Download Manuel Guillermo Moreno Pérez

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS
LABORATORIO SANIDAD DE
GERMOPLASMA
PROGRAMA RECURSOS
GENÉTICOS
CERTIFICACIÓN SANITARIA DEL
GERMOPLASMA DE YUCA
Maritza Cuervo I.
Manuel Guillermo Moreno
Norma Cristina Flor
José Luis Ramírez
Cesar Augusto Medina
Daniel Debouck
2010
Tabla de Contenido
1.
Introducción .........................................................................................................................1
3.
Metodología para certificar el material genético a transferir .......................................... 5
2.
4.
Proceso sanitario en la introducción del material de yuca .............................................. 3
Descripción de algunas enfermedades virales del cultivo de la yuca.............................. 5
4.1 Mosaico Común de la Yuca (CsCMV)..................................................................................................5
4.2 Virus X de la yuca (CsXV) .......................................................................................................................6
4.3 Enfermedad del Cuero de Sapo de la yuca (CSY) ..........................................................................6
5.
Descripción del proceso de indexación del germoplasma de yuca en el LSG ................. 9
5.1 Aclimatización de plántulas ..................................................................................................................9
5.2 Detección de Virus ................................................................................................................................. 12
5.2.1 Detección de los Virus CsXV y CsCMV ............................................................................................ 12
5.2.2 Detección de la Enfermedad del Cuero de Sapo. ........................................................................ 13
5.2.2.1 Procedimiento de la técnica de injerto. .................................................................................. 13
5.2.2.2 Método molecular para el diagnostico del Virus del Cuero de Sapo de la yuca ...... 17
5.2.2.2.1 Extracción de RNA de cadena doble (dsRNA).......................................................... 17
5.2.2.2.2 Síntesis de cDNA y RT-PCR ........................................................................................ 18
6.
Documentación de resultados de la indexación de yuca ................................................19
8.
Bibliografía .........................................................................................................................22
7.
9.
Establecimiento de la colección de yuca miniatura o bonsái ......................................... 21
Anexos ................................................................................................................................ 24
9.1 Anexo 1....................................................................................................................................................... 24
9.2 Anexo 2....................................................................................................................................................... 25
9.3 Anexo 3....................................................................................................................................................... 26
1. Introducción
La colección in vitro del genero Manihot del Programa de Recursos Genéticos (PRG) del Centro
Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) se encuentra actualmente representada por 6,467
materiales, de las cuales 5,184 materiales son de yuca cultivada (Manihot esculenta) procedentes de 28
países, 883 materiales son especies silvestres del género Manihot (33 especies) y 400 son materiales
híbridos.
Desde 1994 estos materiales han sido designados a FAO (Organización de las Naciones Unidas para la
Alimentación y la Agricultura) dentro del marco del acuerdo FAO-CGIAR y han sido registrados en el
Sistema Multilateral de Acceso y Distribución de Beneficios del Tratado Internacional sobre Recursos
Fitogenéticos para la Alimentación y la Agricultura dentro del marco del acuerdo entre el Órgano
Rector del Tratado y el CIAT, y cumple con los estándares para bancos de germoplasma.
La FAO es la entidad que mediante programas colaborativos (acuerdos y/o tratados) entre los
gobiernos de diferentes países del mundo, promueve el movimiento seguro de germoplasma siguiendo
los mandatos de los planes cuarentenarios de cada país. La FAO estipuló que solamente plantas in
vitro del género Manihot podrán ser utilizadas para el intercambio a través de todo el mundo e indicó
que cada material de yuca que se distribuya desde el CIAT debe estar evaluado para ciertos problemas
de importancia cuarentenaria, que básicamente son agentes causales de enfermedades que pueden
causar grandes pérdidas económicas al cultivo (Frison et al. 1991).
En el caso específico de la yuca Manihot esculenta Crantz y debido a que el material vegetativo
utilizado para el intercambio es producido in vitro; las características fitosanitarias son inspeccionadas
desde el momento de selección de plantas madres durante el proceso de introducción hasta antes de
empacar los materiales para su distribución.
La conservación del germoplasma de Manihot y su distribución comprenden un conjunto de
actividades que incluyen los procesos de: Introducción, Cuarentena, Eliminación de patógenos,
Indexación, Micropropagación, Conservación, Caracterización, Distribución, y Duplicados de seguridad
(Flujograma 1). Para conocer más detalles acerca de las diferentes etapas del flujo del manejo de este
germoplasma se puede consultar el manual de procedimientos para la conservación in vitro del
germoplasma del genero Manihot (http://www.ciat.cgiar.org/urg).
La certificación sanitaria del material de la colección de yuca se hace en el Laboratorio de Sanidad de
Germoplasma (LSG) del Programa de Recursos Genéticos (PRG). Se realiza la detección del Virus
Común de la Yuca (CsCMV), Virus X de la Yuca (CsXV) y la enfermedad del Cuero de Sapo (CSY)
(Flujograma 2).
Debido a que la colección de yuca está conservada bajo condiciones asépticas en que se multiplica y
conserva el material in vitro, las probabilidades de contaminación por hongos y bacterias son casi
nulas.
Dentro de las instalaciones del CIAT, existe una oficina de la División de Sanidad Vegetal (Sección de
Inspección y Cuarentena) del Instituto Colombiano Agropecuario (ICA), organismo adscrito al
Ministerio de Agricultura de Colombia, que se encarga de expedir los respectivos certificados
fitosanitarios basándose en las pruebas de sanidad realizadas en el Laboratorio Sanidad de
Germoplasma.
1
Flujograma 1. Flujo de actividades para el manejo del germoplasma de Manihot.
2
Flujograma 2. Diagrama de flujo de indexación de la yuca.
