the N-terminal domain of ø29 DNA polymerase is required, not only
for 3’-5’ exonuclease an strand displacement, but also for interaction with the TP and the DNA
primer, as well as to stimulate the initiation reaction by protein p6. Residue Ser122 of the N-terminal domain, a ligand for ssDNA, is also required for interaction with the TP. On the other hand,
the conserved motif YxGG/A, located between the N- and C-terminal domains, is also involved
in interaction with the TP. The first Asp (Asp456) of the YxDTDS motif in the C-terminal domain,
has been characterized as a metal ligand during both TP-primed and DNA-primed DNA synthesis. Moreover, Asp456 is critical during transition from TP priming to DNA priming. On the
other hand, residue Y254 of the Dx2SLYP motif, has been shown to be involved in ribonucleotide
discrimination.
The mechanism of activation of ø29 SSB of the replication catalyzed by ø29 DNA
polymerase has been studied, and the properties of the SSBs of phages Nf and GA-1,
related to ø29, have been compared. Only the ø29 SSB stimulates the replication rate of
M13 DNA, whereas the three SSBs stimulate the amount of DNA synthesized. The SSBs
of ø29 and Nf are monomers in solution, whereas GA-1 SSB is an hexamer. In agreement with this, the parameters of the interaction with DNA of GA-1 SSB differ from
those of ø29 and Nf SSBs. Thus, GA-1 SSB produces a 5-fold compaction of M13 ssDNA
(work in collaboration with Dr. Crisanto Gutiérrez, CBMSO).
Protein p6, that binds to the ø29 DNA ends to activate the initiation of replication,
interacts with itself forming dimers in vivo. By using a two-hybrid system we have
located two regions in p6 involved in protein-protein interaction. By glutaraldehyde
crosslinking and electron microscopy, protein p6 forms crook-shaped and doughnutshaped structures. By image processing (in collaboration with Drs. Sergio Marco and
José L. Carrascosa, CNB) the latter correspond to two crook-shaped aggregates in a
head to tail arrangement that could correspond to the protein core predicted for the p6DNA complex. After one month at 4ºC the latter structures form filaments that resemble those observed in Alzheimer disease.
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Protein p17, the earliest induced protein, involved in replication, interacts with p6
and facilitates p6 interaction with the origins of replication of ø29 DNA. Protein p1, also
involved in replication, that is found associated to membranes, polymerizes into long
protofilament sheets. These structures resemble eukaryotic tubulin and bacterial FtsZ
polymers, involved in cell division. This structure could provide an anchoring site for
the viral DNA replication machinery. Protein p16.7, whose gene is contiguous to gene
17 and is expressed very early after infection, contains a transmembrane domain, forms
dimers in solution, and interacts with dsDNA in a non-specific way. The C-terminal
domain of p16.7 has homology with the homedomain of the Antennapedia protein. By
using fluorescence techniques (in collaboration with Prof. J. Errington, Oxford
University), protein p16.7 has been located in the cell poles. For this location, the viral
replication proteins TP, DNA polymerase, p1, p6 and p17 seem to be required.
Transcription of ø29 DNA
The interaction of protein p4, a repressor of the early ø29 promoter A2c, to this
promoter has been studied. In the absence of RNA polymerase (RNAP), p4 binds to a
region centered at position -39 with respect to the transcription start site, whereas in the
presence of RNAP p4 binds to position -71, stabilizing the binding of p4 to the promoter (in collaboration with Dr. F. Rojo, CNB). In the presence of protein p4, protein p6
repressed the A2c promoter displacing the RNAP from it. This p4 effect requires the
presence of the late A3 promoter.
The role of the “extended -10” motif in several ø29 promoters has been studied.
Mutants in this motif impair RNAP binding reducing the yield of closed and open complex. However, in promoters containing -35 region, transcription was increased indicating that the “extended -10” motif provides contact points for RNAP with a role restricted to the first steps of transcription.
