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Retrovirus: HTLV
Infecciones Virales Transmisibles por Vía Transfusional: Hitos,
Paradigmas, Aprendizajes. Fundación Hemocentro Buenos Aires
7 de Noviembre de 2013
PRIMEROS RETROVIRUS HUMANOS
• HTLV-1 (Gallo et al, 1979)
• Paciente con leucemia T del adulto
(ATL)
• HTLV-2 (Kalyanaraman et al, 1982)
• Paciente con leucemia de células vellosas
(Hairy cell leukemia)
Homología 65%
HTLV
Familia: Retroviridae
Subfamilia: Oncovirinae
Virus: BLV (Bovine Leukemia Virus)
HTLV (Human T cell Leukemia Virus)
STLV (Simian T cell Leukemia Virus)
TRANSMISION
ALTAMENTE ASOCIADA A CÉLULAS
• Sexual (60% hombre a mujer vs. 1% mujer a hombre)
• Perinatal
• 18-30% principalmente por lactancia (> 6m)
• 3% sin lactancia
• Transfusión de componentes sanguíneos celulares
(40-60%)
• Por compartir agujas contaminadas con sangre
infectada
TRANSMISION: Nuevas Pesquisas
• En órganos y tejidos para transplante
• Células Hematopoyéticas de sangre de cordón
umbilical para donación de BSCU
Nuevos Desafíos
Detección en mujeres embarazadas
Bancos de Leche y Lactarios
HTLV-1: Patología de la infección
• Leucemia/linfoma de células T del Adulto (ATL)
• ~ 5% de los individuos infectados, 20 y 40 años post-infección
• Linfocitosis T, linfopatía, hepatoesplenomegalia, hipercalcemia,
lesiones cutáneas por infiltración leucémica
• Infección perinatal es un factor de riesgo importante
• Las células “flower” se asocian con un estado de alto riesgo
• Hombre: mujer: 1,4:1
Tulane Med Center
HTLV-1: Otras patologías asociadas
Uveítis
Dermatitis
Artropatías
HTLV-1: Patología de la infección
• Mielopatía asociada a HTLV-1 / Paraparesia
Espástica Tropical (HAM/TSP)
• Enfermedad neurodegenerativa
• 0.25-2 % de los infectados, 40 años
• Lesiones neurológicas, inflamación crónica de la médula
espinal
• Progresiva debilidad de los miembros inferiores,
espasticidad, distorsiones sensoriales, incontinencia
urinaria
• Desarrollo rápido asociado con transfusión sanguínea
• La infección en la edad adulta sería un factor de riesgo
• Hombre: mujer:1:3
HTLV-2
Muy pocos casos asociados con leucemia a células
vellosas
Se ha asociado a síndromes neurológicos similares a
HAM/TSP
No se ha establecido su rol etiológico
NUEVOS RETROVIRUS HUMANOS
• HTLV-3: varios aislamientos en pigmeos en África
Central
• HTLV-4: 1 sólo aislamiento en África
• Evidencias de transmisión simio-humano (cazadores)
• No hay datos de prevalencia en poblaciones o bancos
de sangre ni sobre riesgo de transmisión o enfermedad
Características Epidemiológicas
Aumento de la seroprevalencia con la edad
Infancia 20-30a 60a
Mayor prevalencia en MUJERES (> 40 años)
Hombre/Mujer 4 > Mujer/Hombre
PREVALENCIA
HTLV-1
•
•
•
•
•
Sudoeste de Japón
Caribe
Parte de Oceanía (Nueva Guinea)
África Central y Occidental
Regiones de América del Sur (Brasil, Colombia,
Argentina, Perú, Bolivia, Uruguay, Guyanas Francesas y
Chile)
• Medio Oriente
PREVALENCIA
HTLV-2
• Poblaciones originarias de América (Panamá,
Nuevo México, Florida y Brasil)
• Tribus pigmeas de África Central
• Usuarios de drogas inyectables (UDIs)
Distribución Mundial
(15-20 x 106 de personas infectadas)
HTLV-1 endémico
• HTLV-1 aislados
HTLV-2 endémico
• HTLV-2 aislados
HTLV y Bancos de Sangre
Tamizaje de anticuerpos:
•
•
•
•
Japón: 1986
Estados Unidos y Caribe: 1989
Francia: 1991
Países del Norte de Europa: 1993 y
1994
• Argentina 2002 (Ley Nacional 2005)
Circulación de HTLV en Argentina
HTLV-I/II en UDIs en Ciudad de Bs As.(Libonatti et al)
1989
HTLV-I/II en otros grupos de riesgo
(HSH, trabajadoras sexuales, hemofílicos)
1992
HTLV-I/II en Bancos de Sangre Ciudad de
Bs As (Bouzas et al)
1993-1999
HTLV-II en grupos de Tobas y Wichis
(Chaco)
Alta prevalencia de HTLV-I en nativos de
Jujuy con focos de HAM/TSP
Casos intrafamiliares y esporádicos de
ATL y HAM/TSP en Bs As
Prevalencia en Argentina
HTLV-1: Región de alta prevalencia en el Noroeste
(Jujuy, Salta, Formosa) ∼ 0.8%.
