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Tesis de Doctorado en Medicina
Título
Bases Para una Inmunoterapia Racional e Integrada
del Cáncer de Mama Avanzado
Autor
Gustavo Antonio Moviglia.
Médico
Director de Tesis
Profesor Juan Carlos Cavicchia.
Doctor en Medicina,
Profesor Emérito de Histología y Embriología.
Facultad de Medicina
Universidad Nacional de Cuyo
Lugar:
Universidad MaimónidesBuenos Aires - Argentina-
1
Índice
Página
Plan de Tesis
3
Introducción
5
•
Bases Bioéticas
•
Normas Internacionales de Aceptación como de Uso Corriente de una
Terapia Innovadora
•
Bases Biológicas de la Enfermedad Neoplásica.
•
Desarrollo normal de la glándula mamaria, e interacción del epitelio
mamario con el sistema inmune.
Oncogénesis, crecimiento, diseminación metastásica e interacción del cáncer de
mama con el sistema inmune.
9
11
16
28
45
Terapias Oncológicas Actuales
63
Base de las Terapias Inmunes Actuales
67
Aplicación Clínica de Terapias Inmunológicas para el Cáncer de Mama. Nuestra
Experiencia.
83
•
Material y Métodos
83
•
Preparación de los diferentes productos celulares
102
•
Resultados: Seguridad de las Terapias Inmunes Utilizadas
112
•
Resultados: Eficacia de las Terapias Inmunes Utilizadas
121
•
Resultados: Eficiencia de las Terapias Inmunes Utilizadas
132
Postulación de principios para el uso racional e integrado de la inmunoterapia con
las otras formas terapéuticas
135
Bibliografía
139
Anexo 1
174
Anexo 2
200
Anexo 3
205
2
Bases Para una Inmunoterapia Racional e Integrada
del Cáncer de Mama Avanzado
Plan de Tesis
Objetivo Primario
Presentar las bases racionales en el uso de terapias inmunológicas (Monoinmunoterapias, poli-inmunoterapias o terapias combinadas) para el tratamiento
del Cáncer Avanzado de Mama.
Objetivos Secundarios
1. Establecer la factibilidad de estas terapias inmunológicas innovadoras.
2. Evidenciar
la
validez
del
principio
terapéutico
de
estas
terapias
inmunológicas
3. Evidenciar la Seguridad de estas terapias Inmunológicas.
4. Desarrollar un método apropiado para el estudio de la eficacia de estas
terapias inmunológicas.
5. Evidenciar la eficacia de estas terapias Inmunológicas.
6. Evidenciar la eficiencia de estas terapias inmunológicas.
Plan de Actividades
1. A través de una investigación bibliográfica se hará referencia al desarrollo
función y regulación fisiológica del órgano sano.
2. A través de una investigación bibliográfica se hará referencia al proceso de
transformación y diseminación neoplásica basada en la desregulación de
las relaciones celulares y microambientales del tejido glandular.
3. A través de una investigación bibliográfica se hará referencia respecto de la
respuesta inmune local y sistémica frente a este proceso de desarrollo y
mantenimiento de la enfermedad neoplásica.
3
4. Se describirán diversas estrategias terapéuticas actuales.
5. Se desarrollará, a través de experiencias citadas en la bibliografía
internacional y de las realizadas por nosotros, el marco de las estrategias
inmunoterápicas que se utilizan.
6. Describiremos los resultados obtenidos en nuestra experiencia personal
respecto de la factibilidad, seguridad, eficacia y ventana terapéutica de
diversas inmunoterapias aplicadas a humanos, exponiendo nuestros
resultados.
7. Postularemos criterios de integración de la inmunoterapia en el marco de
una estrategia combinada que abarque las diversas formas terapéuticas
actuales a fin de procurar la curación del Cáncer Avanzado de Mama.
4
Introducción
El adenocarcinoma de la glándula mamaria es el cáncer con mayor incidencia y
prevalencia entre las mujeres. En nuestro país, y en la mayoría de los países
industrializados de Occidente, constituye la segunda causa de muerte por
neoplasias. Durante el año 2002 se reportaron más de un millón de nuevos
casos, con una prevalencia a los cinco años de cuatro millones cuatrocientos
mil casos. [1]
En la actualidad se hace especial hincapié en extremar los esfuerzos sanitarios
para lograr un diagnóstico temprano de la enfermedad, ya que cuando la
misma se encuentra en sus primeros estadios existen altas posibilidades de
lograr la curación completa del paciente.
Sin embargo, a pesar de los esfuerzos realizados en esta dirección, y de la
mayor comprensión de las bases moleculares de la biología del tumor de
mama, aproximadamente el 30% de los pacientes con estadios tempranos, que
han recibido el tratamiento estándar completo desarrollan enfermedad
recurrente. Por otro lado, el 5% de los pacientes al ser diagnosticados ya
poseen diseminación metastásica. [2]
El 70 % de éxitos terapéuticos observados en el tratamiento de lesiones
tempranas se basa en un correcto uso de terapias locales (Cirugía y
radioterapia) y sistémicas (agentes citotóxicos, medicación hormonal, fármacos
dirigidos
a
blancos
metabólicos
específicos
(Targeted
Therapies)
e
inmunoterápicos).
En general los agentes sistémicos actúan eficazmente sobre el 90 % de los
tumores primarios y el 50% de las metástasis. Sin embargo, luego de un lapso
variable, la neoplasia avanza (por diseminación metastásica) o recurre
(localmente). Cuando ocurre cualquiera de estas dos situaciones, la resistencia
a las terapias previamente utilizadas no sólo es frecuente sino que es lo
esperado.
La sobrevida a cinco años de los pacientes con enfermedad recurrente y/o
metastásica es del 20 % y la sobrevida media varía, según los diferentes
parámetros de pronóstico, entre 12 y 24 meses.
5
En
ese
tipo
de
presentaciones
el
adenocarcinoma
posee
múltiples
manifestaciones clínicas y el enfoque terapéutico actual de la enfermedad
avanzada no es curativo sino paliativo. Está dirigido a extender la calidad y
duración de la sobrevida de los pacientes. Las respuestas terapéuticas no
duran por mucho tiempo y los subsecuentes tratamientos utilizados poseen un
porcentaje de efectividad cada vez menor. Por lo tanto, la toxicidad y efectos
adversos de las diversas terapias disponibles juegan un rol esencial en las
decisiones terapéuticas a tomar, siendo la preservación de la calidad de vida el
principal factor a considerar. [2, 3]
Es entonces evidente que el desarrollo de nuevas terapias eficaces y eficientes
para el Cáncer Avanzado de Mama constituye un desafío médico no resuelto,
cuya necesidad de resolución es imperiosa.
Para encarar este desafío se considera esencial tomar en cuenta un enfoque
integral de la biología tumoral, no sólo en relación a la biología molecular
(aspecto genético-metabólico) sino respecto al conjunto de interacciones que
genera el tumor con el organismo hospedante durante su desarrollo (aspecto
epigenético).
En 1960 el Dr. H. Prieto Díaz en su “Biología Celular para Médicos”, en el
capítulo sobre biología celular del cáncer, postulaba que las enfermedades no
son más que el resultado de la exacerbación de algunos de los procesos
celulares normales, y la represión de otros.
Conforme a este concepto, que guarda plena vigencia en la actualidad, las
patologías no generan una nueva biología sino, por el contrario, muestran en
forma parcial y disarmónica el proceso biológico que, en otras circunstancias, o
especies, ocurre en forma armónica, para solucionar un problema concreto.
Al estudiar la biología molecular que rige el comportamiento de los así llamados
oncogenes y de sus interacciones con los factores epigenéticos que los
influyen, así como el de la célula tumoral en sus interacciones con las otras
células, tejidos, órganos y sistemas a los que se integra, nos resultará fácil el
aceptar que las neoplasias remedan la biología del órgano que les dio origen.
6
Entre las interacciones que condicionan la agresividad y progresión del cáncer
de mama, nuestros conocimientos actuales indican que el sistema endocrino y
el inmune cumplen roles esenciales.
Se ha encontrado una gran similitud entre la forma como un tejido se repara o,
en el caso de la mama, sufre cambios dependientes de la vida sexual de la
mujer, y la forma en que crecen los tumores, se estimula su crecimiento y estos
escapan al control de la vigilancia inmunológica.
Al ser la glándula mamaria un órgano sexual secundario femenino, al igual que
ésta, el adenocarcinoma de mama guarda una particular hormono-dependencia
tanto en su génesis como en su crecimiento y diseminación. [4]
El Sistema Inmune actúa sobre el tejido mamario normal durante el ciclo
sexual, el embarazo, la lactancia y la disminución de tamaño glandular post
lactancia. Durante esos tiempos favorece la diferenciación del tejido mamario,
su hormono sensibilidad y remisión controlada, así como permite la
inmunización pasiva del lactante. Estas complejas acciones dependen de una
interacción de señales recíprocas, donde el epitelio mamario controla
facultativamente su tolerancia por parte del sistema inmune. [5, 6]
Si bien la terapéutica moderna focaliza su acción en la regulación de las
influencias endocrinas sobre el cáncer de mama [7], poco o nada se ha
avanzado sobre el estudio y uso del conocimiento de la interacción glándula –
sistema inmune para el manejo inmunológico de esta patología.
Probablemente este descuido haya tenido su base en el concepto expresado
por Allan CP y col [8] de que el cáncer de mama era muy poco inmunogénico,
y por lo tanto pobre candidato para el tratamiento inmunoterápico.
Varios trabajos pre-clínicos y clínicos apoyan el concepto de que el sistema
inmune, a través de la elaboración de una reacción efectora específica,
desempeña un importante papel en el control y rechazo de tumores mamarios
establecidos. Sin embargo esta respuesta estaría atenuada por múltiples
factores inhibidores.
En efecto, han sido identificados muchos antígenos asociados al tumor de
mama (TAA, del ingles Tumor Associated Antigens). Algunos de estos parecen
desempeñar un papel crítico durante la tumorigénesis y por ello constituyen
7
blancos atractivos para el desarrollo de inmunoterapias [9].
Existen evidencias del reclutamiento y activación de células dendríticas dentro
de los adenocarcinomas de mama [10]. La presencia de estas células impacta
favorablemente sobre la sobrevida de los pacientes. Más aún, se observa una
sorprendente relación inversa entre la presencia de células tumorales en el
ganglio centinela y su contenido de células dendríticas.
Se ha documentado la presencia de leucocitos que infiltran al tumor (TIL, del
ingles Tumor Infiltrating Lymphocytes). Sin embargo su función está
disminuida por la secreción, por parte de la célula tumoral, de citoquinas
inhibidoras, alteración de la expresión en las células tumorales de las MHC
(Abreviación inglesa de Moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad), de las moléculas coestimuladoras, así como la expresión
aberrante de ligandos de las moleculas Fas, e incremento de linfocitos y
macrófagos reguladores entre las células que conforman el infiltrado TIL (Treg
y MDSC respectivamente), entre otras razones. [11].
Estos hechos nos permiten vislumbrar parte de la complejidad del desarrollo de
una terapia inmune. Por un lado debe reconocer, a un mismo tiempo, múltiples
y diferentes antígenos celulares, para generar sobre ellos una reacción inmune
efectora específica. Por otro lado debe controlar los diferentes factores de
regulación inmune generados directa y/o indirectamente por el tumor.
Para ir afrontando uno a uno estos problemas y generar un programa de
inmunoterapia activo hemos comenzado utilizando una vacuna celular
autóloga, generada por las células tumorales del paciente, fusionadas con
linfocitos B activados autólogos (TBH, Tumor Cell B-Lymphocyte Hybrid) [12].
Esta vacuna, desarrollada en nuestro laboratorio, ha sido usada en asociación
con linfocitos activados y con células dendríticas naive del paciente [13-14], así
como junto a dos inmunomoduladores: la Ciclofosfamida y la Timosina α−1
[15]. Hemos estudiado sus efectos como tratamientos únicos y sus sinergias al
combinarlos, pudiendo desde allí arribar a conceptos básicos para el enfoque
inmunoterápico del Cáncer Avanzado de Mama.
La vacuna TBH fue desarrollada en su fase pre-Clínica por Guo y
colaboradores [16], y el resultado de estos estudios fue publicado en la revista
8
Science en 1993. A posteriori, en nuestros laboratorios, utilizando un modelo
de glioblastoma animal, el producido por la línea celular F98 (singénico de las
ratas Fisher 344), corroboramos lo afirmado por Guo. Investigamos su
mecanismo de acción y demostramos que su asociación a otros tratamientos
podía incrementar sus posibilidades de éxito terapéutico.
En 1995, en el congreso la “European Society of Haemapheresis”,
presentamos los resultados obtenidos por la aplicación de este tratamiento a la
clínica. El trabajo fue seleccionado para su publicación en “Transfusion
Medicine” que era en ese momento la revista oficial de esa asociación [12].
El estudio de todas las variables relacionadas al uso terapéutico de la vacuna
TBH se realizó a través del análisis de los datos obtenidos por el tratamiento,
en bases compasivas, de un grupo de 275 pacientes. Ellos padecían de
diferentes tipos de tumores avanzados. Para esos pacientes no había ningún
tipo de terapia estándar disponible, ya sea por que no existía una, o porque las
existentes habían fracasado, o bien no fueron toleradas por ellos obligando a
su suspensión.
De ese grupo de 275 pacientes se destaca el estudio realizado sobre la
evolución de 50 pacientes con Cáncer Avanzado de Mama. Sobre ellos, a lo
largo del tiempo, y con fines estrictamente compasivos, procuramos mejorar los
resultados terapéuticos, aplicando distintas terapias innovadoras. A partir de los
resultados de ese estudio se postulan las bases para que la inmunoterapia del
cáncer avanzado de mama se convierta en una opción clínica de uso corriente.
Bases Bioéticas
Todas esas actividades se han realizado conforme a los principios bioéticos de
la “Declaración de Helsinski” [17], en particular por lo expresado en su punto
32. Estos principios han sido a posteriori explicados en el “Reporte Belmont”
[18], y las “Pautas Éticas Internacionales para la Investigación Biomédica en
Seres Humanos (CIOMS)” [19].
Estos documentos constituyen, junto al Código de Nüremberg, la base ética de
toda actividad médica innovadora aplicada a pacientes, y forman parte de
9
pactos internacionales a los cuales se ha adherido la República Argentina, que
les ha conferido rango Constitucioonal en el Ordenamiento Jurídico Nacional.
Estos documentos establecen que todos los procedimientos terapéuticos, ya
sean los universalmente aceptados por su eficiencia reconocida, o los
innovadores, son actos médicos.
Sobre los innovadores, la declaración de Helsinski dice en el punto 32:
“Cuando los métodos preventivos, diagnósticos o terapéuticos disponibles han
resultado ineficaces en la atención de un enfermo, el médico, con el
consentimiento informado del paciente, puede permitirse usar procedimientos
preventivos, diagnósticos y terapéuticos nuevos o no probados, si, a su juicio,
ello da alguna esperanza de salvar la vida, restituir la salud o aliviar el
sufrimiento. Siempre que sea posible, tales medidas deben ser investigadas a
fin de evaluar su seguridad y eficacia. En todos los casos, esa información
nueva debe ser registrada y, cuando sea oportuno, publicada. Se deben seguir
todas las otras normas pertinentes de esta Declaración.”
Por tanto estos procedimientos innovadores no solo pueden sino que también
deben ser usados fuera de un contexto de ensayo clínico cuando la condición
patológica refractaria de un paciente, según el buen saber y entender del
médico, puede mejorarse o aun revertirse con su empleo.
En esto sigue en un todo la tradición Hipocrática y la de Claude Bernard (18131878), Fundador de la Medicina Experimental, quien en 1865 afirmaba en su
Introducción al Estudio de la Medicina Experimental: “…Entonces, entre los
experimentos que pudieran ser ensayados en un hombre, aquellos que sólo
puedan causar daño están prohibidos. Aquellos que son inocentes están
permitidos y aquellos que pudieran hacer bien son obligatorios”[20].
Tal como lo explicita el reporte Belmont estos actos con terapias innovadoras
deben ser considerados de “Uso Compasivo” y deben estar regidos por tres
principios: 1.- Según el buen saber y entender del médico, basado en razones
científicas, deben procurar el bien del paciente. (Principio de Beneficiencia); 2.Deben ser ofrecidos a todos los que lo necesiten (Principio de Justicia) y 3.Deben ser aceptados libremente por el paciente (Principio de Autonomía). Este
último punto se plasma en el consentimiento informado. [18],
10
De estos tres principios se infieren al menos dos importantes consecuencias
éticas: 1.- El Paciente debe tener la libertad de negarse a continuar con el
tratamiento en cualquier momento que él lo decida, y 2.- El médico debe estar
atento a suspender la terapia si detectase que el procedimiento, lejos de
beneficiarlo está, en alguna forma, perjudicando al paciente.
Por ultimo, el punto 32 de la Declaración de Helsinki dice: “…Siempre que sea
posible, tales medidas deben ser investigadas a fin de evaluar su seguridad y
eficacia. En todos los casos, esa información nueva debe ser registrada y,
cuando sea oportuno, publicada.” Esta es la razón por la cual, habiendo
minuciosamente aplicado estos principios éticos en los 275 pacientes que
mencionásemos, nos vemos en la obligación de estudiar retrospectivamente
los datos de seguridad y eficacia de los métodos utilizados y darlos a conocer
para beneficio del saber médico.
Normas Internacionales de Aceptación como de Uso Corriente de
una Terapia Innovadora
Según la CIOMS (Confederación Internacional de Organizaciones Médicas,
fundada por la UNESCO en 1947) la aceptación de una terapia innovadora
como de uso corriente requiere el que se establezcan tres características para
esta práctica: seguridad, eficacia y eficiencia: [19],
Conocer cuál es la seguridad de un acto médico significa saber si produce
efectos adversos no deseados, cuáles son esos efectos no deseados, y cómo
debe realizarse la terapia para que ésta no sea peligrosa, o lo sea lo menos
posible (si su aplicación lo justifica, tal como ocurre con el tratamiento
quimioterápico).
Conocer cuál es la eficacia de un acto médico significa saber si puede lograr el
efecto para el que ésta se realiza. Por ejemplo, si se administra una sustancia o
un producto contra el cáncer, debe ser capaz de detener el crecimiento del
tumor, disminuir su tamaño o hacerlo desaparecer (es lo que se denomina
Respuesta Tumoral).
11
Conocer cuál es la eficiencia de un acto médico significa saber si el efecto
terapéutico logrado es capaz de modificar la historia natural de la enfermedad
sobre la que se actúa, y mejorar o igualar los resultados de tratamientos preexistentes, pero con mayor beneficio para el paciente (menor complejidad,
mejor calidad de vida, disminución de la toxicidad asociada, menor costo, etc.).
Continuando con el ejemplo anterior, la sustancia o producto capaz de detener
el crecimiento de un tumor debe ser también útil en extender la sobrevida del
paciente, y/o de generarle menor toxicidad que los tratamientos pre-existentes,
o permitirle una mejor calidad de vida.
La Historia Natural de la enfermedad se refiere al desarrollo de una dolencia sin
que existan intervenciones médicas: Formas de presentación, etapas
sucesivas, tiempo de sobrevida, secuelas, grado de discapacidad, etc. Por
extensión también puede considerarse “Historia Natural” a la que presenta el
paciente correctamente tratado con el mejor tratamiento estándar que se le
pueda ofrecer.
Como se obtienen los Datos de Seguridad Eficacia y Eficiencia
El conocimiento de la seguridad, eficacia y eficiencia de una práctica médica se
realiza a través de su uso, en forma controlada, en personas que libremente
(es decir con pleno conocimiento del carácter novedoso de la terapia, sus
potenciales riesgos y sin ningún tipo de coerción) deciden someterse a la
misma.
Tal como lo definen el tratado de Helsinski, el informe Belmont y la CIOMS [1719], la aplicación de este recuso terapéutico nuevo puede ser realizado de dos
formas distintas: como acto médico para tratar de salvar la vida o mejorar la
condición patológica de quien no tiene otra opción (uso compasivo), o dentro
del marco de un ensayo clínico con el objeto primordial del conocimiento
(Investigación).
La casi totalidad de los actos médicos han sido aceptados como de uso
corriente a través del análisis de los resultados clínicos observados en los
pacientes tratados por uso compasivo. Modernamente se ha aceptado, en
particular para el uso de fármacos, el realizar una actividad académica
12
investigativa denominada ensayo clínico. Esta última, a diferencia de la primera
posee como objeto primario el de averiguar datos científicos sobre la droga y
no procurar la mejoría del paciente, y está vinculada fundamentalmente con los
intereses de la Industria Farmacéutica.
Ejemplos clásicos, entre muchos otros, sobre la aceptación de terapias
basados solamente en el análisis de los resultados clínicos obtenidos, los
constituyen el
uso de las transfusiones de sangre, el tratamiento de
infecciones con penicilina, el desarrollo de la cirugía laparoscópica y el
transplante de médula ósea.
Durante la segunda guerra mundial, los soldados, a consecuencia de sus
heridas, se desangraban e infectaban. El desarrollo de las técnicas
transfusionales y del uso de la penicilina para tratar a estos pacientes fue
guiado sólo por el buen juicio médico. Al concluir el conflicto bélico, luego de
haberse salvado miles de vidas por la aplicación de estas medidas terapéuticas
a quienes no tenían otra opción, se publicaron los resultados relacionados con
la seguridad, eficacia y eficiencia de estas terapias.
Algo similar ocurrió con el uso de la cirugía laparoscópica. Su aceptación como
práctica de uso corriente no fue mediada por un ensayo clínico sino por el
análisis de los resultados clínicos de quienes habían sido tratados en base
compasiva con esta metodología. Aquí no medió la urgencia de la guerra ni el
peligro de vida del paciente. Se procuró y logró, con técnicas e indicaciones
muy conocidas, utilizando una tecnología innovadora, mejorar la toxicidad
asociada y el tiempo de recuperación de las técnicas quirúrgicas clásicas.
Por otro lado, conforme lo establece la CIOMS, el desarrollo de un ensayo
clínico para considerar de uso corriente la aplicación de un fármaco o de una
vacuna con intención de profilaxis bacteriana y/o viral debe recorrer, a
posteriori de la fase preclínica (ensayo en animales de laboratorio e in Vitro),
tres fases: La fase I que es la orientada a recoger los datos concernientes a la
seguridad de la terapia, la fase 2 para probar su eficacia y la fase 3 para
establecer su eficiencia.
13
Se considera fase 4 cuando se averigua la eficiencia de un fármaco o una
vacuna antibacteriana o antiviral para una aplicación distinta a la
descripta originalmente.
Según
las
normas
internacionales,
sugeridas
tanto
por
agencias
gubernamentales de países donde se practica una alta vigilancia sanitaria
como por estadígrafos y epidemiólogos de nombre internacional [23], el número
de personas necesario sobre el que deben recogerse datos para que el estudio
de una sustancia sea válido está entre 9 y 25 personas cuando se informan
datos sobre seguridad, entre 20 y 200 pacientes para los datos de eficacia y un
número variable entre 30 y miles de pacientes para los datos referidos a la
eficiencia.
El amplio rango de variabilidad del número requerido para establecer estas
características, en particular el de la eficiencia de un fármaco o de un método
terapéutico estriba en el grado de beneficio observado. Estadísticamente se
requiere mayor número de casos estudiados cuando el beneficio obtenido es
menor respecto de la historia natural de la enfermedad y/o de los tratamientos
pre-existentes de una dolencia en particular.
Así, por ejemplo, se necesitó sólo la comparación entre tres grupos de 111
pacientes cada uno para comprobar que el Interferón beta 1 b disminuía en un
30% la velocidad de progresión de la esclerosis múltiple en su forma clínica
recaída-remisión en los pacientes tratados a altas dosis respecto de los
pacientes no tratados. [21]
Por otro lado se necesitaron estudiar los resultados clínicos de 2800 pacientes
con Cáncer de Páncreas en estadios avanzados de la enfermedad tratados con
Gencitabine (Gemzar). Esto ocurrió porque la diferencia en la extensión de la
sobrevida fue de sólo 5 semanas más que la lograda con la terapéutica previa
existente: el 5 fluoro uracilo (5 FU). La sobrevida media lograda por los 1400
pacientes tratados con 5 FU fue de sólo cuatro meses y dos semanas mientras
que la sobrevida media de los 1400 pacientes tratados con Gemzar fue de
cinco meses y tres semanas. [22]
Una vez que el profesional de la salud ha recogido los datos de seguridad,
eficacia y eficiencia estos, según lo aconsejan todos los acuerdos éticos
14
internacionales deben ser adecuadamente comunicados a la comunidad
científica. Probablemente el método más apropiado sea el de someterlo a la
discusión pública a través de la publicación de los resultados en Revistas con
comité científico editorial (“peer reviewed”, según la voz inglesa).
