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TRABAJO ORIGINAL
Natera I, et al
Evaluación de la respuesta serológica en niños con
dengue con signos de alarma y dengue severo
Ivelisse Natera1, Dulce Moron2, Julio Zambrano3, Lieska Rodríguez3, Freddie Acive3, Eduardo Armas3
1
2
Pediatría Médica Infecciosa del Hospital Universitario de Caracas
División de Vigilancia Epidemiológica. Instituto Nacional de Higiene “Rafael Rangel”
3
Laboratorio de Inmunoserología Viral. Instituto Nacional de Higiene “Rafael Rangel”
RESUMEN
Introducción: Determinar IgM por inmunoensayoenzimático de captura (MAC-ELISA) es una
prueba diagnóstica utilizada en Dengue. La Inhibición
de hemaglutinación (IH) titula anticuerpos específicos
IgM-IgG sin distinguirlos, pero discrimina primoinfección
de infección-secundaria. Objetivo: Evaluar la respuesta
serológica en niños con Dengue con signos de alarma y
dengue severo (DCSA/DS). Método: El estudio constó
de una parte prospectiva-descriptiva realizada durante 10
años, en niños hospitalizados con dengue hemorrágico
(DH) y con MAC-ELISA como primera prueba serológica
(PPS). Se realizó una segunda prueba serológica
(SPS) en la muestra sanguínea 1 o en una muestra 2.
La segunda parte retrospectiva, llevó a redefinir DH en
DCSA/DS según OMS-2009. Resultados: De 565 niños
seleccionados, 482 presentaron IgM positiva (85.%) y 83
IgM negativa en la PPS. A 120/565 niños se les procesó
SPS, siendo agrupados en A y B. Grupo A, formado por
53/83 niños con IgM negativa-PPS, se les procesó IH,
nueva IgM MAC-ELISA o ambas pruebas: 19 resultaron
negativos (infección descartada) y 34 positivos (6
mostraron seroconversión de IgM y 28 elevados títulos
de anticuerpos, de los cuales 23 no tuvieron IgM en fase
convalecencia). Al Grupo B constituido por 67 niños con
IgM positiva-PPS, se les procesó IH. Los resultados de
IH en ambos grupos determinó 13 % primoinfecciones,
83 % infecciones secundarias y 4 % no clasificable.
Presentaron serología positiva para dengue 516/565
niños, de los cuales el 4,5 % (23/516) cursó con IgM
negativa. Conclusión: DCSA/DS en niños, puede
presentarse en una infección primaria o secundaria. Una
IgM negativa en convalecencia, no descarta DCSA/DS.
SUMMARY
Introduction: IgM capture enzyme-linked immunoasorbent assay (MAC-ELISA) is a diagnostic test used
in Dengue. Hemagglutination inhibition (HI) measure
IgM-IgG specific antibodies without distinguishing them,
but discriminate primary versus secondary infection.
Objective: To evaluate serological response in children
with Dengue with warning signs and severe dengue
(DWS/SD). Method: The study consisted of a 10 year
prospective-descriptive part, on children hospitalized with
dengue hemorrhagic fever (DHF) and MAC-ELISA as
the first serological test (FST). A second serological test
(SST) was performed on blood sample 1 or a second blood
sample. The second retrospective part led to DHF being
redefined in DWS/SD according to WHO-2009. Results:
Out of 565 children selected, 482 presented positive IgM
(85 %) and 83 negative IgM in FST. 120 of 565 children
were tested by SST and then assigned to groups A and B.
Group A, consisting of 53/83 children with IgM negativeFST, was tested with HI, new MAC-ELISA IgM or both: 19
came out negative (infection ruled out) and 34 positive
(6 children presented IgM seroconversion and 28 had
high antibody titers, of which 23 had negative IgM in the
convalescence phase. Group B, consisting of 67 children
with positive IgM-FST, was tested with HI antibodies titles.