The regulation of phage GA-1 DNA transcription by protein p4 (p4G) has been
studied. Contrary to what happens in ø29, the RNAP starts transcription of the late A3
promoter in the absence of p4G. Preliminary evidence indicates that p4G behaves as an
anti-repressor inhibiting the binding of a putative cellular repressor of the late A3 promoter (in collaboration with Dr. F. Rojo, CNB).
156
Publicaciones / Publications
—
Soengas, M.S., Mateo, C.R., Salas, M., Acuña, A.U. and Gutiérrez, C. Structural
features of ø29 single-stranded DNA binding protein. I. Environment of tyrosines
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Soengas, M.S., Mateo, C.R., Rivas, G., Salas, M., Acuña, A.U. and Gutiérrez, C.
Structural features of ø29 single-stranded DNA binding protein. II. Global conformation of ø29 SSB and the effects of complex formation on the protein and the
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Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Mª Belén Illana Calero: “Proteínas terminales como iniciadores de la replicación de
genomas lineales: análisis funcional en los bacteriófagos ø29 y GA-1 de Bacillus subtilis”.
Universidad Autónoma de Madrid. 1997. Calificación: Apto cum laude.
159
María Monsalve Pérez: “Mecanismo de represión del promotor temprano A2c por la
proteína p4 del bacteriófago ø29 de B. subtilis”. Universidad Autónoma de Madrid.
1997. Calificación: Apto cum laude.
Premios y Distinciones / Prizes and Distinctions
Margarita Salas
—
Miembro de la Comisión Asesora para los Estudios de Ciencias de la Salud y de
la Vida, Universidad Pompeu Fabra (1997– ).
—
Miembro del Comité Científico del Parc Cientific de Barcelona (1997– ).
—
Miembro de la Academia Scientiarum et Artium Europaea (1997– ).
—
Premio a los Valores Humanos del Grupo Correo de Comunicación (1998).
—
Miembro del Consejo Científico del Institut D’Investigacions Biomèdiques
August Pi i Sunyer (IDIBAPS) (1998– ).
—
Premio de Investigación de la Comunidad de Madrid (1998).
—
Premio Mexico de Ciencia y Tecnología (1998).
—
Premio Heroína 1998 de Charter 100 (1998).
160
Memoria 1997/98
CBMSO
1997/98 Report
DESARROLLO DEL SISTEMA LINFOHEMATOPOYETICO
DEVELOPMENT OF THE LYMPHOHEMATOPOIETIC SYSTEM
Jefe de Línea / Group Leader:
Becario Postdoctoral
Postdoctoral Fellow:
Becarios Predoctorales
Graduate Students:
María Luisa Toribio
Graciela Carrillo
Almudena R. Ramiro, César Trigueros, Yolanda R.
Carrasco, Virginia G. de Yébenes
Resumen de Investigación
Nuestro trabajo, junto con el de otros grupos, ha proporcionado evidencias directas de que el timo humano es colonizado por un precursor hematopoyético procedente
de la médula ósea, diferente de la célula hematopoyética multipotencial (HSC), que
mantiene la capacidad de generar no sólo células T, sino también células B, células natural killer (NK), y células dendríticas (DCs). La identificación de este “precursor común
linfoide” (CLP) cuestiona la hipótesis ampliamente aceptada del origen mieloide de las
DCs, y sugiere que las DCs, o al menos un linaje particular de DCs, está más estrechamente ligado al desarrollo del sistema linfoide que del sistema mieloide. Con objeto de
analizar esta hipótesis, intentamos establecer la relación ontogénica entre las DCs
intratímicas y el resto de los linajes linfoides del individuo, para lo que diseñamos un
sistema experimental capaz de inducir la generación exclusiva de DCs a partir de progenitores intratímicos. En este sistema, observamos que las DCs se generan a partir de
precursores intermediarios de gran tamaño, diferentes de los precursores del linaje T,
capaces de generar no sólo DCs, sino también células NK, en respuesta a IL-2 (o IL-15).
Los datos obtenidos, junto con estudios adicionales de dilución límite, ponen de manifiesto la estrecha relación existente en el desarrollo de ambos linajes NK y DC y sugieren, además, que las DCs y las células NK divergen del linaje T a través de un precursor bipotencial común NK/DC. La relevancia fisiológica de este precursor intermediario, así como la identificación de las señales que controlan su diferenciación en linajes
alternativos, constituyen uno de nuestros objetivos de estudio en la actualidad.