Dentro del PRG está el LSG que tiene la responsabilidad de informar sobre el estado fitosanitario del
germoplasma que distribuyen el PRG y demás programas del CIAT, certificando que esté libre de
enfermedades cuarentenarias. En el Manual de Procedimientos para la evaluación sanitaria de Fríjol y
Pastos
tropicales
se
encuentra
la
descripción
detallada
de
este
laboratorio
(http://www.ciat.cgiar.org/urg).
2. Proceso sanitario en la introducción del material de yuca
La introducción de los materiales para el inicio del proceso de conservación generalmente se hace en
tres formas:
1.
A partir de material vegetativo (estacas): proveniente de centros experimentales o colectas
realizadas en el país anfitrión.
2.
En forma in vitro: provenientes de los países donantes.
3.
En forma de semilla botánica y posterior rescate de embriones específicamente para las especies
silvestres.
3
Cualquiera que sea la forma de introducción se debe realizar un registro de información básica o datos
de pasaporte que son almacenados en la base de datos del programa (http://www.ciat.cgiar.org/urg).
La actividad de cuarentena cuenta también con un sistema de documentación que nos permite un
mejor manejo de la información de parte del ICA-CIAT. En el sistema se registra toda la información
relacionada con la introducción de los materiales.
De común acuerdo entre el ICA y el CIAT se han diseñado los procedimientos que permitan manejar el
germoplasma que es introducido a la colección in vitro de Manihot. Dentro de este procedimiento se
realiza la revisión de la documentación con la cual debe llegar el germoplasma (Permiso de
importación expedido por el ICA, certificado fitosanitario expedido por la entidad oficial fitosanitaria
del país donante, lista de variedades enviadas) y la inspección de las plantas para determinar si existe
algún problema fitosanitario especialmente de hongos y bacterias.
Cuando la introducción se realiza a partir de estacas, se realiza un proceso de desinfección, siembra y
tratamiento de termoterapia. Después de realizar este proceso se hace el aislamiento aséptico del
meristemo y su siembra en un medio de cultivo nutritivo y estéril (ver detalles en el en el manual de
procedimientos para la conservación in vitro del germoplasma del genero Manihot
(http://www.ciat.cgiar.org/urg).
Los materiales que han sido introducidos in vitro deben inicialmente deben someterse a una fase de
establecimiento, después de esta etapa se espera un reverdecimiento de las plántulas y se procede a
realizar una nueva evaluación del estado fisiológico y fitosanitario del cultivo. Esta información es
reportada al funcionario del ICA quien se encarga de realizar la nacionalización de los materiales y da
por lo tanto la aprobación para continuar con el proceso de micropropagación.
En el caso en que la introducción es realizada en forma de semilla botánica, se realiza la escisión
aséptica del embrión de la semilla y la siembra en un medio de cultivo estéril, los cuales
posteriormente son transferidos a condiciones normales de crecimiento y se procede a iniciar la etapa
de micropropagación, termoterapia y conservación.
Las técnicas de cultivo de meristemos relacionadas con la termoterapia se desarrollaron en el CIAT; el
propósito era eliminar los virus de las variedades de yuca infectadas. El desarrollo de ésta técnica ha
contribuido enormemente a la producción de clones de yuca en que se ha comprobado la ausencia de
organismos patógenos (Roca et al. 1991).
Las plantas establecidas que han sido obtenidas después de haber sido sometidas al tratamiento de
termoterapia bien sea a partir de estacas o termoterapia in vitro deben ser evaluadas para los
diferentes virus de importancia cuarentenaria en el laboratorio de sanidad de germoplasma.
Si hay presencia de estos patógenos los materiales deben ser esterilizados para su eliminación. Ningún
material puede ser distribuido hasta no completar todo el proceso de eliminación de patógenos y
certificación.
Para ver información más detallada en las etapas en la introducción del material de yuca se puede
consultar en el manual de procedimientos para la conservación in vitro del germoplasma del genero
Manihot (http://www.ciat.cgiar.org/urg).
4
3. Metodología para certificar el material genético a transferir
Debido a que el material vegetativo utilizado para el intercambio es producido in vitro y que las
probabilidades de contaminación por hongos y bacterias son casi nulas, en el proceso de certificación
sanitaria sólo se realizan pruebas para algunos virus de importancia cuarentenaria.
Cuando un país determinado requiere pruebas adicionales con respecto a la sanidad para otros
patógenos, el LSG está en capacidad de realizarlas. Además en el laboratorio se cuenta con el recurso
humano y físico para la realización de pruebas de diagnóstico molecular de diversos fitopatógenos.
La distribución incluye el respectivo certificado fitosanitario expedido por el ICA, en el cual se explican
los tratamientos y pruebas de detección de enfermedades aplicadas al material vegetativo.
Previamente el solicitante debe enviar el respectivo permiso de importación expedido por la autoridad
competente del lugar de destino del material o la respectiva comunicación escrita en la que se informa
la ausencia de requerimiento de este para el ingreso del material vegetal al país de destino.
4. Descripción de algunas enfermedades virales del cultivo de la yuca
Algunos de los virus neotropicales son asintomáticos y sin efectos deletéreos; no obstante, tres
enfermedades vírales justifican una atención detallada, los cuales serán descritos a continuación.
4.1 Mosaico Común de la Yuca (CsCMV)
Inicialmente se reportó en el sur del Brasil (Silberschmid, 1938; Costa, 1940). La enfermedad ha sido
registrada en otros países de Sur América y hay reportes en África y Asia. Tiene mayor incidencia en el
Sur del Brasil y Paraguay.