Una alternativa a la publicación es la de la presentación de los datos en
Congresos Internacionales donde la aceptación de los trabajos se realice con
los mismos métodos rigurosos de selección. La aceptación de un trabajo en
este tipo de revistas o la sucesiva presentación de datos en congresos
científicos como los mencionados confiere validez científica a la observación
clínica.
Los organismos reguladores como la FDA, las autoridades sanitarias de la
Unión Europea, las de la Confederación Helvética o las del Japón consideran
como válido, tanto el reporte de la experiencia clínica de casos tratados en
base compasiva como el de los obtenidos a través de las diferentes fases que
caracterizan a los ensayos clínicos.
En este último caso se debe seguir un riguroso orden, primero se debe realizar
un ensayo fase I para establecer la seguridad del producto y obtener una idea
aproximada de la dosis, o el rango terapéutico de una droga o un
procedimiento. Si esta primera fase es aprobada se autoriza la fase II para
confirmar el modo de acción postulado así como para ajustar aún más tanto la
dosis como el modo de aplicación de la sustancia o la terapia; finalmente se
autoriza la fase III donde se evalúa la eficiencia del fármaco o del tratamiento
propuesto.
Un camino intermedio estriba en el punto donde los datos aportados justifican
que se comience con un ensayo fase II o con fase III. Esto siempre supone que
los datos observados son suficientes para dar por sentado los datos que se
hubiesen obtenidos de realizarse las fases previas.
15
Bases Biológicas de la Enfermedad Neoplásica
Definición de Neoplasia
Las neoplasias se originan en células con potencial reproductivo que, por una
alteración genética, desarrollan una desregulación de su crecimiento y
diferenciación.
Al reproducirse, éstas células, generan a los tumores malignos que se
caracterizan por estar constituidos por células pobremente diferenciadas, con
un patrón de crecimiento anárquico y con capacidad de diseminación
metastásica. [24]
Figura 1: Síntesis de proteínas – Regulación Genética
Crecimiento y diferenciación celular
Se entiende por crecimiento al incremento de protoplasma celular específico.
Se define por protoplasma específico al cúmulo de estructuras celulares y
proteínas propias que caracterizan a la función de esa célula. Por tanto el
incremento de la actividad de los genes específicos, evidenciado por el
incremento de la producción del ARN correspondiente, es el primer signo de
crecimiento celular (ver figura 1). Este incremento de la síntesis proteica
conlleva un aumento del tamaño celular sin incremento de la cantidad de ADN.
En biología celular se denomina hipertrofia a esta situación. [24]
16
De persistir el estímulo que motivó la hipertrofia celular, ésta responde en un
primer momento a través de la amplificación de los genes actuantes y en un
segundo momento con la duplicación de todo el material genético (síntesis de
ADN).
Cuando la célula ha duplicado su ADN, ésta puede a) permanecer sin dividir su
núcleo ni su citoplasma, generando una célula tetraploide; b) dividir solo su
núcleo pero sin dividir su citoplasma, generando una célula binucleada; o c)
dividirse en dos células hijas. En los tres casos se habla de hiperplasia del
tejido. [24]
Si bien todas las células nucleadas de un tejido son capaces de hipertrofiarse,
sólo un pequeño grupo de células, en general mucho menos maduras que el
resto, pueden duplicar su ADN, es decir generar la hiperplasia del tejido. Entre
estas últimas células se encuentran las así denominadas “células madre del
tejido”.
La célula madre es aquella que posee la capacidad de reproducirse dando
origen a dos tipos diferentes de células: una que conserva la característica de
continuar (casi indefinidamente) dividiéndose y la segunda que comienza a
madurar (diferenciarse en una determinada dirección). Esta segunda célula
generalmente pude dar lugar a un número limitado de generaciones de células
hijas. [24]
Las células madre se relacionan íntimamente con un segundo tipo de células
que actúan a modo de nodrizas celulares. Éstas, en conjunto con ciertos
elementos de la matriz extracelular configuran un microambiente peculiar que
se denomina nicho celular. Éste es quien determina cuándo debe reproducirse
una célula madre y cuándo debe permanecer en estado quiescente. [25]
Al dividirse una célula madre en dos hijas, una permanece alojada en el nicho y
la otra comienza a diferenciarse en el tipo celular correspondiente al tejido del
que forman parte. Por esta doble descendencia, una célula que permanece
como reserva celular y otra que comienza su camino de diferenciación celular
se dice que la división de la célula madre es asimétrica.
Se entiende por diferenciación celular al proceso por el cual una célula madre
adquiere en forma progresiva cambios respecto de su función y morfología
17
para convertirse en una célula especializada. Estos cambios corresponden al
silenciamiento de genes activos de la célula madre y a la activación de otros
previamente silentes. [24]
Cuando las células se reproducen pasan, en forma cíclica, por etapas
perfectamente caracterizadas, que en conjunto conforman el “ciclo celular” (ver
figura 2). [24]
Las células que participan de este ciclo, cuando las condiciones se lo
demandan, permanecen en reposo (estado quiescente). Las Células que se
encuentran en esta fase se dice que están en G0.
Ante determinados estímulos, la célula madre es inducida a que duplique su
genoma. La fase durante la cual la célula se dispone a duplicar su ADN se
denomina G1 (del ingles gap: brecha, intervalo), y la posterior durante la cual
sintetiza ese material genético se denomina S (de síntesis).
A posteriori la célula repara los errores de trascripción de las cadenas del ADN
ocurridas durante la fase S y se prepara para los complejos fenómenos de la
mitosis (división primero del núcleo y luego del citoplasma celular). Esta fase se
denomina G2. Por último se denomina fase M a la fase en la cual se realiza la
división mitótica. [24]
Figura 2: Fases del Ciclo celular
18
Fruto del proceso de diferenciación, la célula pierde gradualmente la capacidad
de dividirse indefinidamente pero desarrolla funciones que le permiten al tejido
del cual forma parte ser fisiológicamente eficiente. Así las células progenitoras
hematopoyéticas dan origen a los distintos elementos formes de la sangre, las
progenitoras del epitelio intestinal situadas en las criptas de Lieberkühn, a los
enterocitos altamente especializado de las vellosidades intestinales. [25-26]
Figura 3: Nicho de las células Madres de las criptas de Lieberkühn
Las células que se diferencian atraviesan cuatro fases: la de proliferación, la
indeterminada, la de maduración y la de estar completamente diferenciada.
Fase de Proliferación: Las primeras células hijas que comienzan a diferenciarse
conservan la posibilidad de dividirse. Bajo estímulos apropiados estas células
pueden volver a adquirir características de célula madre.
19
Fase de indeterminación: las células pierden su capacidad de volver a
convertirse en células madre pero continúan dividiéndose y diferenciándose.
Fase de maduración: las células pierden su capacidad de dividirse pero
continúan diferenciándose.
Fase de Células Diferenciadas: Las células ya diferenciadas permanecen en
este estado hasta su muerte por apoptosis.
Figura 4: Progenie celular de las células madre hematopoyéticas e intestinales
Regulación Genética y Regulación Epigenética
En el parágrafo anterior mencionamos que las proteínas son las responsables
de constituir el protoplasma funcional de una células. Debemos aclarar ahora
que por su función podemos clasificarlas como estructurales, enzimáticas o que
poseen ambas cualidades. Estos tres tipos de proteínas son por lo tanto los
efectores genéticos que determinan la morfología y la totalidad de las funciones
de una célula. Cada una de las células somáticas de un organismo posee la
totalidad de los genes que regulan a la totalidad de las proteínas factibles de
ese organismo multicelular. El silenciamiento de ciertos genes y la activación
de otros determina qué tipos de proteínas son las que esa célula va a sintetizar
y, por ende, es el proceso por el cual se genera la diversidad celular. En otras
palabras, éste es el proceso por el cual una misma célula madre puede dar
origen a neuronas, fibroblastos, linfocitos, células epiteliales, etcétera.
20
¿Qué es lo que determina cuál es el camino de diferenciación celular por el que
va a transitar esa célula madre?. En la actualidad se acepta que, tanto durante
el desarrollo embrionario como en la vida adulta, las influencias del
microambiente celular sobre una célula indiferenciada son las que hacen que
ésta tome determinados caminos de diferenciación. Las señales son emitidas
por la matriz extracelular sobre la que se apoya la célula indiferenciada, las
células con las que entra en contacto, los factores humorales que inundan el
microambiente en el cual está inmersa y los requerimientos funcionales a los
que está sometida [24]. Estas señales desencadenan una cascada de
reacciones moleculares intracelulares que finalizan con el silenciamiento de
ciertos genes y la activación de otros y al conjunto de fenómenos que
determinan esta diferenciación del ADN se lo conoce como regulación
Epigenética.
Transición Epitelio-Mesénquima
Para entender cómo se establecen estas relaciones celulares, cómo de ellas
deviene la organización arquitectural-funcional propia de cada órgano, cómo se
producen los cambios referentes a la maduración funcional postnatal, a la
reparación de los daños tisulares y cómo de la alteración de estas relaciones
devienen patologías tales como la fibrosis y el cáncer, debemos referirnos al
proceso denominado Transformación Epitelio-Mesénquima (EMT) y su inverso
Transformación Mesénquima-Epitelio (MET).
Una de las más primitivas divergencias fenotípicas que acontecen en el
desarrollo embrionario temprano es el de la distinción entre células epiteliales y
células mesenquimáticas.
Las Células epiteliales proveen la cohesión en las uniones célula-célula que
resulta ser esencial para el mantenimiento de la integridad de un organismo
multicelular pues funciona como una barrera necesaria para establecer y
mantener un medio interno controlado, independiente del medioambiente
externo [27].
En los mamíferos la epitelización ocurre durante los primeros estadios del
desarrollo embrionario, durante la compactación de la blástula [28, 29]. Poco
21
tiempo después la gastrulación da lugar a la formación del mesénquima [30].
Las células con fenotipo mesenquimal son las que le dan estructura a las
células epiteliales a través de la producción de la matriz
extracelular. A
diferencia de las células epiteliales, que poseen muy poco movimiento, las
mesenquimales son muy móviles, desplazándose a través de los tejidos. [31].
La interconversión fenotípica entre células epiteliales y mesenquimales se
denomina EMT (del inglés Epithelial-Mesenchymal Transition) y el proceso
inverso se llama MET (del inglés Mesenchymal-Epithelial Transition). Estos
procesos proveen la flexibilidad fenotípica esencial durante el desarrollo
embrionario, remodelación tisular, curación de heridas y regeneración de los
tejidos completamente diferenciados [27, 32].
La EMT también se observa en procesos patológicos como la fibrosis y el
cáncer [33]. La mayoría de las vías de señalización y los factores de
transcripción de los procesos EMT fisiológicos se hallan activados durante los
EMT patológicos. Esto es particularmente cierto para la invasión tumoral y su
diseminación metastásica. [34, 35].
Durante el proceso fisiológico de EMT ocurren coordinadamente una serie de
eventos altamente especializados (Figura 5) [27]. Comienzan con la pérdida de
la polarización ápico basal al disolverse las uniones estrechas (zonula
ocludens) que fijan a las células epiteliales unas a otras. De esta forma las
proteínas de membrana, suspendidas en el fluido lipídico bi-laminar que forma
esta estructura, pueden mezclarse libremente [36]. A posteriori comienzan a
deshacerse las uniones adherentes (Zonula adherens) y las uniones
comunicantes (gap junctions). Por último la membrana basal subyacente
comienza a ser degradada [37]. Las proteínas de la superficie celular como las
E-cadherina e integrinas, que median las conexiones entre células epiteliales
vecinas y con la membrana basal son reemplazadas por N-cadherina y otro
grupo de integrinas que proveen a la célula de propiedades de adhesión
transitoria tal como lo exige el fenotipo mesenquimal. Como parte de esta
transición los elementos del citoesqueleto se reorganizan. Las moléculas de
actina de la perifería son reemplazadas por proteínas de estrés, mientras que
los filamentos intermedios de citoqueratina son reemplazados por filamentos de
vimentina. Estos cambios de la membrana celular y del citoesqueleto son los
22
responsables de que la forma cuboidal epitelial se transforme en fusiforme. Por
último la célula adquiere la propiedad de invadir y moverse a través de la matriz
extracelular sin necesidad de realizar algún contacto con ninguna otra célula.
Presumiblemente durante este proceso la célula epitelial adquiere resistencia a
la propiedad de anoikis (entrar en apoptosis por perder contacto con la
membrana basal) y adquiera la sensibilidad para responder a señales
extracelulares que guían con precisión su migración hasta arribar a destino. Al
llegar allí las células Mesenquimales realizarían el proceso inverso (MET) [38].
Por tanto durante el transcurso del desarrollo las células progenitoras
atravesarían distintos estadios de EMT o MET una o varias veces hasta dar
origen a la diversidad de órganos que constituyen nuestro cuerpo.
Figura 5: procesos celulares y moléculas implicadas en el proceso EMT [332]
En cáncer, características de EMT han sido observadas en las neoplasias de
mama, [39], ovario [40], colon [41], y esófago [42]. La EMT oncogénica está
asociada con la pérdida de la polaridad ápico-basal [43], la desintegración de
las uniones estrechas [44] y de las Zonulas Adherens, cambios en el
citoesqueleto, incluidos la disminución de producción de citoqueratina y el
incremento de la síntesis de vimentina [45], y la adquisición de un fenotipo
móvil e invasivo. Estos cambios guardan paralelismo con los antes descriptos
para la EMT fisiológica que ocurre durante el desarrollo.
Se han identificado numerosos inductores de la EMT en líneas de células
neoplásicas: Transforming Growth Factor-β (TGF-β) [46], Wnt [47], Snail/Slug
[48, 49], Twist [50] and Six1 [51, 52]. Estos inductores son también críticos
durante la EMT fisiológica [53-56].
En el contexto de los carcinomas, la EMT prove una explicación coherente y
unitaria que explica tanto la invasion de los tejidos circundantes, de los vasos
linfáticos y sanguineos y la diseminación metastásica (Figura 6). Reforzando
23
esta idea se ha comprobado a través de evidencias clínicas que la presencia
de reguladores de la EMT en las células cancerosas está directamente
relacionada con el pronóstico ominoso y la agresividad del tumor [57, 58].
Figura 6: Se resumen las principales EMT-MET que ocurren durante la oncogénesis, la
invasión de los tumores a los tejidos adyacentes y la diseminación metastásica. [332]
Regulación Epigenética y Cáncer
La metilación del ADN es el proceso epigenético más conocido. Éste participa
en la regulación de la expresión génica de dos maneras: directamente, al
impedir la unión de factores de transcripción, e indirectamente, propiciando la
estructura "cerrada" de la cromatina.
En los humanos, la metilación del ADN ocurre sobre las moléculas de citocina
que preceden a las de guanina. La secuencia de estos pares de nucleótidos se
denomina dinucleótidos CpG. El ADN presenta regiones de 1000-1500 pares
de bases (pb) ricas en dinucleótidos CpG ("islas CpG"). Estas son reconocidas
por las enzimas ADN-metiltransferasas. Durante la replicación del ADN estas
enzimas metilan al carbono 5 de las citosinas de la cadena recién sintetizada,
por lo que la “memoria” del estado de metilación se localiza en la cadena hija
del ADN. (Figura 7)
24
Figura 7: Metilación del ADN
Se acepta que la metilación es un proceso unidireccional, por tanto cuando una
secuencia CpG se metila de novo, esta modificación se hace estable y es
heredada como un patrón de metilación clonal. Por otra parte, la pérdida de
metilación genómica (hipometilación), como evento primario, se asocia
frecuentemente con el proceso de transformación neoplásica y ésta es
proporcional a la severidad de la enfermedad.
La metilación del ADN ocurre en el contexto de la modificación química de las
proteínas nucleares denominadas histonas. Las histonas no son simplemente
proteínas de empaque del ADN, sino estructuras moleculares que participan en
la regulación de la expresión del gen. Ellas almacenan la información
epigenética a través de modificaciones post-transduccionales como la
acetilación de lisina, metilación de arginina y lisina, y fosforilación de serina.
25
Estas modificaciones afectan la transcripción del gen y la reparación del ADN.
Se ha propuesto que las distintas modificaciones de las histonas dan lugar a un
“código de histona”. La acetilación de lisinas de histonas, por ejemplo, está
generalmente asociada con la activación de la transcripción.
Las consecuencias funcionales de la metilación de histonas depende del tipo
de residuo - lisina (K) o arginina- y el sitio especifico que la metilación modifica
(ej. K4, K9 o K20). La metilación de H3 en K4 esta muy ligada a la activación
transcripcional, mientras que metilación de H3 en K9 o K27 y de H4 en K20
esta asociada a la represión transcripcional. Lo que emerge desde estos
hallazgos es un flexible pero preciso patrón de metilación del ADN y
modificación de las histonas que es esencial para la actividad fisiológica de
células y tejidos.
El genoma de las células envejecidas, el de las pre-neoplásicas y el de las
cancerosas comparten tres cambios importantes respecto de su grado de
metilación. Estos cambios son considerados eventos tempranos del desarrollo
de algunos tumores. El primer cambio se refiere a la hipometilación de la
heterocromatina. Esto conduce a una inestabilidad genómica e incrementa los
eventos de recombinación mitótica. El segundo se refiere a la hipermetilación
de genes individuales. El tercero se refiere a la hipermetilación de la islas CpG
de genes constitutivos y genes tumor-supresor. Los procesos de metilación y
los de demetilación pueden presentarse en forma individual o simultánea. En
general, la hipermetilación está involucrada con el silenciamiento de genes y la
hipometilación con la sobre-expresión de ciertas proteínas involucradas en los
procesos de invasión y metástasis. [59].
La perdida de metilación es principalmente debida a la hipometilación de
secuencias repetitivas de ADN y demetilación de regiones codificantes e
intrones – regiones de ADN que permiten versiones alternativas del ARN
mensajero (m ARN) que trascribe un gen.
Esta falta de control epigenético propia de los tumores puede ser revertida si
las células tumorales son cultivadas en un medioambiente adecuado. Así
diversos autores han demostrado que si se cultivan líneas tumorales humanas
en un estroma sano, joven, e incluso embrionario, las células neoplásicas
26
adquieren un fenotipo normal [60]. Similar fenómeno ha sido observado in vivo
por la transferencia de células tumorales de la madre al feto durante el
embarazo. Estas células raramente desarrollan tumores en la descendencia,
aunque el fenómeno opuesto, la transferencia
y persistencia de células
mesenquimales del feto a la madre ha demostrado ser causa de enfermedades
autoinmunes y de neoplasias [61].
A la luz de estos hallazgos la aparición de un tumor se produce no solo por la
alteración genética de una célula con capacidad proliferativa sino que ésta
debe estar asociada a la desregulación epigenética, la totalidad de los
elementos que conforman el entorno de esa célula (sustancia extracelular,
contacto con otras células, factores humorales del microambiente y
requerimientos funcionales).
De lo dicho puede inferirse una nueva definición de neoplasia donde existe una
relación dinámica de desregulaciones genéticas y epigenéticas originadas
primariamente en el entorno celular que inducen a la expresión, la sobreexpresión y la represión de diversos grupos de genes. Esto da lugar a la
formación de un tejido cuyo crecimiento, morfología y función siguen leyes
anárquicas. Este neo-órgano, utilizando los medios de la homeostasis orgánica,
progresa a expensas del resto de la economía dando lugar a la aparición de la
enfermedad neoplásica.
27
Desarrollo normal de la glándula mamaria, e interacción
con el sistema inmune del epitelio mamario
Crecimiento, diferenciación e involución de la glándula mamaria
durante el ciclo sexual femenino
La figura 8 resume las principales características de la estructura de la glándula
mamaria adulta.
Figura 8: Estructura de la Glándula Mamaria
Para alcanzar esta compleja estructura, a diferencia de lo que ocurre con la
mayoría de los órganos, la mayor parte de la organogénesis se concreta luego
del nacimiento, en particular acompañando al desarrollo puberal y, para ciertos
aspectos propios del epitelio secretor, sólo se concreta al finalizar el período
involutivo que ocurre al fin del de lactación que sucede al primer embarazo.
Por otro lado, desde el momento que se completa el desarrollo inherente al
período puberal, la totalidad de la glándula, al igual de lo que ocurre con el
útero y con el ovario, debe remodelarse continuamente a causa de las
variaciones cíclicas de las hormonas reproductivas [62].
28
Plasticidad epitelial de la glándula mamaria.
La glándula mamaria se desarrolla en tres estadios. Un primer estadio de
desarrollo embrionario, que implica el desarrollo del rudimento primario de la
glándula. El segundo estadio durante el desarrollo puberal donde se produce la
elongación y ramificación de los ductos glandulares. Un tercer estadio que
acontece durante el primer embarazo donde ocurre la ramificación de tercer
orden de los ductos glandulares asociada a la diferenciación secretoria de los
alvéolos glandulares (figuras 9 y 12) [63].
El desarrollo de la glándula mamaria comienza en la sexta semana de
gestación con la aparición de la línea mamaria formada por las placodas
pertinentes que se desarrollan sobre esa línea (figuras 10 y 11). Las placodas
se invaginan dentro del estroma subyacente formando la yema mamaria. La
yema mamaria comienza a invadir el tejido adiposo que la rodea produciendo
entonces un rudimento de glándula formado por la primera generación de tubos
(ductos) glandulares y quedando en ese estado hasta la pubertad.
Durante la pubertad los ductos se elongan y ramifican llenando el panículo
adiposo mamario. Así permanece la glándula hasta producirse el embarazo, el
que induce el desarrollo de los alvéolos para que éstos produzcan leche
(Figuras 9 y 11). Durante el segundo estadio del desarrollo de la glándula es
cuando se forman las yemas terminales (TEB, del ingles Terminal End Buds)
(figura 13) [63]. Éstas son estructuras formadas por varias capas de células
epiteliales colocadas al final de los ductos alveolares, que a partir de este
estadio se constituyen en estructuras formadas por dos laminas de epitelio, el
luminal y el de las células mioepiteliales [64]. La bifurcación de los TEB se
realiza bajo la regulación de numerosos inductores extracelulares propios de la
regulación de la plasticidad epitelial e inductores de la EMT: epidermal growth
factor (EGF), Hepatocyte Growth Factor/Scatter Factor (HGF/SF), y la
activación de proteasas tales como las metaloproteinasas de la matriz (MMP)
[65].
Si bien las células de los TEB no llegan a desplegar un completo fenotipo
mesenquimal ni pierden sus estructuras de unión con otras células, varios
signos confirman que este es un proceso EMT: Las células pierden la polaridad
29
apico-basal demostrada por la distribución uniforme sobre su membrana de la
β-catenina, de localización habitual en la superficie basolateral, y de la proteinkinase C-ζ localizada en la superficie apical [66]. Así mismo los TEB secretan
proteasas como la MMP3, para adelgazar a la Membrana Basal subyacente
[64], activan las vías de inducción nuclear Msx2/Cripto-1 [67, 68] y expresan
un grupo propio de integrinas (α2, α3 y β1) receptoras de proteínas de la matriz
extracelular. [64, 69].
Figura 9: paralelo de los procesos que implican la EMT en el desarrollo normal de la glándula
mamaria y durante el proceso de oncogénesis y diseminación metastásica. [332]
Estudios de la expresión genética de los TEB realizados con el análisis por
“microarray” identifican a reguladores conocidos de la EMT: Snail y Twist [70].
Durante la formación embrionaria de la mama, los tejidos del mesodermo y el
ectodermo de la denominada línea mamaria deben interactuar. Estos procesos
de inducción mutua, lejos de ser simples y sólo confinados a un momento del
desarrollo, son complejos y se desarrollan durante todo el estadio. Reciproca y
30
secuencialmente ambos tejidos embrionarios modifican epigenéticamente su
expresión génica hasta arribar a la conformación de un epitelio glandular,
hormono-dependiente altamente especializado, capaz de nutrir y brindar
inmunidad pasiva al niño durante sus primeros seis meses de vida.
