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Evolución Molecular
Coordinadora: Susanna Manrubia
Miembros de la línea de investigación: Jacobo Aguirre Araujo, María Arribas Hernán, Carlos Briones
Llorente, Laura Cabanillas Vega, José Ángel Capitán Gómez, Cristina Cid Sánchez, Héctor Díaz
Maldonado, María Fernández Algar, Laura García Descalzo, Eva García López, Ana García Sacristán ,
Manuel J. Gómez Rodríguez, Enrique González, Jaime I. Iranzo Sanz, Eva Mª Lanagrán Valero, Ester
Lázaro Lázaro, Francisco J. López de Saro, Carlos Lugo, Susanna Manrubia Cuevas, Miguel Moreno
Molina, Michael Stich
Resumen: La línea de Evolución Molecular tiene como objetivo la caracterización experimental y teórica de los mecanismos
evolutivos a nivel molecular. Los grupos que integran esta línea abordan cuestiones que requieren el uso de distintos sistemas,
desde ácidos nucleicos hasta genomas completos, incluyendo aptámeros de RNA y DNA, virus de RNA y microorganismos
extremófilos. Un aspecto clave para que la adaptación sea observable en el marco de esta investigación es la existencia de
suficiente heterogeneidad en las poblaciones estudiadas. Ello permite el análisis de la dinámica in vitro de conjuntos de
moléculas de RNA o virus de RNA en tiempos de semanas o meses, y la monitorización de los cambios moleculares que
subyacen a la adaptación a nuevos ambientes o a la exposición a nuevas presiones de selección. En el caso de la evolución de
microorganismos y genomas, donde habitualmente los tiempos a los que se producen los cambios moleculares son mayores, se
analizan poblaciones naturales de distinta procedencia o con diferentes historias evolutivas, a fin de determinar los cambios
genómicos implicados en su adaptación y, por ende, en su supervivencia. Desde una perspectiva más formal se analizan
modelos computacionales de la evolución de poblaciones de moléculas de RNA y se plantean modelos fenomenológicos
dirigidos a comprender los mecanismos básicos que relacionan genotipo y fenotipo, el efecto de la selección natural en la
adaptación y la emergencia de la innovación evolutiva.
Relación secuencia-estructura-función en el RNA
experimental han sido los siguientes:
Un tema fundamental en la investigación sobre el
origen y la evolución temprana de la vida es el estudio
de los procesos que pudieron llevar a la formación de
las primeras macromoléculas poliméricas con
información biológica (ácidos nucleicos y proteínas). De
acuerdo con el modelo del “Mundo RNA” actualmente
vigente, este ácido nucleico habría precedido al DNA y
a las proteínas como biopolímero informativo, debido a
su versatilidad funcional: es un archivo de información
genética, tiene funciones estructurales y también
catalíticas. Por tanto, las relaciones secuenciaestructura-función en el RNA son imprescindibles para
explicar tanto la dinámica adaptativa de poblaciones de
secuencias de RNA como la evolución precelular (RuizMirazo et al., en prensa). Dentro de este contexto
general, en nuestra línea se investigan aspectos como
las propiedades de moléculas análogas de los ácidos
nucleicos naturales [como el ácido nucleico peptídico,
PNA (Briones y Moreno, 2012)], las características de la
relación entre secuencia y estructura secundaria en el
RNA (Romero-López et al., 2012), el plegamiento
tridimensional de esta molécula en distintas
condiciones iónicas, la modularidad del RNA, la
polimerización de ribonucleótidos sobre superficies
catalizadoras, los procesos de selección de los ácidos
nucleicos in vitro (aptámeros específicos contra
diferentes dianas moleculares) o los escenarios formales
que podrían explicar la aparición de RNAs autoreplicativos. En su aspecto más aplicado, se desarrollan
aptámeros con aplicaciones terapéuticas, y biosensores
basados en PNA o en aptámeros.
1. Se ha analizado la estructura del sitio de entrada
interna del ribosoma (IRES) existente en la región 5’ del
genoma del virus de la hepatitis C (HCV) mediante una
combinación de microarrays de DNA y modificación
química (sistema SHAPE). Se ha caracterizado el tipo
de interacciones RNA-RNA que se establecen entre los
extremos 5’ y 3’ del genoma de este virus, necesarias
para que el IRES sea funcional y por tanto puedan
traducirse las proteínas virales (Romero-López et al.,
2012).
Los logros principales en el año 2012 en el ámbito
2. Se ha optimizado la tecnología de microscopía de
fuerza atómica (AFM) para el estudio de la estructura
del IRES de HCV y del virus de la fiebre aftosa (FMDV)
en diferentes condiciones iónicas (García-Sacristán et
al., preprint).