The results of antibodies titles in both groups determined
13 % primary infections, 83 % secondary infections and
4 % unclassifiable infections. After the SST were done,
516/565 children had positive serology for dengue, 23
of which (4.5 %) showed negative IgM. Conclusion:
DWS/SD can be a clinical presentation in children with
primoinfection or secondary infection. A negative IgM
in convalescent phase does not rule out the disease.
INTRODUCCIÓN
A nivel mundial ha ocurrido un aumento
progresivo en el número de casos de infecciones por
el virus del dengue (VD) (1), así como la propagación a
nuevas áreas geográficas como ha sido la detención
en el Estado de Florida y en Hawaii (2,3).
Venezuela es un país endémico para la infección
por el virus del dengue con períodos epidémicos
que se presentan en el curso de cada 2 a 3 años.
Mientras en el año 2004 se reportaron 30.694
casos, para los años 2007, 2010 y 2013 fueron
registrados 80 646, 124 931 y 63 726 casos de
dengue, respectivamente, correspondiendo entre
un 6 y 8 % de los casos a dengue hemorrágico (4-7).
La infección por el VD puede cursar con
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EVALUACIÓN DE LA RESPUESTA SEROLÓGICA EN NIÑOS CON DENGUE
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Bol Venez Infectol Vol. 26 - Nº 2, julio-diciembre 2015
Infección primaria
Infección secundaria
IgG
Fase aguda
Niveles de anticuerpos
manifestaciones clínicas similares a varias
patologías infecciosas y no infecciosas,
pudiendo ocasionar la indicación de tratamientos
innecesarios, como la administración de
antibióticos hasta en un 15 % de los casos (8),
por lo que se hace necesario la realización de
pruebas diagnósticas.
Las pruebas diagnósticas de infección
por el VD incluyen pruebas virológicas y
serológicas(9). De estas, la determinación de
anticuerpos específicos son los más empleados,
presentando algunas ventajas respecto a las
pruebas virológicas. Mientras los anticuerpos
son moléculas termoestables que no requieren
de refrigeración para el transporte y pueden
detectarse desde el quinto día hasta meses del
inicio de los síntomas, las pruebas virológicas
requieren de medidas estrictas de conservación
y transporte debido a que el VD y sus partículas
son termolábiles, además son pruebas costosas,
laboriosas y limitan la recolección de las muestras
a los primeros 5 días de enfermedad.
Serológicamente, en la infección por el VD
se puede observar dos tipos de respuesta, la
primoinfección y la infección secundaria.
En la primoinfección los anticuerpos IgM se
detectan a partir del quinto día de enfermedad, con
un pico hacia la segunda semana, descendiendo
a valores indetectables entre los 30-90 días10. Los
anticuerpos IgG comienzan a elevarse después del
día 7 a 10 de la enfermedad, para luego declinar
hasta valores detectables de por vida.
En la infección secundaria, la IgG se eleva a
valores detectables casi simultáneamente con
la sintomatología para continuar su ascenso
durante las dos primeras semanas, alcanzando
títulos más elevados que en la primoinfección.
Los niveles de IgM pueden hallarse muy bajos o
no ser detectables, reportando falsos negativos
hasta en el 5 % de las infecciones secundarias
(11-13)
. (Figura 1).
Entre las pruebas serológicas están el
Inmunoensayo-enzimático de captura (MACELISA) y la inhibición de la hemaglutinación (IH).
El MAC-ELISA determina anticuerpos clase
IgM con una sensibilidad 90 % y especificidad de
98 % en muestras en convalescencia (14), es una
prueba económica, rápida y fácil de ejecutar; pero
no permite el diagnóstico en los 5 primeros días de
la enfermedad; pierde sensibilidad en infecciones
secundarias; no identifica al serotipo involucrado;
puede ocurrir una respuesta cruzada con otros
flavivirus por infección o vacunación (15-18).