Figura 10: Desarrollo embrionario de la glándula mamaria
En el embrión de seis semanas aparece un engrosamiento bilateral del
mesodermo denominado línea mamaria (figura 10, señalada como mammary
ridges). Por la influencia de este particular tipo de mesodermo se genera un
crecimiento del ectodermo hacia el interior del mesénquima a la manera de la
gemación de los vegetales. [71-72]. (Figuras 10 y 11)
La influencia del mesénquima de las líneas mamarias respecto de la
diferenciación de este órgano puede homologarse al de la notocorda respecto
del desarrollo del tubo neural. Las señales que emite inducen a la proliferación
y particular diferenciación del epitelio ectodérmico adyacente. La figura 11,
resume alguno de los cambios de la expresión fenotípica que ambos tejidos,
epitelio y estroma, atraviesan durante el desarrollo de la glándula. [72-75].
En los humanos el crecimiento de la glándula mamaria comienza con la
pubertad. En esta etapa del desarrollo, las células del parénquima celular se
ramifican a partir de los extremos ciegos de los ductos primarios y secundarios
en un elaborado árbol con conductos y lóbulos múltiples. Durante cada ciclo
31
menstrual el número de células del epitelio mamario que proliferan varía
alcanzando su máxima proporción durante la fase lútea cuando la fracción de
crecimiento del epitelio es del 35% [76, 77] (figuras 9 y 12).
Figura 11: Desarrollo embrionario de la glándula mamaria (relación con el mesodermo) según
Gertraud W. Robinson Nature Reviews Genetics 2007; 8:963-972
Figura 12: Distintos momentos funcionales de la glándula mamaria
Durante el embarazo, el número de alvéolos por lóbulo se incrementa diez
veces y se forman nuevos lóbulos de similares características a partir del
crecimiento y ramificación de los ductos terminales existentes. Todo esto se
32
realiza a expensas del tejido conectivo, el que se ve reducido a su mínima
expresión en el espacio interalveolar [78].
Figura 13: estructura de los ductos primitivos y el nicho de células madre al ramificarse Según
Sternlicht M et al Differentiation. 2006; 74(7): 365–381
Basados en estos estudios de cinética celular Taylor-Papadimitriou et al [79]
postularon la existencia de diferentes poblaciones de células madre en los
33
adenómeros de la glándula mamaria adulta.
Esto fue corroborado por
Villadsen et al [80], a través de técnicas de marcación inmunohistoqímica.
Estos autores describieron tres tipos diferentes de células madre epiteliales:
Las que se localizan en los ductos primarios (en sus yemas laterales, ver figura
10, puntas de flecha negras), las de los ductos de segundo y tercer orden (en
sus yemas terminales o laterales, figuras 13 y 14) y las de los alvéolos.
Figura 14: Caracterización histoquímica y localización topográfica de las células madre de los
ductos secundarios y de las alveolares [80]
La capacidad de reproducción de estas diferentes células disminuye
progresivamente a medida que, en su crecimiento, se alejan de los ductos
primarios. Para volver a los conceptos que se expresaron con anterioridad, al
34
hablar sobre el ciclo vital de la célula, se confirma una vez más que el potencial
reproductor de cada población de células progenitoras disminuye a medida que
estas se alojan en regiones de mayor diferenciación epitelial.
Esta disposición espacial de las células epiteliales de la glándula mamaria
brinda una imagen especular de lo observado en el epitelio intestinal. En este
último se observa que las células del epitelio de absorción intestinal disminuyen
su capacidad reproductiva e incrementan su grado de diferenciación a medida
que estas se alejan del fondo de la cripta de Lieberkühn y se acercan a la
superficie libre del intestino. En el epitelio mamario ocurre a la inversa, el
potencial reproductor disminuye y el grado de diferenciación celular se
incrementa a medida que las células se alejan del pezón (comparar figuras 3y 4
con las 13, 14 y 15).
Figura 15: Regulación de las células madres por hormonas, factores de crecimiento y factores
de transcripción durante las distintas etapas del ciclo vital del epitelio mamario. [81]
35
La figura 15 representa los distintos estadios madurativos correspondientes a la
diferenciación de las células madre de los ductos primarios [81]. Estas células
no poseen receptores para estrógenos (ER-negativo). Luego de una primera
división asimétrica, una de sus células hijas (que continúa siendo pluripotente)
se convierte en ER positiva. Estas células hormono dependientes segregan
factores paracrinos que regulan la actividad de las células madre ER negativas.
Las células epiteliales pluripotentes pueden diferenciarse en tres linajes
celulares distintos: el progenitor del epitelio basal (células verdes de la figura
15) el progenitor del epitelio luminal ductal (células azul oscuro de la figura 15)
y el progenitor del epitelio alveolar (células grises de la figura 15).
Como resultado de la estimulación con estrógenos durante el desarrollo de los
ductos se activa el gen GATA 3. Éste podría determinar el destino del epitelio
luminal (alveolar o ductal). Por otro lado, la activación del gen ΔN-p63 podría
determinar la diferenciación en células mioepiteliales ductales.
Durante el embarazo la prolactina activa, en forma combinada, a los genes
GATA 3, Stat 5 y C/EBP lo que favorece que las células progenitoras
alveolares se diferencien en células alveolares. Éstas, por activación del gen
Elf5, comienzan a segregar leche. Por otro lado, la activación del gen ΔN-p63
convierte a las progenitoras alveolares en células mioepiteliales alveolares.
Durante años se ha pensado que sólo la acción directa de las hormonas
sexuales podía explicar la totalidad de los cambios necesarios del epitelio
mamario para que éste cumpla su función primordial que es la de segregar
leche. Sin embargo eso ha sido desmentido por experiencias muy sencillas que
serán explicadas en el próximo apartado
Función de las células mioepiteliales y del estroma mamario como
inductor del desarrollo y función del parénquima epitelial
Desde su origen embrionario la glándula mamaria se desarrolla en base a la
compleja y reciproca relación del ectodermo con el mesénquima subyacente.
Los procesos de inducción y diferenciación mutuos, secuenciales y recíprocos
36
continúan a través del desarrollo postnatal pues mesénquima y ectodermo, se
transforman en el estroma y el tejido glandular respectivamente.
Las interacciones celulares descriptas son esenciales para la correcta
consecución de los cambios por los que atraviesa la glándula durante el
desarrollo puberal, durante cada ciclo sexual, y durante el embarazo, lactancia
e involución post lactación de la glándula. Desarmonías en esta mutua
inducción permiten el desarrollo de tumores malignos de mama.
Las células mioepiteliales en primer lugar, y las células del estroma en segundo
lugar, así como las proteínas propias de la membrana basal del adenómero son
los elementos que conforman el nicho celular que controla la proliferación y
diferenciación de las diversas poblaciones de células progenitoras de la
glándula mamaria.
Diversas experiencias han demostrado la veracidad de estos conceptos. Se ha
observado que los cultivos primarios de células del epitelio mamario realizadas
en botellas de plástico, sin importar lo complejo de las mezclas hormonales y
de otros factores humorales con los que se enriquezca el medio, nunca logran
producir leche. Por el contrario al cultivar estas mismas células en una matriz
tridimensional de membrana basal reconstituida (Matrigel) adquieren un
fenotipo similar al epitelio mamario secretor [82, 83]. Le Beyec et al [84] han
demostrado que en estas condiciones tanto la relación tridimensional con otras
células así como el contacto con la membrana basal inducen una rápida
desacetilación de las histonas H3 y H4 asociada a un descenso global de la
transcripción.
Ahora bien en la glándula mamaria normal la mayoría de las células epiteliales
luminales no está en contacto directo con la membrana basal. Éllas descansan
sobre las células mioepiteliales (Figura 13). Éstas últimas son las que producen
la membrana basal (BM), que es la estructura que divide físicamente el
compartimiento del estroma del compartimiento epitelial.
En co-cultivos de células epiteliales con células mioepiteliales se ha observado
una reagrupación espontánea de ambas poblaciones formándose esferas
constituidas por una capa interna de células del epitelio secretor, rodeadas por
una capa externa de células mioepiteliales. Entre ambas poblaciones celulares
37
aparecen elementos extracelulares propios de la BM (laminina 1 y 5.) [85] y las
células epiteliales, a posteriori del reordenamiento espacial descripto, se
polarizan. Esto se ha demostrado por inmunohistoqímica ya que la sialomucina
(MUC1) y moléculas de ocluidina sólo se detectan en el borde apical, mientras
que el Antígeno Específico Epitelial (ESA) y la Integrina b-4 sólo pueden
detectarse en la membrana plasmática basolateral. [83].
Respecto de la relación del adenómero con el estroma caben señalar cuatro
elementos principales, la membrana basal, (a la cual ya hemos hecho
referencia en los dos párrafos anteriores) los fibroblastos, los adipocitos y las
células del sistema inmune.
Durante la embriogénesis las células mesenquimáticas del mesodermo de la
línea mamaria pueden determinar el fenotipo sexual de la glándula y los
adipocitos embrionarios [63, 86] controlan en forma específica el desarrollo de
los ductos mamarios. (Figura 16)
Figura 16: Algunas de las interacciones entre mesénquima y ectodermo durante los primeros
estadios del desarrollo de la glándula murina. Se consignan Genes que se activan
secuencialmente desde el día 11 al día 18 del desarrollo embrionario. [63]
Durante el desarrollo puberal (figura17) los adipocitos de la grasa del estroma
mamario apoyan la expansión del árbol de ductos mamarios, (esto último
probablemente muy influenciado por el papel que la misma
juega en el
metabolismo de las hormonas sexuales). Por otro lado, los fibroblastos del
estroma mamario regulan negativamente el crecimiento ductal a través de
proteínas de la sustancia extracelular, tales como el colágeno I y el
38
condroitinsulfato, inducidas por el TGF-beta del medio. El contacto directo de
las células epiteliales con estas dos proteínas activaría en ellas el fenómeno de
apoptosis. [86]
En el adulto, evidencias obtenidas por cultivo de tejido muestran que las
señales requeridas para la inducción de la diferenciación tejido-específico
durante el embarazo y el mantenimiento de la función durante la lactación se
originan en la membrana basal. Se puede inducir síntesis de Beta-caseína en
un cultivo de células del epitelio mamario puro si éstas están embebidas dentro
de una matriz de membrana basal reconstituida. Esta inducción se realiza a
través de una vía dependiente de la Integrina. Por el contrario, la degradación
de la matriz de membrana basal lleva a la pérdida de la producción de caseína
La preponderancia de la influencia del estroma sobre la diferenciación del
epitelio es tal que se ha demostrado que éste puede inducir a las
espermatogonias [87] y a los neuroblastos [74] a transformarse en epitelio
mamario. Más aún, es capaz de alterar el fenotipo de las células cancerosas
mamarias a un fenotipo más benigno [73, 75].
Figura 17: Algunas de las interacciones entre estroma y epitelio glandular durante el desarrollo
post natal de la glándula murina. Se consignan Genes y factores de diferenciación que actuan
secuencialmente para producir los cambios morfológicos y funcionales aquí graficados. [63]
En otras palabras puede afirmarse que al tomar contacto las células malignas
con las células del estroma normal, la sustancia extracelular y los factores
39
solubles extracelulares inducen la transdiferenciación de células cuyo genoma
ya había iniciado otro camino de diferenciación o había perdido su regulación.
Sin embargo las interacciones celulares descriptas, inducción del desarrollo de
los ductos y regresión de los ductos, no puede ser realizada sin la concurrencia
de un tercer elemento: las células del sistema inmune.
Figura 18 Influencia de la relación entre dos células vecinas para inducir la diferenciación
celular del epitelio mamario. [63]
En efecto, Gouon-Evans et al [88] demostraron que la presencia de macrófagos
y eosinófilos era esencial para que las yemas terminales de los ductos
epiteliales (TEB, Terminal End Buds) pudiesen crecer y ramificarse dentro del
estroma. Otro tanto ocurre con los fenómenos de regresión donde el TGF b,
40
sustancia segregada por los Linfocitos Th2 y los T reg, juega un papel esencial
en la inducción de los fibroblastos para que estos sinteticen colágeno I y
condroitinsulfatos.
Recientemente Watson CJ y su equipo [49, 90] han demostrado que los genes
que regulan los diferentes estados de diferenciación de las células epiteliales
son los mismos que regulan la diferenciación de los linfocitos Th0 para que
estos devengan en Th1 o Th2. El Epitelio indiferenciado posee activados
Genes Th1 y segrega citoquinas propias de estos linfocitos (Interferón gama,
Interleuquina 12 y TNFa); y el que se diferencia para segregar leche, por acción
de la prolactina activa, por el contrario, genes Th2 (Stat6) y segrega
Interleuquinas 4 , 5 y 13 que, en forma paracrina, activan a células vecinas.
En la figura 18 Watson [63] ha resumido cómo por el contacto de una célula
debidamente activada, que según Guon-Evans posee características de
macrófago M2, en conjunto con la secreción de Estrógenos y Prolactina, se
generan factores epigenéticos que al actuar sobre una célula epitelial
indiferenciada la diferencian en Secretora. Luego esta célula, en conjunto con
las células inmunes induce al resto de las células epiteliales del ducto.
Por otro lado durante la involución post lactación, las células epiteliales que
entran en apoptosis activan dos genes que inducen una respuesta inflamatoria
aguda: El Factor inductor de la transcripción Stat 3 y el factor nuclear NFkB.
Esto atraería hacia la glándula macrófagos y linfocitos necesarios para la
remodelación de la glándula y la prevención de infecciones oportunistas.
El actuar del sistema inmune favoreciendo la maduración post natal de un
órgano, así como su ulterior reparación y el mantenimiento de su función,
parece ser una condición propia de los distintos órganos de la economía. Este
fenómeno ha sido descripto gracias al esfuerzo conjunto de dos equipos del
Instituto Weizmann de Israel: el del Profesor Irun Cohen y el de la Profesora
Michael Schwartz.
Al mismo tiempo que Cohen desarrollaba el modelo de la encefalitis alérgica
experimental y descubría infinidad de clonas linfocitarias T autoagresivas
contra el tejido nervioso, Schwartz establecía que la reacción inflamatoria
41
deficitaria post injuria de los mamíferos era lo que impedía su reparación. [91,
92]
Ambos equipos poseían la sospecha que, más allá de la aparente contradicción
de sus observaciones, existía un proceso natural de relación entre ambos
sistemas. El defecto o la exacerbación parcial del diálogo que se establecía
durante una injuria daban lugar a un defecto de reparación o a una reacción
autoinmune respectivamente.
Para probar esta presunción, se unieron ambos grupos de investigadores.
Generaron una lesión traumática de la médula espinal en ratones. Luego les
infundieron linfocitos autoagresivos singénicos anti-mielina que habían sido
clonados en el laboratorio de Cohen.
Esos linfocitos, infundidos a animales intactos, penetran en el cerebro e
inducen una reacción autoinmune similar a la que se produce en una placa
desmielinizante de Esclerosis Múltiple.
Contrariamente a lo que se observaba en animales intactos, los linfocitos se
dirigían selectivamente al área lesionada e incrementaban varias veces la
reacción inflamatoria local, pero no producían síntomas sistémicos. Por el
contrario, en quince días los animales, aunque con dificultad, volvían a caminar
con sus cuatro patas.
Un grupo estrechamente relacionado con los dos anteriores, del Instituto Max
Planck de Alemania, agrupado por el Dr. R. Hohlfeld, brindó un aporte crucial y
esclarecedor. Demostró que los linfocitos T autoagresivos anti-mielina, al ser
expuestos al antígeno específico segregaban neurotrofinas. Es decir que al
llegar a la región dañada del SNC, además de desplegar su actividad citolítica,
producían factores de crecimiento y maduración de los distintos elementos del
tejido nervioso. [93]
Con estos elementos se forjó el concepto de “autoinmunidad protectora” tal
cual fue publicado en Nature Medicine en enero de 1999 [92].
En nuestro Instituto, decidimos estudiar si existía alguna relación directa entre
la capacidad reparadora de los linfocitos autoagresivos responsables de los
fenómenos de la autoinmunidad protectora y las MSC. Para esto, aislamos de
un mismo individuo linfocitos autorreactivos contra el SNC y MSC. Al co42
cultivarlas, en el breve lapso de 48 horas, las MSC se transformaban en células
madres neurales. Más aún, comprobamos que este cultivo podía ser utilizado
para reparar lesiones del SNC. [94]
Por último decidimos averiguar si este fenómeno de inducción específica de
diferenciación por linfocitos autorreactivos órgano específicos se aplicaba
también a otros órganos. Para esto, con una misma muestra de MSC
realizamos tres co-cultivos diferentes con linfocitos anti-mielina, anti-miocardio
y anti islotes de Langerhans respectivamente, sin el agregado de ningún factor
trófico exógeno ni utilizando matriz de adhesión alguna.
A las 48 horas el cultivo control con linfocitos indiferenciados conservaba su
morfología fusiforme habitual pero el incubado con los linfocitos anti-mielina
había adquirido fenotipo de neuroblastos. El correspondiente a los linfocitos
anti-miocardio había adquirido un doble fenotipo, de células endoteliales uno y
de miocardiocitos el segundo. El correspondiente a los linfocitos anti-islotes
había adquirido un doble fenotipo, el primero similar a células neuroendocrinas,
y el segundo similar a adenómeros secretantes (figura 19) [95].
MSC
Culture 48
hr control
MSC Culture + Anti-Islet Lymphocytes
48 hr co-culture
MSC Culture + Anti-Islet Lymphocytes
48 hr co-culture
Figura 19 Efecto de la co incubación de Linfocitos Autorreactivos anti Islotes de Langerhans
sobre la diferenciación de las MSC a las 48 horas de co-cultivo. [95]
43
Vistos estos últimos resultados creemos poder afirmar por extensión de
conceptos que el sistema inmune posee papel coordinador de los diversos
fenómenos fisiológicos que implican primariamente el actuar de las células del
estroma pero, probablemente también lo hagan respecto de la función de las
células del epitelio mamario.
44
Oncogénesis, crecimiento, diseminación metastásica e
interacción con el sistema inmune del epitelio mamario.
Oncogénesis, Crecimiento y Diseminación Metastásica
Al referirnos a los diversos aspectos de la Biología Tumoral del cáncer de
mama, basados en los conceptos que hemos desarrollado hasta el presente,
debemos hacer especial referencia a algunos aspectos que en la actualidad
han cobrado especial relevancia: 1.- El tumor se origina por la desarmonía
genética de una célula progenitora. Esta desarmonía se caracteriza por la
pérdida de su control reproductivo y adecuado desarrollo de contacto con las
estructuras normales del organismo. Ésta se considera entonces Célula Madre
del Tumor. 2.- La célula Madre del Tumor está contenida dentro de un nicho
celular, que es quien causa que la célula madre se active , o permanezca en
estado quiescente. 3.- Es probable que La transformación EMT-MET sea el
principal cambio de programa celular que debe sufrir una célula madre del
tumor para atravesar la membrana celular, invadir tejidos vecinos, penetrar en
los vasos sanguíneos y linfáticos y por último establecer metástasis del tumor.
4.- El estroma celular dentro del que se encuentra la célula madre tumoral debe
ser permisivo, e incluso proactivo en la promoción del crecimiento del tumor. 5.Las células del Sistema Inmune que componen el estroma parecen ser uno de
los factores más importantes para controlar la aparición de tumores mamarios o
favorecer su crecimiento y propagación.
Célula madre del tumor
Existe gran evidencia referente a que el cáncer de mama se origina y mantiene
a través de una pequeña proporción de células indiferenciadas con capacidad
de auto-renovación [96]. Los marcadores CD24–/low / CD44+ caracterizan a la
mayoría de estas células [97]. La pequeña población de células progenitoras
que expresa este fenotipo genera un conjunto de células más diferenciadas las
cuales representan la principal masa del tumor. Este comportamiento tisular
45
remeda a la organización jerárquica de las células que conforman al
adenómero mamario normal [96-98]
Estas células madre del tumor (CSC) parecen compartir un fenotipo similar con
su contraparte normal. Sin embargo poseen patrones disfuncionales de
proliferación y diferenciación celular respecto de las últimas y no responden a
los controles fisiológicos que regulan el recambio celular.
A diferencia de las normales, las CSC promueven la formación de vasos
sanguíneos, promueven la motilidad celular así como la resistencia a diversas
terapias [97], y son las principales responsables de la diseminación
metastásica [98-100].
Desde el descubrimiento de las CSC se ha generado un cambio del paradigma
de la oncogénesis [101]. A diferencia de la anterior teoría, donde cualquier
célula podía sufrir mutaciones al azar, hacia un tumor, ahora se sabe que la
neoplasia se origina a partir de células madre normales de un tejido, cuando
éstas sufren una desregulación de las vías genéticas y epigenéticas que
regulan su auto-renovación. Las células desreguladas se expanden como una
población celular propia la cual puede ser sensible a distintas señales
genéticas y epigenéticas propias, diferenciándose en formas variadas y
aberrantes, dando así origen a la heterogeneidad celular propia de las
neoplasias [102].
De lo dicho surge, tras un rápido análisis, que la variedad de cáncer resultante
puede estar influenciada por la variedad de célula progenitora mamaria sobre la
que ocurra el cambio, el carcinógeno que indujo la mutación y/o la
desregulación genética y, especialmente, por el nicho celular que contiene a
esa célula progenitora.
Pero de todas las características que comparten con las células madre
normales resalta la de su particular insensibilidad a agentes farmacológicos y
tóxicos ambientales tales como las radiaciones. Las CSC sobre-expresan la
producción de diversas moléculas transportadoras tales como las ABC, poseen
una mayor capacidad de enzimas reparadoras del ADN y resistencia a la
apoptosis [97, 103-105]. Por esto los tumores cuentan con una población de
células madre que pueden sobrevivir tanto a la radioterapia como a la
46
quimioterapia. Esto es lo que daría origen a las recidivas locales y a las
metástasis.
Nicho de la Célula Madre
El nicho de las células madre esta formado por la sustancia extracelular y las
células que la rodean. Éstas últimas emiten señales para que las primeras no
se diferencien y permanezcan sin dividirse. El papel del nicho en la fisiología de
la glándula mamaria es obvio ya que, bajo el influjo hormonal, induce las
complejas transformaciones que sufre el epitelio glandular secretor durante la
pubertad, el embarazo, la lactancia y la posterior remodelación. [106].
El nicho de la celula madre mamaria normal, como anteriormente se ha hecho
referencia, es capaz de reprogramar la diferenciación de células previamente
diferenciadas (Transdiferenciación celular) tales como las espermatogonias o
los neuroblastos para que estas devengan en epitelio mamario normal [107].
Estos hechos evindencian la importancia del microambiente celular sobre la
naturaleza intrínseca de la diferenciación celular de un tejido adulto alternativo.
El nicho de la célula madre del tumor de mama favorece su crecimiento,
invasión metastásica y diseminación tumoral [108, 109].
Cuando células tumorales han sido cultivadas dentro del panículo graso normal
del embrión o del adulto, éstas han cambiado su fenotipo maligno por uno
benigno, integrándose a las estructuras normales de la glándula [73, 75].
Estas tres situaciones demuestran que el microambiente en el que se
encuentra la célula madre tumoral es esencial para determinar su destino
madurativo hacia la normalidad o la transformación neoplásica.
Para disecar este fenómeno, y lograr una mejor comprensión del mismo,
dividiremos al problema de la relación nicho-célula madre tumoral en: 1) los
cambios que sufre una célula madre para crecer, formar la masa tumoral y
metastatizar (transformaciones EMT-MET); 2) lo que ocurre en el estroma,
como para facilitar estos hechos y 3) la importancia del sistema Inmune, que
parece ser el principal actor en la transformación del estroma normal a pro
tumoral (y viceversa).
47
Las transformaciones EMT-MET de los oncocitos mamarios
El pronóstico médico referente a los pacientes que padecen de cáncer de
mama está en relación directa con el grado de diseminación de la enfermedad
[110]. Aunque el promedio general de curación se ha incrementado, el referido
a las formas avanzadas no ha variado significativamente por varias décadas.
Para encarar una nueva estrategia terapéutica que cambie esta situación se
debe comprender el cómo y el porqué los oncocitos pueden escapar del tejido
en el que se han originado, invadir los vecinos y colonizar otros a distancia.
Las transformaciones EMT-MET que acontecen en las células tumorales [111]
es una de las avenidas de estudio que ha explicado con mayor claridad el
problema. Como anteriormente se mencionase, las células epiteliales malignas
hacen uso de esta conducta celular para disolver la membrana basal que las
contiene, invadir los tejidos circunvecinos, penetrar los vasos sanguíneos y
linfáticos e invadir órganos a distancia. En éstos deben realizar una MET para
crecer como metástasis. (Figura 20)
El estudio morfológico de estos fenómenos se ha visto dificultado grandemente
pues al adquirir las células epiteliales aspecto mesenquimatoso ha sido muy
difícil distinguir a estas últimas de los fibroblastos propios del tejido conectivo.
