Download introducción a la inmunología molecular

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INTRODUCCIÓN A LA INMUNOLOGÍA MOLECULAR
Al estudiar los contenidos teóricos de esta asignatura te habrás sorprendido por la
complejidad de ciertos procesos inmunológicos y la minuciosidad y el detalle con
el que los mismos han sido descriptos.
¿Te has preguntado cómo se ha adquirido tanta valiosa información?
Generalmente, el esquema simplificado de un mecanismo (por ejemplo, ontogenia
de la célula T y/o B, procesamiento antigénico, cooperación T-B, activación
linfocitaria, entre otros) ocupa no más de la mitad de una página en cualquier
libro de texto, pero es el producto de muchos años de investigación por parte de
miles de investigadores de todo el mundo. Y sólo se ha logrado acceder al
conocimiento necesario para poder elaborar ese esquema simplificado con el
desarrollo inteligente de estrategias experimentales. Del mismo modo, sólo con el
perfeccionamiento de estas estrategias experimentales se han podido generar
aplicaciones de gran relevancia en el diagnóstico, terapéutica y profilaxis.
En este seminario pretendemos que el alumno se familiarice con estas estrategias
experimentales, desde las más simples hasta las más sofisticadas y que al
desarrollar problemas en el que se aplican estas metodologías, el alumno se
sienta, al menos por algunas horas, como un inmunólogo desenmarañando un
intrincado mecanismo.
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A. TÉCNICAS Y METODOLOGÍAS QUE CONSIDERAMOS QUE EL ALUMNO
DEBE YA CONOCER PARA PODER DESARROLLAR ESTE SEMINARIO
1. Técnicas para evaluar la inmunidad celular in vitro
a. incorporación de timidina tritiada
b. pruebas para evaluar citotoxicidad
c. dosaje de citoquinas
d. purificación de subpoblaciones celulares
2. Técnicas para evaluar la inmunidad humoral
a. ELISA
b. Western blot
3. Purificación de proteínas por técnica fisicoquímicas
4. Nociones básicas de clonado y expresión de genes
a. Southern Blot
b. Northern blot
c. Librerias de DNA, cDNA
d. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
5. Generación de antisueros policlonales y anticuerpos monoclonales
6. Generación de anticuerpos quimericos y humanizados
B. EL USO DE ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN:
El primer desafío con el que se enfrentaron aquellos estudiosos de nuestro
sistema inmune (SI), fue comprender cómo se genera una respuesta inmune en
un organismo vivo (“in vivo”). Para esto, ha sido esencial el uso de animales de
laboratorio, entre ellos ratas y ratones. En un primer lugar, se utilizaron cepas
endocriadas normales (wild type) y se desarrollaron técnicas para poder manipular
su SI. Posteriormente, se utilizaron cepas de animales que poseían mutaciones
naturales que le conferían algún fenotipo particular, útil para el estudio de algún
aspecto de la respuesta. Con el advenimiento de la biología molecular se generó
una verdadera revolución: la creación de nuevas cepas genéticamente
modificadas según las necesidades del problema a investigar.
I.
Técnicas para modificar el funcionamiento del SI en un animal normal.
Irradiación: las radiaciones X o γ matan a las células linfoides en dosis a las
cuales no afectan a otros tejidos del organismo. Irradiando un animal (receptor)
con una dosis apropiada para eliminar las células linfoides, se puede evaluar la
habilidad de distintas poblaciones de linfocitos de un ratón singénico* (donante)
para transferir funciones inmunes.
Irradiaciones más elevadas eliminan todas las células de origen hematopoyético
(incluido los linfocitos) del animal receptor, permitiendo el reemplazo de todo el
*
singénico: dos individuos son singénicos si son genéticamente iguales; es importante distinguir el
concepto de singénico y congénico. Este último término se aplica a individuos que sólo difieren en
un locus o región genética (en inmunología, son particularmente útiles los animales que sólo
difieren en los genes del CMH)
3
sistema hematocitopoyético con células progenitoras de un donante. Asi se
generan los animales quiméricos: animales letalmente irradiados y
posteriormente reconstituidos con células de medula ósea de otra cepa (una
definición más exhaustiva de quimeras se verá más adelante). Como los linfocitos
derivan de células stem de médula ósea, estos animales contienen eventualmente
linfocitos derivados del donante pero todos sus tejidos son del receptor irradiado.