La inhibición de la hemaglutinación titula la
presencia de anticuerpos específicos IgM e IgG
en el suero del paciente, sin distinguir entre uno
Fase de
convalecencia
IgG
IgM
IgM
0
5 6 7
15
60-90
0 1 2
15
60-90
Días de enfermedad
Figura 1. Cinética de la IgM e IgG en la primoinfección por
virus del dengue y en la infección secundaria. Modificado de
las guías OMS 2009.
u otro anticuerpo, pero discrimina entre infección
primaria y secundaria por el VD considerando que
en infección secundaria la IgG alcanza valores
muy superiores a los alcanzados por la IgM e IgG
en la primoinfección.
Debido a la disponibilidad de las pruebas
serológicas sobre las virológicas, se quiso
evaluar la respuesta de anticuerpos de niños con
criterios clínicos Dengue con signos de alarma
y dengue severo (DCSA/DS) a fin de lograr una
interpretación idónea de los resultados.
Objetivo: Revisar la respuesta de anticuerpos
contra el VD en niños con DCSA/DS hospitalizados
en Pediatría Infecciosa del Hospital Universitario
de Caracas (PI-HUC).
MÉTODO
El estudio constó de una parte prospectiva y
de una segunda parte retrospectiva.
Prospectivamente se seleccionaron todos los
niños hospitalizados en PI-HUC, entre septiembre
de 1999 y junio 2009 que cumplieron con los
siguientes criterios:
Criterios de inclusión:
Edad mayor de un mes y menor de 12 años.
Criterios clínicos de dengue hemorrágico según
la definición aportada por la OMS en 1997 (19,20).
Tener como primera prueba diagnóstica la
determinación de IgM por MAC-ELISA (Primera
prueba serológica-PPS) y haber sido procesada
en el Laboratorio de Inmunoserología del Instituto
Nacional de Higiene “Rafael Rangel” (INH-RR).
Criterios de exclusión:
Criterios de Fiebre por Dengue.
Errores en la identificación de la muestra,
transporte y/o procesamiento.
Tener como única prueba diagnóstica una
Natera I, et al
Prueba virológica.
Al completar los 10 años de selección de la
muestra, se procedió a reclasificar a aquellos
niños que cumplían con los criterios de la nueva
clasificación de dengue, propuesta por la OMS
en 2009(21): Dengue con signos de alarma o
Dengue severo
Una vez seleccionada la muestra e independiente
del resultado del MAC-ELISA, se realizó una
segunda prueba serológica (SPS) a aquellos
niños con alícuotas sanguíneas conservadas de
la primera prueba serológica o a aquellos con
disponibilidad de extracción de una segunda
muestra sanguínea. Esta segunda muestra
sanguínea fue traída como mínimo 7 días después
de la primera muestra. La SPS permitiría evaluar
la frecuencia de positivos y falsos negativos por
MAC-ELISA y clasificar el tipo de respuesta al VD”.
Los niños con una segunda prueba serológica
fueron agrupados en:
a) Grupo A, constituido por niños con IgM negativa
en la PPS. A estos se les procesó una nueva
determinación de IgM por MAC-ELISA, títulos
de anticuerpos por IH o la realización de ambas
pruebas.
b) Grupo B, formado por niños con IgM positiva
en la PPS. A este grupo se les procesó solo
títulos de anticuerpos por IH.
Las muestras fueron procesadas en el
Laboratorio de Inmunoserología Viral del INH-RR,
utilizando un Kit de ELISA de captura validado
por el CDC de Puerto Rico y/o por el método de
la Inhibición de la Hemaglutinación.
Los resultados se clasificaron como infección
probable, confirmada o descartada, según los
criterios de la OMS(19) y empleando las siguientes
definiciones:
• Fase aguda: < 6 días del inicio síntomas.
• Fase de convalecencia: ≥ 6 días de evolución.
• Infección probable: IgM positiva en la fase
aguda tardía o en convalescencia; la existencia
de monosuero con títulos de anticuerpos ≥
1.280 por IH sin determinación de IgM por
MAC-Elisa.