En las últimas décadas con las técnicas de inmunohistoqímica y de tinción con
fluorocromos por hibridación del ADN in situ (FISH) se ha podido describir este
fenómeno. Así se ha averiguado que, con la excepción de pocas circunstancias
[111-113], este fenómeno ocurre en los denominados bordes activos del tumor
[114, 115]. En estos lugares, por modificaciones epigenéticas y cambios en la
expresión genética se inicia la EMT. Luego, por estímulos extracelulares entre
los que se encuentran la producción de TGF-β y Wnt adquieren el fenotipo
mesenquimal y orientan su camino. Las células mesenquimatosas, responden
a estos estímulos activando genes reguladores Snail/Slug/Twist, Cripto-1 y
Six1), adquieren el fenotipo mesenquimal, orientan su camino y se produce la
invasión de los tejidos locales e incluso metastatizan (Figura.9).
48
Figura 20: Cultivo de las células de un exudado pleural por Adenocarcinoma de mama donde
pueden apreciarse células con patrón de crecimiento epitelial y células con patron de
crecimiento Mesenquimatoso.
El número de genes envueltos en la EMT está directamente relacionado con la
agresividad del tumor. Por otro lado la expresión de estos genes puede ser
revertida conforme a las influencias del microambiente al que arriban las
células [116-121].
Además del tipo de diseminación metastásica inducido por la EMT, la cual
resulta en la diseminación tumoral por células tumorales aisladas, ha sido
descripta la migración colectiva de grupos de oncocitos [122]. Esto ha sido
observado en el estudio de biopsias humanas [123], in vitro en cultivos
tridimensionales de tumores [124], en animales de experimentación por
coloración intra-vital y utilizando métodos no invasivos [125, 126].
Al haber descripto estas dos formas surge entonces una tercera posibilidad que
ha sido también observada en heridas que están sanando: la combinación de
células epiteliales que, sin perder su contacto con las células vecinas,
desarrollan características mesenquimatosas que le permiten invadir los tejidos
y migrar en grupos. Interesantemente se ha observado que conforme
predomine la característica epitelial o la mesenquimal se puede determinar cual
será el sitio preferido de metástasis. Las células que se mueven solitariamente,
y particularmente con la cooperación de macrófagos, migran preferencialmente
49
por vía sanguínea [127, 128], mientras que las que migran colectivamente lo
hacen por vía linfática [126].
Reafirmando lo dicho se ha visto que la inducción genética provocada por el
TGF-β y que induce la EMT, y en consecuencia la migración de las células
aisladas, es necesaria para que estas últimas ingresen a los vasos sanguíneos,
egresen de ellos y se establezcan como metástasis hematógenas [126,129].
Por el contrario al inhibir la señalización del TGF-β se puede inhibir la migración
de células aisladas pero no la colectiva y esto resulta en que el tumor
metastatiza por vía linfática [126].
Otro efecto importante de la EMT es el de favorecer la oncogénesis a partir del
incremento de células madre tumorales [130]. El que se expresen múltiples
genes responsables de la EMT en líneas de cáncer de mama incrementa el
número de células iniciadoras de tumor tal como se determina por el
incremento de los marcadores de célula madre detectados por citometría de
flujo, la formación de mamosferas y el ensayo de dilución límite para la
formación de tumores [130, 131].
La activación de los genes reguladores de la EMT también influencia la
sobrevida celular, específicamente luego del tratamiento con quimioterapia
[132, 133], y previene la senescencia inducida por los oncogenes [134-136],
ambas propiedades asociadas con la progresión de la enfermedad.
Por ultimo se ha observado que las células tumorales que activan los genes
responsables de la EMT tales como el Snail generan la producción de
citoquinas inmunosupresoras que bloquean la acción de la vigilancia
inmunológica [137].
En conclusión, podemos resumir que la inducción de la EMT activa las
propiedades migratorias del tumor, favorece su dispersión, selecciona su vía de
diseminación, induce la proliferación de células madres tumorales, favorece la
aparición de clonas quimiorresistentes, incrementa la sobrevida media de las
células tumorales, prolonga la senescencia inducida por la activación de
oncogenes e induce la secreción de citoquinas que bloquean a la vigilancia
inmunológica. Todas estas características favorecen la progresión del Tumor.
50
Influencia del estroma sobre la oncogénesis, desarrollo y
diseminación metastásica del Tumor de mama.
Diversos estudios sobre modelos experimentales han demostrado que la
proliferación, sobrevida, polaridad, grado de diferenciación y capacidad
invasiva de las células del cáncer de mama pueden ser moduladas por las
células mioepiteliales y las otras células del estroma [138-150].
El criterio diagnóstico anatomopatológico utilizado por los patólogos para
determinar si el carcinoma es clasificado como in situ o invasivo es el de la
presencia o ausencia, respectivamente, de una capa intacta de células
mioepiteliales. Esto se establece a través del análisis de los marcadores
específicos de estas células: actina relacionada al músculo liso, calponin y
CD10 [151].
Para averiguar por que desaparece esta capa celular tan importante y permitir,
por ejemplo, que un Carcinoma Ductal In Situ (DCIS) se transforme en
invasivo, Hu y su equipo han recurrido al modelo experimental de
xenotransplante de células MCF10 (humanas) inyectadas en ratones inmuno
deficientes [152, 153].
Esta línea celular posee la particular cualidad de diferenciarse tanto en células
mioepiteliales como del epitelio luminal y formar tumores cuando son
inyectadas en ratones inmuno deficientes. Estos tumores poseen una gran
semejanza histológica y molecular con los comedocarcinomas in situ (DCIS)
que progresan a tumores invasivos (IDC). Si se injertan estas células
acompañadas de células mioepiteliales y fibroblastos humanos sanos, se
previene el desarrollo del tumor y/o se impide que progrese a IDC. Por el
contrario si las células del estroma
proceden de un tumor mamario o los
fibroblastos se han originado en regiones afectadas por artritis reumatoidea se
promueve tanto la aparición del tumor como de su transformación a IDC [153].
En otro grupo de experimentos se demostró que la pérdida o atenuación de la
producción de TGFb (y de su correspondiente señalización) acelera la
progresión tumoral por el incremento de la secreción, por parte de la célula
tumoral, de las quemoquinas Cxcl1 y Cxcl5 así como de la expresión global de
otros genes asociados con esta citoquina [154]. Otros autores confirmaron
51
estos hallazgos al estudiar tumores con una gran producción de quemoquinas.
Estos oncocitos reclutaban en el borde invasivo del tumor un tipo peculiar de
célula mieliode la MDSC (MDSC, del ingles myeloid derived suppressor cells) lo
que incrementaba tanto su capacidad invasiva como de metastatizar. Por el
contrario cuando se bloqueaban los receptores de las quemoquinas Cxcl1 y
Cxcl5, Cxcr2 con pequeñas moléculas bloqueantes disminuia la infiltración de
MDSC y la generación de metástasis pulmonares [155].
Diversos autores han encontrado estas asociaciones pro-tumorales de
fibroblastos y macrófagos en la respuesta anormal de estas células al intervenir
en el proceso de cicatrización de heridas, encontrando grupos de genes que
siempre se expresan en las moléculas del estroma cuando se genera un tumor
y este progresa [156-167]. El Gen FSP1, también conocido como S100A4 o
proteina promotora de metástasis [157-161] es probablemente el más
importante descripto en la actualidad.
Contrario a esto se ha observado que la inhibición del gen PTEN en los
fibroblastos del estroma favorece la transformación maligna del epitelio
mamario así como la iniciación y progresion de los tumores, la transformación
de la sustancia extracelular por incremento de la angiogenesis y reclutamiento
de células del sistema inmune innato, particularmente macrófagos M2 [168].
Los macrófagos M2 han sido asociados con fenómenos de tolerancia, y se los
ha encontrado infiltrando distintas metastasis de cancer de mama. Distintos
experimentos animales han mostrado que, cuando se inhibe el actuar de estas
células también disminuye la agresividad y capacidad metastásica de los
tumores de mama [169]. Ésto ocurre pues los M2 inducen a las células
epiteliales para que éstas expresen y activen mayor cantidad de receptores al
Epidermal Growth Factor [170]. Lisa Coussens y colegas han demostrado que
los linfocitos CD4(þ) que segregan IL4, regulan la actividad de estos
macrófagos y de las MDSC [145] para favorecer su acción pro-tumoral.
Probablemente el estado patológico del estroma más asociado al riesgo de
oncogénesis
sea
el
de
la
inflamación
crónica.
Recientes
estudios
epidemiológicos respecto del uso de antinflamatorios no esteroides y el riesgo
de padecer distintos tipos de cancer apoyan esta hipótesis [171].
52
Tumor de Mama y Sistema Inmune
De lo hasta aquí expuesto puede deducirse que las alteraciones genéticas y
epigenéticas de los genes que regulan la proliferación celular, polaridad,
sobrevida y diferenciación celular del epitelio mamario son los probables
“iniciadores oncogénicos” del tumor de mama. Por su parte las interacciones de
este epitelio mamario con su estroma, y en particular con las células del
sistema inmune que lo componen, son las que determinan su evolución futura
[172-178]. A continuación analizaremos el papel aparentemente ambiguo de
protección-promoción que juega cada componente celular del sistema inmune.
Leucocitos y desarrollo tumoral
Las células del sistema inmune innato incluyen a los macrófagos, granulocitos,
células dendríticas (DCs), células cebadas y los linfocitos citotóxicos naturales
(NK). Representan la primera línea de defensa contra patógenos y agentes
foráneos. Por su capacidad de destruir, fagocitar y elaborar antígenos para
generar una respuesta inmune específica, a las primeras tres de estas células
se las denomina células presentadoras de antígenos (APC). Cuando se
produce una alteración del la homeostasis tisular, las APC residentes y las
células cebadas segregan citoquinas, quemoquinas, mediadores bioactivos y
proteínas remodeladoras de la matriz, con la finalidad de reclutar mayor
cantidad de leucocitos circulantes, para que estos se concentren en el lugar de
la lesión. Esta es la primera fase del proceso inflamatorio [173, 179, 180].
El actuar de las APC in situ puede llevar a la eliminación completa del
patógeno. Éstas, una vez que lo han fagocitado, migran hasta los ganglios
linfáticos regionales donde, el patógeno elaborado como antígeno es
presentado a los linfocitos T y B los cuales inician la respuesta inmune
específica (adaptativa) [181, 182]. Ver figura 21
Sin embargo, según vimos en la sección anterior esta respuesta inmune puede
ser responsable de la promoción tumoral antes que del rechazo de los
oncocitos. Este concepto fue desarrollado por Virchow en 1863. El postuló que
el cáncer se originaba en los sitios de inflamación crónica [183].
53
Memory B
Activated B
Memory T reg
Activated T reg
CoCo-stimulation
Differentiation
Plasmocito
B Naive
Stimulation
CD4 Naive
Activated CD4 TH2
Memory CD4 Th2
Ag Presentation
Stimulation
Activated CD4 TH1
Activated Macrophage
Memory CD4 Th1
Naï
Naïve CD8
Ag Process
Effector
Response
Resting Macrophage
Phagocytosis
Differentiation
NKT
Activated CD8
Virus
Memory CD8
Figura 21: Respuesta inmune efectora antiviral acoplada a la respuesta reguladora inducida por
linfocitos Treg. No se ha graficado la intervención de la MDSC.
Históricamente se ha pensado que los leucocitos que infiltraban y rodeaban a
los tumores representaban el intento del hospedante para erradicar las células
transformadas. Esto es particularmente cierto para los linfocitos T citotóxicos
(NKT) y los NK [184]. Epidemiologicamente existen datos que apoyan estos
dichos en particular en lo referido a los tumores asociados a virus [185-189].
Los virus más frecuentes son el del papiloma Humano (HPV) asociado al
cáncer cervical uterino y al epidermoide, el herpes 8 asociado al sarcoma de
Kapossi, y el de Epstein–Barr asociado a los linfomas No Hodgkin [185-189].
Igualmente se ha demostrado que en la población inmuno comprometida tanto
los melanomas como los adenocarcinomas de pulmón también son más
frecuentes [187-190].
Contrariamente a estas observaciones, en los últimos años, con el
advenimiento del SIDA ha sido posible detectar, también por medios
epidemiológicos, que las mujeres inmuno comprometidas poseen menor riesgo
de contraer adenocarcinoma de mama [187,190-193].
54
En la actualidad existe un cuerpo creciente de literatura que indica que, en
particular respecto del cáncer de mama, los leucocitos del estroma parecen
jugar un papel promotor de la neoplasia ya que su número se incrementa
cuando se incrementa la agresividad tumoral (Figuras 22 y 23).
Figura 22: El desarrollo del carcinoma de mama humano se caracteriza por una infiltración creciente de
células inmunes (detectada por inmunomarcación con anti CD45)conforme progresa su severidad Breast Cancer Res. 2007; 9(4): 212.
Figura 23: El desarrollo del carcinoma de mama humano se caracteriza por una infiltración creciente de
células inmunes (detectada por inmunomarcación con anti CD4, CD8 y CD20 )conforme progresa su
severidad. Breast Cancer Res. 2007; 9(4): 212.
Linfocitos B como promotores del tumor de mama
La secreción de inmunoglobulinas antígeno específicas por parte de los
linfocitos B diferenciados (células plasmáticas) ha sido asociada al efecto
anticanceroso de estas células (Figuras 21 y 24). Si bien esto es cierto para la
55
respuesta inflamatoria aguda para erradicar neoplasias incipientes [194],
nuevos datos indican que la activación crónica de estos linfocitos juega un
importante papel en la promoción tumoral (Figura 24).
En efecto, la activación de los linfocitos B ante lesiones agudas puede dar lugar
a que estos segreguen citoquinas (tales como la IL4, 6 y 13), otros mediadores
solubles, subtipos de inmunoglobulinas y activación de la cascada del
complemento, todos ellos con efecto dual. En conjunto gatillan el inicio de una
respuesta inmune efectora, pero que cuando se prolonga a través del tiempo,
producen una inflamación crónica que genera efectos deletéreos, también
mediados por las células del sistema inmune innato, tales como los observados
en varias situaciones patológicas (artritis reumatoidea y otras enfermedades
autoinmunes) [195].
Figura 24: Relación dual del sistema inmune respecto de las células transformadas de la
mama. La reacción aguda se caracteriza por el actuar efector de linfocitos T y B apoyados por
macrófagos M1. Este actuar conjunto lleva a la destrucción del tumor naciente. Por el contrario,
al cronificarse la inflamación las mismas células antes nombradas, por estimulación epigenética
del tumor que remeda a un órgano reparándose, desarrolla tolerancia inmune y promoción del
crecimiento tumoral. Breast Cancer Res. 2007; 9(4): 212.
Durante el proceso de carcinogénesis del adenocarcinoma de mama se puede
observar una infiltración creciente de linfocitos B que se incrementa en número,
56
conforme progresa la enfermedad. (Figura 23). Si se lo compara con biopsias
de individuos sanos, los ganglios centinelas de los pacientes poseen un
enriquecimiento de linfocitos B maduros (IgG+) [196]. Este número se
correlaciona en forma directa con el incremento de la estadificación tumoral y la
agresividad total del tumor [197-199]. Similares hallazgos han sido realizados
en las biopsias del tumor primario observándose que aquellos superan en
número a los linfocitos T y que su cantidad es proporcional respecto del avance
de la enfermedad [200, 201] (Figura 23). Aproximadamente el 20% de los
carcinomas invasivos contienen un alto número de linfocitos B. En estos
pacientes el porcentaje de estos linfocitos puede ser del 60% del total de
células mononucleares infiltrantes [202]. Esta observación no es exclusiva del
cáncer de mama, ya que se ha reportado que el 70% de los tumores sólidos
están infiltrados con estas células [203].
En el DCIS y el IDC los linfocitos B se hallan en posición peri-vascular, en
grupos asociados a linfocitos T formando estructuras foliculares [202-205].
Estos
folículos
poseen
linfocitos
que
rodean
y
se
relacionan
por
interdigitaciones con DC caracterizadas por el marcador CD21+. Por esto se los
puede identificar como auténticos folículos ectópicos. Estos folículos contienen
células plasmáticas, índice de la cronicidad del proceso. Estas estructuras
también
han
sido
descriptas
en
enfermedades
autoinmunes:
Artritis
reumatoidea, Esclerosis Múltiple, Enfermedad de Sjögren y enfermedad de
Graves donde, se piensa, son parte de la patogénesis de esa particular
condición [206-209].
Los autoanticuerpos producidos por estas células plasmáticas han sido
encontrados en el suero y/o depositados en el intersticio de los tejidos
tumorales [210]. La aparición temprana de autoanticuerpos en el suero (en
particular anti-músculo liso) se considera signo de mal pronóstico para el
paciente [211]. Aproximadamente el 50% de los pacientes con cáncer de mama
poseen inmunoglobulinas circulantes contra antígenos originados en los
tumores. Anticuerpos anti ErbB2/HER2/neu están presentes en el 20% de los
pacientes ErbB2-positivos [212]. Paradójicamente éstos son los pacientes con
peor pronóstico [210-213] (Figura 24). Esto habla de la ineficiencia de estos
anticuerpos y de su probable papel en la promoción tumoral.
57
Confirmando esto último puede decirse que más del 50% de los pacientes con
cáncer de mama poseen anticuerpos contra sus tumores aunque son
anecdóticos los casos registrados de remisión tumoral espontánea [214, 215].
Varios factores pueden ser los causales de esta ineficiencia biológica: la
concentración de inmunoglobulinas específicas, la expresión de determinados
HLA, la generación de tolerancia inmune, la actividad T citotóxica dañada, etc.
Inmunidad Adaptativa y desarrollo del cáncer de mama: Linfocitos T
Por inmunohistoquímica se han podido detectar linfocitos T asociados con
tumores en desarrollo (Figura 23). Su papel pronóstico está en debate.
Mientras que los Linfocitos B parecen ser los predominantes durante los
primeros estadios tumorales [204], tanto los CD4+ como los CD8+ son los
predominantes en los DCIS de alto grado y en los IDC [216].
La proporción de estas células respecto del total de la masa celular, cubre un
amplio rango entre el 1% y el 45% [217]. En los tumores rápidamente
proliferativos su presencia es índice de buen pronóstico y se lo correlaciona, en
pacientes con ganglios centinelas negativos y pequeño tamaño tumoral, con
menor grado de malignidad histológica y mayor sobrevida libre de recurrencia
[218]. Todos estos datos apoyan su papel en la así denominada vigilancia
inmunológica.
El indicador más importante de progresión tumoral y pronóstico del paciente es
el de la presencia de células epiteliales malignas en los ganglios centinela [219221]. Contradictoriamente a lo antes mencionado, mientras que el papel de los
CD8+ no está claro, se acepta que a mayor cantidad de CD4+ infiltrando el
tumor primario, peor pronóstico del paciente; esto incluye mayor número de
metástasis ganglionares, mayor incremento de la masa del tumor primario y
mayor tendencia a la diseminación metastática [217, 222]. Tal vez más
significante que la proporción individual de linfocitos lo sea el de la proporción
CD4+/CD8+ en el infiltrado tumoral. Las proporciones mayores de uno se
relacionan con metástasis ganglionares y menor sobrevida del paciente [217,
222]. Resultados similares han sido informados para carcinomas de otro origen
[223, 224].
58
Figura 25: Relación dual del sistema inmune respecto de la evolución del tumor. Papel de la
respuesta inflamatoria aguda dominada por la actividad de los Th1 y de la respuesta
inflamatoria crónica dominada por la actividad Th2 para producir rechazo o promoción tumoral
respectivamente Breast Cancer Res. 2007; 9(4): 212.
Una posible explicación respecto de estos resultados contradictorios estaría
basada en la distinta polaridad que puede desplegar el fenotipo de los CD4+.
Estos pueden ser Th1 y Th2 (Figura 25) [225]. Ante un estímulo antigénico los
Th1 segregan IFNγ, TNFα e IL-2 [226]. Estas citoquinas colaboran con la
función citotóxica de los CD8 [227], incrementan el procesamiento de antígenos
por los proteosomas, la expresión de moléculas MCH clase I y clase II en las
células tumorales así como moléculas coestimuladoras en estas mismas
células. La secreción de INFγ también induce la activación de los macrófagos
M1 que se vuelven citotóxicos [228]. En contraste los Th2 expresan IL-4, IL-5,
IL-6, IL-10 e IL-13, las cuales inducen anergia de los CD8 citotóxicos e
incrementan la inmunidad humoral (linfocitos B) [229].
Tomados en conjunto, estos hechos nos inducen a pensar que la respuesta
inmune gobernada por los Th1 produce efectos antitumorales beneficiosos para
el paciente [230-233] mientras que la reacción gobernada por los Th2
disminuye la respuesta inmune antitumoral [233-237] e incrementa la respuesta
promotora del Tumor [238, 239].
59
Papel de los linfocitos T reguladores (Treg)
Además de la polaridad Th1-Th2 los CD4 pueden tener un tercer fenotipo:
Treg. Éstos inhiben por contacto célula a célula el actuar de los CD4 Th1, los
CD8 y las células dendríticas. Normalmente protegen a los tejidos de las
agresiones autoinmunes. Pueden ser identificados porque expresan en su
superficie las proteínas CD4, CD25 y FOXP3. De esta forma se ha establecido
que están presentes en una proporción variable del 5–10% de todos los
linfocitos T presentes en un órgano sano.
En el cáncer de mama los DCIS poseen una proporción normal de Treg que se
va incrementando a medida que se transforman en invasivos y progresa la
enfermedad [240], siendo en ésta última situación indicadores de mal
pronóstico. La forma en la que inhiben la respuesta inmune efectora es por
contacto célula a célula con todos los actores efectores, y su acción es dosis
dependiente [241-245]. Se cree que los tumores son los principales inductores
de Treg a través de la secreción de diversos factores tales como la
prostaglandina E2 y el CCL22 por parte de los macrófagos M2 (pro-tumorales)
[246-249].
Inmunidad Innata y desarrollo del Adenocarcinoma de mama.
Como se ha mencionado ya en varias ocasiones, las células de la inmunidad
innata, cuando actúan en la inflamación crónica, favorecen el desarrollo del
tumor de mama [173, 178, 250]. Se atribuye esto a la enorme plasticidad de
estas células, y a que pueden segregar una miríada de citoquinas,
quemoquinas, metaloserinas y metalocisteina proteasas, radicales libres,
histamina y otros mediadores bioactivos [173, 178, 250]. Varios de los procesos
fisiológicos que inducen estas sustancias para favorecer la curación de heridas
también son beneficiosos para la progresión tumoral: incremento de la
sobrevida celular, remodelación de la matriz extracelular, angiogénesis,
supresión de la respuesta inmune adaptativa. Esta regulación ha sido
ejemplificada por la correlación positiva entre el número de células de la
respuesta inmune innata (macrófagos, células cebadas, y neutrófilos) con el
grado de infiltración tumoral y el número de vasos sanguíneos [251, 252], y por
60
estudios realizados en modelos animales, donde atenuando la respuesta
inmune innata se reduce la angiogénesis y se limita el desarrollo tumoral [253260].
A mediados de los 50 se publicaron los primeros trabajos que demostraron este
efecto pro tumoral de la inmunidad adaptativa referido a que la transferencia
pasiva de anticuerpos tumor-específicos aceleraba in vivo el crecimiento de los
tumores transplantados [261-263]. En esta última década diversos trabajos han
reforzado estos hallazgos encontrando que el efecto pro-tumoral de los
linfocitos B está relacionado con la regulación de la actividad del sistema innato
y no con una acción directa sobre el tumor [264, 265].
Estudios de Barbera-Guillem y colegas encontraron que la respuesta humoral
antitumor potencia el crecimiento e invasión tumoral in vivo de tumores murinos
y humanos transplantados. Este efecto es mediado por el reclutamiento y
activación de granulocitos y macrófagos pro tumorales [264, 266, 267]. El
depósito de inmunoglobulinas en el microambiente neoplásico puede mediar el
reclutamiento de macrófagos vía la cascada de activación del complemento o
mediante la expresión de receptores Fc expresados en las APC residentes
[268, 269].
Durante el desarrollo del tumor de mama la fagocitosis de
inmunoglobulinas del estroma tumoral incrementa la producción macrofágica
del factor de crecimiento endotelial (VEGF) y, por ende, la angiogénesis pro
tumoral [266].