161
Por otra parte, hemos obtenido información relevante a nivel molecular sobre los
eventos críticos que determinan la diferenciación del CLP en diferentes estirpes celulares y, en concreto, aquellos que controlan el desarrollo temprano de las células T en el
timo. Nuestros estudios previos habían mostrado que uno de los puntos de control críticos en este proceso viene determinado por la expresión de un pre-receptor (pre-TCR)
asociado al complejo CD3, compuesto por la cadena TCRβ unida a una cadena preTCRα (pTα). Sin embargo, quedaba por establecer cómo se regula la expresión del preTCR durante el desarrollo intratímico para garantizar la transición a estadios madurativos posteriores donde se induce la expresión del complejo maduro TCRα/β. Mediante
la generación de un anticuerpo policlonal que reconoce un epítopo expuesto de la proteína pTα humana, observamos que la expresión en membrana de la molécula pTα está
restringida in vivo a una población pre-T enriquecida en células grandes en división
que coexpresan bajos niveles del complejo CD3 . Este restringido patrón de expresión
nos permitió identificar una nueva subpoblación de timocitos pequeños CD3- que carecen de la molécula pTα en superficie, pero que expresan la cadena TCRβ en el citoplasma. La nueva subpoblación incluye células pre-T tardías, quiescentes, en donde se
induce la reexpresión de los genes de activación de las recombinasas (RAG), y desaparece la transcripción en línea germinal de TCRα (TEA), coincidiendo con la parada del
ciclo celular, e inmediatamente antes de la expresión del gen TCRα. Es importante decir
que los timocitos en este estadio pre-T tardío constituyen los intermediarios funcionales entre las células pre-T pTα+ y los primeros timocitos maduros TCRα/β+. Estos resultados se encuadran en un modelo hipotético en el que la expresión en membrana del
pre-TCR induce la rápida activación del ciclo celular y la consiguiente expansión de las
células pre-T pre-TCR+, que posteriormente internalizan el complejo y detienen su actividad mitótica, previamente a la expresión del gen TCRα.
La información obtenida sobre los eventos críticos que restringen el potencial linfoide del CLP y que determinan su diferenciación en linajes linfoides alternativos nos
ha permitido diseñar estrategias experimentales de diferenciación linfoide, que pueden
suponer valiosas herramientas en estudios preclínicos de transferencia genética, de
futura aplicación en defectos genéticos del sistema hematolinfoide. En particular,
hemos mostrado la idoneidad de un nuevo mutante de la proteína verde fluorescente
162
(EGFP) como marcador genético en precursores linfoides primarios transducidos retroviralmente, en los que se mantiene la capacidad de generar, al menos, DCs. Por tanto,
debido a su rápida y fácil detección y a la ausencia de efectos tóxicos, la EGFP constituye un valioso gen trazador de la eficiencia de transducción de los precursores linfoides humanos en los que, además, mantiene intacto su potencial hematopoyético.
Research Summary
Current studies, including ours, support the notion that the thymus is seeded by
a yet uncommitted bone marrow-derived progenitor cell, distinct from the hematopoietic stem cell (HSC), that retains the capability to generate T cells, B cells, Natural
killer (NK) cells, and also Dendritic cells (DCs). The identification of such a “common
lymphoid progenitor” (CLP) challenges current views on the myeloid lineage affiliation
of most DCs, and supports the notion that the DC lineage, or at least a particular lineage of DCs, is developmentally more closely related to lymphoid cells than to myeloid
cells. Thus, we shought to determine the developmental relationship between such a
“lymphoid DC” and the other lymphoid cell lineages, in humans. To this end, we set
up a multicytokine-supported cell culture system that induced the most immature
intrathymic progenitors to develop exclusively to DCs. Under these culture conditions,
generation of DCs was shown to proceed through a transient population of large-sized
cells, distinct from T-cell precursors, that was capable of generating not only DCs, but
also NK cells, in response to IL-2 (or IL-15). Limiting dilution studies provided further
evidence of linked pathways of NK cell and DC development from intrathymic precursors, and suggested that NK cells and DCs branch off the T cell lineage through a bipotential NK/DC progenitor. The physiological relevance of such a common NK/DC
intermediate, as well as the molecular signals that control its commitment decisions, are
currently under investigation.