• Infección confirmada: aislamiento viral en
suero o en muestras de autopsias; muestras
pareadas con incremento de 4 veces o más
en los títulos de anticuerpos o al registrarse
seroconversión de la IgM.
• Infección descartada: Niños con IgM negativa
y títulos de anticuerpos por IH < 1 280, en fase
de convalecencia.
•Infección Indeterminada: inexistencia de
muestra para corroborar una IgM negativa.
Las infecciones probables o confirmadas fueron
clasificadas según las siguientes definiciones de
la OMS(19).
•Infección Primaria: Muestra extraída en la
fase aguda con IgM positiva y anticuerpos
< 160 por IH; muestra tomada en la fase de
convalecencia con reporte de IgM positiva y
anticuerpos <1.280.
• Infección Secundaria: Muestra en fase aguda
con IgM positiva y títulos de anticuerpos
por HI > 160 o muestra extraída en fase de
convalecencia con IgM positiva o negativa
pero con títulos ≥ 2 560.
• Respuesta no clasificable: Aquellas muestras
con resultados de títulos de anticuerpos ≤ 160 en
suero agudo o de 1 280 en suero convaleciente
sin haberse estudiado la determinación de IgM
por MAC-ELISA.
Análisis Estadístico:
Los datos fueron recolectados en fichas
clínicas y los resultados representados en tablas
de distribución de frecuencia.
RESULTADOS
De 1 012 niños que ingresaron con el
diagnóstico de dengue a PI-HUC durante el lapso
de estudio, 565 cumplieron con los criterios de
inclusión.
Los resultados obtenidos en la PPS de los 565
niños seleccionados fueron: 482 con IgM positiva
(85 %) y 83 con IgM negativa (15 %).
La segunda prueba serológica (SPS) se pudo
realizar a 120 niños: 106 de ellos tenían alícuotas
conservadas de la muestra 1 y a 14 se les extrajo
una segunda muestra sanguínea. De estos 120
niños con una SPS, 53 traían IgM negativa en
la PPS y 67 niños presentaban IgM positiva en
la PPS, denominándolos Grupo A y Grupo B,
respectivamente.
Del grupo A, a 47/53 niños se les procesó como
SPS la determinación de anticuerpos por IH; a 2/53
una nueva determinación de IgM por MAC-ELISA
y a 4/53 se les procesó tanto IgM-MAC-ELISA
como la determinación de títulos de anticuerpos
por IH. Los resultados permitieron descartar la
infección en 19 niños (IgM negativa con títulos
de anticuerpos por IH < 1280 en muestras de
la fase de convalecencia) y en los 34 restantes
se demostró el diagnóstico de la enfermedad,
elevando el número de niños con diagnóstico
de infección por el VD de 482 (85%) a 516/565
(91%). Los 34 niños con infección probable o
confirmada, 6 seroconvirtieron la IgM y 28 niños
mostraron títulos de anticuerpos > 1 280 por IH con
IgM negativa, de estos últimos, 5 muestras fueron
extraídas en la fase aguda sin contarse con una
.
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EVALUACIÓN DE LA RESPUESTA SEROLÓGICA EN NIÑOS CON DENGUE
segunda muestra para evaluar seroconversión de
la IgM en la fase de convalecencia y 23 muestras
mostraron la ausencia de IgM a en la fase de
convalecencia (Tabla 1).
El número de niños con diagnóstico de infección
por el VD que cursaron con ausencia de IgM en
la fase de convalecencia fue de 23/516 (4,5 % de
los casos) (Tabla 1).