3. Se han utilizado las técnicas de selección y evolución
in vitro de ácidos nucleicos (RNA y DNA) previamente
optimizadas en nuestro laboratorio para desarrollar
aptámeros específicos contra una molécula de bajo peso
molecular muy interesante como biomarcador en
Astrobiología: el antibiótico Thiostrepton. Se ha
iniciado el trabajo para la obtención de aptámeros de
RNA y DNA contra dos proteínas que se unen al
elemento IRES y poseen un gran interés como
reguladores funcionales: Ebp1 y PCBP2.
4. Se han desarrollado aptámeros de RNA específicos
contra la región 5’UTR del genoma del virus de la
inmunodeficiencia humana (HIV), y se han diseñado
moléculas cortas que poseen una funcionalidad similar
a la de los aptámeros completos. Se ha demostrado el
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sus consecuencias evolutivas. Aunque la mayor
disponibilidad de mutaciones beneficiosas podría ser
ventajosa, el hecho de que a alta tasa de error éstas
aparezcan en contextos genómicos deletéreos puede
dificultar su propagación y, en consecuencia, también
la adaptación.
Durante el año 2012 se han proseguido con el estudio
de las consecuencias que el aumento artificial de la tasa
de error tiene en la evolución, utilizando como modelo
un virus RNA, el bacteriófago Qβ, replicando en
presencia del análogo de nucleósido mutagénico 5azacitidina (AZC). Se ha prestado especial atención a la
propagación en la población viral de varias mutaciones
que aportan ventajas selectivas en presencia del
mutágeno. Algunas de estas mutaciones llegan a fijarse,
mientras que otras permanecen como polimorfismos
durante un número elevado de generaciones. Los
principales logros obtenidos son los siguientes:
Figura 1. Frecuencia de mutación en el bacteriófago
Qβ salvaje (wt) y en varios mutantes seleccionados
en presencia de AZC. Se observa que todos los
mutantes disminuyen la frecuencia de mutación
respecto al virus salvaje en presencia de AZC. Sin
embargo, mientras que para los mutantes en la
replicasa (A2982G y U3582C) este descenso es
significativo, no lo es para el mutante en la proteína
readthrough (A1746U).
gran potencial inhibidor en cultivo celular de estas
moléculas, que han sido patentadas para su uso en
terapia y diagnóstico (Patente P201231819).
En el ámbito
computacionales:
de
los
estudios
teóricos
y
1. Se han utilizado los algoritmos de plegamiento in
silico de RNA para analizar las poblaciones de
aptámeros obtenidas experimentalmente en el
laboratorio. La aproximación combinada in silico-in
vitro ha permitido obtener los aptámeros de menor
longitud (con sólo 16 nucleótidos) que son estables y
activos como inhibidores de HIV.
2. Hemos continuado el estudio de la estructura
topológica del espacio de genotipos a través del análisis
de las redes neutrales de estructura secundaria de RNA
y su accesibilidad mutua.
Relación genotipo-fenotipo en virus de RNA
Los virus RNA forman poblaciones altamente
heterogéneas, capaces de adaptarse en tiempos récord a
los cambios en las presiones selectivas. Este hecho,
unido a que sus reducidos tamaños genómicos
permiten establecer fácilmente relaciones entre el
genotipo y el fenotipo, los convierte en un modelo
excelente para estudiar los mecanismos moleculares
básicos de la adaptación. El proceso adaptativo está
determinado por dos parámetros principales que
condicionan la proporción de mutaciones beneficiosas
y la capacidad para que éstas se fijen en la población: el
tamaño molecular y la tasa de error de la replicación. El
aumento de la tasa de error incrementa la cantidad total
de todos los tipos de mutaciones (beneficiosas,
neutrales y deletéreas), lo cual hace muy difícil predecir
1. Se ha encontrado que las mutaciones polimórficas se
distribuyen en varias líneas evolutivas que compiten
entre ellas, dificultando la emergencia de una secuencia
consenso definida. Cada línea evolutiva puede aportar
ventajas selectivas a través de mecanismos moleculares
diferentes, lo cual implica la coexistencia de multiples
vías adaptativas en la población viral (Cabanillas et al.,
2013).
2. Se ha demostrado que dos de las mutaciones
beneficiosas que aparecen en el gen de la replicasa no
pueden asociarse en el mismo genoma, lo cual es un
claro ejemplo de epistasis antagonística.
Como
consecuencia, estas mutaciones compiten entre ellas,
retrasándose su fijación y dando lugar a su presencia
prolongada como polimorfismos.
3. La variedad de contextos genómicos en los que los
polimorfismos son detectados indica que las
mutaciones beneficiosas recurren frecuentemente en el
bacteriófago Qβ. Este hecho podría disminuir las
consecuencias negativas que la competición entre
diferentes mutaciones tiene en la adaptación.