Otros experimentos correlacionan directamente al grado de infiltración tisular
por macrófagos con la progresión de tumores inducidos por virus [256, 270].
Así mismo se favorece el desarrollo de metástasis pulmonares [256].
En oposición a todo lo descripto, los NK protegerían al hospedante de la
progresión tumoral al detectar y eliminar en forma inespecífica células
transformadas e inhibir la angiogénesis tumoral [273, 274].
Lo cierto es que el microambiente en el que crece el tumor es modificado
también por él mismo. Produce sustancias con actividad inmunológica que
promueve respuestas inmunes crónicas pro-neoplásicas opuestas a las de la
respuesta inmune aguda, [178, 275] donde se inhibe la actividad citotóxica de
los linfocitos T efectores [276]. Así mismo estas secreciones tumorales atraen
61
hacia si una sub-población particular de células de la inmunidad innata
inmunosupresora las MDSC. Éstas se identifican por los marcadores de
superficie CD11b+Gr-1+. Se acumulan en torno al tumor e invaden la sangre y
otros órganos linfáticos de los portadores del tumor [275-279]. Se acepta que la
inhibición de la actividad inmune efectora es por el contacto célula a célula con
las efectoras. Se sabe que también promueven el crecimiento tumoral por la
secreción de sustancias angiogénicas [280].
Las citoquinas derivadas por la activación de la inmunidad humoral y/o los Th2
actúan directamente sobre los macrófagos. La activación crónica de los
linfocitos B (típica de los centros germinales ectópicos) producen GMCSF,
TNFα, IL-6, e IL-10 [281]. Estas citoquinas en combinación con las producidas
por las Th2 (IL-4, IL-13, e IL-10) producen una polarización del sistema inmune
innato
generando
los
macrófagos
pro-tumorales
M2,
reprimiendo
simultáneamente a los macrófagos pro-citotóxicos M1 [282] y la diferenciación
de monocitos a DC [283].
Tomados todos estos hechos en conjunto, podemos concluir que la totalidad
de los factores generados por la inflamación crónica configuran un
microambiente pro tumoral a través del desarrollo de la tolerancia inmune y la
promoción de la progresión del tumor.
De todo lo antes dicho en esta introducción surge pues que el desarrollo de una
inmunoterapia efectiva contra el cáncer de mama debe primariamente estar
destinada a cambiar la miríada de condiciones que convierten al estroma tanto
del tumor primario como de sus metástasis en un ambiente pro-tumoral. El
sistema inmune es modulado por el tumor el que desarrolla las mismas
acciones que las de un tejido que se repara, y por consiguiente convierte al
sistema inmune en su aliado.
Luego de resumir las estrategias terapéuticas
no inmunes actuales
desarrollaremos, a través del análisis de nuestra experiencia clínica, los
principios de una inmunoterapia racional.
62
Estrategias terapéuticas Actuales
Conforme a la Información Oficial Suministrada por el Instituto Nacional del
Cáncer de Estados Unidos de Norteamérica a través de su manual para
Profesionales PDQ el tratamiento de los diferentes cánceres está reglado por el
tamaño y avance local del tumor primario, la locación y el número de los
ganglios afectados, y si existe o no diseminación metastásica de la
enfermedad.
La determinación de estas características en el paciente se denomina
Estadificación de la Enfermedad Maligna. Ésta permite establecer estrategias
terapéuticas para cada grupo de pacientes conforme a su respectivo
pronóstico.
La terapia de los pacientes con Cáncer de Mama son tomadas considerando el
estadio de la enfermedad, la presencia o ausencia en el tejido tumoral de
receptores de estrógeno, de progesterona, de factor 2 de crecimiento epitelial
(HER/2neu), si se encuentra en menopausia y su condición clínica (índice
ECOG o Karnovsky)
Conforme al estado actual del conocimiento médico se considera que existen
posibilidades terapéuticas con intenciones de curación en los pacientes con un
tumor menor de 50 mm en su diámetro máximo y/o menos de 9 metástasis en
los ganglios axilares ipsilaterales regionales.
La presencia de ganglios extra regionales o de cualquier signo de enfermedad
metastásica, según los criterios modernos, clasifican al paciente como portador
de una enfermedad avanzada y por lo tanto su terapia no se realiza con
intención de curar al paciente sino que posee como finalidad el extender su
expectativa de sobrevida y calidad de vida. Este grupo de pacientes, según el
Instituto Nacional del Cáncer de USA el ASCO y la ESMO, son considerados
como pasibles de recibir terapias innovadoras con intensión terapéutica o para
establecer la seguridad y eficacia de estas. [284]
En el anexo 1 se trascriben distintos criterios de estadificación de la
enfermedad así como el resumen terapéutico oficial establecido por el PDQ del
NCI de USA.
63
En la actualidad el tratamiento de los estadios avanzados es combinado. Se
utiliza hormonoterapia y quimioterapia asociada a trastuzumab. El uso de
radioterapia y/o cirugía está limitado a pacientes con determinado tipo de
metástasis sintomáticas. Según el Instituto Nacional del Cáncer de los Estados
Unidos, todos los pacientes que poseen Carcinoma Avanzado de Mama deben
ser considerados como candidatos para recibir terapéuticas innovadoras [285].
Los criterios de indicación quirúrgica se refieren a pacientes que posean
lesiones de la pared torácica impetiginizadas o dolorosas, metástasis que por
su localización les causen dolor, que hayan migrado al cerebro, que compriman
la medula espinal, que con su extirpación pueda impedirse o prevenirse una
fractura ósea, que sean metástasis pulmonares o hepáticas aisladas, o que
exista derrame pleural o pericárdico.
La radioterapia está indicada cuando se deben paliar síntomas localizados
ocasionados
por
metástasis:
metástasis
óseas
dolorosas,
metástasis
cerebrales, de la medula espinal o de las meninges no resecables. Lesiones de
la pared torácica impetiginizadas o dolorosas, luego de las cirugías
descompresivas del SNC, o siguiendo a la fijación de fracturas patológicas. En
la actualidad se estudia la posibilidad de la administración sistémica de
Estroncio 89 para cuando existen metástasis óseas múltiples.
Como terapias sistémicas se utilizan bifosfonatos, diversas formas de
hormonoterapia, anticuerpos monoclonales que bloquean los receptores del
Epidermal Growth Factor, y quimioterapia.
Se ha comprobado que los bifosfonatos reducen la morbilidad de los pacientes
con metástasis óseas. Actúan modulando la actividad de los osteoclastos, que
son macrófagos, los cuales han mostrado ser esenciales para el crecimiento de
las metástasis óseas del cáncer de mama. La relación de las metástasis óseas
con los osteoclastos remeda la interacción del crecimiento de los TEB y los
macrófagos en el tejido mamario. Los fosfonatos Indirectamente han
comprobado la influencia de los macrófagos sobre la angiogénesis ya que
como efecto tóxico se ha visto que los pacientes tratados con esta droga
pueden presentar necrosis ósea avascular del maxilar. [286, 287]
64
Respecto de los tratamientos hormonoterápicos están especialmente indicados
como primera línea de tratamiento para aquellos pacientes con diagnóstico de
cáncer de mama avanzado con receptores estrogénnicos positivos (ER+) y/o
progesterona positivo (PR+) o ER/PR desconocidos. La primera medicación
utilizada fue la testosterona. A posteriori se utilizaron inhibidores por
competencia de los receptores hormonales (tamoxifeno y similares) su efecto
era similar al de la testosterona, pero sin los efectos virilizantes secundarios.
Una tercera generación de fármacos la constituyeron los agonistas LHRH que
por saturación de receptores de las células gonadotropas de la hipófisis inhiben
la producción de gonadotropinas. Finalmente los inhibidores de las aromatasas
que inhiben la síntesis de todas las hormonas esteroides (incluidos los
corticoides). Se ha visto que las medicacioes hormonales pueden potenciarse
farmacologicamente si se las combina. [288-293]
Figura 26 Isoformas de las dos subunidades del receptor del factor de crecimiento epitelial
humano (hEGF) del que sobresale la subunidad HER2. Este antígeno se ha denominado
HER2/neu (también conocido como ErbB-2, del ingles Human Epidermal growth factor
Receptor 2)
Aproximadamente el 25% de los pacientes con cáncer de mama poseen
células que sobre-expresan una subunidad del receptor del factor de
crecimiento epitelial HER2/neu (ver Figura 26). Basados en este concepto se
65
utilizan, como medicación de segunda línea, dos tipos diferentes de
anticuerpos humanizados: el Trastuzumab y el Lapatinib. Ambos han mostrado
poseer acción sinérgica cuando se los combina con quimioterapia aunque
también han demostrado potenciar varios de los efectos colaterales de las
respectivas drogas quimioterapicas [294-299].
Los pacientes que han empeorado durante el tratamiento hormonoterápico son
candidatos a recibir quimioterapia. Igual criterio se adopta para aquellos que
han sido diagnosticados como ER/PR negativos [300]
El uso de más de un agente quimioterápico parece ser más efectivo que el uso
de un solo agente. La multiplicidad de citostáticos parece incrementar la
proporción de pacientes con respuesta tumoral y el tiempo libre de enfermedad
pero la sobrevida total no ha mejorado con ninguna combinación. Lo mismo
puede decirse del tratamiento con altas dosis de quimioterapia asociado al
transplante de médula ósea [301-306].
Por lo tanto la decisión de usar quimioterapia en éstos pacientes, o de cuál o
cuáles agentes quimioterápicos utilizar, se basa en la actualidad, en la
velocidad con que los pacientes recaen y, en cada caso, en cuál es el estado
general de éstos al momento de decidir la terapia. (Para más detalles ver el
anexo 1) [301].
66
Base de las Terapias Inmunes Actuales
A mediados del siglo XX Burnet y Thomas sugirieron que el sistema inmune,
podría defendernos del crecimiento de células tumorales de neoformación. En
los 60, se postuló que las alteraciones del control de crecimiento y
diferenciación celular propias del cáncer devenían, en su mayoría, de
alteraciones genéticas producidas por mutaciones espontáneas, secundarias a
factores ambientales. Se calculó que por día se generaban entre 104 y 106
células potencialmente capaces de generar un tumor por día. Se atribuyó a las
células del sistema inmune el papel de destruir a estas potenciales fuentes de
tumor. Esto dio origen en la década de los 70 al desarrollo de diversas técnicas
inmunoterápicas capaces, al menos en modelos experimentales, de prevenir el
desarrollo
de
tumores
experimentales.
Más
tarde,
algunas
técnicas
inmunoterápicas lograron demostrar su utilidad clínica, pero en el inicio del
siglo XXI nuevos trabajos revelaron que bajo ciertas condiciones el sistema
inmune podía convertirse en aliado del desarrollo tumoral. A este proceso se lo
llamó Edición Inmune del Tumor [307-309].
El sistema inmune previene la aparición de tumores a través de diferentes
funciones. Primero, protege al organismo de tumores inducidos por virus
eliminando o suprimiendo las infecciones virales. Segundo, por la rápida
eliminación de patógenos, y en consecuencia de la inflamación asociada,
previene el que se instaure un estado inflamatorio crónico que es el que
favorece la tumorigénesis. Tercero, puede identificar específicamente y eliminar
células tumorales nacientes al reconocer a las proteínas mutadas que presenta
el oncocito y que no son propias del individuo adulto. Este tercer punto es el
que se denomina Vigilancia Inmunológica [308].
La Edición Inmune del Tumor se divide en tres fases: Eliminación, Equilibrio y
Escape (Figura 27). La primera de estas fases coincide con el concepto
descripto en el párrafo anterior respecto a la Vigilancia Inmunológica donde el
sistema inmune detecta y destruye células que, a consecuencia de fallos en los
procesos intrínsicos del genoma para eliminar mutaciones y expresión de
oncogenes, se han transformado.
67
La fase de Eliminación puede ser completa, cuando todas las células
transformadas son destruidas, o incompleta , cuando solo una porción de estas
células es eliminada. En este último caso se establece una segunda fase de
Equilibrio transitorio entre el sistema inmune y el crecimiento tumoral.
Se asume que durante el período de Equilibrio las células tumorales,
permanecen en estado quiescente, o continúan evolucionando acumulando
mayores cambios en su ADN. De una u otra forma producen ciertos cambios
en su fenotipo que incluyen la no expresión de los antígenos previamente
reconocidos por el sistema inmune, disminución o supresión de la expresión
genética de las moléculas presentadoras de antígeno y de las moléculas
coestimuladoras, y sobre-expresión de los genes pertinentes a la producción
de TGFb e IL10.
Cuando la destrucción de todas las células inmuno suceptibles es superada por
la de las células resistentes comienza la tercer fase que es la de progresión de
la enfermadad. [309]
Figura 27: Fases de la edición inmune del tumor según Smyth, M.J y col. [309]
68
Los cambios fenotípicos del oncocito, acontecidos durante la fase de equilibrio,
generan cambios tanto en el sistema inmune como en el resto de los elementos
del estroma tumoral. Los linfocitos T efectores reconocen a los antígenos del
oncocito cuando éstos están presentados por las moléculas de MHC asociadas
a las moléculas co-estimuladoras. La falta de moléculas co-estimuladoras
produce anergia tumoral. En tanto, el tumor produce IL10 y TGFb, ambas
sustancias favorecen la conversión de la respuesta efectora Th1 en Th2 (propia
de la inflamación crónica) inducen la generación de Treg, favorecen que los
fibroblastos desarrollen una matriz anti inflamatoria rica en Colágeno I, inhiben
la producción de Interferón γ , atraen hacia el sitio de lesión a las MDSCy
transforman los macrófagos M1 en M2. (figura 28).
Memory B
Memory T reg
Activated B
Activated T reg
CoCo-stimulation
Differentiation
Plasmocito
B Naive
Stimulation
CD4 Naive
Activated CD4 TH2
Memory CD4 Th2
MDSC
Ag Presentation
Stimulation
Activated CD4 TH1
Activated Macrophage
NK
Memory CD4 Th1
Naï
Naïve CD8
Ag Process
Resting Macrophage
Phagocytosis
Activated CD8
NK
Anti-tumor
Response
Differentiation
NKT
Memory CD8
Figura 28 Respuesta inmune efectora antitumoral (líneas azules continuas) y las
correspondientes inhibiciones inmunes (líneas rojas discontinuas) que inhiben la destrucción
del tumor y generar un estado de tolerancia inmune hacia la neoplasia.
A resultas de todo lo expuesto se establece un estado inflamatorio crónico protumoral. Este estado es muy difícil de revertir ya que las clonas antitumorales
preexistentes han desaparecido, y la falta de señales celulares adecuadas del
oncocito, que ahora se encuentra en un entorno que lo protege y promueve,
69
impiden que el sistema inmune desarrolle una nueva respuesta celular
efectora.
Chemoth.
MAB
Tα1
Treg V
MLC
ALT
DC-TBH
MLC
CD3+
CD25TIL
Tα1
LAK
Anti-tumor
Immunotherapy
TBH
NK
ALT
Figura 29 Diferentes inmunoterapias antitumorales utilizadas en nuestro centro
Para vencer estas dificultades, y con el ánimo de restaurar las condiciones
necesarias para retornar a la primera fase, la de eliminación de las células
tumorales, se han desarrollado diversas estrategias terapéuticas. En la figura 29
se nombran los distintos tratamientos que nuestro centro ha ensayado, y están
colocados en el lugar donde se asume que ejercen su acción.
Hemos utilizado dos tipos de vacunas celulares autólogas: la vacuna TBH [1216], y la de células dendríticas autólogas desafiadas con TBH autólogo [310,
311]. Algunos pacientes han recibido como inductores de la terapia con vacunas
un citoimplante (MLC) [312-314] de un cultivo mixto de linfocitos producido al
cultivar células mononucleares periféricas de un donante no relacionado con
células irradiadas del paciente. Cuando ha sido posible obtener linfocitos TIL los
hemos aislado, cultivado y re-infundido al paciente [315]. En otras ocaciones
hemos
suministrado
al
paciente
pre-inmunizado
linfocitos
T
efectores
(CD3+CD25-), los cuales se han comportado como TIL [316, 317]. Para regular la
actividad o la aparición de linfocitos T reguladores hemos administrado, previo a
70
cada vacuna, quimioterapia a bajas dosis [315]. Cuando el paciente presentó
intoleracia a esta medicación le hemos administrado Timosina α 1 (T α 1) [318].
Últimamente hemos ensayado el uso de una autovacuna realizada con Linfocitos
Treg que protegen al tumor. El objeto de esta inmunización es el de estimular
linfocitos anti-idiotipo que los anulen [319]. Finalmente, en una ocasión hemos
utilizado la terapia ALT [320-323] para promover la reactivación de los linfocitos
de memoria. En el cuadro, por su importancia histórica, esta mencionada la
terapia LAK y la que utiliza anticuerpos monoclonales. Ninguna de estas dos
últimas terapias las hemos aplicado a nuestros pacientes.
A continuación desarrollamos los antecedentes preclínicos de la vacuna TBH ya
que hemos sido pioneros en su uso clínico y es la base de la mayor parte de
nuestras terapias celulares.
La vacuna TBH como medio de vencer los obstáculos en el
reconocimiento de las células tumorales:
Los linfocitos B activados son una de las mejores células presentadoras de
antígeno (APC) para los linfocitos CD4. Expresan MHC tipo II sobre su
membrana, y el resto de las moléculas co-estimuladoras necesarias. Producen
además varias leuquinas, que promueven positivamente la respuesta inmune.
El paralelo antagónico entre los Linfocitos B activados y las células
tumorales, inspiró la creación de una vacuna tumoral, constituida por el híbrido
celular entre ambas. El cultivo de esta “nueva célula”, en un medio con
suplementos especiales para incrementar el número y mantener el estado de
activación linfocitario, en particular del linfocito B, permite que, una vez inyectado
al paciente, el hibridoma “muestre” en su membrana celular los Ag. propios (los
provenientes del linfocito), y los provenientes de la célula cancerosa (Figura 30).
Estos Ag. son mostrados en el hueco altamente especializado de comunicación
con los CD4, que poseen las moléculas MHC II. Así mismo, un fenómeno no
esperado, es que el hibridoma también presenta Ag. “propios” en MHC I, que es
el vehículo de comunicación adecuado para los linfocitos citotóxicos específicos
(CD8), quienes bajo la instrucción de los CD4 sensibilizados, realizan la real tarea
antitumoral. Por último, este hibridoma segrega más leuquinas activadoras que
71
sustancias antinflamatorias, lo que incrementa la respuesta inmune del
organismo. En forma independiente Guo, y Moviglia [12-16], desarrollaron y
estudiaron este modelo en animales de laboratorio en un modelo de hepatomas
murinos, y en pacientes con distintos tipos de neoplasias avanzadas,
respectivamente, demostrando la base inmunológica, la baja toxicidad y alta
efectividad clínica que posee el método.
En estudios de inmunomarcación de células neoplásicas, provenientes de
distintos tumores humanos y murinos con baja capacidad antigénica, se
comprobó que todas ellas expresaban bajos títulos, o no expresaban, proteínas
pertenecientes al complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) tipo II, pero sí
presentaban MHC I. Así mismo eran carentes en la expresión de las llamadas
moléculas co-estimuladoras de adhesión tales como la B7.
Las moléculas MHC II junto con las moléculas co-estimuladoras permiten el
reconocimiento de los antígenos propios de una célula transformada por parte
de las clonas CD4 tumor específicas. Estas células son las que inician la
reacción de rechazo informando a las CD8 de la existencia de las células a
destruir.
Por otro lado, aún logrando obtener clonas CD8 antígeno tumoral informadas,
si bien éstas pueden informarse a través de las MHC I, no podían ser efectivas
in-vitro en la destrucción de las células tumorales específicas. El agregado por
ingeniería genética de moléculas co-estimuladoras como la B7, permitió que las
CD8 pudieran cumplir su cometido. Así mismo el bloqueo de las moléculas coestimuladoras no sólo genera falta de reacción, sino inducción de tolerancia
periférica.
Guo utilizó una línea tumoral singénica de ratas wistar. La membrana celular de
una línea generada a partir de un hepatoma de rata wistar, BERH-2, obtenido
por el tratamiento de estos animales con metil colantreno, que presenta muy
poca o nula antigenicidad, presenta baja expresión, de MHC tipo I e ICAM 1, y
no expresaban MHC tipo II, B7 y LFA-1 (Figura 31) [16].
Considerando que los linfocitos B activados son células presentadoras de
antígeno a los CD4 casi tan potentes como las células dendríticas, y que éstas
células presentan en su superficie las moléculas faltantes en las BERH-2, Guo
72
y colaboradores [16] generan una línea híbrida (TBH) resultante de la fusión
con polietilenglicol de BERH-2 con linfocitos B activados, generando así la
BERH-2-B. (Figura 30).
Activated
B-Lymphocyte
TBH
CD8 (T(T-Lymphocyte)
APC
Hybrid cell
Tumor cell and
B-lymphocyte fusion
“Wild”
Wild”
Tumor Cell
Tumor Cell
Protein
CD4
(T Lymphocyte)
“Wild”
Wild” Tumor Cell
Figura 30: Esquema de formación de la vacuna TBH
Figura 31: Determinación por comatrografía de las diversas proteinas de membrana presentes
en el linfocito B activado, la célula tumoral y la célula producto de la fusión de ambas.
73
Esta nueva línea celular expresa la totalidad de las moléculas de superficie
presentes en ambas líneas progenitoras por separado. Al ser inyectadas a
animales singénicos producen una reacción inflamatoria importante, con
infiltrado linfomonocitario. Al ser estudiado el fenotipo de los linfocitos del
infiltrado, estos presentan un fenotipo CD8 70% y CD4 30%. Los TIL
provenientes de esta reacción tienen acción citotóxica contra las células BERH2-B y las originales BERH-2, según se demuestra por ensayos de citotoxicidad
con liberación del Cr51. Por otro lado esta acción citotóxica es tumor específica,
ya que no pueden destruir líneas tumorales singénicas provenientes de
tumores de células transicionales o de pulmón.
El modelo animal descripto, basado en la producción de una línea celular formada
a partir de la hibridación de una línea de Hepatoma, la BERH-2, con linfocitos B
activados autólogos, generando así las células BERH-2-B, fue utilizado para
estudiar las acciones y propiedades de este tipo de inmunización.
En un primer experimento se inyectaron, por vía de la vena porta, 10 ratas con
2x106 células de BERH-2, que murieron dentro de los 60 días de inyectadas, y
10 ratas, por igual vía, con 2x106 células de BERH-2-B, que no desarrollaron
tumor durante 180 días de observación que tuvo el experimento. Estos
resultados fueron repetidos al comparar otras cuatro líneas celulares tumorales
contra los hibridomas obtenidos de igual forma que los BERH-2-B. De esta
forma se concluyó que los hibridomas perdieron su capacidad de desarrollar
tumores en ratas singénicas. Pero al inyectar ratones nude, que son animales
que carecen de timo, y por tanto pueden permitir el desarrollo de injertos
xenógenos y de tumores, cada uno de los hibridomas desarrolló un tumor, por
tanto se concluyó que la diferencia en el desarrollo tumoral correspondía a la
reacción inflamatoria que generaba cada uno de los hibridomas.
En un segundo grupo de experimentos se intentó saber si se podían inmunizar
animales con el pre tratamiento con TBH y el posterior injerto intrahepático del
tumor que dio origen al TBH. Para ello se utilizaron tres lotes de animales de
ocho animales cada uno (Figura 32). Los tres grupos fueron inyectados por vía
subcutánea con 2x106 células, el primero con BERH-2; el segundo con BERH2-B, y el tercero con BERH-2-B irradiadas. Al cabo de 2 semanas los tres
grupos recibieron un implante intrahepático de 2x106 células BERH-2. Sólo el
74
segundo grupo, aquel que fue inmunizado con BERH-2-B viables sobrevivió
durante los 120 días que se conservaron las ratas, y no desarrollaron tumores.
Los otros dos grupos desarrollaron tumores y murieron dentro de los sesenta
días de haber recibido la segunda inyección. Este experimento fue repetido dos
veces con idéntico resultado. (Figura 32).
Surviva l
10 0
Survival probability (%)
80
60
T reatmen t
BERH-2
BERH-2 i rra d.
BERH-2 -B
40
20
0
0
20
40
60
80
10 0
12 0
T i me in d ays
Figura 32: Esquema de Kaplan Meyer que muestra el por ciento de animales sobrevivientes
luego de la inyección intrahepática de una dosis letal de BERH-2, pre inmunizados de distinta
forma (ver leyenda en el recuadro). El tiempo (eje X) está expresado en días.