Additional studies allowed us to obtain relevant information about the critical
points of lineage decision leading the CLP to commit to each alternative lymphoid cell
lineage. Particularly, molecular processes that control early T-cell development inside
the thymus have been analyzed in order to identify some of the regulatory mechanisms
163
that control T-lineage commitment in man. Our previous studies showed that one of the
earliest control points in human T-cell development involves the expression of a CD3associated pre-T cell receptor (pre-TCR) complex composed of the TCRβ chain paired
with a pre-TCRα (pTα) chain. A major issue is how surface expression of the pre-TCR
is regulated during thymocyte development to control further transition to TCRα rearrangement and TCRα/β expression. To address this issue, we derived a polyclonal
antibody that recognizes an exposed epitope of the native human pTα protein and showed that developmental expression of pTα is time- and stage-specific, and is confined
in vivo to a limited subset of large cycling human pre-T cells that coexpress low density
CD3. This restricted expression pattern allowed the identification of a novel subset of
small CD3- thymocytes lacking surface pTα, but expressing cytoplasmic TCRβ, that
represent late noncycling pre-T cells in which recombination activating gene (RAG)
reexpression, and dowregulation of T early α (TEA) transcription, are coincident events
associated with cell cycle arrest, and immediately preceding TCRα gene expression.
Importantly, thymocytes at this late pre-T cell stage are shown to be functional intermediates between large pTα+ pre-T cells and TCRα/β + mature thymocytes. The results
support a model in which pre-TCR-expressing pre-T cells are brought into cycle,
rapidly downregulate surface pre-TCR, and finally become small resting pre-T cells,
before the onset of TCRα gene expression.
The information obtained on the critical events that control the developmental
decisions leading the CLP to individual lymphoid commitment has allowed us to set up
in vitro experimental systems of lymphoid development, as powerful tools to approach
gene transfer protocols in preclinical trials of genetic defects affecting the lymphohematopoietic system. Particularly, we showed the feasibility of a novel mutant gene of the
green fluorescent protein (EGFP) as a genetic marker in retroviral-mediated transduction of primary lymphoid precursors, which were shown to retain their developmental
capabilities and to generate efficiently DCs. Therefore, because of its rapid and easy
detectability and its nontoxic characteristics, EGFP proves itself to be a valuable reporter
gene by allowing the transduction of hematopoietic lymphoid progenitors, and by being
compatible with the developmental programs of lymphoid lineage generation.
164
Publicaciones / Publications
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Guérin, S. Mari, B., Fernández, E., Belhacene, N., Toribio, M.L. and Auberger, P.
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Colaboraciones con la Industria / Collaborations with the Industry
GLAXO WELLCOME S.A. Ayuda a la investigación farmacéutica (1996-1998).
GLAXO WELLCOME S.A. Research Grant (1996-1998).
165
Memoria 1997/98
CBMSO
1997/98 Report
VIRUS DE LA PESTE PORCINA AFRICANA
AFRICAN SWINE FEVER VIRUS
Jefe de Línea / Group Leader:
Personal Científico
Scientific Personnel:
Becarios Postdoctorales
Postdoctoral Fellows:
Becarios Predoctorales
Graduate Students:
Técnicos de Investigación
Technical Assistance:
Eladio Viñuela
Ángel L. Carrascosa, Yolanda Revilla, Javier M.
Rodríguez, José Salas, María Luisa Salas
Germán Andrés, Esther Culebras, Ramón García,
Mariano Oliveros
Alí Alejo, Ana Cebrián, Inmaculada Galindo, Gema
Rojo
María José Bustos, María Luisa Nogal
Resumen de Investigación
Estudio de la función de genes virales
Se está estudiando la función de genes del virus de la peste porcina africana
(VPPA) que codifican proteínas con homología a otras proteínas de las bases de datos.