Región del centro ∼ 0.04 - 0.15%
HTLV-2: Poblaciones originarias del Norte (Salta,
Formosa y Chaco (Tobas, Matacos, Wichis, Chorotes)
HTLV-1 y HTLV-2:
Grupos de riesgo: UDIs, HSH, trabajadoras sexuales
Co-infección con HIV
Prevalencia de HTLV-1/-2 en donantes de sangre
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Caribe
Estados Unidos
Grecia
Argentina: Bs. As
Reino Unido
Francia:
Holanda
España
Suecia
Alemania
0.2%
0.016- 0.025%
0.02%
0.02-0.04%, Jujuy: 0.81%
0.005%
0.004%
0.002%
0.002%
0.002%
0.001-0.004%
HTLV-1/-2 en Banco Público de Referencia Nacional de
Sangre de Cordón Umbilical (BSCU)
Prevalencia de HTLV-1 5/3786 (0.13%)
BSCU: Dras Gamba, Remesar, del Pozo, 2013
Diagnóstico de la Infección
Pruebas serológicas
Aglutinación de partículas de gelatina
Enzimoinmunoanálisis
Inmunofluorescencia indirecta
Inmunoblotting (Western Blot)
Inmunoensayo en línea (LIA)
Pruebas serológicas confirmatorias
• WB preparados con lisados virales de HTLV-1 con el agregado de
antígenos de envoltura recombinantes
• Agregado de glicoproteínas externas recombinantes propias de
HTLV-1 y HTLV-2, que permite la diferenciación
• Desarrollo de la proteína env recombinante: GD21
Alto porcentaje de pruebas indeterminadas
Western blot
rgp46 I
rgp46 II
p36
p32
p28
p26
p24
p19
GD21
InnoLia
(Inmunoensayo en Línea,
InnoGenetics)
Western Blot
WB
Positivo
Indeterminado
Negativo
Informe:
HTLV-I
Informe:
Negativo
HTLV-II
HTLV-I/II
Pruebas moleculares: PCR
HTLV 1 y 2
• Son virus ARNss
• Tropismo por células T CD4+
• Infección persistente:
Integración no específica en el genoma (Provirus)
Baja producción de virus libre
•
Replicación viral ocurre con la división celular
baja tasa de replicación
Alta Estabilidad
Genética
alta fidelidad de transcripción
MODELO DE ENTRADA DE HTLV 1
• Complejo de 3 receptores ?
Proteoglicanos de heparan sulfato (HSPGs)
Neurofilina (NRP1)
Transportador de Glucosa (GLUT1)
Ghez et al, Retrovirology 2010
GENOTIPOS DEL HTLV-1
a) Cosmopolita
Transcontinental (A)
Japonés (B)
Africano Occidental (C)
Africano del Norte (D)
Peruano de Origen Africano (E)
b) África Central
c) Melanesia
d) Contiene aislamientos de Gabón y de Camerún
e) Aislado en un pigmeo Efe Mbuti del Congo
f) Aislado en un individuo en Gabón
g) Recientemente descripto en África Central
LTR
GENOTIPOS DEL HTLV-1
a) Cosmopolita
Transcontinental (HTLV-1aA):
Caribe, Japón, África del Sur, Irán, Rusia…
Japonés (HTLV-1aB)
Africano Occidental (HTLV-1aC): África occidental y cuenca del Caribe
Africano del Norte (HTLV-1aD): Marruecos, Argelia y Mauritania
Peruano de Origen Africano (HTLV-1aE): Perú
En Argentina: HTLV-1aA (Jujuy y Ciudad de Buenos Aires)
Posibles hipótesis del origen del HTLV-1
en América del Sur
1) Origen Africano (siglo XVI al XIX):
*Alta prevalencia de acs anti HTLV-1 en población negra de África y
de América del Sur. Similitud de secuencia de aa en el gen env
pero no en LTR.