Esta técnica permite evaluar el desarrollo de los linfocitos y ha sido
particularmente importante en el estudio de la diferenciación de la célula T.
Timectomía: extirpación quirúrgica del timo obteniendo animales deficientes de
células T.
Tratamiento con anticuerpos “in vivo”: consiste en la inyección de animales o
humanos con un anticuerpo monoclonal dirigido contra una molécula particular de
la superficie celular. Este anticuerpo va a actúar sobre las células que expresan
esta molécula llevando a su eliminación o a la inhibición de la función,
dependiendo del isotipo del anticuerpo utilizado. La eliminación de un determinado
tipo celular o la inhibición de la función de una determinada molécula puede
proveer información sobre su rol y relevancia. El tratamiento con anticuerpos
monoclonales también se utiliza en humanos con fines terapéuticos. Debido a que
generalmente se requieren de tratamientos crónicos para ver efectos, es frecuente
que los humanos desarrollen anticuerpos contra las inmunoglobulinas de ratón. Es
por eso, que en la actualidad se utilizan anticuerpos humanizados o quiméricos.
II.
Animales que portan mutaciones naturales:
Dentro de las cepas de animales que presentan mutaciones naturales, los más
utilizados para el estudio de la función de las células del SI son:
-ratones SCID: en estos ratones no se produce la diferenciación de los linfocitos
y por ellos son altamente sensibles a infecciones por una gran variedad de
agentes infecciosos. El defecto genético se localiza a nivel de los genes que
codifican para RAG1 y RAG2, enzimas involucradas en los rearreglos genéticos
de las porciones variables del TCR y las Igs. Sin embargo el estroma de sus
órganos linfáticos primario es perfectamente normal. Puesto que el defecto
radica en sus propias células linfoides y debido a que presentan un
microambiente estromal normal, el injerto de médula ósea (células stem) de
animales normales permite la correcta diferenciación de células T y B
inmunocompetentes generando de esa manera un sistema inmune intacto. Estos
animales que poseen parte de su SI proveniente de un animal, por ej. A,
madurando en órganos linfáticos de otro animal receptor, por ej. B, se
denominan quimeras (en alusión a aquellos animales fantásticos de la mitología
griega).
Generalmente la nomenclatura utilizada para las quimeras es la siguiente:
A
B, que indica la inyección de médula ósea (o células de algún otro órgano
linfoide) de la cepa A en la cepa B
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Los animales SCID son excelente receptores de subpoblaciones purificadas.
-Ratones Nude: en estos ratones el defecto radica en el epitelio cortical tímico
por lo que carecen de células T y por ello son muy útiles para estudiar el rol que
cumplen dichas células. El hecho de repoblar estos animales con distintas
subpoblaciones de células T (CD4-CD8) permite evaluar la función individual de
cada una de estas poblaciones.
III.
Animales genéticamente modificados:
Animales transgénicos
Se denominan animales transgénicos a aquellos a los cuales se les ha introducido
una copia extra o una copia alterada de un determinado gen en su genoma. Para
producir estos animales el gen clonado es introducido en el genoma del ratón
mediante una microinyección dentro del pronúcleo masculino del huevo fertilizado,
el cual es luego implantado dentro del útero de una hembra pseudo preñada. En
algunos huevos así tratados, el DNA extraño se integra AL AZAR en el genoma
dando lugar a ratones que tienen una estructura extra en el genoma conocida
como TRANSGEN (Fig.1)
Figura. 1
Rata hembra es inducida a
su perovular con hormona FSH
y gonadotrofina corionica y
po steriormente puesta a cruzar
Un huevo fertilizado es extraido de la
hembra y el DNA elegido es inyectado
en el pronucleo masculino.
El hue vo inyectado es transferid o a una
hembra pseudop reñada
Alguna de las crías seguramente
portará el transg en
La cría transgénica se cruza con una
cepa a elección para obtene r un linea
de ratones transgénicos
Esta técnica permite estudiar el
impacto de un gen recientemente
descubierto en el desarrollo de un
organismo vivo, identificar regiones
regulatorias necesarias para la
normal expresión de la proteína en
los tejidos y determinar los efectos
de la sobre-expresión o de la
expresión de esta proteína en
tejidos en los que generalmente
está ausente.
