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Tema 3: Alineamiento múltiple de secuencias
© Pablo Vinuesa 2007, [email protected],
http://www.ccg.unam.mx/~vinuesa
Protocolo básico para un análisis filogenético de
secuencias moleculares
Curso fundamenteal de Inferencia Filogenética Molecular
Pablo Vinuesa ([email protected] )
Colección de secuencias homólogas
Progama de Ingeniería Genómica, CCG, UNAM
• BLAST y FASTA
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Tema 3:
alineamientos
múltiples de secuencias
Tutor: PDCBM, Ciencias Biológicas, PDCBioq. y
Profesor de la Lic. Ciencias Genómicas y posgrado
Alineamiento múltiple de secuencias
• Clustal, T -Coffee ...
Análisis evolutivo del alineamiento y selección del modelo de sustitución más ajustado
• tests de saturaci ón , modeltest, ...
• Tema 3: Alineamientos m últiples
Estima filogenética
1. Alineamientos mú ltiples y el problema de las repeticiones , sustituciones e indeles
2. Alineamientos mú ltiples progresivos usando programas de la familia Clustal
• NJ, ME, MP, ML, Bayes ...
3. Formatos de secuencia
4. Alineamiento de secuencias codificadoras de proteínas usando RevTrans y DAMBE
Pruebas de confiabilidad de la topolog ía inferida
• proporciones de bootstrap
probabilidad posterior ...
5. Alineamiento de genes ribosomales usando RDP-II y GreenGenes
Interpretación evolutiva y aplicación de las filogenias
Tema III: alineamientos m últiples
Tema III: alineamientos m últiples –
• Cualquier estudio de filogen ético o de evolución molecular basado en secuencias necesita
de un alineamiento mú ltiple para determinar las correspondencias de homolog ía
a nivel de los resíduos individuales o caracteres .
• El problema de las repeticiones
Muchas proteínas multidominio pueden presentar diverso grado de repetici ón d e domi-
• La mejor manera de representar un alineamiento múltiple es escribiendo las secuencias
a comparar en filas una encima de la otra, gener ándose una matriz de m x n (secs. x posic)
caracteres, en la que cada columna contiene a res íduos homólogos
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3
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nios particulares. Puedellegar a ser muy complejo o prá cticamente imposible hacer el
alineamiento correcto de estos “repeats”.
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?
A nivel de DNA se dan tambi én regiones repetidas, muchas veces involucrando a unos
poco nts. como es el caso de los microsat élites y otras regiones repetidas . Con frecuencia
estas regiones son imposibles de alinear objetivamente. Suelen acumularse en regiones no
codificantes del genoma, o en regiones codificantes hipervariables como espaciadores
interg énicos transcritos o regiones reguladoras (UTRs).
• Comparar los aln. múltiples en el contexto de una filogenia nos puede revelar mucho acerca
de los patrones y tasas de sustitución.
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Este tipo de “repeats” cortos son poco frecuentes a nivel de aminoácidos , si bien a este nivel
es común encontrar regiones o dominios “de gran escala ” repetidos. Un ejemplo cl ásico de
este fen ómeno son las calmodulinas.
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Tema 3: Alineamiento múltiple de secuencias
Tema III: alineamientos m últiples –
• El problema de las sustituciones
• Al examinar alns. mú ltiples de proteínas se obaservan dos patrones de sustitución :
1.- Existen bloques de 5 a 20 resíduos con alto nivel de identitad y similitud dispersos
entreregiones de menor similitud. Estos bloques corresponden típicamente a elementos
estructurales como α -hélices y pliegues betaque evolucionan más lentamente que los
loops o bucles que los interconectan
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Tema III: alineamientos m últiples –
• El problema de las sustituciones
• Es importante recordar que por debajo del 20% de identidad a nivel de sec. de AA es
ya imposible que se pueda obtener un alineamiento múlitiple (o pareado) confiable si nos
basamos para obtenerlo sól o en la secuencia primaria, puesto que entramos en la zona
de penumbra.
