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Ecología, composición y fisiología de la Microbiota
Prof. Dr. Benito Regueiro, Servicio de Microbiologia, Hospital
Álvaro Cunqueiro, (EOXI Vigo). Facultad de Medicina,
Universidad de Santiago (USC)
Definiciones
Microbiota: Microorganismos que viven en un entorno dado (según Joshua
Lederberg).
Microbioma (metagenoma): Comunidad ecológica de microorganismos comensales,
simbióticos o patógenos que comparten un espacio de nuestro cuerpo y han sido
ignorados como determinantes de salud o enfermedad.
Visión convencional
Los estudios realizados por cultivo, amplificación de 16S-rRNA y secuenciación y el
uso de la espectrometría de masas han ampliado espectacularmente la capacidad de
nuestras bases de datos para la identificación.
En 1980 se habían reconocido, oficialmente, 1.791 especies bacterianas.
En la actualidad nuestras bases de datos para la identificación contienen más de
12.000 especies.
Clásicamente los métodos de identificación eran fenotípicos y se basaban en nuestra
capacidad de cultivo, el uso de sistemas moleculares;
secuenciación 16S-rRNA o la de los genes rpoB (para la
caracterización de Enterobacteriaceae, Staphylococcus,
Streptococcus y aerobios grampositivos, Mycobacteras,
Leptospira, Corynebacterium y Spirochaetas) o superoxido
dismutasa (SOD) (para Streptococcus y Coxiella) o el gen Tuf
(para Staphylococcus coagulasa negativos) o el gap o NGS, han incrementado
nuestra capacidad de estudio e identificación de especies microbianas.
A finales del siglo XIX la Microbiología Clínica se basaba principalmente en el cultivo
puro, lo cual condicionaba un tiempo de respuesta de 24-48 horas y estaba
condicionada por la base de datos de solo los microorganismos cultivables.
Lo que entendemos por infección y
enfermedad infecciosa se deriva del
conocimiento científico marcado por los
postulados de Koch y de lo que es
cultivable, pero, por fin, hoy día, podemos
enfrentarnos al reto del tiempo y al de la
microbiología que no podíamos cultivar.
En 1970 C. Woese, basándose en los genes
ribosómicos, definió tres dominios de seres vivos: Bacteria, Archaea y Eukarya.
Excluyó los virus porque no tienen esos genes y no los consideraba seres vivos. Pero,
los virus gigantes comparten muchas características con otros microorganismos.
En 2013, con descubrimiento de Mimivirus y otros Megavirales, que son microbios,
aparece una nueva clasificación de microorganismos: los TRUC (Things Resisting
Uncompleted Classifications - cosas que resisten clasificaciones incompletas-)
Didier Raoult. TRUC or the need for a new microbial classification. Intervirology 2013; 56: 349353. doi: 10.1159/000354269
Métodos de estudio de la microbiota (Flora normal)
Metagenómica: El numero de especies de procariotas se estima sea de 10 millones,
hoy conocemos unas 14 000 gracias al uso de la secuenciación tras amplificación de
16S-rRNA. Son unidades operacionales taxonómicas.
Los estudios por secuenciación de microbiota están ciegos a cantidades de <105
bacterias/g (límite de resolución). Bacterias que pueden estar en minoría incluyen
patógenos importantes como Salmonella typhi, Tropheryma whipplei y Yersinia
enterocolitica
Lagier JC et al. Microbial culturomics: paradigm shift in the human gut microbiome study. Clin
Microbiol Infect 2012; 18: 1185-1193. doi: 10.1111/1469-0691.12023.
Cultivómica: La diversificación de las condiciones de cultivo asociado a identificación
por MALDI-TOF MS para incrementar el repertorio de aislamientos bacterianos pueden
detectar aproximadamente el mismo número de especies.
Los estudios con técnicas de cultivo y de no-cultivo de forma concomitante han
demostrado que solo un 15% de las especies bacterianas son susceptibles de
resolución por los dos métodos.
El uso de cultivos y secuenciación 18S-rRNA ha extendido los repertorios a
Eucariotas y la filtración y co-cultivo sobre Protistas de vida libre asociado a cultivo de
alto rendimiento incluye al Megaviroma.
Las procariotas del sistema intestinal
El ecosistema intestinal consta de 1011-12 bacterias/g. Tenemos unas 400-500
especies diferentes.
Por cultivo hay predominio de bacterias grampositivas y anaerobios; sin embargo,
con la tinción con el método de Gram el predominio es de los gramnegativas,
discrepancia ya bien mostrada por Staley y Konopka en 1985.
Staley JT, Konopka A. Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in
aquatic and terrestrial habitats. Ann Rev Microbiol 1985; 39: 321-346.
