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Crio preservación de embriones de mamíferos
( Publicado en Revista Creces, Julio 1982 )
Diversas técnicas permiten hoy congelar embriones para posteriormente implantarlos
con propósitos experimentales o de producción animal. Se estima que el tratamiento de
la infertilidad humana podría beneficiarse con tales implantes, campo en el cual deben
observarse también situaciones morales.
La preservación de células animales a bajas temperaturas (criobiología) se remonta al
año 1866, fecha en la que Montegazza logró mantener vivos espermatozoides después
de haber congelado una muestra de semen a –17°C; sin embargo, no es sino hasta el
año 1949 que se produce un avance sensacional en este campo. Efectivamente en ese
año los Drs. C. Polge, A.V. Smith y S.A. Parkes descubren que la adición de glicerol
(crioprotector) al medio de suspensión de los espermatozoides, impide el daño celular
provocado por la congelación y descongelación del semen. Usando esta tecnología se
ha logrado mantener vivos espermatozoides de varias especies en semen congelado a 79°C. Con posterioridad se ha establecido técnicas que permiten congelarlos a la
temperatura del nitrógeno liquido (-196°C) por largos períodos.
La importancia del crioprotector se puede comprender mejor si se considera lo
siguiente:
Durante la congelación de las células se forma hielo extracelular lo que lleva a un
aumento en la concentración de solutos. Esto provoca a su vez salida de agua desde las
células, fenómeno necesario para minimizar la formación de hielo intracelular. La
exposición de la célula a altas concentraciones de solutos es tóxica, sin embargo, este
daño disminuye al bajar la temperatura. Aunque no está del todo claro la acción del
crioprotector, se acepta que ésta se encuentra asociada a la reducción del sistema que
se transforma en hielo. Con posterioridad al descubrimiento del glicerol como
crioprotector de espermatozoides, se ha podido demostrar que otras sustancias tales
como el DMS0 (dimetil sulfóxido, CRECES 5 vol. 3); etilen-glicol, PVP
(polivinilpirrolidona), y otros, tienen propiedades crioprotectoras. En general, dos son
las propiedades que debe tener un crioprotector, la primera es que sea muy soluble en
agua y la segunda es que no sea tóxica para la célula a congelar.
Congelados y vivos
Los primeros experimentos asociados a la criopreservación de embriones de mamíferos
se realizaron en el año 1971 per los doctores Whittingham, Leibo y Mazur, quienes
demostraron que embriones preimplantacionales de ratón se podían congelar a
temperaturas lo suficientemente bajas como para permitir guardarlos por largos
periodos. De esta manera se pudo recuperar embriones vivos después de haber
permanecido por un largo periodo congelados a –196° C y a –269° C. Sin embargo,
desde un punto de vista practico, como veremos más adelante, la temperatura del
nitrógeno liquido (-196° C) es suficientemente baja como para permitir su
almacenamiento por largo tiempo.
En la práctica de la criopreservación es conveniente recuperar de cada hembra el
mayor número de embriones. Esto se logra como una técnica relativamente sencilla
destinada a inducir a las hembras a superovular, es decir que ellas ovulen un número
de oocitos varias veces mayor al número que ellas normalmente producen,
aumentando por lo tanto el rendimiento. La fecundación in vivo o in vitro de estos
oocitos llevará a la obtención de embriones de desarrollo y edad conocidos.
Medio de cultivo específico
El estado del desarrollo en que los embriones se pueden congelar varía con la especie,
así por ejemplo, en algunas como el ratón, la congelación se puede realizar con éxito
en cualquier estado del desarrollo, incluyendo oocitos recién ovulados. En otras como la
abeja, la congelación tiene éxito sólo a partir de mórulas (32 células), y en la vaca sólo
a partir del estado de blastocisto (64 -128 células). En el cerdo, ningún embrión
sobrevive cuando la temperatura se baja de los 15° C.
Por lo anteriormente expuesto, los embriones pueden ser congelados en un medio de
cultivo específico. La elección de este medio es muy importante, por cuanto la
recuperación y manejo previo a la congelación debe asegurar la sobrevida del embrión.
En resumen, la técnica de la congelación consiste en suspender en una ampolla los
embriones en una pequeña cantidad (0,15 ml) de medio de cultivo; a continuación la
temperatura se baja hasta 0°C en donde se dejan por algunos minutos; luego se
agrega el crioprotector preenfriado a 0°C y se mantiene por breves minutos para que
esta mezcla se equilibre. En la criopreservación de embriones de mamíferos se ha
usado fundamentalmente glicerol, etilen glicol y DMSO, siendo este último el más
usado. El segundo paso consiste en la inducción de formación de hielo, lo que se logra
a una temperatura de –5°C. A partir de este momento la ampolla conteniendo los
embriones se debe continuar enfriando a una velocidad de más o menos
0.3°C/minutos, hasta alcanzar –40° C. Una vez en esta temperatura la ampolla se
transfiere directamente a nitrógeno liquido. También se puede hacer este traspaso
cuando se alcanza –80°C. La temperatura de transferencia a nitrógeno líquido debe ser
considerada en relación a la modalidad de descongelación, como se vera más adelante.