α -hélice
• Un par de secuencias de nts al azar presentarán en promedio un 25 % de dentidad.
2.- Las columnas alineadas con múltiples estados de caracter tienden a presentar resíduos
de con caracter ísticas bioquímicas similares (I, A, V, L; S, T; R, K; etc.). Esta conservaci ón de res íduos similares es particularmente patente en los bloques correspondientes
a elementos de estructura secundaria, sitios activos o de uni ón a ligandos.
La propiedad bioquímica más conservada es la de polaridad/hidrofobicidad.
Tema III: alineamientos m últiples –
• El problema de los indeles ( inserciones/deleciones )
• Cuando por eventos de inserción o deleción (indeles ) las secuencias hom ólogas presentan
distintas longitudes, es necesario introducir “gaps” en el alineamiento para mantener la
correspondencia entre sitios hom ólogos situados antes y después de las regiones afectadas
por indeles. Estas regiones se identifican medianteguiones (-).
• Por tanto, siempreque sea posible , hay que realizar los alineamientos mú ltiples en base
a las secuencias traducidas , es decir, sobre AAs (igual que al hacer búsquedas en bases
de datos de secuencia)
Tema III: alineamientos m últiples –
• A mayor distancia gen ética ( evolutiva) entre un par de secuencias, mayor ser á el número d e
mutaciones acumuladas. Dependiendo del tiempo de separación de los linajes y la tasa
evolutiva del locus, puede llegar a ser imposible alinear ciertas regiones debido a fen ómenos
de saturaci ón mutacional. En loci de evoluci ón muy rápida como intrones o espaciadores
interg énicos, los fenómenos de saturación mutacional se observan incluso cuando se comparan secuencias de organismos evolutivamente pr óximos (mismo género o familia).
Los indeles no se distribuyen aleatoriamente en las secuencias codificadoras .
Casi siempre aparecen ubicados entre dominios funcionales o estructurales,
preferentemente en bucles (loops) que conectan a dichos dominios.
Esto vale tanto para RNAs estructurales (tRNAs y rRNAs) como para proteínas.
No suelen interrumpir el marco de lectura .
• Generalmente se usan sistemas de penalizaci ón de gaps afines (GP = gap + (ext. x long.) )
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¡Las regiones de homolog ía dudosa deben de ser excluídas de un análisis filogen ético!
Debemos de procurar maximizar la relaci ón entre señ al/ruido
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Alineamientos múltiples (AM)
• Existen diversos algoritmos (adem ás de matrices de sustitución y esquemas de “gap penalty ”)
para la generación de AMs. Unos son exahaustivos ( garantizan encontrar el alineamiento
óptimo) y otros son heurísticos (no lo garantizan)
• No existe un algoritmo ideal para todas las situaciones. Para búsquedas en bases de datos
se emplean algoritmos heurísticos para encontrar alineamientos locales (FastA y BLAST).
Para aná lisis filogenéticos necesitamos métodos que produzcan alineamientos globales .
• Algoritmos basados en programación din ámica (PD) aseguran encontrar la soluci ón óptima
o el mejor alineamiento global para 2 secuencias. Se trata de un algoritmo O(N2 ), ya que
el tiempo y memoria que demandan es proporcional al producto de las long. de ambas
secuencias (N1 X N2). Se puede generalizar el proceso para la comparación de múltiples
secuencias , usando la función de objetividad llamada suma ponderada de pares (WSP):
SS W ij Dij
Donde Di j es la puntuación de cada posible par de secuencias y W ij es un factor de ponderación arbitrario que permite dar más o menos peso a ciertas comparaciones (por ej. en función
de su score Dij. Algoritmos de PD se pueden emplear para encontrar el AM que da el mejor
valor posible de la funci ón WSP. El problema radica en que la complejidad crece exponencialmentecon cada nueva secuencia que se añade (complejidad O(NM)), donde N=long. sec
M= no. secs. Ello implica que se alcanza r á pidamente un límite computacional
Pasos en la generación de un alineamiento múltiple
siguiendo la estrategia de alineamiento progresivo
1. Se generan todos los
posibles alineamientos pareados , usando métodos
heurísticos o exhausivos
(PD), y se calcula su score
(puntuación) en base a la
matriz de sustitución y gap
penalties elegida
puntuación 1-2
puntuación 1-3
.
