Download TP Grupo 6 - laboratorio de carcinogénesis hormonal

TRABAJO PRÁCTICO Nº 6
Título: “Participación del factor de transcripción RUNX2 en la inestabilidad
cromosómica de una línea celular humana de cáncer de mama”.
Jefe TP: Dra. Victoria Fabris
Ayudantes: Lic. Sabrina Fletcher
Lic. Natalia Galignana
OBJETIVO: Estudiar el efecto de la sobreexpresión del factor RUNX2 sobre la
inestabilidad cromosómica en dos líneas celulares de cáncer de mama humano, una
con cariotipo hipodiploide y otra triploide.
Antecedentes
La mayoría de los cánceres humanos son aneuploides, es decir que
presentan ganancia y/o pérdida de alguno de los cromosomas, como consecuencia
de la inestabilidad cromosómica (1,2). Los errores que pueden ocurrir durante la
mitosis serían una causa de la inestabilidad cromosómica. En esos casos es
frecuente observar cromosomas rezagados durante anafase, puentes de cromatina y
mitosis multipolares, asociadas con un aumento en el número de centrosomas
(estructuras formadas por un par de centríolos y material pericentriolar, que definen
a cada uno de los polos del huso mitótico). La desregulación de algunas de las
proteínas que controlan el ciclo celular puede conducir a mitosis aberrantes. Se ha
demostrado que el grado de inestabilidad cromosómica estaría asociado con el
pronóstico en varios tipos de cáncer, y en particular con el cáncer de mama (3). Se
observó la sobreexpresión de varias ciclinas (4) y de la quinasa Aurora kinasa A en
los tumores mamarios, y en muchos casos se lo asoció con mayor inestabilidad
cromosómica (5).
Por otro lado, el factor de transcripción RUNX2 regula la expresión de varios
genes involucrados en diferenciación y progresión del ciclo celular. Participa en la
diferenciación de los osteoblastos y en el desarrollo óseo, por lo cual está
involucrado en el desarrollo de osteosarcomas. Además, RUNX2 está desregulado
en cáncer de mama y participaría en las vías de señalización de proliferación celular
y metástasis (6).
En nuestro laboratorio trabajamos con la línea celular humana de cáncer de
mama IBH-6, desarrollada por la Dra. I. Lϋthy en el IBYME. Esta línea celular
expresa receptores de estrógeno (RE) y progesterona (RP), y responde a hormonas
(7). Además, tiene un cariotipo hipodiploide con 36 cromosomas (humano normal
2n=46). Estudios citogenéticos previos mostraron que la línea IBH-6 transfectada
con el factor Runx2 presentaría un mayor número de cromosomas comparada con la
línea IBH-6 wild type. Por otro lado, se observaron células multinucleadas y
micronúcleos (que podrían contener fragmentos o cromosomas enteros que no
segregaron correctamente durante la mitosis) en la línea celular IBH-6 que
sobreexpresa RUNX2, lo cual sugiere cierto grado de inestabilidad cromosómica en
dicha línea celular.
Metodología:
1- Se utilizarán las líneas celulares humanas de cáncer de mama IBH-6
(hipodiploide) y T47D (triploide), las cuales fueron transfectadas con el factor de
transcripción RUNX2. Se utilizarán técnicas de citogenética clásica (obtención de
metafases, coloración con Giemsa, bandeo G) para el estudio del cariotipo. Se
analizará la ploidía (número de cromosomas) y la presencia de rearreglos
cromosómicos. Se evaluará la presencia de células multinucleadas y micronúcleos
por la tinción con giemsa de las células en cultivo. Se realizará la técnica de
inmunofluorescencia para detectar γ-tubulina (uno de los componentes del
centrosoma) para el estudio del número de centrosomas y la presencia de mitosis
aberrantes multipolares. Se compararán las células wild type con las células
transfectadas, en cuanto al número de cromosomas por metafase, cantidad de
rearreglos cromosómicos, número de centrosomas por núcleo y porcentaje de
células con micronúcleos.
2- Se analizará la expresión de algunas proteínas relacionadas con el control
del ciclo celular y la mitosis, como las proteínas Check 1 (Chk1), polo-like kinasa
(Plk) y Aurora kinasa (Aurk) por la técnica de Western blot en extractos proteicos
totales de las líneas celulares wild type y transfectadas. Se compararán los niveles
de proteína para determinar si RUNX2 induce una desregulación en la expresión de
alguna de estas proteínas que pueda estar asociado con las alteraciones
cromosómicas observadas en el punto anterior.
Fecha estimada de comienzo: jueves 14 de abril.
Bibliografía:
1. Thompson SL, et al. Mechanisms of chromosomal instability. Current Biol
20:285-295, 2010.
2. Bakhoum SF, et al. Chromosomal instability and cancer: a complex
relationship with therapeutic potential. J Clin Inv 122:1138-1143, 2012.
3. Ueno T, et al. Genome-wide copy number analysis in primary breast cancer.
Expert Opin Ther Targets 16 Suppl 1:S31-5, 2012.
4. Kronenwett U, et al. Improved grading of breast adenocarcinomas based on
genomic instability. Cancer Res 64:904-909, 2004.
5. Barr, AR and Gergely F. Aurora-A: the maker and breaker of spindle poles
Journal of Cell Science 120, 2987-2996, 2007.
6. Wysokinski D, et al. Role of RUNX2 in Breast Carcinogenesis. Int. J Mol Sci
16: 20969-20993, 2015.
7. Bruzzone A, et al. Novel human breast cancer cell lines IBH-4, IBH-6, and
IBH-7 growing in nude mice. J Cell Physiol 219:477-484, 2009.