*Aislamientos del Caribe tienen semejanza con los del Oeste de
África
2) Origen Asiático: población de Mongoles introdujo el virus tanto a
Japón hace 10000 años como al Nuevo Mundo por el estrecho de
Bering.
3) Origen Japonés: por migraciones recientes vía Océano Pacífico.
GENOTIPOS DEL HTLV-2
HTLV-2A: América del Norte y UDIs Europeos y sus parejas
sexuales
HTLV-2B: Nativos americanos
HTLV-2D:Tribu Africana: Mbuti Efe Pigmy
DESAFIOS
Limitada información sobre la epidemiología y la
historia natural de la infección por HTLV
Limitado acceso a pruebas serodiagnósticas
(confirmatorios) en varias areas
Desempeño de las pruebas diagnósticas
Alta proporción de resultados indeterminados
por tamizaje
Diagnóstico molecular y tipificación viral
MUESTRA: Sangre periférica anticoagulada con EDTA
10% (ADN extraído de PBMC)
METODOLOGIA:
PCR –RFLP
PCR anidada
PCR en tiempo real
Tipificación del HTLV-1 y –2
PCR-RFLP: tax
128pb
Taq 1α
Sau 3A
128pb
104pb
24pb
122pb
69pb
53pb
6pb
HTLV-2
TAX/REX
HTLV -1
HTLV-2
6pb
HTLV-1
Tipificación del HTLV-1 y –2
PCR anidada: pol
1ra RONDA
12P1/SK111
398bp HTLV-1/2
2da RONDA
2P3/1P1/12P5
318bp HTLV-1
(1P1/12P5)
161bp HTLV-2
(2P3/12P5)
Human T Lymphotropic Virus Types I and II Proviral
Sequences in Argentinian Blood Donors With Indeterminate
Western Blot Patterns.
Mangano A, Remesar M, del Pozo A, Sen L. Journal of Medical Virology 2004
Población de estudio =106.791 DS
Período = 1993-2004
WB
RR
Prevalencia
%
Total
I+
PCR
II+
Indet.
Neg
Indet.
112
0.102
52
1
1
3 (6%)
47 (90%)
I+*
32
0.030
18
18
0
0
0
II + **
14
0.013
9
0
9
0
0
Neg
24
0.022
8
0
0
0
8
Total
182
0.170
87
19
10
3
55
* Indeterminado vs. HTLV-I, p=0.01; **Indeterminado vs. HTLV-II, p<0.001.
DESAFIOS
Algoritmos alternativos para confirmación
diagnóstica métodos de biología molecular
no están disponibles para uso de rutina
falta de estandarización y control de calidad
limitaciones operacionales: protocolos de PCRanidadas. Actualmente disponibilidad de PCR
en tiempo real
MARCADORES PRONÓSTICOS
CARGA PROVIRAL (Taylor et al, 99)
Expansión monoclonal de células infectadas
T CD4+ (Takemoto et al, 94)
Susceptibilidad Genética (Jeffery et al, 99)
Monitoreo de la infección:
Cuantificación de la carga proviral de
HTLV-1 por
PCR en tiempo real
Características de la infección
Transcripción reversa del ARN viral
Integración del ADN proviral en el LT
Propagación de la infección
expansión clonal de los linfocitos infectados con
expansión del ADN proviral
transferencia del genoma viral por contacto
directo entre célula infectada y no infectada
Escasa producción viral
Medición de carga proviral
(CPV) en CMT
∼10 a más 100.000 copias /106 CMT
Carga Proviral de HTLV
Alta CPV factor de riesgo de progresión de enfermedad
CPV de HTLV-1 es mayor en pacientes sintomáticos que
asintomáticos
Altas CPV se asocia con mayor riesgo de HAM/TSP y ATL
Infecciones parasitarias o el tratamiento de infecciones
concurrentes como HIV que estimulan la proliferación
linfocitaria, producen un aumento de la expansión clonal y
mayores CPV
Identificación y cuantificación de
HTLV por PCR en tiempo real
SYBR GREEN
Diluciones seriadas 1/10
Curva de Melting
Identificación y cuantificación de
HTLV por PCR en tiempo real
Sondas Taqman
Monitoreo de la infección:
Cuantificación de la carga proviral de
HTLV-1
NUESTRA EXPERIENCIA EN EL
HOSPITAL GARRAHAN
SERVICIO DE HEMOTERAPIA
LABORATORIO DE RETROVIRUS
Desarrollo de un ensayo para la
cuantificación de carga proviral de HTLV-1
# PCR en tiempo real, SYBR Green
# Cuantificación en CMT
# Amplificación en paralelo de un fragmento del gen pol
(318bp) y albúmina (81bp)
# Curva de calibración: línea celular MT-2 (2 copias de pol
por célula)
Carga proviral de HTLV-1:
cuantificación por PCR en tiempo real
Albúmina
Pol
Límite de detección = 400 copias/106 CMT
Carga proviral
Asintomáticos vs Sintomáticos
Los pacientes sintomáticos (n=10) presentaron cargas virales
significativamente mayores (mediana=5.02 log10 copias/106 PBMCs,
IQR=4.70-5.30) que los asintomáticos (n=52; mediana=4.11 log10
copies/106 PBMCs, IQR=3.55-4.66).