Por técnicas moleculares, como el uso sucesivo de secuenciación 16S-rRNA y
secuenciación masiva (NGS), el 80% de las bacterias detectadas no se podían
cultivar. Las limitaciones de la diana 16S-rRNA son carencia de sensibilidad con
géneros específicos, dificultades cuando hay similitud interespecies, y heterogeneidad
en las secuencias de especies que tienen más de una copia. Tenemos capacidad de
detección de 120 phyla, 31 cultivables. La NGS ha demostrado 2 phyla dominantes
(Firmicutes y Bacteroides), de ellos Ruminococcaceae, Lachnospiraceae (esp.:
productoras de butirato), Clostridiaceae, y Bacteroidaceae son difíciles de cultivar.
Por cultivómica, usando el MALDI-TOF de 32 500 colonias desde 212 condiciones
de cultivo diferentes, dio 340 especies de 7 phyla y 117 géneros (2 phyla raros, 5
hongos y un virus gigante).
Simplificaciones en el numero de condiciones (70 (todos los cultivables) o 18 con
subcultivos cada 3 días, 717 especies de 7 phyla y el uso de taxono-genómica y la
identidad media genómica de secuencias genéticas ortólogas (AGIOS) ha permitido
incrementar el numero de especies cultivables.
El microbioma identificado por cultivómiva incluyó 174 especies nunca descritas
previamente en el intestino humano, incluyendo 31 nuevas especies y géneros para
los cuales los genomas fueron secuenciados, generando 10 000 nuevos genes
desconocidos (ORFans), que ayudarán en futuros estudios moleculares. Entre éstas,
la nueva especie Microvirga massiliensis que tiene el genoma bacteriano más grande
hasta ahora obtenido de un ser humano, y el virus Senegal, el virus más grande
registrado en el intestino humano. El análisis metagenómico concomitante de las
mismas muestras produjo 698 filotipos, incluyendo 282 especies conocidas, 51 de las
cuales se superponían con el microbioma identificado por cultivómica. Así, cultivómica
complementa la metagenómica superando el sesgo de profundidad inherente en los
enfoques metagenómicos.
Lagier JC, et al. Microbial culturomics: paradigm shift in the human gut microbiome study. Clin
Microbiol Infect 2012; 18: 1185-1193. doi: 10.1111/1469-0691.12023
Entre los phyla cultivables en el intestino humano se encuentran familias de 23
Actinobacteria, 6 Bacteroidestes, 24 Fimicutes, 31 Proteobacteria, y otras 10 familias
de los phyla Chlamydiae, Deinococcus, Fusobacteria, Lentisphaerae, Spirochaetes,
Leptospiraceae, Synergistetes, Tenericutes, Verrucomicrobia y Euryarchaeota.
Hugon P et al. Repertoire of human gut microbes. Microb Pathog 2016; doi:
http://dx.doi.org/10.1016/j.micpath.2016.06.020.
Los eucariotes
En el intestino se encuentran cinco grupos: Amoebozoa, Opisthokonta, Excavata,
Sar, y Archaeplastida.
Entre los Eucariotes cultivables en el intestino, el grupo más abundante son los
hongos, aunque su presencia es baja y generalmente asociada a enfermedad. Entre
los taxones de Fungi se encuentran 61 Ascomycota, 17 Basidiomycota y 4
Zygomycota.
Adl SM, et al. The revised classification of eukarytes. J Eukaryot Microbiol 2012; 59: 429-514.
Hugon P et al. Repertoire of human gut microbes. Microb Pathog 2016; doi:
http://dx.doi.org/10.1016/j.micpath.2016.06.020.
Las arqueas
Aunque habitualmente se encuentran en ambientes
extremos, las especies mesofílicas son diversas y habitan
ambientes comunes.
En el intestino se han aislado 8 especies:
Methanobrevibacter ruminantium, Methanobrevibacter smithii, Methanosphera
stadtmanae, Methanomassiliicoccus luminyensis, Methanobrevibacter oralis,
ethanomethylophilus alvus, Methanomas siliicoccus intestinales y Methanobrevibacter
arboriphilicus.
Usando la secuenciación del 16S-rRNA y las secuencias de los genes amoA y mcrA
se han detectado otras arqueas como Sulfolobales, Nitrososphaerales,
Methanosarcinales, Methanomicrobiales, y dos bacterias halofílicas del phylum
Euryarchaeota usando DGGE (electroforesis en gel de gradientes desnaturalizantes).
Viroma (ecosistema intestinal 109 VLP /g)
Este ecosistema contiene virus procarióticos (bacteriófagos) y eucarióticos. Los
primeros incluyen Caudovirales (dsDNA) y Microviridae (ssDNA). El titulo es de 1.1
en relación con las bacterias. Hay virus clásicos DNA y RNA , y algunos virus
asociados a la alimentación que son de origen vegetal.