A fin de corroborar este efecto inmunogénico de las BERH-2-B, se inyectaron
catorce ratas, por vía intra-hepática, con 2x107 células BERH-2. Diez días más
tarde, ocho de estas ratas fueron inmunizadas con una inyección subcutánea
de 5x106 células híbridas BERH-2-B. Las restantes seis recibieron una
inyección subcutánea de 5x106 células BERH-2. Las ocho ratas inmunizadas
con las TBH permanecieron vivas durante los 100 días restantes de
observación. Tampoco mostraron tumores intra-hepáticos. Por el contrario, las
seis ratas inmunizadas con las células tumorales parentales desarrollaron
tumores intra-hepáticos y murieron dentro del los 60 días de inyectadas. Este
experimento fue repetido dos veces con idéntico resultado (Figura 33).
75
Survival
100
Survival probability (%)
80
60
Treatment
BERH-2
BERH-2-B
40
20
0
0
20
40
60
80
100
120
Time in days
Figura 33: Esquema de Kaplan Meyer que muestra el por ciento de animales sobrevivientes a
la inyección intrahepática de una dosis letal de BERH-2, inmunizados 15 días más tarde de
distinta forma (ver leyenda en el recuadro). El tiempo (eje X) está expresado en días.
Para estudiar si el grado de desarrollo tumoral podía influenciar este efecto
inmunogénico de las BERH-2-B, se implantaron en el hígado pequeños
fragmentos de masas tumorales de BERH-2 (0.3 mm x 0.5 mm). Diez días más
tarde, ocho de estas ratas fueron inmunizadas con una inyección subcutánea
de 5x106 células híbridas BERH-2-B. Las restantes seis recibieron una
inyección subcutánea de 5x106 células BERH-2. Las ocho ratas inmunizadas
con las TBH permanecieron vivas durante los 60 días, entre los 60 y 70 días
dos animales fallecieron por desarrollo de tumor intrahepático. Los seis
sobrevivientes no presentaron masas tumorales en la autopsia al cumplirse 120
días de observación. a semejanza del experimento anterior, las seis ratas
inmunizadas con las células tumorales parentales desarrollaron tumores intrahepáticos y murieron dentro del los 60 días de inyectadas. Este experimento
fue repetido dos veces con similar resultado (Figura 34).
76
Survival
100
Survival probability (%)
80
60
Treatment
BERH-2
BERH-2-B
40
20
0
0
20
40
60
80
100
120
Time in days
Figura 34: Esquema de Kaplan Meyer que muestra el por ciento de animales sobrevivientes a
al implante tumoral intrahepático de pequeños fragmentos de BERH-2, inmunizados 15 días
mas tarde de distinta forma (ver leyenda en el recuadro). El tiempo (eje X) está expresado en
días.
Para corroborar que era el efecto del Hibridoma como tal, y no la simple suma
de ambas células lo que producía el fenómeno, se seleccionaron tres grupos
de ratas de ocho animales cada uno. El primer grupo fue inyectado por vía
subcutánea con 5x106 células BERH-2; el segundo con igual cantidad de
células de BERH-2-B también por vía subcutánea, y el tercero, también por vía
subcutánea, con 5x106 células BERH-2 más 5x106 linfocitos B, en presencia de
polietilenglicol. Nuevamente todos los animales de los tres grupos, al cabo de 2
semanas, recibieron un implante intrahepático de 5x106 células BERH-2. Sólo
el segundo grupo, aquel que fue inmunizado con BERH-2-B, sobrevivió y no
desarrollaron tumores durante los 150 días que se conservaron las ratas. Los
otros dos grupos desarrollaron tumores y murieron dentro de los sesenta días
de haber recibido la segunda inyección. Este experimento fue repetido tres
veces con idéntico resultado (Figura 35). En este último grupo de experimentos
los TBH no fueron purificados, y sin embargo conservaron su efectividad.
77
Survival
100
Survival probability (%)
80
60
Treatment
BERH-2
BERH-2 + B
BERH-2-B
40
20
0
0
20
40
60
80
100
120
Time in days
Figura 35: Esquema de Kaplan Meyer que muestra el por ciento de animales supervivientes
luego de la inyección intrahepática de una dosis letal de BERH-2, inmunizados 15 días mas
tarde de distinta forma (ver leyenda en el recuadro). El tiempo (eje X) está expresado en días.
Estos cuatro experimentos corroboran lo postulado. La hibridación de estas dos
células, actuando como célula viva en el animal receptor, es la que desarrolla el
efecto inmunógeno. Las células tumorales solas, inyectadas en un lugar no
propicio como es el tejido celular subcutáneo, no proliferan pero tampoco
producen ninguna reacción antigénica, pues carecen de las señales de
membrana necesarias para ser reconocidas por los CD4. Tampoco basta la
presencia de los linfocitos B junto a las células tumorales. El linfocito B necesita
recibir el antígeno presentado por otra célula presentadora de antígenos. Sólo el
híbrido tiene esta propiedad, pues en la formación de membranas del hibridoma,
fracciones proteicas de los antígenos propios de la célula tumoral son procesados
y presentados por los elementos celulares que utiliza el linfocito B activado para
comunicarse fisiológicamente con las células T. Esta misma es la razón por la
que las TBH irradiadas no generaron ninguna respuesta efectora y permitieron el
desarrollo tumoral. Los linfocitos T informados por esta extraña vía son los
responsables de iniciar la reacción de rechazo que, por reacción cruzada,
previene el desarrollo o destruye a las células tumorales parentales del hibridoma.
78
Una vez corroborada la efectividad inmunogénica del tratamiento con TBH, a fin
de averiguar cuál (o cuáles) subpoblación linfocitaria T era responsable, se
diagramó un tercer grupo de experimentos. Tres grupos, de seis ratas cada uno,
fueron tratados con anticuerpos monoclonales purificados, provenientes de ratón,
contra CD4 (OX38) para el primer grupo, contra CD8 (OX8) para el segundo
grupo, y contra ácido dimetilamino pentacético para el tercer grupo que fue
considerado grupo control. Cada animal recibió una inyección intravenosa de 500
μg de anticuerpo monoclonal, dos veces por semana, durante tres semanas. Dos
días previos a la inyección de las TBH se controló en sangre periférica, por
inmunomarcación y microscopía de fluorescencia, el grado de inhibición
alcanzado. Las tratadas con anti CD4 disminuyeron en más de un 95 % el
número de CD4, las tratadas con anti CD8 disminuyeron en aproximadamente un
95 % el número de CD8, y las tratadas con anticuerpo control no tuvieron
alteraciones en el número de CD4 o CD8. Un cuarto grupo de seis ratas,
considerado también control, no recibió ningún tratamiento con anticuerpos
monoclonales. Cada una de las ratas de los 4 grupos recibió una inyección
intrahepática de 5 x 106 células híbridas BERH-2-B. Cuatro de las ratas pobres en
CD4, y cinco de las ratas pobres en CD8 desarrollaron tumores intrahepáticos.
Por el contrario ninguno de los animales del grupo control desarrolló tumores.
Lo hasta aquí expuesto parece establecer que en la fase de inducción tanto los
CD4 como los CD8 son esenciales para el efecto inmunogénico de las TBH (ver
tabla 1). Este resultado guarda cierta lógica con lo conocido sobre el papel que
poseen estas subpoblaciones en el mecanismo efector. Las CD4, instruidas, por
las TBH, informan y promueven la acción citotóxica de las CD8. Ambas son
necesarias. A fin de corroborar esta hipótesis se tomaron otros tres grupos de
ratas, de cinco animales cada uno. todas fueron inmunizadas con una inyección
subcutánea de 2 x 106 células híbridas BERH-2-B. Dos semanas luego de la
inmunización los animales fueron tratados con Anticuerpos monoclonales en
forma
similar
al
experimento
anterior.
Nuevamente
se
verifico
con
inmunomarcación de sangre periférica el grado de disminución celular de cada
población, según cada tratamiento. Tres días más tarde luego de la última
inyección de anticuerpos, todas las ratas fueron inyectadas en el hígado con 5 x
106 células BERH-2. Ni el grupo empobrecido en CD4, ni el tratado con
79
anticuerpo inespecífico desarrollaron tumores. Por el contrario, todas las ratas
tratadas con anticuerpos anti-CD8 desarrollaron tumor. Este resultado es
coherente y corrobora la hipótesis total, pues los CD4 informados permanecen
como células de memoria, y son estimulados con la inyección de células
tumorales. Por el contrario, la falta de CD8 impide que los CD4 puedan inducir la
respuesta inmune, y esto permite la proliferación celular por anergia efectora.
Tabla 1
Especificidad del Anticuerpo
Inmunización con BERH-2-B,
Tratamiento con Anticuerpo y
Número de animales con
tratamiento con Anticuerpo y
luego Inyección Intrahepática
tumores sobre el total de
luego Inyección Intrahepática
de BERH-2-B.
animales tratados.
de BERH-2.
No
-
0/6
CD4
+
4/6
CD8
+
5/6
Anticuerpo control
+
0/6
CD4
+
0/5
CD8
+
5/5
Anticuerpo control
+
0/5
Por último, a fin de corroborar el grado de especificidad de respuesta
inmune generada por los TBH se diseño el siguiente experimento. Se
inmunizaron, por vía subcutánea, dos grupos, de ocho ratas cada uno, con 2 x
106 células híbridas BERH-2-B. Dos semanas más tarde el primer grupo fue
inyectado por vía intra-hepática con 5 x 106 células BERH-2, y el segundo con
igual cantidad, pero por vía subcutánea con una línea de carcinoma de células
transicionales obtenidas de la American Type Culture Collection denominada
NBT-II. Mientras, como era de esperar, ninguna rata del primer grupo desarrollo
tumor, todas las ratas del segundo grupo desarrollaron tumor de la línea NTB-II, y
murieron dentro de los 45 días. (Tabla 2)
Tabla 2
Number of animals with
Immunization cells
Challenge cells
BERH-2-B
BERH-2
0/8
BERH-2-B
NBT-II
8/8
tumors
80
Figura 36: desarrollo del modelo Experimental de GBM. Inyección intracerebral de 105 células
F98 en el cerebro de Ratas Fisher. El 100% de los animales muere a los 32 días del implante.
81
A fin de corroborar estos hallazgos en otro modelo animal utilizamos el modelo
de glioblastoma multiforme (GBM) el tumor más agresivo y menos imunogénico
que se conoce. Al inyectarlo dentro del cerebro de ratas Fisher, el 100% de los
animales entre el día 28 y el 32 mueren por ocupación completa del hemisferio
inyectado (Figura 36) .
Si una semana a posteriori de la inyección, los animales son tratados con
vacuna TBH, estos no desarrollan tumor durante los siguientes 60 días de
observación. Figura 37
100
Survival probability (%)
80
treatment
Control
TBH
Thy+TBH
Thymosine
60
40
20
0
0
10
20
30
40
50
60
Time in days
Survival time
Endpoint
: Survival
: Death
Factor codes
: treatment
Factor:
Control
Sample size: 12
Median surv.: 25.5
TBH
12
-
Thy+TBH
12
-
Thymosine
12
-
0.0
3.4
0.0
3.4
0.0
3.4
Comparison of survival curves
Logrank test
Endpoint-Observed n
Expected n
Chi-square
DF
Significance
12.0
1.9
= 65.1371
= 3
P < 0.0001
Figura 37 Estudio de sobrevida por el análisis Kaplan Meier en ratas Fisher con implante
intracerebral de 105 células F98 respecto del tratamiento que recibieron. (resultados de nuestro
laboratorio no publicados)
(En en gráfico no me resultaron claros los colores de cada serie)
82
Aplicación Clínica de Terapias Inmunológicas para el
Cáncer de Mama. Nuestra Experiencia.
Material y Métodos
Sinopsis del Protocolo Clínico Utilizado
Criterios para la Indicación Terapéutica
1. Pacientes de ambos sexos, con cualquier tipo de tumor avanzado que
hubiesen empeorado al recibir las terapias de efectividad comprobada, y/o
hubiesen sido intolerantes a las mismas y/o no cualificasen para otra
terapia de eficiencia establecida.
2. Los pacientes debían tener un diagnóstico fehaciente de poseer
enfermedad neoplásica, establecido por
2.1. Imagen Positiva detectada por ecografía (Eco), tomografía axial
computada (TAC), resonancia magnética nuclear (RMN) y/o Tomografía
de Emisión de Positrones (PET).
2.2. Las imágenes positivas debían haber sido corroboradas por estudio
histopatológico
3. Se aceptaron pacientes sin limitación por su estado de perfomance clínica.
De todas maneras la Perfomance fue establecida por el índice ECOG
(Eastern Oncology Cooperative Group).
4. El Paciente debía ser mayor de edad o contar con la autorización escrita de
su representante legal.
5. El paciente mayor de 18 años debía pesar más de 40 Kg y los niños estar
dentro de los percentiles de normalidad
6. El Hematocrito debía ser igual o mayor al 25 %.
7. El recuento de leucocitos periféricos debió ser igual o superior a 3000/mm3
8. El Volumen Corpuscular Medio (VCM) ser igual o mayor de 70 fl
9. La Hemoglobina Corpuscular Media (HCM) debió ser igual o superior a
21pg
83
10. El recuento de plaquetas debió ser inferior a 500000/mm3
11. Debió demostrar función cardíaca, hepática, respiratoria, renal y condición
metabólica pre-existente compensada.
12. El paciente, o su representante legal, debió haber sido informado
fehacientemente y haber aceptado recibir el tratamiento a través de la firma
del Consentimiento Informado.
Criterios para la no indicación terapéutica
1. Pacientes que hubiesen recibido terapia radiante o quimioterapia durante
los 30 días previos al inicio de la inmunoterapia.
2. Pacientes con una segunda neoplasia en actividad (excluido el carcinoma
de piel basocelular).
3. Pacientes con Infección viral o bacteriana sistémica o micosis visceral en el
momento de comenzar a tratarse con el régimen inmunoterápico propuesto.
4. Presentar Ictericia o fallo hepático.
5. Mujeres embarazadas o lactando.
6. Mujeres
en
edad
reproductiva
que
no
observasen
un
régimen
anticonceptivo no hormonal durante el tratamiento.
7. Pacientes con adicciones o trastornos psiquiátricos no controlados
8. Presencia de cualquier otra enfermedad asociada la cual en opinión del
medico tratante pudiese interferir con el tratamiento o la adhesión del
paciente a la terapia.
9. Negarse a firmar el consentimiento informado
Evaluación Previa al Inicio del Tratamiento:
Durante la semana previa al inicio del tratamiento indicado se les realizaron
controles a los pacientes. Estos incluyeron la confección de una historia clínica
completa, análisis de sangre, serología sanguínea para detectar infecciones
ocultas, de la función cardíaca a través del estudio de un especialista y la
84
obtención de un registro electrocardiográfico, de la función respiratoria a través
de una espirometría y de la respuesta inmune antitumoral a través de la prueba
de proliferación linfocitaria. El clínico, utilizando la escala ECOG, tomó nota de
la perfomance clínica del paciente al inicio del tratamiento.
Procedimientos terapéuticos
Elaboración y Aplicación de la Vacuna TBH y de los TIL
1. Obtención de las células tumorales.
Conforme a la condición clínica del paciente fueron utilizadas dos formas
diferentes de obtener células tumorales autólogas: Por disociación celular
de pieza quirúrgica o por cultivo de células obtenidas por biopsia realizada
con aguja delgada.
Este ultimo procedimiento fue realizado bajo guía tomográfica, las más de
las veces, o bajo guía ecográfica, las menos. Utilizando cualquiera de estas
dos formas de biopsia guiada por imágenes siempre se realizó el
procedimiento bajo anestesia local y sedación general, en condiciones
estériles y controlando siempre la citología de la pieza obtenida para
asegurar que se obtuviesen células tumorales. El procedimiento fue
realizado por un radiólogo intervencionista, ayudado por un anestesista y en
conjunto con el patólogo y un clínico del equipo.
Luego de haberse practicado las biopsias los pacientes fueron medicados
con protección gástrica y analgésicos y observados en internación (sólo si
fuese necesario) o en forma ambulatoria por un total de 72 horas.
De una u otra forma siempre se dividió el material en dos fragmentos. Un
fragmento fue procesado para realizar pruebas histológicas e histoquímicas
y el otro para aislar y cultivar las células tumorales.
Este ultimo procedimiento, el cultivo de las células tumorales, fue realizado
en un nuestro laboratorio de alta seguridad biológica, calidad GMP,
especializado para estos menesteres.
85
2. Aislamiento de células tumorales y de Linfocitos que infiltraban al Tumor
(TIL)
El tejido obtenido por biopsia destinado a producir el TBH fue disociado
mecánicamente y pasado por una malla metálica de 40 micrones de poro
hasta obtener una suspensión de células individuales.
La suspensión celular fue sembrada sobre un gradiente de Ficoll-Hypaque
(uso clínico CG) y el conjunto fue centrifugado a 1200 rpm durante 30
minutos. Las células mononucleares precipitadas fueron las tumorales,
mientras que las que quedaron en el anillo de la interfase fueron glóbulos
blancos mononucleares entre los que se hallaban los TIL.
Las células tumorales fueron cultivadas en DMEM enriquecido con Insulina
humana recombinante y “epidermal growth factor” humano recombinante.
Los TIL fueron cultivados en DMEM + IL2 + ranitidina + Indometacina, para
obtener otro producto terapéutico.
3. Obtención de los leucocitos mononucleares del paciente.
Los leucocitos Mononucleares del Paciente fueron obtenidos a través de la
aféresis de una volemia. Se utilizaron separadores celulares de flujo
continuo Fenwal CS3000 Plus o Cobe Spectra. Con ambas máquinas se
utilizó un programa de obtención de “Buffy Coat”. En todos los casos se
procesó un volumen de sangre igual a 1 volemia del paciente. Para facilitar
el procedimiento, si el paciente no poseía venas de una adecuada
resistencia y calibre, se colocó un catéter de 12 French doble lumen en vía
central.
4. Expansión, activación y selección de los linfocitos B.
La bolsa de recolección de buffy coat fue procesada en el laboratorio GMP
de alta seguridad biológica. Las células del buffy coat fueron lavadas con
solución salina balanceada (SSB) sin Ca++ ni Mg++. Luego las células
mononucleares fueron sembradas sobre un gradiente de Ficoll Hypaque
(CG) y centrifugadas a 1200 rpm durante 30 minutos.
Las células del anillo de la interfase fueon lavadas con SSB sin Ca++ ni
Mg++. Luego fueron sembradas en DMEM enriquecido con IL4 e IL6. Al
86
tercer día fueron cosechadas e incubadas en una SSB con un cóctel de
anticuerpos con afinidad para todas las células que posiblemente pudiesen
estar presentes en el buffy coat excepto para los linfocitos B. Cada
anticuerpo estaba unido por su porción Fc con un anticuerpo anti-teflón, y
este, a su vez, unido a una microesfera de teflón, que en su estructura
contenía un polvo ferro magnético. Cuando las células preincubadas en
este cóctel de anticuerpos pasaban por una columna de inmunoselección
magnética, todas las células, excepto los linfocitos B, eran retenidas por
esta. La pureza de la suspensión celular que eluía de la columna era entre
92 y 98% de linfocitos B.
5. Generación del los TBH.
Se cosecharon los cultivos tanto de linfocitos B Activados como de células
Tumorales aisladas. Ambas suspensiones celulares fueron mezcladas en
una proporción de 10:1 respectivamente. Esta suspensión celular fue
tratada con polietilenglicol (PEG) durante tres minutos. Luego se lavaron las
células y se cultivaron en DMEM con Insulina, EGF, e IL6.
6. Control y aseguramiento de la calidad del proceso de elaboración y del
producto celular.
Se efectuaron estudios microbiológicos y de identidad, viabilidad y potencia
biológica de muestras de las diferentes células utilizadas a través del
proceso de elaboración de los diferentes productos celulares. (bolsa de
aféresis, células aisladas, producto de cada cultivo celular, etcétera)
Las pruebas microbiológicas investigaron la presencia de bacterias
aerobias, anaerobias, micobacterias, hongos, y virus. Si alguna de las
pruebas realizadas fue positiva, se aplicó, de ser posible, un protocolo de
decontaminación. En caso contrario, de no haber sido factible decontaminar
la muestra, o si el proceso de descontaminación hubo fracasado, el
producto biológico fue descartado y, de ser posible , se repitió todo el
proceso desde el punto último de seguridad. Las pruebas biológicas
incluyeron conteo total de células, investigación de viabilidad celular, a
través de la prueba de inclusión del Trypan Blue, identificación y
cuantificación de las diversas poblaciones celulares a través de su análisis
87
microscópico morfológico e inmunohistoquímico, apoyado por el análisis de
citometría de flujo, según correspondiese.
Por ejemplo, para corroborar si se había formado el híbrido TBH se
realizaron coloraciones de May Grünwald Giemnsa y tinciones inmunohistoquímicas para determinar si una misma célula (bi nucleada o no)
poseía microfilamentos de citoqueratina en el citoplasma y proteínas CD19
en su membrana celular, a un mismo tiempo. (Ver anexo 1)
7. Infusión Intravenosa de Ciclofosfamida
48 horas previas a la vacunación, ambulatoriamente, se le infunde al
paciente por vía endovenosa una única dosis de Ciclofosfamida (350 mg
por m2 de superficie corporal).
8. Inmunización Intraganglionar
Las Inmunizaciones se realizan por inyección intraganglionar de la vacuna.
El Ganglio linfático no debe haber sido irradiado ni mostrar signos de
invasión neoplásica (a la palpación). Las inmunizaciones se realizan cada
tres semanas, alternando cada vez el ganglio a inyectar.
El procedimiento puede resumirse de la siguiente manera:
Se escoge una región linfática que no haya sido irradiada ni muestre
indicios de invasión neoplásica, al palpar la zona y los ganglios locales. Se
prefieren los de la región inguinal.
Por palpación se localiza un ganglio que sea móvil y de consistencia blanda.
Se lo fija utilizando el dedo índice y el mayor de la mano no hábil.
Con la mano hábil se pasa una gasa con alcohol 70 sobre la piel que
recubre al ganglio elegido, así como sobre los dos dedos que lo sujetan.
Luego, se toma la jeringa que contiene la vacuna. La jeringa debe ser de 1
cm3 o poseer el tamaño suficiente como para que solo pueda contener el
volumen total en el que está suspendida la vacuna. La jeringa debe estar
cargada y montada con una aguja 25G o de menor calibre.
Colocando la aguja paralela a la superficie de la piel se deprime esta y se
ingresa al ganglio linfático por uno de los polos. Se realiza una pequeña
88
succión, para constatar que no hemos ingresado en ningún vaso sanguineo.
Luego se presiona el émbolo suavemente para evitar el reflujo
extraganglionar de la vacuna.
La Dosis de vacuna a administrar debe ser superior a 1x107 células totales.
Preparación y aplicación de la Vacuna TBH AAL.
9. Obtención de las MNC del paciente
9.1. Luego que el paciente hubo recibido las dos primeras inmunizaciones
con TBH se le practica una leucoaféresis. El producto celular de este
procedimiento es el denominado “Buffy Coat”. Consiste en una
suspensión enriquecida de leucocitos mononucleares (MNC) y una
pequeña proporción de granulocitos, glóbulos rojos y plaquetas.
9.2. El producto celular se controla (ver anexo 1) para determinar la calidad,
cantidad y proporción de MNC existentes.
9.3. Los MNC se lavan con SSB sin Ca++ ni Mg++. Se siembran sobre un
gradiente de Ficoll-Hypaque (CG) y se centrifugan a 1500 rpm durante
30 minutos.
9.4. Se recogen las células que forman el anillo de la interfase ficoll-SSB. Se
lavan, cuentan y controlan.
10. Co-cultivo de las MNC con el TBH.
Los TBH y los MNC (1:10) son co-cultivados durante 3 días a 37ºC, 5% de
CO2, en Medio de cultivo DMEM, enriquecido con Insulina rh, EGF rh, SCF
rh, TNFα rh y GMCSF rh durante tres días.
11. Control y aseguramiento de la calidad del proceso de elaboración y del
producto celular.
Se procede igual a lo descripto en el punto 6.
12. División en alícuotas y preservación de las Dosis de TBH AAL
Luego de realizados los controles pertinentes las células se dividen en
alícuotas 5x108 células. Estas se suspenden en DMEM con 2% de albúmina
89
humana y 10% de DMSO. Luego se congelan a -84ºC hasta el momento de
su utilización.