La proteína codificada por uno de estos genes ha sido caracterizada como una transpreniltransferasa que cataliza la síntesis del compuesto isoprenoide geranilgeranil
difosfato, el cual podría servir como sustrato para la prenilación de proteínas virales o
celulares, regulando de esta manera su función durante la infección viral.
El VPPA codifica también por una nueva DNA polimerasa de tan sólo 20 kDa perteneciente a la familia X de DNA polimerasas, que incluye a las polimerasas de tipo
reparativo. La DNA polimerasa reparativa del VPPA es un enzima monomérico y altamente distributivo, que conserva los residuos críticos para la unión al DNA y a los
nucleótidos, así como para la catálisis de la reacción de polimerización. Esta DNA polimerasa representa la mínima versión funcional de este tipo de polimerasas reparativas
166
y puede formar parte, junto con otros enzimas codificados por el virus, de un sistema de
reparación del tipo de excisión de base para eliminar bases modificadas en el DNA viral.
Por otra parte, se ha continuado con el estudio de genes virales implicados en el
control de la apoptosis y de la respuesta inmune. Se ha demostrado que el homólogo
viral del Bcl-2, que actúa como inhibidor de la apoptosis, interacciona con la proteína
celular pro-apoptótica Bax durante la infección, sugiriendo que la proteína viral lleva a
cabo su función anti-apoptótica por un mecanismo similar al del Bcl-2 celular, que también heterodimeriza con Bax.
Previamente, se había demostrado que el homólogo viral del IkB celular, un inhibidor de los factores de transcripción NFkB implicados en la expresión de genes de respuesta inmune, bloquea la activación de NFkB e inhibe la unión de éste al DNA . Dado
que los factores NFkB son dímeros constituídos por distintas subunidades que pueden
responder a diferentes estímulos e interaccionar con distintas secuencias en el DNA, se
ha llevado a cabo un estudio de las subunidades NFkB que interaccionan con el IkB del
VPPA. Estos estudios han demostrado que el IkB viral, como el IkB-α celular, inte-racciona con heterodímeros p50-p65, que es el complejo NFkB que se induce más frecuentemente en una gran variedad de sistemas celulares.
Estudio de la interacción del ligando del virus con receptores celulares
El estudio de la interacción ligando-receptor puede conducir al descubrimiento
de nuevas terapias para la prevención o tratamiento de la enfermedad, mediante un
bloqueo específico del primer paso en el ciclo infectivo. Se ha iniciado, por tanto, una
caracterización de los receptores celulares para el VPPA mediante el tratamiento de la
superficie celular con distintos enzimas y lectinas. Los resultados indican que el receptor es de naturaleza proteica y que en la unión del virus a la membrana celular no participan carbohidratos ni lípidos .
Morfogénesis del VPPA
Con el fin de estudiar la función de proteínas virales, se ha desarrollado un método para la generación de recombinantes del VPPA que expresan de una manera inducible genes del virus. El análisis por microscopía electrónica de células infectadas con
un virus recombinante que expresa induciblemente la proteína mayoritaria de la cápsi167
da p72 ha permitido demostrar que la acumulación progresiva de la cápsida sobre
estructuras membranosas precursoras conduce al ensamblaje de las partículas virales.
Otros estudios de microscopía electrónica indican que la envuelta interna del VPPA
está constituida por una cisterna colapsada, con dos membranas, derivada del retículo
endoplasmático.
Emigración de mitocondrias a los sitios de ensamblaje del VPPA
En células infectadas con el VPPA, se ha observado la presencia de grandes acúmulos de mitocondrias en la periferia de factorías virales que contienen partículas en
formación. Estas mitocondrias presentan la morfología ultraestructural característica de
orgánulos respirando activamente, mientras que la mayoría de las mitocondrias de
células no infectadas tienen la ultraestructura correspondiente al estado de reposo.