Carga proviral según síntomatología
Síntomaticos:
5 HAM/TSP
2 ATLL
2 uveitis
1 PG
Los pacientes con HAM/TSP presentaron cargas virales
significativamente mayores (mediana=5.25 log10 copias/106 PBMCs)
que otros sintomáticos (mediana=4.04 log10 copies/106 PBMCs).
Carga proviral HTLV-1 según procedencia
6 CMT
copias/10
CPV HTLV-1 log10
7.5
Norte
Centro
Otros Países
5.0
2.5
0.0
North
Center
Other Country
Asintomáticos
En los individuos nacidos en el Norte la CPV fue significativamente
mayor (4.69 log10/106 CMT, IQR:4.43-5.00) comparados con los del
Centro (3.83 log10/106 CMT, IQR:2.63-3.84).
6
copias/10 CMT
CPV HTLV-1 log10
7.5
Carga proviral y Sexo
5.0
2.5
0.0
Female
Femenino
Male
Masculino
# No encontramos diferencias significativas entre la CPV y el sexo o
edad de los individuos.
Conclusiones
La carga proviral de HTLV-1 se asoció con el
fenotipo de la infección, siendo baja en los
pacientes asintomáticos y alta en los sintomáticos,
indicando que sería un marcador relevante del
desarrollo de la enfermedad.
Se encontró una correlación entre la carga
proviral y el Norte de Argentina como lugar de
nacimiento.
REPORTE DE UN CASO
Hospital Garrahan
Hospital Roffo
Mangano et al , Retrovirology 2011
Noviembre 2008. Pac. Masculino, 52 años con lesiones
dérmicas nodulares.
Refiere diagnóstico de infección por HTLV-1 luego de una
donación de sangre en 2005. Nació y vive en Buenos Aires.
Biopsia de piel: Foliculitis y desarrollo de Trychophyton rubrum.
Rto leucocitos= 48.000 céls/ml
Artralgias. TAC cuello, tórax y abdomen= normal
Derivado al Servicio de Infectología y Hematología
Hto=42%, plaquetas 170.000/ml, calcio sérico= 9.6 mg/dl,
álbumina= 4.2 g/dl, urea nitrogenada 31 mg/dl, creatinina= 1.29
mg/dl y LDH= 769 IU/l. Otros tests dentro de los límites
normales.
Citometría de flujo de S.P.: 65% población linfocitaria con 52%
clon anormal T positivo para CD3, CD25, CD4, CD5 y negativo
para CD7, CD8, CD19, and CD56.
Biopsia de M.O. 20% infiltración por linfocitos maduros
compatibles con ATL.
Plan para iniciar INF alfa + AZT.
Aumento de leucocitos a 111.000 céls./ml
Inicia quimioterapia en Noviembre 2008 por 6 ciclos con
vincristina 2mg, doxorubicina 100mg, ciclofosfamida 1500 mg y
prednisona 80mg día por 21 días, más GCSF.
El pac. desarrolla diabetes y requiere insulina diariamente.
Remisión completa de la leucemia y comienza en Mayo 2009
con INF alfa 5 millones de unidades tres veces por semana +
AZT 600 mg/día y profilaxis con TMS.
Luego de un año de terapia presenta alta CpV
Cambio a INF PEG alfa 2B 120 µg por semana, tenofovir 300
mg/día and lamivudina 300 mg/día.
Junio 2011, continúa en remisión con elevada CpV
• Septiembre 2009 CpV= 5.5 log10 copies/106 PBMC.
• Diciembre 2009 (1 año en ARV) CpV= 5.3 log10 copies/106 PBMC.
• Agosto 2010 (4 meses con nuevo ARV), CpV= 5.45 Log10 copies/106 PBMC.
• Febrero 2011 CpV= 5.35 log10 copies/106 PBMC.
Conclusión:
Paciente con ATL en remisión luego de
3 años, con carga proviral de HTLV-1
persistentemente alta luego de 2 años en
tratamiento ARV
Muchas gracias ...