No se conocen vectores del CsCMV (por sus siglas en inglés); la principal fuente de inoculo es el
material vegetal infectado. Debido a que el virus se disemina de manera sistémica en la planta, las
estacas provenientes de una planta afectada también estarán infectadas. El virus es muy estable y
puede ser propagado por transmisión mecánica. En general la enfermedad no reviste mayor
importancia, aunque su prevalencia en algunas áreas hace necesario su control.
La enfermedad del mosaico común de la yuca es causada por el virus del mosaico común el cual infecta
especies pertenecientes a varias familias de plantas de dicotiledóneas (Kitajima et al. 1965). Este virus
fue clasificado originalmente en el grupo de los potexvirus, el cual ahora es referido como género
Potexvirus. Los viriones de CsCMD son partículas alargadas semiflexuosas de 15 x 495 nm que
contienen RNA como ácido nucleico. En la yuca se presentan las inclusiones nucleares típicas de los
potexvirus al igual que en el hospedero herbáceo Nicotiana benthamiana. Se conoce que CsCMV
infecta de manera sistémica yuca, Euphorbia spp., Cnisdoscolus aconitifolius (chaya), N. benthamiana y
diferentes especies de especies de la familia dicotiledóneas (Costa & Kitajima, 1972).
Las partículas vírales de CsCMV contienen una cubierta proteica simple con un relativo peso molecular
de 26000 daltons. El genoma consiste de un ARN de cadena sencilla del cual se conoce la secuencia
completa (Calvert et al. 1996). En general la organización estructural, proteínas y pesos moleculares
son similares a otros potexvirus.
Las hojas de la planta de yuca afectadas por CsCMV desarrollan síntomas de mosaico y clorosis (Figura
1). En algunos casos, sobre algunas de las hojas afectadas se presentan manchas verdes claras y
oscuras delimitadas por las nervaduras. Los síntomas son más severos cuantos más largos sean los
5
periodos relativamente fríos, situación que es frecuente en zonas subtropicales de Sur América. Bajo
estas condiciones las plantas afectadas son muchas veces más enanas y las pérdidas en el rendimiento
pueden alcanzar hasta un 60 % (Costa & Kitajima, 1972).
La eliminación de las plantas que expresan síntomas de CsCMV permite un control adecuado. La mejor
oportunidad para identificar y eliminar las plantas afectadas es sobre los rebrotes, puesto que los
síntomas en las hojas primarias son evidentes. El cuidado en seleccionar el material vegetativo sano
permitirá que el CsCMV pueda erradicarse o reducir a un mínimo el daño económico.
Figura 1. Sintomatología clásica del CCMV.
4.2 Virus X de la yuca (CsXV)
Es una enfermedad asintomática producida por el virus X de la Yuca. El CsXV no produce síntomas en
las plantas infectadas, por lo que se considera de menor importancia, ya que no ocasiona una baja
considerable en los rendimientos del cultivo. Fue reportada en la zona Norte de Colombia en 1983
(Lennon et al. 1986).
Este virus fue clasificado originalmente en el grupo de los potexvirus. Es transmitido por propagación
vegetativa y por inoculación mecánica. Este virus es detectado por medio de la técnica serológica de
ELISA.
4.3 Enfermedad del Cuero de Sapo de la yuca (CSY)
La enfermedad denominada "cuero de sapo" fue reportada por primera vez, en 1971, en el
Departamento del Cauca, al sur de Colombia (Pineda et al. 1983). Su origen, parece ser la región
amazónica de Brasil o Colombia. Además de Colombia se ha reportado en Brasil, Costa Rica, Panamá,
Perú y Venezuela. Entre las enfermedades de la yuca el "cuero de sapo" está considerado como una de
las más perjudiciales para el cultivo, puesto que afecta directamente la producción de raíces,
provocando pérdidas del 90% o más en el rendimiento. La expresión de síntomas es variable de
acuerdo a la temperatura y al genotipo. En algunas variedades las plantas afectadas no presentan
señales visibles en su parte aérea y, en algunos casos, hasta puede lucir sana y vigorosa (Lozano & Nolt,
1989).
En las raíces, los síntomas varían desde muy suaves a severos, dependiendo de la edad de la planta y
de factores climáticos. Las condiciones secas o calientes tienden a inhibir el desarrollo de los síntomas,
6
mientras que condiciones más frescas favorecen el desarrollo de éstos. Aún en plantas afectadas
levemente, las pérdidas económicas persisten debido a la menor acumulación de almidón. Los
síntomas consisten en pequeñas fisuras longitudinales, localizadas cerca del callo donde se originan las
raíces y, posteriormente, se prolongan a lo largo de ellas. A medida que las raicillas aumentan de
diámetro, las fisuras tienden a cicatrizar, dando a las lesiones forma de labio. La cáscara o epidermis
de las raíces presenta una apariencia corchosa que se desprende con facilidad. Según sea la severidad
de los síntomas, la profundidad y número de las lesiones aumentan hasta deformar la raíz.
En general, el sistema radical de las plantas afectadas no alcanza a tener el mismo desarrollo del que
tienen las plantas sanas; las raíces permanecen delgadas, leñosas, de cáscara gruesa y corchosa y su
contenido de almidón es muy bajo (Figura 2) (Calvert & Cuervo, 2002).
Figura 2. Síntomas de “cuero de sapo” en raíces de yuca.
La detección de la enfermedad se puede hacer mediante el examen visual de las raíces, observándolas
cuidadosamente con el fin de detectar los síntomas característicos, ya sean de carácter leve o severo.