4. Se ha avanzado en el conocimiento de los
mecanismos moleculares por los que actúan varias de
las mutaciones beneficiosas seleccionadas en presencia
de AZC. Se ha encontrado que las mutaciones en la
replicasa disminuyen la frecuencia de mutación en el
espectro de mutantes de la población viral. Otra de las
mutaciones, localizada en el gen de la proteína
readthrough, posiblemente afecta a la regulación de la
expresión génica de dos de las proteínas virales.
Por último, durante el año 2012 se han iniciado las
siguientes líneas de investigación:
1. Selección y caracterización de mutantes del
bacteriófago Qβ que posean mayor estabilidad en
condiciones ambientales extremas en ausencia de
replicación.
2. Evolución del bacteriófago Qβ en presencia de
metales con capacidad para inducir estrés oxidativo.
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Modelos de evolución y adaptación molecular
En el año 2011 comenzamos un ambicioso proyecto que
ha comenzado a producir resultados. El objetivo es el
desarrollo de una teoría evolutiva del cambio
fenotípico a partir de un conocimiento suficiente de la
dinámica evolutiva a nivel molecular (o de genotipo).
Para ello necesitamos conocer las propiedades
topológicas de las llamadas redes de genotipos (RG),
definidas como el (usualmente astronómicamente
grande) conjunto de genotipos que dan lugar al mismo
fenotipo, o función biológica observable. Con
anterioridad demostramos con redes de secuencias de
RNA correspondientes a la misma estructura
secundaria que, en este caso, las RG poseían una
distribución amplia de grado –es decir, del número de
vecinos a distancia una mutación de un genotipo
dado—y que tenían la propiedad de ser asortativas. En
el año 2012 hemos ampliado este estudio al caso de selfavoiding walks a través del modelo HP. Este modelo
considera residuos hidrófobos y polares y representa
una primera aproximación al caso del plegamiento de
proteínas. Los resultados obtenidos hasta el momento
muestran interesantes paralelismos con el caso del
RNA que estamos explorando. Por otra parte, hemos
desarrollado la teoría dinámica de caminantes
aleatorios sobre este tipo de redes. Hemos observado
un interesante fenómeno no descrito hasta ahora y que
hemos
denominado
phenotypic
entrapment
(atrapamiento fenotípico). El proceso dinámico que
mueve a una población sobre RG causa un movimiento
hacia regiones más conectadas, de forma que la
probabilidad de escapar de una red de genotipos dada
(o de un fenotipo) depende del tiempo que la población
ha presentado ese mismo fenotipo. Este es un caso de
proceso semi-Markoviano, con memoria de su historia
anterior (Manrubia y Cuesta, preprint).
En colaboración con el grupo del Prof. Esteban
Domingo del Centro de Biología Molecular “Severo
Ochoa” hemos seguido el análisis de la ventaja de
terapias de combinación frente a terapias secuenciales.
El modelo matemático que desarrollamos en años
anteriores ha sido aplicado al caso del virus de la
hepatitis C. Como en casos anteriores, hemos podido
establecer la terapia y la dosis de antivirales que
minimiza la carga viral, la aparición de mutantes
resistentes, o ambas cantidades.
Evolución y adaptación de microorganismos
Otro de los objetivos de la investigación en la línea de
Evolución Molecular es el estudio de la organización y
de la dinámica de poblaciones de microorganismos, y
de los cambios moleculares que les permiten adaptarse
a nuevas condiciones y colonizar distintos ambientes.
Una de las tareas fundamentales consiste en determinar
mediante técnicas de proteómica, y con la utilización de
diversas
especies
bacterianas
extremófilas
(especialmente psicrófilas), cuál es el funcionamiento
de la maquinaria molecular y cómo varía en función
del entorno, con la intención de identificar las
modificaciones involucradas en un amplio número de
funciones celulares y especialmente las relacionadas
con la adaptación al ambiente y la evolución de los
microorganismos.
Un tema de especial interés es el papel desempeñado
en la adaptación al calor y al frío de las proteínas de
choque térmico –o heat shock proteins (Hsps)—y el de
las cold shock proteins (Csps). Estas proteínas son
sensibles a los cambios ambientales y
pueden
condicionar la evolución de poblaciones y estirpes que
están sometidas a selección por presión ambiental.
Funcionan formando complejos con otras moléculas y
se ha comprobado que la participación de otras
proteínas (denominadas client proteins) en estos
complejos depende de las condiciones ambientales.
Los hitos alcanzados en el año 2012 son los siguientes:
1. Se ha ampliado el estudio de proteínas responsables
de la adaptación de los microorganismos psicrófilos al
frío. Además de la previamente identificada Heat shock
protein 90 (Hsp90/HtpG), se ha estudiado el papel de
otras HSPs en la adaptación. Entre las más importantes
se han identificado DnaK, DnaJ, GroEL y GroES.