Animación suspendida
Los embriones que se han transferido al nitrógeno liquido pueden teóricamente
permanecer congelados por tiempo indefinido en un estado de animación suspendida,
debido a que a la temperatura del nitrógeno liquido se suspende toda actividad
biológica. A dicha temperatura el único tipo de reacción que puede ocurrir es la
fotofísica, como por ejemplo, la radiación ionizante. Este tipo de radiación puede
provocar daño genético durante la preservación a baja temperatura. Tal daño seria
acumulativo, debido a que los mecanismos enzimáticos necesarios para reparar el daño
están detenidos. Sin embargo es necesario destacar a este respecto dos hechos
importantes: el primero se refiere a que el nivel basal de radiación natural es de 0.5 a
1.0 rad/año, y el otro a que menos del 1%de las mutaciones espontáneas que ocurren
a temperaturas fisiológicas se pueden atribuir a la radiación natural. Por estas razones
se necesitaría entre 200 a 1000 años de almacenamiento para producir una reducción
significativa de sobrevida. Se han realizado experimentos en embriones de ratón los
cuales se han mantenido congelados por dos años, lapso en el que recibieron un nivel
de radiación equivalente a 200 años; cuando estos embriones se descongelaron, no se
observó una pérdida adicional de embriones o un aumento en las mutaciones con
respecto a los embriones que no fueron irradiados.
Ventajas
Entre las ventajas de la criopreservación se puede destacar que los embriones
congelados pueden ser transportados de un lugar a otro en gran número y en forma
relativamente simple la posterior descongelación de ellos no requiere de equipos
especiales; simplemente basta un recipiente con agua caliente o bien dejar las
ampollas con los embriones a temperatura ambiente. La modalidad de
descongelamiento, por lo tanto, dependerá de la temperatura a la cual son pasados al
nitrógeno líquido. Si los embriones a transferir estaban congelados a –40° C, la
descongelación se debe hacer en forma rápida (350°-450°C/min); en tanto que si ellos
estaban congelados a –90°C la descongelación debe ser lenta (20° C/mm).
El método más directo para evaluar la viabilidad de los embriones consiste en
cultivarlos in vitro por 24 horas, si éstos continúan dividiéndose ellos se pueden
transferir a hembras seudopreñadas, es decir a hembras que desde un punto de vista
funcional y endocrino se comportan como si estuvieran preñadas, pero que no tienen
embrión en su vía genital (oviducto o útero). Si no es posible para el estudio de
vitalidad, cultivar los embriones, existen reacciones de coloración vital que permiten
una evaluación inmediata de la sobrevida embrionaria y que no interfieren con el
desarrollo posterior.
En algunas especies de mamíferos, específicamente roedores, se han podido también
congelar oocitos recién ovulados, los que después de ser descongelados han sido
fecundados in vitro sin observarse diferencias con respecto a oocitos no congelados.
Genoma
¿Qué ventajas tiene la congelación de embriones con respecto a la congelación de
oocitos y/o espermatozoides? Parecería claro que una ventaja importante de los
embriones congelados es que ellos pueden dar origen a un organismo cuando son
transplantados en una hembra seudopreñada. Este es un enorme beneficio desde el
punto de vista de la producción animal debido a que congelando el embrión se está
almacenando el genoma diploide, lo que tiene obvias ventajas con respecto a la
preservación de los gametos. Las proyecciones de tipo práctico parecerían ser bastante
claras en el caso de la producción animal. Actualmente se está explotando esta
tecnología en el manejo genético en bovinos. Las facilidades de transporte de grandes
cantidades de embriones de buena calidad genética permitirán reemplazar, en periodos
relativamente cortos, la población ganadera de una región o de un país. Por otra parte
esta técnica ofrece la posibilidad de almacenar congelados cepas de animales de
laboratorio, evitándose así el enorme costo que implica su mantención en viveros. En el
momento requerido ellos pueden ser descongelados y los embriones transplantados a
hembras seudopreñadas y así recuperar en cualquier momento la cepa deseada.
En el ser humano
Las posibles aplicaciones que esta técnica pueda tener en el tratamiento de infertilidad
humana pueden empezar a vislumbrarse cuando ella se asocia a la técnica de
fecundación in vitro de oocitos humanos. En 1981 en Australia el Dr. A. Trounson
congeló embriones humanos preimplantacionales, producto de una fecundación in vitro.
Sin embargo, hasta este momento no existen evidencias de que ellos sean viables, ni
tampoco se sabe que se hayan reimplantado en el útero de alguna mujer receptora; de
ser viables estos embriones podría ser de considerable ayuda en el éxito de la práctica
de la fecundación in vitro, en parejas con problemas de esterilidad por anomalías del
oviducto de la mujer. Esto se debe a que normalmente en la práctica de la fecundación
in vitro de oocitos humanos se trata de obtener y fecundar más de uno a fin de
asegurar el éxito de esta técnica. Ahora bien si todos ellos se fecundan y todos ellos se
desarrollan normalmente, el médico se vera en la disyuntiva del destino de aquellos
que no serán reimplantados en la mujer en tratamiento. Una alternativa seria
reimplantar algunos (uno o dos) y el resto guardarlos congelados para ser
reimplantados con posterioridad cuando la mujer desee comenzar otra gestación.
Estas son obviamente posibilidades que se presentan desde un punto de vista biológico,
sin embargo hay consideraciones de tipo ético y moral, no examinadas aquí, que
deberán considerarse en la eventual aplicación de esta técnica en humanos.
Claudio Barros
Laboratorio de Embriología
Pontificia Universidad Católica de Chile
Artículo extraído de CRECES EDUCACIÓN - www.creces.cl