Debido a que esta enfermedad es fácilmente transmitida por medio de injertos esta técnica se puede
utilizar como otro método de diagnóstico. Esta prueba consiste e injertar a las plantas a evaluar una
variedad indicadora (Secundina: accesión CIAT, MCol 2063) debidamente certificada como libre de
virus. Es recomendable remover las yemas de los patrones para incrementar el porcentaje de
germinación de los injertos. Después de 3 ó 4 semanas, las plantas deben ser revisadas para verificar la
presencia de síntomas tipo mosaico en el follaje de los retoños, lo cual indicaría la presencia de la
enfermedad (Figura 3).
7
Figura 3. Variedad Secundina mostrando síntomas foliares del virus del cuero de sapo.
La enfermedad puede ser eliminada por medio de termoterapia y cultivo in-vitro de meristemas (Mafla
et al. 1984), siendo necesario que después de este proceso se realicen las pruebas respectivas para
confirmar la sanidad del material.
En las últimas investigaciones realizadas a nivel molecular se ha asociado consistentemente un virus
del grupo de los reovirus con esta enfermedad (Virus del Cuero de Sapo de la Yuca VCSY) y se ha
confirmado la existencia de diferentes cepas o variables genéticas (Calvert et al. 2008).
En algunas investigaciones realizadas se ha asociado esta enfermedad con fitoplasmas. Se ha
detectado mediante PCR la presencia de un fitoplasma en hojas infectadas por la enfermedad del cuero
de sapo (Álvarez et al. 2009).
Debido a los notables progresos en la caracterización y detección del virus asociado a esta enfermedad,
se desarrolló un método de diagnostico molecular mediante RT-PCR que posee grandes ventajas
comparativas con el método del injerto, siendo más efectiva y confiable.
La producción de material básico y certificado de propagación de yuca es la mejor estrategia para el
control del cuero de sapo de la yuca.
8
5. Descripción del proceso de indexación del germoplasma de yuca en el LSG
5.1 Aclimatización de plántulas
Las plántulas in vitro procedentes del Laboratorio de conservación in vitro se siembran en
invernadero, dándoles las condiciones requeridas para que la plántula se desarrolle y se conserve en
buen estado agronómico y sanitario bajo condiciones controladas, para su posterior indexación.
La forma de siembra de estas plántulas es la siguiente:
En un matero plástico con capacidad de dos litros, se adicionan cuatro centímetros de granito y sobre
éste, el sustrato compuesto por una relación de 2:1 de arena y suelo esterilizado al vapor a una
temperatura de 150 °C por cuatro horas (Figura 4, y Figura 5).
Figura 4. Matero con granito.
Figura 5. Granito y sustrato.
Se golpea la parte inferior del tubo de ensayo con la mano para desprender el medio de cultivo del
tubo y se extrae la plántula con unas pinzas las cuales son desinfectadas en alcohol al 70% después de
su uso (Figura 6 y Figura 7).
9
Figura 6. Desprendimiento de plántula.
Figura 7. Extracción de la plántula con pinzas.
Se lava la raíz de la plántula con agua destilada removiendo los residuos de medio de cultivo (Figura
8).
Figura 8. Limpieza del agar y de residuos.
Con la base de un tubo de ensayo, se abre un hoyo en el sustrato, se introduce la plántula y se adiciona
el sustrato de forma que la planta quede firme. En caso de que la planta por su tamaño quede inclinada,
es necesario utilizar una pajilla plástica como guía o soporte para mantenerla derecha (Figura 9 y
Figura 10). Es indispensable desinfectar todos los utensilios y las manos con alcohol al 70% al pasar
de una accesión a otra durante la siembra.
10
Figura 9. Siembra de plántula.
Figura 10. Soporte para la plántula.
Una vez que cada material es trasplantado, se cubre con una bolsa plástica transparente (con orificios,
para permitir el intercambio de aire) por un periodo de tres (3) semanas, hasta que se adapten a las
nuevas condiciones ambientales del invernadero (Figura 11).
Cuando las plantas ya estén adaptadas, se trasplantan a materos plásticos (Figura 12).
La planta se mantiene en invernadero de 3 a 5 meses, hasta alcanzar un tamaño que le permita ser
utilizada como patrón para realizar el proceso de injertación en el clon Secundina y detectar la
presencia de la enfermedad del Cuero de Sapo (Figura 13).
Figura 11. Protección.
Figura 12. Plántulas establecidas.
Las plantas se establecen y mantienen en invernadero en condiciones adecuadas para expresión de
síntomas (20-30°C) y 2000-5000 lux de iluminación, y cuando hay tejido o material disponible se toman
muestras para realizar las pruebas necesarias.
11
Figura 13. Plantas con el tamaño esperado a 3 meses.
5.2 Detección de Virus
5.2.1 Detección de los Virus CsXV y CsCMV
Para la detección de CsCMV y CsXV se utiliza la técnica ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay),
que es un método serológico rápido y eficiente para la detección de virus. Existen varias clases de
ELISA, la que se utiliza para estos virus es la de doble emparedado de anticuerpos (DAS-ELISA)
(Velasco et al. 1985).
Las gamaglobulinas utilizadas en estas pruebas fueron obtenidas del laboratorio de Virología del CIAT.
En todas las pruebas se utilizan controles negativos (plantas sanas) y positivos (plantas afectadas por
cada enfermedad) mantenidas en condiciones aisladas. Antes de realizar la evaluación se debe realizar
un esquema en donde se describe la posición exacta de cada accesión a evaluar dentro de la placa de
ELISA; de esta manera se ubicará fácilmente el resultado respectivo para cada accesión (Anexo 1). La
preparación de soluciones se pueden leer en el capítulo de anexos (Anexo 2). A continuación se
describen los pasos a seguir para la realización de esta metodología:
1.
2.
3.
Diluir la gammaglobulina con el buffer de cubrimiento según las concentraciones previamente
estandarizadas (CsXV dilución 1/1600, CCMV dilución 1/2500) y agregar 100 μl de esta solución
a cada uno de los pozos de una placa de microtitulación. Incubar a 37 C durante 3-4 horas.