.
.
puntuación 4-5
.
.
.
3. Se estima un árbol guía
usando un métodode
distancias (NJ o UPGMA),
el cual representa de manera
aproximada las relaciones entre
las secuencias
1
4
3
0.02
2
5
5X5
2. Se calcula una matriz
de distancias en base a las
puntuaciones de los alineamientos pareados del paso
anterior
4. Se hace el alineamiento
riguroso (PD) y global entre
pares de secuencias
siguiendo el orden de similitud indicado por el
árbol guía
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Alineamientos múltiples (AM)
Existen diversas estrategias computacionales para obtener alineamientos múltiples de manera (semi)automática.
1.- Implementaci ón de algoritmos de alineamiento progresivo.
Así como los alns. mú ltiples son indispensables para reconstruir filogenias a partir de secs ,
un árbol de relaciones filogen éticas representa información muy valiosa para guiar la generación de un aln. múltiple.
La mayor parte de los alineadores automáticos modernos se basan en este tipo de algoritmos. Construyen un árbol guía aproximado a partir de distancias calculadas entre todos
los pares posibles de secuencias. De la matriz de distancias resultantes se construye un
árbol usando un método algor ítmico (NJ o UPGMA). El árbol guía resultante se emplea para
construir el alineamiento de manera progresiva. Las dos secuencias más similares se alinean
primero usando DP y una matriz o esquema de ponderación particular. Una vez alineado el
primer par, los gaps generados y a no se mueven. Este par es tratadocomo una sola secuencia
y es alineada contra la siguientesecuencia o grupo de secuencias más próximas en el árbol.
Se repite el proceso hasta que todas las secs. está n alineadas. El proceso es suficientemente
rápido como para alinear varios cientos de secuencias. Son menos precisos que los métodos
basados en la WSPs, pero muchísimo más r ápidos.
Pasos en la generación de un alineamiento múltiple
siguiendo la estrategia de alineamiento progresivo
- y su uso para estimar una filogenia
1
2
3
4
5
alineamiento múltiple (global) final
métodos algorítmicos
(NJ y UPGMA)
búsquedas exhaustivas o heurísticas
bajo un criterio de optimización
(ME, MP y ML)
matriz de dist.
5X5
1
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0.02
1
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0.02
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Alineamientos múltiples progresivos usando Clustal
-aspectos prácticos
Alineamientos múltiples progresivos usando Clustal
• La familia Clustal es posiblemente la más popular para hacer AMs de nt y aa
• Existen versiones para todas las plataformas y en red (http://www.ebi.ac.uk.clustalw )
• La primera versión (Clustal) salió en 1988, la ú ltima , ClustalX , en 1997 (última Vers. = 1.83)
• ClustalX (X- windows Clustal) lee secuencias en diversos formatos, calcula un árbol guía
NJ, usando algoritmos heur ísticos o exhausivos sobre aln. locales basado en distintas
matrices de pesado y d e penalización de gaps afines y sitio-específicos. Puede hacer
alineamientos de perfiles y existen diversas herramientas de control de calidad del AM.
Permiteincluir criterios estructurales para guiar el AM, usando máscaras estructurales .
Partes del alineamiento o secuencias particulares pueden ser realineadas para ir obteniendo
un aln global cada vez mejor. Es decir, ClustalX no sólo genera alineamientos (como
ClustalW ), sino que éstos pueden ser editados y mejorados interactivamentepor el usuario.
Además, ClustalX (y ClustalW ) permite la reconstrucción y visualización de árboles NJ
y hacer análisis de bootstrap sobre los alineamientos. Finalmente, los AMs pueden ser
escritos en diversos formatos de salida (CLUSTAL, FASTA, NEXUS, PHYLIP ...)