Los ratones transgénicos han sido
muy útiles para el estudio del rol de
los receptores de las células T y B
en el desarrollo y selección de las
poblaciones.
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Los ratones transgénicos han sido particularmente útiles para estudiar la
diferenciación de la célula T. Si un gen ya rearreglado de la cadena α o β se
inserta en el genoma de ratón, en general ocurre la exclusión alélica de los genes
α y β endógenos. Esto hace que el repertorio de célula T de un animal
transgénico esté formado prácticamente en su totalidad por el TCR transgénico.
Esto implica que en vez de tener un determinado TCR en una frecuencia normal
que oscila 1 en 104-106, la especificidad del TCR transgénico puede representar
hasta un 90% del repertorio dependiendo del grado de exclusión alélica del TCR
endógeno.
Animales knock out
En algunos casos las funciones de un gen particular sólo puede dilucidarse si se
obtiene un animal carente de dicho gen. La obtención de estos animales ha sido
posible ya que existen líneas celulares de células progenitoras embrionarias (ES)
que pueden ser mantenidas en cultivo en un estado indiferenciado y que son
capaces de generar todos los linajes celulares cuando se los coloca dentro de un
embrión de ratón que es implantado en útero. Dichas líneas celulares se obtienen
de tumores embrionarios que pueden ser inducidos artificialmente en algunas
cepas de ratones. Para obtener ratones deficientes en un gen particular (ratones
“knock out”) se reemplaza el gen en estudio mediante recombinación homóloga
en estas líneas celulares embrionarias (Fig.2a). Posteriormente se seleccionan las
células mutadas (sólo una copia del gen debe estar mutado). La célula
embrionaria mutada es inyectada dentro de un embrión temprano donde es
incorporada al embrión en desarrollo, contribuyendo a todos los tejidos del animal
resultante. El gen mutado puede ser así transmitido a algunas crías y por
entrecruzamiento entre éstas, obtener animales homocigotas para la mutación
(Fig. 2b).
Recombinación homóloga: esta metodología consiste en alterar las copias de un
gen clonado in vitro de manera que sean no funcionales e introducirlas en la célula
en estudio donde se recombinará en el genoma celular con el gen homólogo,
reemplazando al gen normal. Debido a que la recombinación homóloga es un
evento raro en células de mamíferos, es necesario una buena herramienta para
seleccionar a las células que han incorporado el gen mutado en el lugar del gen
normal. Generalmente, la construcción genética utilizada es mutada por la
interrupción de la secuencia del gen en estudio con la introducción del gen
funcional de resistencia a algún antibiótico, por ej. la neomicina, que permite luego
la selección de las células que lo han incorporado. Además la construcción tiene
también la secuencia del gen de la timidin kinasa del virus herpes simple (HSVTK). Las células que incorporan el DNA al azar retienen tanto la resistencia a la
neomicina como la actividad de TK, mientras que las que lo integran por
recombinación homóloga retienen la resistencia a la neomicina pero no el gen
HSV-TK. Por otro lado, las células que contienen el gen HSV-TK son susceptibles
a la droga ganciclovir. Por eso las células que han integrado el DNA foráneo por
recombinación homóloga tienen la particularidad de ser resistentes a neomicina y
a ganciclovir y de esa forma son eficientemente seleccionadas. (Fig.2a)
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Figura 2: Obtención de animales knock out
a)
b)
Construcción genética que contiene
exones del gen de la B2-microglobulina junto con el
gen del HSV-TK
Transfectar la construcción con el gen B2microglobulina mutado en células ES
El gen deseado (B2-microglobulina) es interrumpido
por la inserción del gen de resi stencia
a la neomicina (neo r )
Inyectar las células ES transfectadas a un blastocito
de ratón
El DNA es introducido a la célula
El DNA no se integra
Las células se
mueren por la
neomicina (G418).