Lavar la placa con el buffer PBS-Tween por 4 veces. En el lavado inicial, enjuagar los pozos y
descartar el buffer de inmediato. Este paso se realiza mecánicamente en un aparato lavador de
placas en donde se ha programado previamente para realizar 3 lavados por tres minutos cada
uno.
Macerar las muestras a evaluar, en una dilución 1/10 con el buffer para muestras y adicionar 100
µl en cada pozo de la placa de titulación. Incubar a 4-6° C durante toda la noche. Incluir
muestras de controles conocidos: sano, enfermo y además el buffer para muestras, con el
propósito de chequear la reacción. Las muestras se adicionan según esquema previamente
realizado en donde se ubica específicamente cada accesión a evaluar (Anexo 1).
12
4.
Lavar nuevamente la placa, de igual forma que en el paso 2, teniendo cuidado de remover todo
residuo de las muestras.
6.
Lavar nuevamente la placa, de igual forma que en el paso 2.
5.
7.
8.
9.
Diluir la gamma-globulina marcada con la enzima (conjugado) con el buffer para el conjugado
según las concentraciones previamente estandarizadas (CsXV dilución 1/1100 y CCMV dilución
1/2000) y agregar 100 µl de la solución a cada pozo de la placa. Incubar a 37° C durante 3-4
horas.
Adicionar 50 µl de substrato de color (Solución de p-nitrofenil fosfato) y leer a partir de los 15
minutos de adicionado.
La reacción puede pararse después de algún tiempo, adicionando 50 µl de hidróxido de sodio en
concentración 3 M.
Obtención de resultados: La lectura de los resultados se puede realizar visualmente observando
los pozos que den coloración amarillenta o por absorbancia a 405 nm usando un
espectrofotómetro. Se considera "positivo" todo aquel valor mayor a 2 veces el valor del control
sano. Se realizan al menos dos lecturas por placa en diferentes tiempos. Todos los registros de
las lecturas se guardan teniendo un archivo físico.
Durante los períodos de incubación la placa debe cubrirse. Es importante mantener una temperatura
uniforme a través de toda la placa pare evitar los efectos de bordes. Para ello, puede colocar a incubar
la placa dentro de una caja cerrada con humedad (a manera de cámara húmeda).
5.2.2 Detección de la Enfermedad del Cuero de Sapo.
Esta enfermedad es fácilmente transmitida por injertos, por este motivo esta técnica es utilizada para
su diagnóstico. El principio del injerto es trasmitir directamente savia, agua, nutrientes y agentes
sistémicos que se pueden encontrar por los haces vasculares de una planta (patrón) a otra planta
(injerto). Teniendo en cuenta que el patrón son los materiales o variedades que se quieren evaluar y
como injerto se usa la variedad Col 2063 denominada Secundina altamente susceptible a la
enfermedad, donde se expresarán los síntomas de mosaico si la enfermedad está presente.
También se está utilizando para la detección de esta enfermedad la metodología desarrollada para la
detección del VCSY mediante (RT-PCR). Esta metodología cuenta con ventajas comparativas como son
la disminución del tiempo para la obtención de un resultado y la poca cantidad de tejido que se
necesita, lo que posibilita la indexación de material in vitro, permitiendo evaluar la totalidad de la
colección de yuca del banco de germoplasma del CIAT (Cuervo et al. 2009).
5.2.2.1 Procedimiento de la técnica de injerto.
Se deben tener listos todos los implementos necesarios para realizar la injertación (Figura 14).
13
Figura 14. Implementos para injertación: cuchillas desechables, papel parafilm, esqueje de secundina y
esqueje de material a evaluar.
El procedimiento es el siguiente:
1.
Cortar con bisturí dos esquejes del material a evaluar que contengan tres nudos y de igual forma
de la variedad indicadora Secundina (injerto) teniendo en cuenta que coincida con el diámetro
del patrón (Figura 15).
Figura 15. Corte bisel en la parte inferior de la secundina.
14
2.
Realizar un corte en bisel (transversal) tanto en el patrón como en el material a evaluar, teniendo
precaución de eliminar en los materiales a evaluar todas las yemas presentes, para evitar su
desarrollo y poder ver la expresión de síntomas en la Secundina (Figura 16).
Figura 16. Corte bisel en la parte superior del material y eliminación de yemas.
3.
Unir el esqueje del material y la Secundina, fijando fuertemente con cinta parafilm para asegurar
la unión de las dos estacas. Las yemas deben quedar apuntando hacia arriba (Figura 17). Cubrir
el injerto y sellar con cinta parafilm el extremo superior de la estaca del material indicador para
evitar su deshidratación (Figura 18).
Figura 17. Unión del esqueje del material a evaluar y la secundina.
15
Figura 18. Unión y cubrimiento del injerto con papel parafilm.
4.
Depositar el injerto en un frasco de vidrio estéril utilizando como sustrato agua destilada estéril
(Figura 19).
Figura 19. Injerto depositado en frasco de vidrio estéril con su identificación.
5.
6.
Incubar en cuarto de crecimiento a temperatura entre 25 - 27 0C y un fotoperiodo de 12 horas luz
y 12 horas oscuridad, cambiar el agua de los frascos cada dos a tres días.
Observar y registrar periódicamente la aparición de síntomas característicos de CSY (Clorosis,
enrollamiento en los bordes y mosaico) en las hojas de Secundina de los injertos. Al cabo de 45
días de incubación evaluar la presencia ó ausencia de la presencia de mosaico en el follaje del
injerto de Secundina. Documentar todo los resultados siendo positivos los que desarrollen los
síntomas característicos y negativos los que no presentan síntomas (Figura 20 y Figura 21).