Alineamientos múltiples progresivos usando Clustal
-un ejemplo: alineamiento de GDPs dependientes de NAD
• Para obtener un AM con clulstal tenemos que tener todas las secuencias homólogas en
un solo archivo. Estas secs. pueden estar escritas en diversos formatos (FASTA, EMBL
SWISS-PROT ...)
• Sobre este archivo se puede correr un primer a nálisis usando las opciones por defecto de
Clustal
• Segú n el grado de divergencia de las secuencias a analizar, puedeser muy útil probar
distintas series de matrices y valores de gap penalty. Existen scripts de Perl que prueban
sistemáticamente una gran cantidad de combinaciones de par ámetros para encontrar
aquellos que maximizan el score del alinemiento (MULTICLUSTAL). Yuan et al., 1999
BioInformatics 15:862-863.
• Clustal es adecuado para alinear sets de secuencias totalmentecolineares (no usar para
ensamblar contigs!) y que presentan el mismo órden de dominios estructurales
•
Condiciones en las que Clustal no puede operar de manera óptima
1.
Si tenemos unas pocas secuencias muy divergentes de una superfamilia; ajustar “delay
parámeter ” y/o usar modo de alineamiento de perfiles, preferentementecon máscara
estructural
2.
Sesgo composicional en aas hidrofílicos (G, P, S, N, D, Q, E, K, R) pueden introducir
demasiados gaps ( penalidades de indel sitio-espec ífico)
Alineamientos múltiples progresivos usando Clustal
-un ejemplo: alineamiento de GDPs dependientes de NAD
1.- Seleccional modo de aln y fichero a alinear
(en este caso las secs. están escritas en formato FASTA)
...
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Tema 3: Alineamiento múltiple de secuencias
Alineamientos múltiples progresivos usando Clustal
-un ejemplo: alineamiento de GDPs dependientes de NAD
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Alineamientos múltiples progresivos usando Clustal
-un ejemplo: alineamiento de GDPs dependientes de NAD
1.
2.
Alineamientos múltiples progresivos usando Clustal
-reconstrucción de una filogenia (NJ) mediante NJplot
3.
Servidores para alinear nts. en base a un alineamiento de proteínas
¡¡¡ Siempre que quieras alinear secs. de DNA codificadoras (CDSs) alinea primero sus
productos y u s a el alineamiento mú ltiple de proteínas para guiar el de los genes
correspondientes !!! Usa para ello servidores como protal2dna o RevTrans, o tus propios
scripts de Perl
http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/protal2dna.html
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Tema 3: Alineamiento múltiple de secuencias
Servidores para alinear nts. en base a un alineamiento de proteínas
http:// www.cbs.dtu.dk/services/RevTrans/
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Servidores para alinear secuencias de rRNAs o rDNAs
• Los genes ribosomales representan un problema muy particular en el contexto de
alineamientos mú ltiples. Deben de guiarse usando máscaras de información estructural .
• Servidores como GreenGenes y RDP- II proveen
herramientas muy útiles en estecontexto .
Si quieres ver unos tutoriales sobre el uso de
estos servidores, visita mi sito web y busca
bajo phylogeny tutorials:
http://www.ccg.unam.mx/~vinuesa/
Using_the_GreenGenes_and_RDPII_servers.html
Formatos de secuencias
I) FASTA
• Existen una gran cantidad de estilos o formatos de presentación de secuencias. Muchos
programas de análisis filogenético usan su propio formato (Phylip , Nexus, Mega ...)
• El formato más sencillo es el FASTA, en el que cada secuencia se identifica mediante un
rengl ón descriptor que comienza con > en el siguiente rengl ón comienza la secuencia
Formatos de secuencias
II) PHYLIP
• Phylip (interleaved): no. seqs, no. caracteres
nombre secuencias (máx 10 caracteres) espacio, secuencia ...
3
100
R._galegae CCGCUGGUCA CCUCCGGCAA GCGCGCCAUC CACCAGGAAG CGCCUUCCUA
M._plurifa ...G.C.A.G ..GU..AGCU ...U...... ......CCG. .U..GG....