Además, se ha encontrado que otras proteínas
involucradas en la adaptación al frío de los
microorganismos psicrófilos son proteínas relacionadas
con la replicación y traducción (factor de elongación
Tu, factor de elongación Ts, proteínas ribosomales, etc.)
y proteínas que se han relacionado con el estrés
oxidativo (SOD, Thiol specific antioxidant, etc.).
2. Se ha estudiado el efecto del aumento de
temperatura de los ambientes glaciares en las
poblaciones de las bacterias y microorganismos
eucariotas que los habitan. Con el objetivo de
identificar cómo evolucionan las poblaciones de
microorganismos residentes en las muestras de hielo
glacial, se han estudiado mediante microscopía
electrónica de barrido y se han identificado mediante
secuenciación de su 16S rRNA y 18S rRNA. Se ha
observado que las abundancias relativas de
microorganismos a diferentes niveles taxonómicos
están correlacionadas con la altitud, el área y el pH de
los glaciares, pero no con otros parámetros ambientales
estudiados tales como su composición química.
Hemos participado en la Campaña Antártica 2012-2013,
en la que hemos obtenido nuevas muestras y datos
ambientales con los que seguir realizando nuevos
trabajos experimentales en laboratorio.
Evolución del genoma
En el año 2012 ha continuado el desarrollo de un
proyecto plurianual centrado en el estudio de la
dinámica y evolución de los elementos móviles del
genoma en poblaciones microbianas extremófilas. Un
objetivo central de este proyecto es la comprensión de
aspectos básicos de la biología de las secuencias de
inserción a fin de determinar su papel en la evolución
de los genomas bacterianos.
Los hitos alcanzados en el año 2012 son los siguientes:
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implicaciones de una estructura en cuasiespecies de las
poblaciones virales para el diseño de terapias exitosas
(Perales et al., 2012) y las implicaciones biomédicas de
tasas de mutación elevadas en virus (Sanjuán et al.,
2012).
Publicaciones y artículos de los miembros de la Línea,
relacionados con las actividades desarrolladas en el
2012
C. Briones y M. Moreno. Applications of peptide
nucleic acids (PNAs) and locked nucleic acids (LNAs)
in biosensor development (2012). Analytical and
Bioanalytical Chemistry, 402, 3071-3089.
Figura 2. Ajuste del modelo de evolución neutra de
secuencias de inserción a la abundancia de la familia
IS110. El histograma muestra la abundancia observada
en varios centenares de genomas bacterianos; la línea
azul es el ajuste al modelo neutro. Para esta familia de
secuencias de inserción, un modelo análogo con
selección proporciona un ajuste tan bueno como el del
modelo neutro. En la mayoría de casos, el modelo
neutro (más sencillo) es preferido frente al que
incorpora un efecto deletéreo de las secuencias de
inserción en el genoma huésped.
1. Se ha analizado los patrones de transposición de
57.515 secuencias de inserción presentes en 1.806
cromosomas bacterianos circulares y completamente
secuenciados. Estos datos han revelado la existencia de
sesgos en la transposición en numerosas familias que
han sido correlacionados con la replicación del
cromosoma.
2. Se ha analizado la distribución filogenética y la
distribución ecológica (en metagenomas) de las
secuencias de inserción.
3. Se ha estudiado bioquímicamente la interacción entre
transposasas y factores de replicación en bacterias. Se
han descubierto numerosos casos de interacciones entre
las transposasas que muestran sesgos en el genoma y el
factor de procesividad β.
4. Hemos realizado estudios de la distribución de
abundancias de las distintas familias de secuencias de
inserción en los genomas bacterianos. El resultado
obtenido es que las abundancias de secuencias de
inserción pueden ser explicadas como resultado de la
dinámica de un proceso neutral de duplicacióndeleción donde la selección natural no juega un papel
determinante (Iranzo et al., preprint).
Finalmente, la actividad científica de los miembros de
la línea ha dado lugar a varias revisiones y artículos de
opinión en diversos ámbitos, como la relevancia de la
existencia de redes de genotipos en la complejidad
química de un mundo de RNA prebiótico (Manrubia,
2012a), los retos que supone una modelización realista
de las poblaciones virales (Manrubia, 2012b), las
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procedimiento de obtención y sus aplicaciones”.
Nº de solicitud: P201231819
País de prioridad: España.
Fecha de prioridad: 23 de noviembre de 2012.
Entidad Titular: Consejo Superior de
Investigaciones Científicas (CSIC), Instituto
Nacional de Técnica Aeroespacial (INTA)
Empresa que lo está explotando: Aptus Biotech
(Acuerdo de Licencia)
F. J. López de Saro, Gómez, M.J., González-Tortuero, E.
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Inventores (p.o. de firma): A. Berzal-Herranz, C.
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M. Stich
Título: “Moléculas inhibidoras del virus de la
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