16
Figura 20. Planta enferma con síntomas de CSY.
Figura 21. Planta sana sin síntomas de CSY.
5.2.2.2 Método molecular para el diagnostico del Virus del Cuero de Sapo de la yuca
La metodología utilizada para el diagnóstico de esta enfermedad se basa en una Reacción de la Cadena
de Polimerasa en Transcripción Reversa (RT-PCR del inglés Reverse transcription polymerase chain
reaction) que es una técnica que consiste en la síntesis de cDNA por medio de una retotranscriptasa o
transcriptasa reversa, seguido de una amplificación por medio de PCR (Polymerase Chain Reaction).
En la realización de esta técnica se siguen diferentes etapas: extracción de los ARN de cadena doble
(dsRNA), síntesis del DNA complementario (cDNA) y el RT-PCR.
5.2.2.2.1 Extracción de RNA de cadena doble (dsRNA)
La extracción del ARN viral de doble cadena (ARNcd) en plantas se realiza mediante un micro método
estandarizado por el grupo de trabajo del laboratorio de virología del CIAT basado en el método de
Morris et al. 1983. El procedimiento es el siguiente:
La preparación de todas las soluciones utilizadas se pueden leer en el Anexo 3.
•
•
Macerar 0.1gr de material vegetal con nitrógeno líquido. Colocar en tubos eppendorf de 1.5 ml.
Tener presente de colocar siempre controles positivos y negativos.
Adicionar a cada muestra 400 µl de buffer de extracción (VF 100ml STE10X 20ml, SDS10%10ml,
Agua 70µl, Bentonita 40 mg/ml en agua 100µl, 10 µl β-mercaptoetanol (añadir en el último
•
momento).
•
cloroformo-isoamilico en proporción 24:1 y homogenizar bien.
Adicionar a la muestra en cámara de extracción 200 µl de fenol saturado en 1x STE, 100 µl de
Agitar bien por 5 minutos.
17
•
•
•
Centrifugar a 4°C durante 15 min a 8000 g
Medir la fase acuosa (400 µl)
Adicionar la fase acuosa en un nuevo tubo de centrifuga que contiene 0.02 gr de celulosa CF-11 y
adicionar etanol a una concentración final del 16.5 %, agregándolo lentamente y en agitación (ml
•
etanol=0.195 X ml de muestra).
•
Centrifugar a 4°C durante 5 min a 8000 g
•
Después de cada lavado centrifugar por 2 minutos a 5000 g para separar bien las fases.
•
min a 8000 g. Repetir este paso tres veces
•
•
•
Lavar tres veces con 200 µl de STE 1X 16.5 % etanol hasta que la celulosa quede bien limpia.
Para recuperar los RNA de cadena doble: adicionar 200 µl de STE 1X y centrifugar a 4°C durante 5
Adicionar a los 600 µl extraídos 2 volúmenes de etanol y guardar a -20°C toda la noche.
Centrifugar a 4°C durante 30 min a 10.000g
Desechar el sobrenadante con cuidado y dejar secar el precipitado.
Resuspender en 25 µl de agua libre de RNAsas.
5.2.2.2.2 Síntesis de cDNA y RT-PCR
En la realización del RT-PCR se utilizan dos primers específicos que son: el primer F110
(TGGCCGGGAGAACAATAATA) y R1067 (GCGAAGTAAGTTCCGTCGTT), mediante los cuales se obtiene
un fragmento de 958 bases.
Para realizar la síntesis de cDNA se toman 10 µl del dsRNA purificado, se le adicionan 12 µl de agua
libre de RNAsas, y 2 µl del primer F110 en concentración de 10µmol. Esta mezcla se desnaturaliza a
100°C por 2 minutos, e inmediatamente se coloca en hielo para mantener el RNA linearizado.
Se toman 20 µl de esta solución y se le adiciona: 1µl transcriptasa reversa TR, 1 µl inhibidor de RNAsa,
6.0 µl de buffer 5x transcriptasa, 0.5 µl de DTT 0.1M, 1ul de DNTP’s 10mM. Se incuba en un
termociclador por 1 hora a 37 °C, y por último se inactiva la enzima incubando 10min a 70 °C.
Para la realización del PCR se utiliza 1 µl del cDNA sintetizado en el paso anterior, adicionándole las
siguientes soluciones: 18 µl de agua, 2.5 µl de buffer 10X para PCR, 2.0 µl de MgCl2 25mM, 0.5 µl de
DNTP’s 10mM, 0.5 µl de primer F110, 0.5 µl de primer R1067, y 0.2 µl de Taq polimerasa,
completando a un volumen final de 25 µl con agua estéril.
La reacción se realiza en un termociclador con una denaturación inicial a 94° C durante 5 min y 28
ciclos. Cada ciclo consiste de una desnaturalización a 94 °C durante 1 minuto, hibridación a 55 °C
durante 90 segundos y extensión a 72 °C durante 3min. Además se realiza una extensión final a 72 °C
durante 10 minutos.
En cada conjunto de experimentos se utilizan como controles negativos plantas sanas de la variedad
Secundina y blancos de la reacción con el fin de evaluar una posible contaminación.
18
Los productos del PCR son observados en geles de agarosa al 1,0%, corridos a 100 voltios por 1 hora
en buffer 0.5X TBE y teñidos con bromuro de etidio a una concentración de 1 mg/ml. Se consideran
positivas las muestras en que se observe el fragmento de 958 bases (Figura 22). Actualmente la tinción
se está realizando con SYBR safe en una concentración de 5 µl/20 ml.