13. Infusión Intravenosa de Ciclofosfamida
Se procede igual a lo descripto en el punto 7.
14. Inmunización Intraganglionar
Se descongela la dosis correspondiente. Se lava para quitarle la solución de
DMSO, se controla la calidad del producto y se procede igual a lo descripto en
el punto 8.
Elaboración y Citoimplante del Cultivo Mixto de Leucocitos (MLC)
15. Selección del Donante
Se selecciona un donante de células mononucleares entre tres posibles
donantes. Cada uno debe reunir las condiciones de un donante de sangre,
poseer buen calibre venoso en miembros superiores, debe ser no
relacionado, en el caso que la paciente sea mujer no debe ser su
compañero sexual. Se realiza un cultivo mixto de linfocitos unidireccional
entre los linfocitos de cada uno de los posibles donantes enfrentado a los
linfocitos irradiados del paciente.
El que reúna todos los criterios de
selección y posea los índices mayores de incompatibilidad en el cultivo
mixto de linfocitos será el escogido.
16. Obtención de las MNC
16.1.
Se le practica al paciente una leucoaféresis. El producto celular de
este procedimiento es el denominado “Buffy Coat”. Consiste en una
suspensión enriquecida de leucocitos mononucleares (MNC) y una
pequeña proporción de granulocitos, glóbulos rojos y plaquetas.
16.2.
El producto celular se controla (ver anexo 1) para determinar la
calidad, cantidad y proporción de MNC existentes.
16.3.
Los MNC se lavan con SSB sin Ca++ ni Mg++. Se siembran sobre
un gradiente de Ficoll-Hypaque (CG) y se centrifugan a 1500 rpm
durante 30 minutos.
90
16.4.
Se recogen las células que forman el anillo de la interfase ficoll-
SSB. Se lavan, cuentan y controlan.
16.5.
Los MNC del paciente así purificados se irradian con 2500 Rads
17. Cultivo Mixto de Linfocitos (MLC)
Se mezclan las MNC del donante con las MNC irradiadas del paciente
(10:1) y se cultivan en DMEM a 37ºC, 5 % CO2 durante 72 horas. Al cabo
de este tiempo se cosecha el cultivo, se lo cuantifica y se le realizan los
controles pertinentes. Se requiere un mínimo de 1x109 células del MLC.
18. Implante del MLC
El MLC fue implantado dentro del tumor durante un acto quirúrgico o a
través de una punción guiada por tomografía o por ecografía. En todos los
casos se corroboró, a través del reporte citológico de un patólogo, si el sitio
escogido para la punción era el adecuado o no. A posteriori del implante se
selló el o los sitios de punción con un coágulo de fibrina realizado con un
preparado comercial (Tissucol®, Baxter–Immuno, Chicago, USA).
Elaboración y administración de la Vacuna DC-TBH autóloga.
19. Se elabora un TBH de cada uno de los diferentes tipos de metástasis y del
tumor original según la metodología descripta en los puntos 1 a 6.
20. Movilización de células Dendríticas (DC) naive desde médula ósea:
Durante cinco días consecutivos (días 1 al 5), el paciente recibe GM-CSF
150 microgramos
por vía subcutánea. La inyección se realiza a las 19
horas.
21. Obtención de las MNC del paciente
21.1.
El día 6 se le practica al paciente una leucoaféresis. El producto
celular de este procedimiento es el denominado “Buffy Coat”. Consiste
en una suspensión enriquecida de leucocitos mononucleares (MNC) y
una pequeña proporción de granulocitos, glóbulos rojos y plaquetas.
21.2.
El producto celular se controla (ver anexo 1) para determinar la
calidad, cantidad y proporción de MNC existentes.
91
21.3.
Los MNC se lavan con SSB sin Ca++ ni Mg++. Se siembran sobre
un gradiente de Ficoll-Hypaque (CG) y se centrifugan a 1500 rpm
durante 30 minutos.
21.4.
Se recogen las células que forman el anillo de la interfase ficoll-
SSB. Se lavan, cuentan y controlan.
22. Aislamiento de las DC:
Las MNC son incubadas con un cóctel de anticuerpos (StemSep® human
DC enrichment cocktail, Stem Cell Technology, Vancouver). Cada
anticuerpo reconoce una de las diversas poblaciones celulares que
componen la suspensión de MNC excepto a las DC. A su vez cada
anticuerpo se encuentra unido por su fracción Fc a la fracción Fc de un
segundo anticuerpo que reacciona con el teflón. Luego de 30 minutos de
incubar a las MNC con el cóctel de anticuerpos se agrega una suspensión
de micro-esferas de Teflón que contienen en su estructura un particulado
magnético. De esta forma, al permitir que las MNC marcadas escurran a
través de una columna de inmunoselección magnética, todas las células
marcadas quedan retenidas y dejan escurrir a las DC. Las DC son lavadas
con BSS.
23. Activación de las DC desafiándolas con TBH
Las DC aisladas se co-cultivan con TBH (4:1) en DMEM enriquecido con
TNFα y GM-CSF. Se cultivan las células por tres días. Luego las células
son cosechadas, cuantificadas y controladas apropiadamente.
24. Control y aseguramiento de la calidad del proceso de elaboración y del
producto celular.
Se procede igual a lo descripto en el punto 6.
25. Infusión Intravenosa de Ciclofosfamida
Se procede igual a lo descripto en el punto 7.
26. Inmunización Intraganglionar
Se procede igual a lo descripto en el punto 8.
92
Elaboración y administración de los CD3+CD25- autólogos,
específicos contra el propio tumor.
27. Cuando
los
pacientes
antitumorales,
aparecen
han
en
sido
sangre
tratados
con
linfocitos
vacunas
celulares
específicos
activados
CD3+CD25-. Esto suele ocurrir a la semana de la primera inmunización,
pero el número de los linfocitos efectores específicos se incrementa varias
veces luego de la segunda inmunización. Por esto, luego de haber
transcurrido dos semanas de la segunda inmunización se extraen, por
aféresis, las CMN correspondientes al procesamiento de dos volemias.
28. Por selección negativa se aíslan los linfocitos CD3+. Éstos se co-cultivan
por 48 horas con TBH en DMEM, sin otro agregado, en proporción 10:1. Al
tercer día, por selección negativa, se aíslan los linfocitos CD3+CD25- y se le
agrega al cultivo IL2. El día 5 se cosechan, cuentan y controlan los linfocitos
así procesados.
29. Control y aseguramiento de la calidad del proceso de elaboración y del
producto celular.
Se procede igual a lo descripto en el punto 6.
30. Infusión Intravenosa de Ciclofosfamida
Se procede igual a lo descripto en el punto 7.
31. Implante intratumoral de la suspensión de linfocitos CD3+CD25Se procede igual a lo descripto en el punto 18.
Tratamiento con Timosina alfa 1 (Tα1):
La Tα1 es una hormona tímica que actúa selectivamente sobre la inmunidad
celular modulando la respuesta efectora, principalmente Th1. Se la utiliza como
medicación de segunda línea para los pacientes con Hepatitis B y C crónicas
que no han respondido al tratamiento con ribavirina e interferón. Ha mostrado
ser altamente efectiva para elevar la inmunidad celular de los pacientes
oncológicos que han recibido o se encuentran recibiendo tratamientos
93
quimioterápicos agresivos. Así mismo ha mostrado ser un poderoso adyuvante
de vacunas profilácticas antivirales.
Por esto se decidió administrar este inmunomodulador a aquellos pacientes
que poseían signos de inmunidad celular deprimida (micosis, herpes zoster,
haber recibido un tratamiento de quimioterapia muy agresivo, etc). Así mismo
se trató a aquellos pacientes que luego de la primer inmunización no lograban
incrementar el valor absoluto del índice de proliferación linfocitaria (LPA scores)
por sobre 10x103 células por μl. Se administró 1 ampolla de 1,6 μg por vía
subcutánea, dos veces por semana, a las 19 horas. El nombre comercial es
Zadaxin® y es producido por SciClone Pharmaceuticals.
Evaluación de la Seguridad Terapéutica:
La Seguridad del tratamiento de Inmunoterapia se realizó conforme se describe
en el documento de Regulación Federal de la FDA para IND 21CFR 312.32
[324].
Los controles pertinentes se le tomaron al paciente a primera hora del día en
que iba a ser inmunizado, y luego a las 24 y 96 horas de ese primer control.
Este esquema de controles permitió monitorear, y de haber habido lugar,
tomar las medidas clínicas necesarias a los Eventos Adversos tempranos y
tardíos que pudiesen haber ocurrido.
El examen clínico incluyó el registro del peso, temperatura corporal, frecuencia
cardiaca,
tensión
arterial,
frecuencia
respiratoria
y
oximetría
digital,
electrocardiograma de reposo, y estudios de laboratorio de la primer orina de la
mañana y de una muestra de 20 cm3 de sangre. El médico clínico realizó un
interrogatorio estructurado complementándolo con un examen físico general y
en particular neurológico. Se valoró el estatus clínico del paciente conforme a la
escala ECOG. De esta forma se pudo descartar que el tratamiento produjese
alteración sobre las funciones cardiacas, respiratorias, renales hepáticas,
neurológicas y del medio interno.
Estuvo previsto que si el paciente hubiese desarrollado signos compatibles con
un evento adverso severo (SAE) tal como hipersensibilidad aguda, anafilaxis, o
94
Síndrome de Respuesta Inflamatoria Sistémica (SIRS), fuera tratado con las
medidas pertinentes y, de ser necesario, se lo derivara a la Unidad de Terapia
Intensiva.
Se consideró SAE a todos los eventos adversos que alcanzaron el grado 3 o 4,
así como las reacciones de hipersensibilidad de grados 2, 3 y 4 de la escala de
toxicidad transcripta en el Anexo 2. Los SAE fueron reportados al comité de
bioseguridad dentro de los siete días de ocurridos. De ocurrir un SAE el comité
de bioseguridad debió decidir si el paciente podía o no continuar con su
tratamiento.
Tanto los datos clínicos como de laboratorio fueron registrados en un formulario
de la historia clínica estructurada. Todos estos datos fueron valorados
conforme a la escala pre-establecida descripta en el anexo 2. Los valores
absolutos de cada ítem fueron sumados y el valor total resultante se denominó
Índice de Toxicidad (IT). Utilizando este índice se pudo realizar una evaluación
estadística para averiguar si el mismo poseía alguna correlación con el status
clínico del paciente (ECOG, anexo 8) previo a cada inmunización, a la cantidad
de células (dosis) que compone cada inmunización y al número de dosis ya
recibidas. Las comparaciones se realizaron utilizando el “Spearman´s rank
correlation test”.
Evaluación de la Eficacia del Tratamiento:
Como medida de la eficacia terapéutica se consideran dos parámetros:
Desarrollo de respuesta inmune efectora antitumoral y Respuesta tumoral
Respuesta Inmune:
Para estudiar la respuesta inmune funcional de la relación tumor-paciente, se
realizó un co-cultivo del TBH del paciente con sus células mononucleares
periféricas. Los estudios sobre la respuesta sistémica inmune del paciente
fueron realizados el día de inicio de cada nuevo ciclo terapéutico.
El procedimiento, descripto con anterioridad, puede resumirse como sigue:
leucocitos mononucleares , aislados a partir de una muestra de 20 cm3 de
95
sangre periférica del paciente y concentrados en un volumen de 1500
microlitros fueron sembrados en placa de 96 posetas. Cada poseta recibió 100
microlitros de la suspensión en DMEM de Células mononucleares, 100
microlitros de DMEM con albúmina al 5% o suero autólogo (una poseta para
cada condición, la primera considerada co-cultivo libre de suero y la segunda
considerada co-cultivo con suero), y 100 microlitros con una suspensión de
TBH en DMEM a una concentración 10 veces menor que la de mononucleares.
A las dos primeras posetas (una con suero y otra sin suero), consideradas
controles, no se le agregaron células TBH, a las dos segundas (una con suero
y otra sin suero) se les agregaron células TBH (Irradiadas con 2500 RAD de
radiación gama) originadas en otro paciente portador de un tumor similar
(homólogo), y a las últimas dos (una con suero y otra sin suero) se le agregó
una suspensión de células (Irradiadas con 2500 RAD de radiación gama) de
TBH autólogo . Cada cultivo fue realizado por duplicado. El número aproximado
de leucocitos mononucleares sembrados en cada poseta fue de 5 x 105 células
y de TBH fue de 5 x 104 células. la placa de ensayo fue incubada a 37ºC, en
atmósfera de aire filtrado, humidificado y 5% de concentración de CO2, por 96
horas. El número final de células fue cuantificado utilizando un contador celular
automático (Autocounter AC 9000 Swelab TM).
El índice de proliferación linfocitario (LPI) utilizado para evaluar la respuesta
inmune fue calculado dividiendo el valor absoluto del número de células
presentes en los cultivos desafiados, ya con el TBH homólogo o con el TBH
autólogo, sin suero y con suero, dividido por el valor absoluto de células
presentes en los cultivos sin desafiar con el TBH sin suero y con suero
respectivamente.
Si el LPI fue inferior a 0.7 se interpretó como respuesta
inmune de tolerancia, si sus valores estuvieron entre 0.7 y 1.0 se interpretó
como respuesta inmune equilibrada, y si los valores fueron superiores a 1.0 se
interpretó como respuesta inmune efectora.
Respuesta Tumoral
Se considera Respuesta Tumoral a la disminución de la masa de la Neoplasia.
En general para evaluarla luego de un tratamiento quimioterápico, radioterápico
96
u hormonoterápico se han utilizado los criterios RECIST (disminución de dos
diámetros de una masa tumoral tomados en dos imágenes comparables).
De esta forma se dice que existe una respuesta completa (CR) si la masa
tumoral ha disminuido en un 100% ambos diámetros. Si la reducción promedio
de ambos diámetros es superior al 50% (pero inferior al 100) se dice que la
respuesta ha sido parcial (PR). Si esta reducción de los diámetros es inferior al
50%, pero superior al 20%, se dice que la remisión ha sido menor (MR). Si la
variación de los diámetros, en más o en menos, es inferior al 20% se dice que
el paciente presenta una enfermedad estable (SD). Si los diámetros se han
incrementado en más de un 20% se dice que el paciente posee una
enfermedad en progresión (PD).
La figura 38 es un ejemplo donde se observa reducción de masa tumoral
facilmente evaluada por la aplicación de los criterios RECIST utilizando
imágenes pre y post tratamiento.
A
C
B
D
Figura 38: Paciente con LNH. Imágenes A y B de adenopatías mediastinales detectadas
previas al tratamiento que han disminuido su tamaño a posteriori del tratamiento con DC-TBH
(Imagenes C y D).
Sin embargo el actuar de los tratamientos inmunoterápicos implica primero la
inflamación del tumor, luego la interacción de las células inmunes con el tumor,
97
lo que puede llevar a una parálisis metabólica de éste y finalmente a la
reducción de la masa tumoral. Por esto se observó que los criterios RECIST no
siempre pueden ser aplicados.
La Inflamación del tumor puede ser confundida con un incremento de tamaño
del tejido tumoral. La detención del metabolismo tumoral es uno de los
primeros pasos que anteceden a la destrucción tumoral pero esta no puede ser
detectada por una TAC o una RMN.
Un segundo elemento a considear es el comportamiento observado respecto
de la concentración plasmática de los marcadores tumorales. Como se ilustra
en la Figura 39, la evaluación al mes de la primer inmunización, en un
tratamiento exitoso, se caracteriza por un dramático incremento de la
concentración sérica de los marcadores tumorales.
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
Start
1st month
3rd month
6th month
12 month
18 month
Figura 39: Evolución de los valores séricos del CA 19-9 de un paciente con Cáncer de
Pancreas avanzado que experimentó una remisión completa luego de ser tratado con la
combinación del citoimplante con MLC seguido por seis inmunizaciones con TBH autólogo.
Para entender este fenómeno paradógico se debe analizar lo que ocurre por
otros modos de remoción o reducción tumoral.
Durante las dos a tres semanas siguientes a una cirugía exitosa, en la que todo
el tumor ha sido removido, suele observarse el incremento sérico de los
marcadores tumorales. Éstos disminuyen a la cuarta semana post-cirugía. Se
postula que un gran número de oncocitos es detruido durante la excéresis
tumoral y los marcadores se liberan a la corriente sanguinea. La vida media de
éstos explicaría su persistencia sérica durante tres semanas. Esta destrucción
es un hecho que ocurre sólo durante el acto quirúrgico.
98
La citólisis tumoral generada por el tratamiento inmune es un hecho que se
prolonga en el tiempo, generalmente varias semanas. Por tanto es lógico
deducir que el lavado plasmático de estas sustancias se represente por una
gráfica similar a la de la figura 39.
El Uso de la Tomografía de Emisión de Positrones (PET) asociada (o no) a la
realización simultanea de una TAC (PET-TAC) nos permite evaluar la
respuesta metabólica de los tumores a la acción de la inmunoterapia (Figura
40)
Figure 40: Remisión parcial detectada por PET de metástasis hepaticas de CA de Mama
tratadas con dos ciclos de DC TBH
Figure 41: las Imágenes A, B y C ilustran la apariencia de un leiomiosarcoma retroperitoneal
evaluado por TAC, PET e histológicamente. La imágen C muestra una masa tumoral sólida sin
ninguna presencia de células inmunes. Luego de tres semanas de inmunoterapia la imagen
tomográfica (D) y la obtenida por PET (E) han aumentado ligeramente pero, las dos biopsias
obtenidas de la perífería y del centro (F y G respectivamente) muestran que la mayor parte del
99
tumor está compuesta por un inflitrado linfomonocitario activado presitiendo escasas células
tumorales en la perifería de la imagen histológica.
Sin embargo, como lo ilustra la figura 41, cuando la destrucción tumoral es
mediada por una fuerte infiltración de linfomonocitos activados la interpretación
de los resultados del PET son confusos. En efecto, tal como ocurre en los
tuberculomas, la respuesta inmune celular posee SUV similares a los
producidos por los tumores en actividad.
Por tanto para realizar una mejor evaluación de la respuesta tumoral en los
tratamientos inmunoterápicos hemos adoptado el algoritmo de estudios que se
ilustra en el Figura 42.
Tomografía Axial
Computada
Reducción de
Tamaño Tumoral
No Reducción de
Tamaño Tumoral
Marcadores
Tumorales
Disminución de
Valores
No Disminución de
Valores
Tomografía
Emisión de
Positrones
Disminución de
SUV
No Disminución de
SUV
Biopsia del Tumor
Citología Positiva
Sin Inflamación
Citología Negativa
o Citología Positiva
con Inflamación
Figura 42: Algoritmo para estudiar la respuesta tumoral.
100
Evaluación de la Eficiencia del Tratamiento:
La eficiencia del tratamiento inmunoterápico fue evaluada por la sobrevida libre
de enfermedad y por la sobrevida global de los pacientes.
1. Tiempo de Sobrevida libre de Enfermedad: Este parámetro fue controlado
por medio de exámenes clínicos y estudios serológicos (incluidos marcadores
tumorales) mensuales. De detectarse alguna anormalidad en alguno de esos
controles, se realizó un estudio por imágenes (TAC, RMN, PET, etc) para
investigar recidiva o diseminación metastásica (Progresión de la enfermedad).
El tiempo de sobrevida libre de enfermedad se estudió (para los pacientes con
un mismo tipo de neoplasia y tratamiento) a través del análisis de Kaplan–
Meier y un test “two side log rank” con prueba de Chi cuadrado (cuando hubo
que realizar estudios comparativos).
2. Sobrevida global: Para evaluar la sobrevida global, una enfermera
especialmente asignada registró la sobrevida de cada paciente cada semana
durante los primeros dos años de seguimiento. Este control se realizó
mensualmente durante el segundo año de tratamiento.
Con igual criterio al descripto para la sobrevida libre de enfermedad los valores
recogidos del total de pacientes, agrupados por patología y por terapia fueron
comparados utilizando el análisis de Kaplan-Meier y se compararon las curvas
con el test “two-side log rank”.
101
Aplicación Clínica de Terapias Inmunológicas para el
Cáncer de Mama. Nuestra Experiencia.
Resultados: Preparación de los diferentes productos
celulares
Cultivo de las células tumorales autólogas: La obtención de las células
tumorales del paciente se puede realizar a partir de: pieza quirúrgica, biopsia
por punción percutánea y/o colección de efusiones pleurales, pericárdicas,
ascitis y Líquido Céfalo-Raquídeo (LCR). Se toma una muestra de cada tejido
metastatizado pues se ha comprobado que, probablemente debido a las
diferentes moléculas de adhesión que expresa cada uno, poseen respuesta
inmune independiente. (figura 43)
Figura 43: Producción de la Vacuna TBH
Salvo en el tercer caso, el de las efusiones, el tejido obtenido por los otros dos
medios debe disociarse para obtener una suspensión de células aisladas. En
este caso se utilizan solo medios mecánicos para evitar el alterar con enzimas
los receptores de membrana.
102
Las células son sembradas en botellas de plástico calidad de cultivo de tejidos,
con fondo de calidad óptica y sin ningún tipo de cobertura .
Figura 44: Mamosferas
Figura 45: Células madre de Adenocarcinoma de mama Creciendo como mamosferas (círculos
amarillos) y con forma mesenquimatoide.
El medio que se utiliza es químicamente definido y posee el agregado de
Insulina humana recombinante de uso farmacológico y factor de crecimiento
epitelial humano recombinante libre de patógenos calidad GMP.
103
A través de gradientes, cultivos por dilución y repiques sucesivos es posible
obtener un cultivo puro de epitelio tumoral, probablemente de células madre del
mismo. Este puede crecer con dos patrones diferentes: el de mamosferas
(Figuras 44 y 45) y el de células mesenquimatosas. Ambas son positivas para
citoqueratina, pero las segundas también lo son para vimentina.
Preparación del TBH: La figura 43 ilustra los diferentes procedimientos que se
deben realizar para obtener los linfocitos B activados del paciente. [12, 13,
325-327]
Brevemente: por aféresis de una volemia del paciente se obtienen
aproximadamente entre 5x109 y 1x1010 células mononucleares totales. Luego
de pasar por el gradiente de ficoll-hypaque (CG) se obtiene aproximadamente
un 60% de este número inicial (3x109 y 6x109 células totales).
Estas células se cultivan en DMEM + IL4, IL6, Ranitidina, e Indometacina. Las
dos primeras son para estimular el crecimiento y activación de los linfocitos B,
las dos segundas son para dificultar el crecimiento de los Treg. Al cabo de 3 a
5 días las células son cosechadas y los linfocitos B activados se purifican por
inmuno-selección negativa utilizando para ello un kit comercial. (Ver figura 43).
Se obtienen por este método aproximadamente 3x108 a 6x108 linfocitos B
Activados.
Se realiza una suspensión mixta con una proporción de 4 linfocitos activados
por cada célula tumoral aislada y se los trata con polietilenglicol para obtener
híbridos celulares. Aproximadamente un 10 a un 15% del total de células
incubadas se transforma en un híbrido TBH. Este híbrido puede duplicarse in
vitro si se lo cultiva con IL6, insulina y EGF. Cada dosis de vacuna esta
compuesta por 1x107 a 5x107 células totales.
Preparación del MLC: El procedimiento está ilustrado en la figura 46 [13, 326].
Se selecciona un donante sano no histocompatible con el paciente. Al paciente
y al donante se le practican sendas leucoaféresis. De cada uno se procura
obtener una cantidad aproximada de 5x109 y 1x1010 células mononucleares
totales. Ambas suspensiones celulares son sembradas sobre un gradiente de
de ficoll hypaque (CG). Luego de centrifugado el gradiente se cosecha el anillo
104
de celulas de la interfase ficoll solución salina de la que se rescata en cada
muestra aproximadamente 3x109 a 6x109 células totales.
Figura 46: Producción del MLC
Figura 47: Producción de ll tratamiento combinado MLC + TBH
Se separa la muestra del paciente en dos alícuotas, la primera es igual al 10%
del número total de células obtenidas del donante. Esta alícuota es irradiada
105
con 2500 rads y se co-cultiva en DMEM (con las células del donante), sin
ningún otro tipo de agregados, por 3 días. La alícuota restante, en caso del
paciente recibir un tratamiento combinado MLC + TBH o MLC + DC-TBH (figura
47) , es incubado en un medio como el antes descripto para obtener linfocitos B
Activados.
Al cosecharse el MLC se inyecta dentro del tumor principal o alguna(s) de sus
metástasis. El procedimiento puede hacerse por punción a cielo abierto durante
un acto quirúrgico o por punción guiada por tomografía (o ecografía). En
cualquiera de los casos luego de haber abordado el tumor se extrae una
muestra para que el patólogo, allí presente, corrobore la positividad del sitio.