El DNA se integra al
AZAR en el genoma, las
células expresan los
genes neor y HSV-TK
Las células se
mueren por el
ganciclovir
La recombinación
homóloga reemplaza al
gen endógeno con la
copia interrumpida
La célula expresará el
gen neor pero no
HSV-TK; no morirá ni
por G418 ni por
ganciclovir
Reim plantar el blastocito en una hembra
pseudopreñada
Seleccionar la cría que porte tejido y células
germinales que deriven de las células inyectadas
Cruzar estos animales para generar una línea
homocigota en la deficiencia en B2microglobulina
El problema con la deleción de genes se presenta cuando estos son esenciales
para la supervivencia del animal. En estos casos los genes son llamados genes
letales recesivos y por lo tanto es imposible generar animales homocigotos para
estos genes. En el caso de querer analizar genes letales recesivos de células
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linfoides se aplica la siguiente estrategia: células ES homocigotas para la mutación
letal son inyectadas en blastocitos de ratones deficientes en la enzima RAG (al no
tener la enzima RAG, estos ratones no rearreglan los genes de la
inmunoglobulinas ni del TCR y por lo tanto no tienen ni linfocitos B ni T). Mientras
estos ratones quiméricos se desarrollan, las células deficientes en RAG
compensan cualquier falla en el desarrollo causada por el gen knock out en las
células ES, excepto aquellas fallas que afecten la diferenciación del tejido linfoide.
Si esas células ES son capaces de diferenciarse a progenitoras hematopoyéticas
en médula ósea los embriones sobrevivirán y todos sus linfocitos se diferenciarán
a partir de las células ES (Fig.3)
Figura 3
Células ES con una mutación letal en
homocigotas son inyectadas en
blastocitos RAG-
El ratón resultante es quimérico con
linfocitos derivados de las celulas ES
Las células RAG- no pueden generar
linfocitos. Los linfocitos de sólo
provienen de las células ES
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Otra forma de solucionar el problema de los genes letales recesivos es utilizando
el sistema de recombinación del bacteriófago P1. Este bacteriófago tiene una
proteína que actúa como recombinasa, la enzima Cre. Cre es capaz de escindir
regiones del DNA que se encuentren flanqueadas por secuencias que señalizan la
recombinación (secuencias señal) que se denominan lox p. Por técnicas de
biología molecular, se pueden realizar construcciones en donde el gen que se
quiere anular se encuentre flanqueado por secuencias lox p. Luego por
recombinación homóloga esta construcción se introduce en células ES y se
genera un ratón que posee el gen inyectado y las secuencias lox p (que se
introducen regiones intrónicas o que no alteren la funcionalidad normal del gen.
Por otro lado, se hacen ratones transgénicos para la recombinasa Cre, pero el
gen Cre se coloca bajo la acción de promotores específicos de tejido.
Posteriomente, se cruzan estas dos líneas de animales y se seleccionan aquellos
transgénicos para la Cre recombinasa y que posean el gen con los sitios lox p. La
recombinasa actuará sólo en los tejidos en donde su promotor sea activado y
escindirá el gen en cuestión. Asi, por ejemplo, usando un promotor específico de
las células B para dirijir la expresión de la recombinasa Cre, un gen puede ser
eliminado solo en las células B, mientras que en todas las otras células del animal
permanecerá funcional.
(Figura 5)
Factores de transcripción
específicos para el linfocito
B
Secuencia
blanco
Gen endógeno
Plásmido
Cromosoma
recombinasa
Gen endógeno
modificado pero
funcional
Cromosoma
Knock out de B7.2
específico para células
B
Cromosoma
eliminado
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II. Análisis de la respuesta inmune in vivo:
Durante el transcurso de las clases teóricas de la asignatura , se ha estudiado
cómo se generan las dos ramas efectoras que generalmente coexisten en una
respuesta inmune: la generación de anticuerpos (inmunidad humoral) y la
activación de células T cooperadoras y células T citotóxicas (inmunidad celular).
Aunque generalmente en todas las respuesta inmunes ambas poblaciones
celulares (linfocitos T y B) son activadas, el rol efector puede implicar una u otra
rama de la respuesta o ambas. Para determinar si dicho rol efector es ejercido a
través de la respuesta inmune humoral (anticuerpos) o celular (linfocitos T) o
ambas en conjunto, es posible transferir suero o diferentes sub-poblaciones
celulares ( Li T, Li T CD4+, Li T CD8+ , Li B) de animales inmunizados a animales
receptores normales.