Figura 22. Gel de agarosa teñido con bromuro de etidio, en donde se observan: M: Marcador de peso
molecular 1KB, Control (+), Control (-), S: Plantas sanas, E: Plantas enfermas con CSY.
6. Documentación de resultados de la indexación de yuca
Después de tener los datos obtenidos en las diferentes pruebas realizadas se procede a registrarlos en
la base de datos siguiendo el siguiente procedimiento:
Se debe primero que todo ingresar a la base de datos de la URG introduciendo el Nombre de Usuario y
Clave Personal, correspondiente al personal encargado, seleccionar la opción YUCA. Seleccione el icono
SANIDAD para introducir los datos de los resultados de indexación obtenidos en el proceso (Figura
23).
19
Figura 23. Interfase de entrada a la base de datos de la URG. 1) Selección opción YUCA.
2) Distribución, 3) Invernadero Bonsái, 4) Sanidad.
En la siguiente pantalla se debe:
1.
Introducir el número de accesión de la plántula analizada.
3.
Ingresar la fecha de la obtención del resultado.
2.
4.
5.
6.
7.
8.
Seleccionar la casilla NOMBRE (automáticamente aparecerá en forma abreviada los nombres de
los virus de yuca) escoja la forma abreviada del virus al cual se le hizo la prueba, de la siguiente
forma: CsXV para el Virus X de la Yuca, CsCMV para el Virus del Mosaico Común de la Yuca y FSD
para el Virus Cuero de Sapo de la Yuca (Figura 24).
Ingresar el(los) resultado(s) obtenido(s), ya sean positivos o negativos, de las pruebas realizadas
para CsXV, CsCMV y FSD, según el caso.
Ingresar en la casilla, el método utilizado para indexación ya sea INJERTO o RT-PCR para CSY o
ELISA para CsXV y CsCMV.
Seleccionar en la casilla Responsable, la persona encargada en realizar la indexación
Automáticamente el sistema da como disponible el material que tenga ingresados y negativos los
resultados para los análisis de los tres virus (CsXV, CsCMV y CSY). Las accesiones no disponibles
son todas aquellas que les hacen falta pruebas o que han resultado positivas para alguna de ellas.
Guardar los datos almacenados.
20
Figura 24. Interfase de SANIDAD. Proceso de introducción de resultado en el banco de datos de sanidad
de yuca, datos a introducir: 1) Numero de accesión, 2) Nombre virus, 3) Fecha de obtención de
resultados, 4) Resultado obtenido (N/P), 5) Método de indexación (Elisa/Injerto), 6) Responsable de la
prueba. 7) Casilla de chequeo que indica que accesión está disponible con un visto bueno (√) o de lo
contrario no disponible 8) Guardar.
9.
10.
Enviar una copia de los resultados obtenidos al personal encargado del Banco de Germoplasma
de Yuca del banco de germoplasma
Documentar los resultados en tablas Excel en medio magnético e impreso. Conservar una copia
física de los resultados obtenidos por el lector de ELISA para CsXV y CsCMV. Para el caso del
virus FSD conservar una documentación fotográfica donde se puedan observar los criterios de
resultados.
7. Establecimiento de la colección de yuca miniatura o bonsái
Aprovechando las plantas establecidas en el invernadero, para la certificación mediante la injertación a
Secundina (proceso que fue explicado en el punto 5.1 de este manual), y con el fin de no descartar el
material sano establecido, se decidió conservar una colección miniatura de yuca.
Después de que las plántulas establecidas se certifiquen y queden disponibles o aceptadas
sanitariamente para todas las pruebas, se prosigue a conservarlas en un invernadero específico en
donde se mantienen como colección Bonsái.
Esta colección se conserva con tres objetivos principales:
1.
2.
3.
Tener una copia de seguridad alterna del banco in vitro.
Tener disponibilidad inmediata de material vegetal para hacer extracción de ADN y constituir el
banco de ADN
Tener material de siembra disponible, en el caso de ser requerido rápidamente por los científicos
para trabajos de investigación.
21
8. Bibliografía
Alvarez, E., G.A. Mejía, Llano, J.B. Loke, A. Calari, B. Duduk, A. Bertaccini, A. 2009. Characterization of a
phytoplasm associated with frogskin disease in cassava. Plant Dis. 93:1139-1145.
Calvert, L.A., M. Cuervo, M.D. Ospina, C. Fauquet, B.C. Ramírez. 1996. Characterization of cassava
common mosaic virus and a detective RNA species. Journal of General Virology, 77: 525-530.
Calvert, L.A., M. Cuervo. 2002. Enfermedades Virales de la Yuca en América del Sur. Capítulo 16 de la
Obra “La Yuca en el tercer Milenio. Sistemas Modernos de Producción, Procesamiento, Utilización
y Comercialización”. Producida por el CIAT y el Consorcio Latinoamericano y del Caribe de
Apoyo a la Investigación y Desarrollo de la Yuca (CLAYUCA), pp. 262-268.
Calvert, L., M. Cuervo, I. Lozano, N. Villareal, J. Arroyave. 2008. Identification of three strains of a virus
associated with cassava plants affected by frogskin disease. Journal of Phytopathology 156: 647653.
Costa, A.S. 1940. Observacoes sobre o mosaic comun e o mosico das nervaduras da mandioca (Manihot
utilisima Pohl.) Journal de Agronomía (Piracicaba) 3(3): 239-251.
Costa, A.S., E.W. Kitajima. 1972. Studies on virus and mycoplasma diseases of the cassava plant in
Brazil. En: Cassava Mosaic Worshop, Ibadan Nigeria. International Institute of Tropical
Agriculture (IITA), Ibadan, Nigeria, pp. 18-36.