A los 67 niños del Grupo B con IgM positiva, se
les determinaron por IH los títulos de anticuerpos
contra el VD, en alícuotas conservadas de
la muestra 1, permitiendo clasificar el tipo de
respuesta en primaria o secundaria. Los títulos
obtenidos fueron: a) Títulos de anticuerpos ≥ a
2.560 en 51/67 niños para definirlos como infección
secundaria, registrándose títulos ≥ 10 240 en
41/51 niños ; b) Títulos de anticuerpos <160 en
5/67 pacientes, lo que permitió diagnosticarlos
como infección primaria; c) Títulos >160 < 1 280
en 6/67 niños (2 con muestras extraídas en fase
aguda para el diagnóstico de infección secundaria
y 4 con muestras de la fase de convalecencia
para definirlo como respuesta primaria); d) Títulos
≥ 1.280 pero menores a 2 560 en 5/67 niños (2
en fase aguda para definirlos como infección
secundaria y 3 en fase de convalecencia, lo que
no permitió clasificar el tipo de respuesta (Tabla 2).
Para evaluar el tipo de respuesta a la infección
por el VD en los dos grupos, se tomaron los
99 niños que tuvieron la determinación de los
títulos de anticuerpos por IH (51 del grupo A y
los 67 del grupo B, excluyendo los 19 niños del
grupo A con infección descartada). El tipo de
respuesta presentada por estos niños fue: 13/99
con infección primaria por el VD (13,1 %); 82/99
(82,8 %) con Infección secundaria por VD y 4/99
(4 %) con respuesta no clasificable (Tabla 3).
Tabla 1. Resultados de la segunda prueba serológica aplicada a los niños del Grupo A (n=53)
Títulos de anticuerpos en niños con IgM (-)
Número niños
Diagnóstico
< 1 280 en fase de convalecencia
≥ 1 280 en fase aguda o de convalecencia
Seroconversión de IgM con títulos < 160
Seroconversión IgM sin realizar IH
19
28
4
2
Infección descartada
Infección probable
Infección confirmada
Infección confirmada
Tabla 2. Títulos de anticuerpos por IH en el Grupo B
Títulos de Anticuerpos en niños IgM (+)
< 160 en fase aguda
< 160 en fase de convalecencia
> 160 < 1 280 en fase aguda
> 160 < 1 280 en fase de convalecencia
≥ 1 280 < 2 560 en fase aguda ≥ 1 280 < 2 560 en fase de convalecencia
≥ 2 560 en fase de convalecencia
DISCUSIÓN
En Venezuela, el dengue es una enfermedad
endemo-epidémica que puede cursar con
un espectro de manifestaciones clínicas que
van desde infecciones asintomáticas hasta
manifestaciones clínicas potencialmente fatales
y para la cual, existen pruebas de laboratorio
encargadas de detectar componentes antigénicos
del virus o evaluar la respuesta serológica que
generan.
El predominio de las pruebas serológicas sobre
las virológicas y el mayor riesgo a severidad de
la enfermedad con la exposición sucesiva a otro
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Número niños
Diagnóstico
1
4
2
4
2
3
51
Infección primaria
Infección primaria
Infección secundaria
Infección primaria
Infección secundaria
No clasificable
Infección secundaria
serotipo del virus del dengue, obliga a fortalecer
los conocimientos en cuanto a la respuesta de
los anticuerpos específicos.