Si el rol efector es conferido luego de la transferencia de suero, decimos que el
mismo está ejercido por la “inmunidad humoral”. La transferencia de inmunidad
por antisueros o anticuerpos purificados, provee protección inmediata contra
algunos
microorganismos
patógenos,
contra
toxinas
liberadas
por
microorganismos patógenos (toxina tetánica) o el veneno de ofidios. Esta
inmunidad conferida es temporal dependiendo del tiempo de vida media de las
inmunoglobulinas transferidas. Este tipo de transferencia es denominada
inmunización pasiva. Sólo la inmunización activa (aquella que se genera al
inyectar una antígeno) es capaz de generar inmunidad a largo plazo.(Fig. 4)
La protección contra otros microorganismos patógenos no se transfiere a través
del suero, pero si puede transferirse a través de la inoculación de células
mononucleares de animales inmunizados a animales normales genéticamente
idénticos. Este tipo de transferencia es denominada transferencia adoptiva o
inmunización adoptiva y la inmunidad transferida es denominada inmunidad
adoptiva. Este tipo de estrategia es utilizada en forma experimental en humanos
para tratamiento de cáncer o luego de un transplante de médula ósea en donde se
transfieren células T del paciente o de un donante de médula ósea (Fig 4)
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Figura 4
Patógenos
muertos
Desafío
(patógenos vivos)
Animal vivo
Inmunización
activa
Suero
Esplenocitos
Desafío con dosis letal de patógenos
Animal vivo
Inmunización pasiva
Animal vivo
Inmunización
adoptiva
La presencia de inmunidad activa puede determinarse in vivo en humanos y en
animales de experimentación mediante pruebas cutáneas. Si la reacción aparece
luego de un determinado tiempo de inyectado el antígeno, nos está indicando la
presencia de anticuerpos o linfocitos efectores o de memoria específicos contra el
antígeno inyectado.
La presencia de linfocitos efectores o de memoria se puede determinar
inyectando una pequeña dosis del antígeno deseado por vía subcutánea. La
respuesta aparece 24 o 48 hs después como un área roja e indurada en el lugar
de la inoculación. A esta prueba se la denomina prueba de hipersensibilidad d e
tipo demorada ( ej: reacción de Mantoux ).
La presencia de anticuerpos específicos, principalmente de tipo de IgE también
puede determinarse mediante pruebas cutáneas denominadas pruebas de
hipersensibilidad inmediata. Esta prueba consiste en la inoculación por vía
subcutánea del antígeno (alergeno) en muy baja concentración. La respuesta local
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caracterizada por un enrojecimiento y edema en el lugar de la inoculación se
puede observar entre 15 a 20 minutos después de la inyección.
Luego de la infección con algunos microorganismos patógenos (bacterias, virus,
hongos o parásitos) se genera una respuesta inmune específica que es capaz de
proteger al huésped de futuras infecciones con el mismo microorganismo.
Mediante la inyección de microorganismos vivos atenuados, microorganismos
muertos o antígenos purificados de microorganismos en presencia de adyuvantes
(vacunación), se trata de imitar el efecto de la infección natural sobre el sistema
inmune induciendo la generación de inmunidad protectora en ausencia de
infección. La determinación de la eficacia de la vacunación se realiza infectando
lotes de animales vacunados y controles y determinando la prevalencia, severidad
y sobrevida luego de la infección (Fig. 5)
Solución salina
Patógenos muertos
Después de 10 días, desafío con dosis letal
Muerte
Infección
Sobrevida
Inmunización activa
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Problemas:
1. Luego de la infección con Trypanosoma cruzi, un parásito protozoario
flagelado causante la Enfermedad de Chagas se produce una importante
respuesta inmune capaz de controlar la parasitemia. Además de esta respuesta
protectora. A tiempos variables luego de la infección, tanto los humanos como los
animales de experimentación presentan alteraciones que afectan el normal
funcionamiento del músculo cardíaco. En la etiopatogenia de esta enfermedad
infecciosa muchos investigadores asignan al sistema inmune un rol patogénico.