Cuervo, M., G. Mafla, E. Aranzales, D. Debouck. 2009. Comparación de dos metodologías de diagnóstico
para la detección del virus del cuero de sapo de la yuca (VCSY). XXIX Congreso Nacional de
Fitopatología y Ciencias Afines, Ascolfi. Medellín, Colombia.
Frison, E.A., E. Feliu. 1991. FAO/IBPGR. Technical guidelines for the SAFE Movement of Cassava
Germplasm. Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome/International Board
for plant Genetic Resources/Rome and Centro Internacional de Agricultura Tropical-CIAT, pp.
11-29.
Kitajima, E.W., C. Wetter, A.R. Oliveira, D.M. Silva, A.S. Costa. 1965. Morfologia do virus do mosaic
common da mandioca. Bragantia 24(21): 247-260.
Lennon, A.M., M.M. Aiton, B.D. Harrison. 1986. Cassava viruses from South America. In Annual Report
1985. Scottish Crop Research Institute, Dundee, United Kingdom, pp. 167.
Lozano, J.C., B.L. Nolt. 1989. Pest and pathogens of cassava. En: Plant Protection and Quarantine:
Selected Pests and Pathogens of Quarantine Significance Vol. 2 R.P. Kahn, ed., CRC Press, Pr. Inc.,
Boca Raton FL, USA, pp. 174-175.
Mafla, G., J.C. Roa, W.M. Roca. 1984. Erradicación de la enfermedad cuero de sapo de la yuca Manihot
esculenta, por medio del cultivo de meristemos. Efecto de la termoterapia, y del tamaño del
explante sobre la tasa de saneamiento. En: Perea D. & Angarita, Z.A. eds. Congreso Nacional de
Cultivo de Tejidos Vegetales, Bogotá, Colombia, 1984. Memorias. Bogotá, U. Nacional de
Colombia, pp. 171-175.
22
Morris, T.J., J.A. Dodds, B. Hillman, R.L. Jordan, S.A. Lommel, S.J. Tamaki. 1983. Viral Specific dsARN:
Diagnostic value for plants Virus disease Identification Plant Molecular Biology Reporter 1: 2730.
Pineda, B., U. Jayasinghe, J.C. Lozano, J.C. 1983. La enfermedad "Cuero de Sapo" en yuca (Manihot
esculenta Crantz). ASIAVA 4: 10-12.
Roca, W.M., B. Nolt, G. Mafla, J.C. Roa, J. ReyesJ. 1991. Eliminación de virus y propagación de clones en
la yuca (Manihot esculenta Crantz). En: Roca, W.M., Mroginski, L.A. (eds.), Cultivo de tejidos en la
agricultura: Fundamentos y Aplicaciones, pp. 403-421.
Velasco, A.C., B. Pineda, B.L. Nolt. 1985. Prueba inmunoenzimática (ELISA) para la detección de virus.
Programa de virología de yuca CIAT, Cali, Colombia, 4p.
Silberschmid. K.O. 1938. O mosaico da mandioca. Biológico 4(6): 177-181.
23
9. Anexos
9.1 Anexo 1
Esquema utilizado en el LSG para la distribución de muestras en las pruebas de ELISA.
ELISA FECHA____________________________________________________
Placa No._____________________
1
2
3
4
5
6
Control (+)
Blanco
Control (-)
7
8
9
Control (+)
Blanco
Control (-)
10
11
12
A
B
C
D
E
F
G
H
24
9.2 Anexo 2
Preparación de soluciones para la realización de la técnica de ELISA.
Todas las soluciones deben mantenerse a 4-6 °C.
Buffer PBS (pH 7.4)
Cloruro de sodio
Fosfato de potasio monobásico
Fosfato de sodio dibásico 12 hidratado
Cloruro de potasio
Volumen final con agua destilada
Buffer PBS-Tween
Buffer PBS + 0.5 ml Tween-20 por litro
8.0 g
0.2 g
2.9 g
0.2 g
1l
Buffer de cubrimiento utilizado en la ELISA de doble sándwich (DAS ELISA) pH 9.6
Carbonato de sodio anhidro
0.318 g
Bicarbonato de sodio
0.586 g
Volumen final con agua destilada
200 ml
Preparar solución fresca cada semana
Buffer de muestras para DAS ELISA (antígeno)
Polivinil-pirrolidona, PVP 40.000 MW
Sulfato de Sodio anhidro
Ovoalbumina
Volumen final con PBS-Tween
Buffer de conjugado para DAS ELISA
Seroalbumina bovina
Volumen final con PBS-Tween
10 g
0.65 g
1g
500 ml
0.5 g
250 ml
25
9.3 Anexo 3
Preparación de soluciones para la realización del Método molecular para el diagnóstico del Virus del
Cuero de Sapo de la yuca
Buffer 1x STE.
Preparar una solución 10x y diluir cuando se vaya a utilizar.
Cloruro de sodio
58.0 gr
Tris Base
61.0 gr
Sodio-EDTA
3.7 gr
pH (con HCl concentrado)
6.8
Volumen final
1 litro
Buffer 1x STE : 16.5% etanol absoluto
10x STE
Etanol
Volumen final
Buffer de Extracción
10x STE
Sulfato de Sodio dodecilo al 10%
Bentonita al 1%
2-Mercaptoetanol
Volumen final
100 ml
165 ml
1 litro
20 ml
20 ml
10 ml
0.5 ml
100.0 ml
Fenol saturado en Buffer 1xSTE
El fenol redestilado se disuelve a 60 grados centigrados y se mezcla con 2 volúmenes del buffer 1x STE.
Se agita y se deja en reposo durante 10-15 minutos hasta que haya separación de fases; se descarta la
fase del buffer y el fenol es lavado por dos veces mas de igual forma.
26