Estas observaciones son consistentes con un papel de las mitocondrias que rodean a las
factorías virales en proporcionar la energía que probablemente se requiere para los
complejos procesos morfogenéticos del virus. Estos acúmulos mitocondriales se originan por una emigración masiva de las mitocondrias a las factorías virales, estando
implicados en este transporte los microtúbulos del citoesqueleto celular. El fenómeno
de emigración mitocondrial que se observa en la célula infectada por VPPA hace de ella
un sistema muy adecuado para estudiar los mecanismos implicados en el movimiento
de las mitocondrias en células de mamífero.
Research Summary
Study of the function of viral genes
The function of African swine fever virus (ASFV) genes encoding proteins with
sequence homology to other proteins in the databases is being studied. The protein
encoded by one of these genes has been characterized as a trans-prenyltransferase
catalyzing the synthesis of the isoprenoid compound geranylgeranyl diphosphate,
which could serve as a substrate for the prenylation of viral or cellular proteins, thus
regulating their function during the infection.
ASFV also encodes a novel DNA polymerase of only 20 kDa belonging to the X
family of DNA polymerases that includes the polymerases involved in DNA repair. The
168
reparative DNA polymerase of ASFV is a monomeric and highly distributive enzyme
that conserves the most critical residues involved in DNA and nucleotide binding, as
well as in catalysis of the polymerization reaction. This DNA polymerase represents the
minimal functional version of this type of reparative polymerases and may constitute,
together with other virus-encoded enzymes, a base excision repair system to eliminate
modified bases in the viral DNA.
On the other hand, the study of viral genes involved in the control of apoptosis
and the immune response has been continued. It has been shown that the viral homologue of Bcl-2, which is an inhibitor of apoptosis, interacts with the cellular pro-apoptotic protein Bax during infection, suggesting that the viral protein performs its antiapoptotic function by a mechanism similar to that of the cellular Bcl-2, which also heterodimerizes with Bax.
It had been previously shown that the viral homologue of cellular IkB, an inhibitor of
transcription factors NFkB involved in the expression of immune response genes, inhibits
the binding of NFkB to DNA and prevents the activation of NFkB. Since NFkB factors are
dimers of variable subunits, recognizing different DNA targets or responding to different
stimuli, an study of the NFkB subunits that interact with the virus IkB has been carried out.
These studies have shown that the viral IkB, as the cellular IkB-α, interacts with p50-p65
heterodimers, which is the most commonly induced NFkB complex in many cell systems.
Study of the interaction of the virus ligand with cell receptors
The study of the ligand-receptor interaction could lead to new therapies for prevention or treatment of the disease, by specifically blocking the first step in the infection
cycle. Therefore, a characterization of the cell receptor for ASFV has been initiated by
treatment of the cell surface with different enzymes and lectins. The results indicate that
the receptor is composed of protein, with no carbohydrates or lipids involved in the
virus attachment to the cellular membrane.
ASFV morphogenesis
In order to study the function of viral proteins, a method has been developed for
the generation of recombinant ASFV that inducibly express virus genes. An analysis by
electron microscopy of cells infected with a recombinant virus inducibly expressing the
169
major capsid protein p72 has allowed to demonstrate that the progressive building of the
capsid on precursors membranous structures leads to the assembly of the virus particles.
Other electron microscopic studies indicate that the inner envelope of ASFV is constituted by a two-membraned collapsed cisterna derived from the endoplasmic reticulum.
Migration of mitochondria to ASFV assembly sites
The presence of large clusters of mitochondria in the periphery of viral factories
containing assembling particles has been observed in cells infected with ASFV. These
mitochondria present the ultrastructural morphology characteristic of actively respiring organelles, while most of the mitochondria of uninfected cells have the ultrastructure corresponding to the resting state. These observations are consistent with a role for
the mitochondria that surround the viral factories in providing the energy that is probably necessary for the complex morphogenetic process of ASFV. These mitochondrial
accumulations are originated by a massive migration of the mitochondria to the viral
factories, being involved in this transport the microtubules of the cell cytoskeleton. The
phenomenon of mitochondrial migration observed in the ASFV-infected cell makes of
this cell a most suitable system to study the mechanisms involved in the movement of
mitochondria within the mammalian cell.
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Eladio Viñuela
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