Para dirigir la investigación sobre los mecanismos involucrados en la
protección (disminución de la parasitemia y sobrevida de los animales infectados)
o en la patogénesis (alteraciones del funcionamiento cardíaco):
a) Cómo obtendría un antígeno soluble de T. cruzi?
b) Cómo induciría inmunidad específica en animales de laboratorio contra
el antígeno obtenido purificado?
c) Cómo demostraría la presencia de inmunidad específica en los animales
de experimentación
• pruebas "in vivo"
• pruebas "in vitro"
d) Cómo demostraría que la inmunidad inducida es capaz de proteger
contra la infección.
e) Cómo demostraría que la inmunidad inducida es capaz de generar
patogénesis (daño).
f) Cómo demostraría si la protección es ejercida por la inmunidad humoral
o la celular?
Cómo demostraría si la inmunidad humoral o la celular es la responsable de la
patogénesis en esta enfermedad ?
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2. Se ha generado un ratón que posee un TCR transgénico que reconoce un
antígeno presente únicamente en los machos, el antígeno H-Y, en el contexto del
complejo mayor de histocompatibilidad tipo I, H2-Db (recordar que en ratón las
moléculas del MHC tipo I se denominan H2-K, H2-D, H2-L)
Utilizando un anticuerpo anti-CD4 marcado con un fluorescente verde (FITC) y
otro anti-CD8, marcado con un fluorescente rojo (rodamina), se analizó la
maduración de timocitos en machos y en hembras transgénicos por citometría de
flujo. Los resultados obtenidos se graficaron en gráfico de dot-plot:
Hembra
21.6%
60%
10.8%
11.1%
19.4%
15%
72%
Anti-CD4
Anti-CD4
Anti-CD4
9,5%
Distribución de las poblaciones de timocitos
En ratones wild type
Macho
62.3%
6.3%
8%
5%
Anti -CD8
Responda las siguientes preguntas:
a) ¿Cuáles son las 4 poblaciones mayoritarias de timocitos que pueden
establecerse según la expresión de los marcadores CD4 y CD8 en timo?.
b) Analice los porcentajes de las 4 poblaciones en cada uno de los tres
paneles (hembra y macho transgénicos y ratón wild-type (normal)
c) ¿Que población está sensiblemente modificada en el macho? ¿A qué se
debe este fenómeno?
El problema que Ud. acaba de resolver y discutir con el docente es el experimento
realizado por Harold von Boehemer y publicado en la revista Nature 333; 742,
1988. Es unos de los experimentos clásicos que permitió dilucidar el mecanismo
de selección negativa en timo
3. Se han generado ratones knock out para β2-microglobulina, para la cadena
β de las moléculas del CMH II o para ambas moléculas.
A continuación se muestra los patrones de expresión de células mononucleares de
nódulo linfático en dichos animales teñidas con anticuerpos anti-CD4 y anti-CD8
marcados con FITC y rodamina respectivamente y analizados por citometría de
flujo. Los resultados presentados en gráficos de dot-plot fueron los siguientes:
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a
CD4
b
c
d
CD8
a) ¿Qué proteínas verán afectada su expresión en estos ratones?
b) Indique cuál de los paneles (a, b, c y d) corresponde al patrón de expresión
de linfocitos CD4 y CD8 en nódulo linfático de ratones de los distintos lotes:
Lote 1: MHC clase I +; MHC clase II - (I+ II-)
Lote 2: MHC clase I -; MHC clase II + (I- II+)
Lote 3: MHC clase I -; MHC clase II - (I- II-)
Lote 4: wild type
c) Indique (en forma semicuantitativa, con cruces) cuál de los siguientes
parámetros estará alterado en estos animales (I+II-; I-II+; I-II-; wt)
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Lote1
I+II-
Lote2
I-II+
Lote3
I-II-
Lote4
wt
Vía exógena del procesamiento antigénico
Respuesta inmune a infecciones virales
Respuesta de anticuerpos fijadores de
complemento
Respuesta
inmune
a
Mycobacterium
tuberculosis
Respuesta inmune de mucosas (niveles de IgA)
4. En este problema te contamos los experimentos realizados por Rolf
Zinkernagel y sus col. Ellos realizaron la primera serie de experimentos con
quimeras de medula ósea y timo a fines de los `70. De estos experimentos se
pudieron extraer importantes conclusiones.