B._japonic ...G.CAAGU .GGAA...CU .......... .......... ....GA....
CGUCGAUCAG UCGACCGAAG GCCAGAUCCU GGUCACCGGC AUCAAGGUCG
U.....C... .....G.... CG........ ...U...... ........UC
.AC...C... ..C....... CUG.A..U.. C......... ..........
>R._galegae
CCGCTGGTCACCTCCGGCAAGCGCGCCATCCACCAGGAAGCGCCTTCCTA
CGTCGATCAGTCGACCGAAGGCCAGATCCTGGTCACCGGCATCAAGGTCG
>M._plurifarium
CCGGTCGACGCCGTCGAGCTGCGTGCCATCCACCAGCCGGCTCCGGCCTA
TGTCGACCAGTCGACGGAAGCGCAGATCCTGGTTACCGGCATCAAGGTTC
>B._japonicum
CCGGTCAAGTCGGAAGGCCTGCGCGCCATCCACCAGGAAGCGCCGACCTA
CACCGACCAGTCCACCGAAGCTGAAATTCTCGTCACCGGCATCAAGGTCG
• Phylip (sequential or non- interleaved)
3 100
R._galegae
M._plurifa
B._japonic
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CCGCTGGTCA
CGTCGATCAG
CCGGTCGACG
TGTCGACCAG
CCGGTCAAGT
CACCGACCAG
CCTCCGGCAA
TCGACCGAAG
CCGTCGAGCT
TCGACGGAAG
CGGAAGGCCT
TCCACCGAAG
GCGCGCCATC
GCCAGATCCT
GCGTGCCATC
CGCAGATCCT
GCGCGCCATC
CTGAAATTCT
CACCAGGAAG
GGTCACCGGC
CACCAGCCGG
GGTTACCGGC
CACCAGGAAG
CGTCACCGGC
CGCCTTCCTA
ATCAAGGTCG
CTCCGGCCTA
ATCAAGGTTC
CGCCGACCTA
ATCAAGGTCG
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Tema 3: Alineamiento múltiple de secuencias
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Formatos de secuencias
III) NEXUS
Formatos de secuencias:
su interconversión
#NEXUS
[OJO!!!, no usar guiones -, sólo guiones bajos_]
BEGIN TAXA;
DIMENSIONS NTAX=3;
TAXLABELS
R._galegae;
M._plurifarium ;
B._japonicum;
END;
[taxa block ]
• Cuando preparamos un fichero con nuestras propias secuencias generalmente lo más
adecuado es hacerlo en formato FASTA
• Si necesitamos pasarlo a otro formato, una buena posibilidad es hacerlo con ReadSeq
http://iubio.bio.indiana.edu/cgi-bin/readseq.cgi
BEGIN CHARACTERS;
[character block]
DIMENSIONS NCHAR=100;
FORMAT DATATYPE=DNA MISSING=? GAP=- MATCHCHAR=. INTERLEAVE=yes ;
MATRIX
[
10
20
30
40
50]
[
*
*
*
*
*]
R._galegae
CCGCTGGTCACCTCCGGCAAGCGCGCCATCCACCAGGAAGCGCCTTCCTA
M._plurifarium ...G.C.A.G..GT..AGCT...T............CCG..T..GG....
B._japonicum
...G.CAAGT.GGAA...CT........................GA....
[
[
R._galegae
M._plurifarium
B._japonicum
;
END;
60
70
80
90
100]
*
*
*
*
*]
CGTCGATCAGTCGACCGAAGGCCAGATCCTGGTCACCGGCATCAAGGTCG
T.....C........G....CG...........T..............TC
.AC...C.....C.......CTG.A..T..C...................
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ReadSeq reconoce automáticamente el formato de entrada y s i se trata de aas o nts
•
Muchos de los paquetes de software que utilizaremos en el curso tales como
BioEdit, ClustalX, DAMBE, MEGA3 y PAUP* son capaces de leer e interconvertir
diversos formatos
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