Los virus gigantes de las amebas se han
descubierto los últimos 12 años, los primeros los
Mimivirus. Hasta ahora se han descrito 6 familias
asociadas con virus dsDNA como Poxvirus,
Asfarvirus, Irido/ascovirus o Phycodnavirus, son
ubicuos y visibles en el microscopio, la mayoría se
han co-cultivado con Acanthamoeba y cada vez
vemos más en las heces humanas.
Carga microbiana del intestino
«Nuestro intestino es un medio rico en nutrientes contiene 100 billones (1014)
microorganismos.
Hoy viven en el planeta 6.500 millones de individuos, esto supone un reservorio
intestinal de unas 1023-1024 células microbianas. Este número solo es cinco órdenes
de magnitud menor que la vida contenida por los Océanos. Para los
microorganismos, el hombre representa el segundo hábitat de nuestra
biosfera.»
Whitman WB, et al. Prokaryotes: The unseen majority PNAS 1998; 95: 6578-6583.
Levy RE, et al. Ecological and evolutionary forces shaping microbial diversity in the human
intestine. Cell 2006; 124: 837-848.
Además, puede haber transferencia génica lateral entre bacterias y eucariotas. Así,
por ejemplo, Wolbachia pipientis, que es un endosimbionte por herencia materna que
infecta artrópodos (20% de los insectos), filarias y su transferencia se ha observado en
el escarabajo del frijol (Callosobruchus chinensis) y en el nematodo Onchocerca.
Por otro lado, se han visto insertos desde >1 Mb (genoma completo) a <500 bp
en Drosophila ananassae.
Dunning Hotopp JP, et al. Widespread lateral gene transfer from intracellular bacteria to
multicellular eukaryotes. Science 2007; 317: 1753-1756.
Fisiología y microbiota («segundo genoma»)
Los taxa microbianos del intestino se relacionan con genes del huésped en: sentido
de la dieta, metabolismo e inmunidad.
El microbioma expande las potencialidades fisiológicas del huésped en capacidad
digestiva, reto inicial al sistema inmunitario, producción de vitaminas, degradación de
xenobióticos y resistencia a la colonización de patógenos.
Heredabilidad (no herencia -transmisión vertical-) es la proporción de varianza en un
rasgo del huésped que se explica más por razones genéticas que por efectos
ambientales.
Cuando la función se restringe filogenéticamente a un solo taxa, las asociaciones de
los alelos del huésped y las abundancias taxonómicas son lógicas.
Ejemplos: Christensenellaceae (Firmicute) con bajos niveles de triglicéridos o
metanogénesis con Euryarchaeota; Bifidobacterium y genes LCT (persistencia de
lactasa); Turicibacter y Peptostreptococcaceae con susceptibilidad a
hepatocarcinomas múridos; Akkermansia y delgadez (cromosomas 2 y 7) y lectina
para sialico SIGLEC15 y PLD1(vilus)
- La Dieta ha sido clave en la evolución del «Homo sapiens»
Los Australopithecus divergieron de los monos prehistóricos hace 4,4 MYA, cambio
asociado a frutas y semillas.
El Homo erectus apareció hace 2 MYA, «hipótesis de la abuela» (tribu Hadza –Rift-)
El Homo sapiens (Pleistoceno (2,5 MYA a 10000 AC), asociado a la carne «hipótesis
del tejido caro», con el cerebro mas grande.
El gen de la amilasa salival (AMY1) se duplica en relación con el del chimpancé.
La tolerancia a la lactosa se asocia con las comunidades ganaderas del Neolítico.
La diversidad de las cepas de Helicobacter pylori se asocia a las migraciones del
Homo sapiens.
Las concentraciones urinarias de co-metabolitos de la microbiota y el huésped, como
el hipurato, la fenil-acetil-glutamina y las metil-aminas diferencian las poblaciones de
Asia y Occidente.
Hay diferencias en las comunidades del microbioma y las comunidades libres
de microbiota.
- El sistema inmunológico adaptativo y la presión selectiva, condicionan la codiversificación.
- Un ambiente bioquímico único. El intestino es muy especial, combina alta
abundancia y flujo de polisacáridos, en un ambiente anóxico con temperatura
controlada constante.
En un mundo que pierde la biodiversidad, esta está representada como un
«supra-organismo» en nuestros intestinos.
Como conclusiones, en un mundo que pierde la biodiversidad, el microbioma
está representado como un «supra-organismo» en los intestinos de nuestro propio
cuerpo que hay que conocer y preservar.
Hoy día, por fin, con los nuevos conocimientos científicos y técnicas, podemos
enfrentarnos al reto del tiempo y al de la microbiología que antes no podíamos
cultivar