Los resultados obtenidos en este estudio
permitieron evaluar y conocer mejor el
comportamiento de la IgM específica de
los pacientes con DCSA/DS al emplear al
MAC-ELISA como prueba serológica rápida,
económica, que permite procesar varias muestras
simultáneamente y que no requiere de muestras
pareadas. Esta última ventaja del MAC-ELISA es
de importancia, si se tiene presente que para las
muestras pareadas, se necesita de un intervalo
de tiempo de 7 días o más entre ambas muestras,
Natera I, et al
Tabla 3. Tipo de respuesta al virus del dengue en 99 niños con diagnóstico de infección probable o confirmada (HUC-1999-2009)
Títulos de Anticuerpos por IH
Grupo A: IgM negativa
(Tipo de Respuesta)
Grupo B: IgM positiva
(Tipo de Respuesta)
< 160 fase aguda o convalecencia
4
5
(Primaria)(Primaria)
>160 < 1 280 en fase aguda
0
2
(Secundaria)
< 1 280 en fase convalecencia
19
4
(Descartados)
(Primaria)
≥ 1 280 < 2 560 fase aguda
0
2
(Secundaria)
≥ 1 280 < 2 560 convalecencia
1
3
(No Clasificable)
(No Clasificable)
≥ 2 560 < 5 120 convalecencia
4
1
(Secundaria)(Secundaria)
≥ 5 120 < 10 240 convalecencia
3
9
(Secundaria)(Secundaria)
≥ 10 240
20
41
(Secundaria)(Secundaria)
4 Primarias
9 Primarias
Total 27 Secundarias
55 Secundarias
19 Descartados
3 No clasificable
1 No clasificable
lapso de tiempo en el cual la mayoría de los
pacientes ya han sido egresados (8), lo que puede
limitar la extracción de esa segunda muestra
sanguínea, tal como ocurrió en este estudio en el
cual solo pudo realizarse la toma de una segunda
muestra en 14/120 niños, atribuyendo este hecho
al ausentismo a la consulta de egresados
La realización del MAC-ELISA a los niños
seleccionados como la PPS permitió el diagnóstico
de infección probable por el virus del dengue en el
85 % de los niños con criterios clínicos de DCSA/
DS. Pero al realizar una SPS como lo fue la IH, se
incrementó el número de casos con diagnóstico
de DCSA/DS en la muestra estudiada a 91 %.
Si bien, la determinación del pool IgM-IgG
específica para dengue por la prueba la Inhibición
de Hemaglutinación, no es una prueba que se
realiza en laboratorios convencionales, esta
permitió:
Titular cuantitativamente los anticuerpos y
definir que 8 de cada 10 niños con DCSA/DS
se presentaron en el curso de una infección
secundaria por el VD, hecho de relevancia en
un país en el cual, desde hace más de 5 años,
circulan los 4 serotipos del virus, exponiendo a los
habitantes al riesgo de infecciones secundarias.
Determinar que 1 de cada 10 niños con una
primera exposición a alguno de los 4 serotipos
del virus del dengue, puede manifestarse con
criterios clínicos de DCSA/DS. Este resultado
ha sido expresado en otros estudios, en donde
el DH puede ser la manifestación clínica de una
primo-infección por el VD (22-26).
Detectar que un 4,5 % de los niños con DCSA/
DS no presentan IgM específica contra el VD, por
lo que ante un niño con signos clínicos de DCSA/
DS con IgM específica negativa e IgG específica
positiva debe mantenerse la consideración
diagnóstica de Infección por virus del dengue.
Este resultado coincide con lo reportado en la
literatura (19-21).
Aun cuando este estudio tiene la limitante
de no haber definido los falsos positivos de
ambas pruebas serológicas, no representaron
un inconveniente porque durante los 10 años
del estudio, en Venezuela no se reportaron
casos de infecciones por otros flavivirus (fiebre
amarilla urbana, virus de fiebre del Nilo, encefalitis
Japonesana o encefalitis de Sant Louis que
pudieran dar falsos positivos por reacciones
cruzadas (27-29). Además, hasta la fecha no existen
estudios que convalide el temor teórico de los
anticuerpos producidos por la vacuna contra la
fiebre amarilla (30-33).
CONCLUSIONES
El dengue con signos de alarma y el dengue
severo pueden presentarse en el curso de una
primoinfección o en una infección secundaria,
pero es más frecuente en el curso de esta última.
IgM-MAC-ELISA como prueba única, es de gran
utilidad en el diagnóstico de niños con DCSA/DS.
Un 4 % de los niños con DS cursan con IgM
negativa.
Bol Venez Infectol Vol. 26 - Nº 2, julio-diciembre 2015
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EVALUACIÓN DE LA RESPUESTA SEROLÓGICA EN NIÑOS CON DENGUE
La IH es útil como segundo método diagnóstico
en pacientes con clínica DCSA/DS que cursen
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