A modo general, el experimento consiste en infectar ratones de un determinado
haplotipo (para simplificar A, B o AxB) con un virus. Posteriormente, se extraen
linfocitos de estos ratones infectados con dicho virus a células blanco infectadas
con el mismo virus y marcadas con 51Cr. Estas células blanco pueden presentar
antígenos virales en el contexto de estos supuestos alelos A o B. Se mide así la
liberación del radioactivo como una medida de la citotoxicidad o lisis de los
linfocitos a las células blanco.
Experimento 4 y 5: ratones letalmente irradiados y reconstituidos con medula ósea
(depletada de células T maduras) proveniente de ratones F1 (cruza de A x B)
Experimento 6 y 7: igual que en las lineas 4 y 5 excepto que los ratones
receptores fueron timectomizados (línea 6 y 7) y posteriormente transplantados
con timos de ratones F1 (línea 6).
P orcentaje de lis is de c élulas
m arcad as con 51 Cr ,
expres ando alel os M HC ti po
A o B s egún se indi ca
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Para responder y discutir con el docente:
a) ¿qué conclusiones puede establecer de los experimentos 1 y 2 ?¿Qué
indican los valores obtenidos en el experimento 3?
b) ¿qué conclusiones puede establecer de los experimentos 4 y 5?
c) ¿ por qué cree Ud, que en la experiencia 4 los linfocitos provenientes de
stem cells A x B sólo lisan las células de haplotipo A?
d) ¿En qué experimento se demuestra que es en timo donde se moldea o se
“educa” la restricción MHC?
5. Los ratones homocigotas para la mutación en el gen gld (gld-/gld-)son
deficientes en la expresión de la molécula FasL y presentan enfermedades
autoinmunes y linfoproliferativas como consecuencia de una falla en los
mecanismos apoptóticos. Utilizando estos ratones se realizaron los siguientes
diseños experimentales:
células stem normales
1) ratón scid
células T normales
2) ratón nude
células stem gld-/gld-
3) ratón scid
células T gld-/gld-
4) ratón nude
A) Teniendo en cuenta que tanto el ratón 3 como el 4 desarrollaron las
manifestaciones desarrolladas en los animales gld-/gld-. Qué podría concluir
acerca de la expresión y/o funcionalidad de la molécula FasL presente en células
B? JSR
B) Los ratones 1 y 3 fueron infectados con Trypanosoma cruzi y en ellos se
determinaron (por ELISA) los niveles de citoquinas en suero, la parasitemia y la
sobrevida obteniendo los siguientes resultados:
ratón 1
ratón 3
INF γ (DO)
IL4 (DO)
1200
213
ND
1310
N0 de
parásitos/ml
0,5 x 106
4,8 x 106
mortalidad
1/5
5/5
i) Según estos resultados que subpoblación de cel T CD4 (Th1 o Th2) sería
mas suceptible a la muerte gatillada por FasL durante la infección con
Trypanosoma cruzi? JSR.
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6. Se injecta un ratón de la cepa Balb/c con células mononucleares
humanas, luego de la tercera inyección se preparan Acs monoclonales a partir del
bazo de estos ratones. Uno de los Acs monoclonales obtenido reacciona con una
molécula presente en la superficie de células B activadas, macrófagos (M) y
células dendríticas.
a) Qué técnicas utilizaría para caracterizar a la proteína reconocida por el Ac.
monoclonal.
b) Cómo llegaría a obtener la secuencia del gen que la codifica?
c) Cómo produciría mutaciones del gen en cuestión en una línea celular de
macrófagos que expresa la proteína de superficie.
d) En el siguiente experimento se cultivan M intactos o modificados pulsados con
el antígeno OVA con una línea celular de linfocitos T específicos para OVA en
presencia o ausencia de diferentes anticuerpos monoclonales. Luego de 48 hs
de cultivo se mide en el sobrenadante de cultivo la liberación de IL2.
Considerando los siguientes resultados, indique que molécula de superficie
podría ser la reconocida por el anticuerpo.
M pulsados con
OVA
Normales
Gen X mutado
Normales
Gen X mutado
Li T específiocos
para OVA
Anticuerpo
monoclonal
+
+
+
+
anti X
anti CD28
Liberación de
IL-2
+++
+
+++
BIBLIOGRAFIA
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