También se saca una muestra para elaborar un TBH en conjunto con los
linfocitos B previamente obtenidos. Por último se inyecta el MLC dentro del
tumor y se sella el punto de penetración con un punto quirúrgico o Tissucol.
Preparación de la Vacuna DC-TBH: El procedimiento está ilustrado en la
figura 48 [14,15, 328]. Se asume que ya se ha elaborado uno o varios TBH con
el o los tumores del paciente.
Figura 48: Producción de la Vacuna DC-TBH
106
Luego se le suministra al paciente 150 μg de GM-CSF por vía subcutánea,
durante cinco días consecutivos, a las 19 hs.
El día 6 se realiza una leucaferesis utilizando un programa de Buffy coatt. En
este procedimiento se recogen aproximadamente entre 1x1010 3x1010 células
mononucleares totales. Las células se pasan por un gradiente de Ficoll
Hypaque (CG) y luego se seleccionan por inmuno-selección negativa.
Aproximadamente el 5% de las células mononucleares atraviesan la columna
(entre 5x108 y 1.5x109 células mononucleares ,MNC). De estas células solo el
40%, aproximadamente, son DC, según se determina por citometría de flujo
(figura 49)
Figura 49: Determinación por citometría de flujo de DC. Concentración pos selección negativa.
Luego se co-incuban las células TBH en proporción 1:1 con las MNC
enriquecidas en dendríticas. Este cultivo se realiza durante 3 días en DMEM
enriquecido con TNFα hr y GM-CSF hr. Al cuarto día se cosechan las células y
se inyectan en un ganglio sano.
107
Cada uno de los pasos descriptos fue cuidadosamente estudiado. En la figura
50 se observan los resultados logrados cuando 5 pacientes fueron tratados por
cinco días con G-CSF y otros 5 con GM-CSF. Con el G-CSF se eleva el
número total de glóbulos blancos, a expensas de los granulocitos, de 5000 a
40000 células por microlitro y las DC se incrementan 2 a 3 veces el valor basal.
Por el contrario el GMCSF eleva 35 veces el valor basal de DC, mientras que
el total de Glóbulos Blancos apenas supera los 10000 por microlitro.
Figura 50: Producción de la Vacuna DC-TBH
Para averiguar cuanto tiempo se debía administrar GM-CSF se probaron dar al
paciente dos, cuatro, cinco y seis días consecutivos la citoquina. Según ilustra
la figura 51 el número máximo se logró al día quinto. El sexto día,
probablemente por sobre activación leucocitaria, la muestra de MNC mostraba
una gran adhesividad célula a célula por lo que se dificultaban todos los
procedimientos de selección negativa.
Finalmente, la figura 52 ilustra como la mezcla de TNFa + GM-CSF es más
efectiva para obtener mayor rendimiento y actividad de la vacuna DC-TBH que
el uso de GM-CSF + IL4 como han propuesto otros autores.
108
Figura 51: Tiempo óptimo de administración de GMCSF para la movilización de las DC.
Figura 52: Mezcla más apropiada de citoquinas para lograr una mayor producción de DC-TBH
109
Preparación de los linfocitos efectores autólogos anti tumor CD3+CD25-:
El procedimiento está ilustrado en la figura 53 [317]. Se asume que ya se han
elaborado uno o varios TBH con el, o los, tumores del paciente, y que éste ha
sido inmunizado, ya sea con vacuna TBH o DC-TBH, habiendo recibido al
menos dos inmunizaciones consecutivas con un itervalo de tres semanas entre
cada inmunización.
Figura 53: Producción de la Vacuna DC-TBH
Al paciente se le realiza una leucoaféresis de la cual se obtiene un producto
con 1x1010 a 2x1010 MNC. Luego de purificado y concentrado, el buffy coat es
incubado por 4 días en presencia de TBH. Al cabo de ese tiempo se aislan por
inmuno selección magnética las células CD3+ CD25-. Estas suelen ser un 10%
del total de las MNC en cultivo. Se concentran y administran por infusión
endovenosa lenta en el lapso de 8 horas, o se inyectan dentro de alguna masa
tumoral remanente. El lugar de inyección intratumoral es estudiado por un
patólogo. De mostrar la biopsia abundante infiltración de linfocitos activados, se
debe evitar la inyección local y se debe administrarla por via sistémica.
110
Preparación de la vacuna TregV: El procedimiento está ilustrado en la figura
53 [318]. Es similar al descripto para la obtención de los linfocitos CD3+CD25-.
La principal diferencia en que se realiza una primera separación de CD4+.
Luego se realiza una segunda separación, esta vez positiva con anti-CD25. Los
linfocitos retenidos en la segunda columna son cultivados por 3 días en DMEM
con IL2 y luego son cosechados, irradiados con 2500 Rads e infundidos por vía
endovenosa a la dosis de 1x108 células por vez.
111
Resultados: Seguridad de las Terapias Inmunes Utilizadas
Estudio de seguridad de la inmunización con TBH: 21 pacientes fueron
tratados entre los años 1992 y 1994, poseían tumores avanzados de distinto
origen, que ya no respondían a ninguna terapia. Cada uno recibió, como terapia
de uso compasivo, entre 3 y 10 inmunizaciones con aproximadamente 5x107
células TBH. En esa ocasión los eventos adversos observados fueron evaluados
según la escala establecida por la OMS para modificadores de la respuesta
biológica, y volcados en la historia clínica de cada uno. Al publicar estos
resultados en 1995, se extrajeron estos datos y se resumieron en la Tabla 3
Iniciales
NG
HC
LG
NB
CB
LR
NV
LP
AB
NT
JV
JN
RC
SL
CC
JP
SH
SC
FA
PM
GA
Reacción
Cutánea
Toxicidad
Renal
Toxicidad
Neurol.
Sepsis
Toxicidad
CV&R
Toxicidad
G.I.
Toxicidad
Hematol.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Tabla 3: Eventos Adversos observados por la inmunización con TBH.
Referencias: - No o sin cambios; + Leve; ++ Moderada; +++ Severa.
Defect.
Cuagul.
-
A tres pacientes no se les completó el plan de inmunización debido a la rápida
evolución que mostró la enfermedad durante los dos primeros meses de
tratamiento. Los efectos colaterales se limitaron a cuadros pseudo-gripales con
cansancio y febrícula (Grado 2), raramente alcanzaron a tener fiebre de hasta
38.5º C.Los efectos descriptos generalmente cesaron dentro de las primeras
ocho semanas de iniciado el tratamiento. No se registraron casos de
neutropenia, anemia o trombocitopenia. No se alteró el estilo normal de vida de
112
los pacientes, excepto por el dolor ocasional de alguna reacción local en el sitio
de inyección, que generó un absceso aséptico que fue tratado con frío,
antinflamatorios y, ocasionalmente, drenaje. La resolución de estos abscesos
se prolongó en ocasiones por dos o tres meses. Cada reacción fue biopsiada y
nunca se encontró presencia de células tumorales. Esta reacción local parece
estar relacionada con una mejor respuesta terapéutica. Algunos pocos
pacientes presentaron cuadros de hipotensión grado 2 (TA sistólica no inferior
a los 70 mmHg) que cedió con reposo, reposición de fluidos y sin tratamiento
farmacológico. En un sólo caso obligó a la hospitalización por 48 horas.
A posteriori, al suprimirse el uso de LPS para activar a los linfocitos B, ya no se
observó la aparición de abscesos locales, sí, en cambio inflamación local
transitoria, sobre todo entre la segunda y cuarta inmunización.
El tratamiento ha sido aplicado a aproximadamente 375 pacientes. Sobre este
total de pacientes se observó febrícula entre 37 y 38 ºC (Grado 2) en menos
del 20% de los pacientes; sí se observó, en aproximadamente el 50% de ellos
un síndrome pseudo gripal de resolución espontánea luego de la segunda y
tercera inmunización. En 5 pacientes portadores de distintas condiciones
autoinmunes se constató agravamiento transitorio de estas pre-existencias, que
resolvieron al espaciar el lapso entre inmunizaciones. En un paciente diabético,
afectado por un osteosarcoma con metástasis ganglionares y pulmonares, se
observó descontrol de sus valores de glucemia (Grado 3) y anemia (Grado 2)
por hemocateresis esplénica. El paciente luego de suspender su régimen de
inmunización experimentó una remisión total de su osteosarcoma sin recibir
ninguna otra medicación.
Estudio de seguridad de la inmunización con MLC y MLC-TBH: La seguridad
de la inmunización observada por la administración de un solo MLC fue reportado
por Chang y colaboradores Tablas 4 y 5 copiadas del trabajo original. [312]. El
autor inyectó dentro del tumor primitivo, por punción trans gástrica, a 8 pacientes
con adenocarcinoma de páncreas no resecable, 4 estaban en estadio 2, 3
estaban en estadio 3 y sólo uno en estadio 4. De una rápida evaluación de la
tabla de eventos adversos puede inferirse que el tratamiento no generó eventos
adversos sistémicos pero sí locales, por inflamación del tumor. Todos ellos fueron
resueltos cuando se redujo la masa tumoral.
113
Tabla 4: Eventos adversos y dosis de MLC recibidas por los pacientes. Tabla copiada del trabajo
de Chang y col. [312].
Tabla 5: Eventos adversos serios y forma de resolución sufridos por cada paciente. Tabla copiada
del trabajo de Chang y col. [312].
Nuestra experiencia con idéntico tratamiento aplicado sólo, o asociado a la
inmunización con TBH a pacientes con tumores de páncreas, post-resección de
GBM, con tumores de mama avanzados y con otros tumores avanzados fue
similar [13, 324-327]. Más allá de la hiperpirexia grado 2, observada en menos del
10 % de los pacientes tratados, los síntomas se circunscribieron a los producidos
por la inflamación local. Esta inflamación local fue peligrosa cuando se la utilizó
en pacientes con GBM pues generó encefalitis grados 2 y 3, que debió ser
tratada con esteroides. Esto llevó a no utilizar el MLC para pacientes con GBM.
Por el contrario en la mama ocasionó una mastitis grado 2 que no requirió otro
tratamiento más allá del sintomático.
Dos paciente con adenocarcinoma de mama avanzado, con metástasis óseas
como único lugar de radicación de la enfermedad, que al momento de ser
tratadas presentaban pancitopenia grado 2, incrementaron transitoriamente sus
114
síntomas luego del tratamiento con el citoimplante, pero ambas experimentaron
una PR y CR respectivamente. Ninguna requirió tratamiento específico y los
síntomas revirtieron dentro de las dos semanas siguientes.
Un paciente con adenocarcinoma de páncreas con metástasis hepáticas y
cirugía con irradiación previa de la zona, dentro de las 6 horas posteriores al
citoimplante en la lesión presentó un sangrado gastrointestinal severo (Grado
3) que revirtió luego de la administración de Plasma, Plaquetas, la transfusión
de dos unidades de sangre e inhibidores de la bomba de protones.
Síndrome de Distress respiratorio grado 3 fue observado en 2 pacientes
tratados MLC + TBH. Ambos pacientes tuvieron previamente una infiltración
intersticial metastásica de pulmón y necesitaron ser admitidos en la Unidad de
Cuidados Intensivos (ICU) donde se recuperaron.
La administración de dos MLC a un mismo paciente fue realizada a 6 pacientes
con adenocarcinoma de páncreas estadio IV. Todos realizaron una importante
reacción inflamatoria sistémica luego de la segunda inmunización (4 grado 2 y 2
grado 3). Esto se atribuyó al cambio del estroma tumoral que, de anti inflamatorio
previo al primer citoimplante, adquirió características pro-inflamatorias a
posteriori. Los 2 pacientes con SIRS grado 3 requirieron internación y, si bien se
duplicó su expectativa de vida, la gravedad de los eventos adversos observados
llevó a contraindicar la repetición del MLC en esa y cualquiera otra indicación.
Estudio de seguridad de la inmunización con DC-TBH
Veinte
pacientes
tratados en base compasiva, afectados por diversas neoplasias terminales,
para los cuales no había ninguna terapéutica estándar disponible, fueron
tratados con autovacunas tumorales compuestas por células dendríticas
autólogas desafiadas In-Vitro con TBH autólogo (DC-TBH).
Los 20 pacientes recibieron un total de 51 vacunas y los eventos colaterales
observados se resumen en la Tabla 6.
Los eventos adversos que pudiesen ocurrir fueron evaluados a través de 127
determinaciones clínicas y de laboratorio (Anexo 3): el día de la inmunización, a
las 24 y 96 horas después de la inmunización. [“Common terminology criteria
for adverse events, v3.0” (CTCAE) (http://ctep.cancer.gov/forms/CTCAEv3.pdf)
115
desarrollados por el Instituto Nacional del Cáncer de (NCI) USA para evaluar
las terapias biológicas].
Total
Local
Injection Site
Reaction
Induration
Ulceration
Limb
Oedema
Gait-Walking
Alteration
Systemic
Pain
Geni-Urinary
Obstruct.
Anorexia
Fever
Chills
Flu Like
Syndrome
Nauseas
Vomiting
Dehidrat.
Liver Dysf.
Dyspepsia
Constipation
Blood
WBC
Platelets
Haemoglob
Granulcytes
Lymphocyte
Clotting
Fibrinogen
RIN
KPTT
Liver
Function
Bilirubin
ASOT
ASPT
ALP
GGT
LDH
Renal
Function
Creatinine
Proteinurie
Metabolism
Glucose
Amylase
Calcium
Magnesium
Albumin
Grade 1
Grade 2
Grade 3
AP/TP
(1)
PE/TE
(2)
AP/TP
(1)
PE/TE
(2)
AP/TP
(1)
PE/TE
(2)
AP/TP
(1)
PE/TE
(2)
10/20
19/51
5/20
9/51
4/20
9/51
1/20
1/51
13/20
1/20
25/51
1/51
12/20
24/51
1/20
1/20
1/51
1/51
3/20
5/51
2/20
3/51
1/20
2/51
3/20
3/51
2/20
2/51
1/20
1/51
12/20
15/51
4/20
6/51
1/20
1/51
5/20
3/20
2/20
8/51
5/51
4/51
4/20
3/20
1/20
6/51
5/51
2/51
1/20
2/51
1/20
2/51
1/20
2/51
1/20
1/51
1/20
1/51
5/20
4/20
3/20
1/20
1/20
4/20
8/51
6/51
4/51
1/51
1/51
4/51
3/20
2/20
1/20
4/51
2/51
1/51
1/20
1/20
1/20
1/20
1/20
1/20
4/20
14/20
1/20
15/20
1/51
6/51
16/51
1/51
20/51
1/20
3/20
6/20
1/20
3/20
1/51
4/51
8/51
1/51
7/51
2/20
12/20
4/20
2/51
14/51
5/51
2/20
12/20
3/20
6/20
8/20
5/20
9/20
6/20
10/20
6/51
12/51
7/51
12/51
8/51
12/51
3/20
2/20
8/20
6/20
11/20
9/20
9/20
7/20
8/51
1/20
1/51
2/51
2/51
2/51
1/51
1/51
1/20
1/20
1/20
2/51
2/51
1/51
5/20
4/51
3/20
4/51
7/20
7/51
5/20
6/5
2/51
14/51
4/51
1/20
1/51
2/20
7/20
4/20
5/20
4/20
8/20
2/51
10/51
6/51
7/51
5/51
10/51
3/20
1/20
1/20
2/20
1/20
1/20
3/51
2/51
1/51
3/51
1/51
1/51
1/20
1/51
2/20
1/20
1/20
2/51
2/51
1/51
3/51
2/51
3/20
2/20
3/51
2/51
10/51
6/51
15/51
11/51
9/51
6/20
4/20
10/20
8/20
7/20
7/51
4/51
14/51
10/51
8/51
1/20
2/51
1/20
1/20
1/20
1/20
1/20
1/51
1/51
1/51
1/51
1/51
1/20
1/51
Grade 4
AP/TP
(1)
PE/TE
(2)
1/20
1/51
5/20
4/20
3/20
1/20
1/20
4/20
8/51
6/51
4/51
1/51
1/51
4/51
1/20
1/51
116
Tabla 6: Eventos adversos por DC-TBH. (1) AP/TP: número de pacientes afectados/total de
pacientes tratados. (2) PE/TE: Número de eventos positivos/total de eventos factibles.
El Índice ECOG inicial y la dosis de células administradas fueron tomados en
cuenta como factores que pudiesen influir en los eventos adversos que
pudieran ocurrir luego de cada inmunización.
La totalidad de estos Eventos adversos observados parecen estar vinculados a
la reacción inflamatoria local en las diferentes masas neoplásicas.
Para evaluar si la cantidad de células utilizadas en cada inmunización y/o el
estatus clínico del paciente previo a cada inmunización tuvo influencia en los
Eventos Adversos observados se procedió a la suma de los escores parciales
de cada ítem evaluado. Así se estableció un Índice de Toxicidad propio de cada
inmunización.
No se observó que la toxicidad de alguna inmunización estuviese asociada con
el número de DC administradas por inmunización (Figura 54).
70
60
Toxicity
50
40
30
20
10
0
1000000
100000000
100000000
Doses
Sample size
= 51
Correlation coefficient r
= -0,1562 P=0,2737
95% Confidence interval for r = -0,4140 to 0,1248
Figura 54: Relación de las diferentes dosis de células (expresadas como logaritmo de las
mismas) aplicadas en cada inmunización y el Índice de Eventos Adversos de cada
inmunización.
117
Por el contrario, el estado clínico inicial del paciente (medido por el índice
ECOG) sí tuvo relación directa con los eventos adversos observados. La
evaluación estadística realizada muestra una correlación altamente significativa
entre el ECOG previo a cada inmunización y el Índice de Eventos Adversos
obtenido a posteriori de cada evento (Figura 55).
70
60
Toxicity
50
40
30
20
10
0
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
ECOG
Sample size
= 51
Spearman's coefficient
of rank correlation (rho)
= 0.609
P<0.0001
95% Confidence Interval for rho = 0.401 to 0.758
Figura 55: Relación de los diferentes ECOG previos a cada inmunización y el Índice de Eventos
Adversos de cada inmunización.
En general los pacientes que presentaron nauseas y vómitos grado 3 y 4, y en
un caso asociado a incremento transitorio de la amilasa grado 4, poseían
neoplasias que comprometían su tubo digestivo. En todas estas ocasiones se
los hospitalizó por 48 horas en sala común. Fueron tratados con reposición de
fluidos y metoclopramida y una única dosis de 4 mg de dexametasona. Los
pacientes se recuperaron a las 24 horas de instaurado el tratamiento. En
ningún caso se suspendió el tratamiento por estas complicaciones y estas
fueron desapareciendo en las sucesivas inmunizaciones.
Las alteraciones hematológicas fueron, en general, menores. Sólo los
pacientes con compromiso neoplásico de su médula ósea presentaron
inhibición transitoria de la producción de glóbulos rojos, confirmada por la
disminución de su hemoglobina grado 3, ausencia de reacción de Coombs y
118
disminución de los reticulocitos. Esta situación requirió transfusión de glóbulos
rojos y fue superada sin otra medicación en el lapso de una semana.
Una paciente con compromiso hepático previo presentó, en la segunda de las
tres inmunizaciones que recibió, una movilización de enzimas hepáticas grado
3. Esto obligó a su observación en medio hospitalario, el tratamiento con
esteroides y antitérmicos, así como cobertura antibiótica, a pesar de no
detectarse foco séptico,
clínica ni bacteriológica. La rápida resolución del
cuadro nos permitió continuar con el tratamiento y no volvió a presentarse el
mismo grado de complicaciones.
En todos los casos, solo pacientes con un ECOG igual o superior a 3 fueron
aquellos que presentaron eventos adversos de grado 3 y 4.
Un paciente, ECOG 3, afectado por una neoplasia avanzada de páncreas
(estadio IV), presentó alteraciones grado 3 y 4 en su glucemia, niveles de
amilasa, hipoalbuminemia, incremento de la GGT, FAL y bilirrubina, así como
vómitos y deshidratación secundaria. Estos síntomas llevaron a la derivación
del paciente a la Unidad de Terapia Intensiva. El tratamiento con esteroides
rápidamente controló el cuadro en 48 horas pero se le suspendió el
tratamiento.
Un segundo paciente, ECOG 3, que padecía un Leiomiosarcoma estadio IV
desde hacía siete años, que había sido sometido a varias cirugías abdominales
previas, colostomizado y con pelvis congelada presentó, luego de las dos
primeras inmunizaciones, edema de miembros inferiores, trastornos en la
marcha y obstrucción urinaria grado 3, acompañados de dolor radicular grado 4
de la cintura pelviana y miembros inferiores que cedieron en el lapso de 12
horas luego de su internación en sala común, colocación de una sonda vesical
y administración de calmantes no opiáceos por vía endovenosa. Por
considerarse que estos efectos eran secundarios a la respuesta inflamatoria del
tumor a posteriori del tratamiento, y que estos eventos habían tenido una
rápida y completa superación, no se le suspendió el tratamiento pero fue
internado durante cada una de las siguientes inmunizaciones para su mejor
control.
Las
siguientes
Inmunizaciones
presentaron
menor
grado
de
complicaciones y requirieron un régimen analgésico menor, esto fue
119
coincidente con una buena evolución clínica del paciente que permitió la
exéresis quirúrgica de gran parte de las lesiones.
Estudio de seguridad de la inmunización CD3+CD25-: en 7/8 pacientes
tratados con TBH + CD3+CD25-. Se presentó fiebre grado 2 post implante de
los linfocitos. La fiebre fue controlada con 400 mg. de Ibuprofeno cada 8 hs.
durante los primeros dos días
El dolor grado 2 en el lugar del citoimplante fue observado en 2/8 pacientes
tratados con CD3+ CD25- + TBH.
Un paciente tratado con TBH + CD3+ CD25- comenzó su tratamiento porque
luego de tres años de la cirugía, quimio, radio y hormonoterapia, el 60% de su
hígado fue ocupado por metástasis del cáncer de mama. Luego del
citoimplante ella sufrió una reacción SIRS. Fue admitida en la ICU y
permaneció allí por 12 días, finalmente superó su complicación y regresó a la
vida normal sin ninguna secuela. El control mostró más de un 90% de
reducción de la masa tumoral. La paciente decidió suspender el tratamiento y
no mostró ninguna progresión durante los siguientes 20 meses, luego tuvo una
recaída y falleció dos meses después de diagnosticada.
Estudio de seguridad de la inmunización TregV: Ninguno de los 4 pacientes
tratados, (2 con carcinoma de mama avanzado) ha presentado algún evento
adverso por la inmunización con esta vacuna.
120
Resultados: Eficacia de las terapias Inmunes
Respuesta Inmune
Las respuestas inmunes de los pacientes tratados fueron evaluadas por LPI
(índice de proliferación linfocitario) y grado de infiltración tumoral (Figura 56).
Figura 56: Inmunomarcación positiva para CD8 en la biopsia de una metástasis pulmonar de
cáncer de mama. Previo a la inmunización de la paciente con dos dosis de DC-TBH, la
metástasis pulmonar no permitía el ingreso de MNC en su masa.
La inmunización con MLC provocó un rápido desarrollo de inmunidad
antitumoral detectada por LPI (figura 57) que desapareció entre las tres y las
seis semanas de realizado el citoimplante.
Figura 57: Respuesta inmune de la paciente con respuesta parcial para el cáncer de mama
durante la inmunización por citoimplante intratumoral de MLC.
121
La Inmunización con TBH provocó en los pacientes respondedores una
elevación del LPI luego de la segunda inmunización. (Figura 58)
Figura 58:Respuesta inmune de la paciente con respuesta completa para el cáncer de mama
durante la inmunización con 6 vacunas TBH.
La administración conjunta de ambos tratamientos MLC + TBH produjo un
efecto sinérgico aditivo en los pacientes respondedores. (Figura 59)
Figura 59:Respuesta inmune de la paciente con respuesta completa para el cáncer de mama
durante la inmunización con un citoimplante de MLC seguido de seis vacunas TBH.
122
Similares resultados a los obtenidos en este último grupo pudieron observarse
en los pacientes con DC-TBH, claro está, que sin los eventos adversos locales
reportados por el uso de MLC. Más aún, sucesivas dosis de DC incrementaban
el LPI e incrementaban el grado de respuesta tumoral observada en un primer
momento. (Figura 60)
Figura 60: Respuesta inmune de la paciente con respuesta completa para el cáncer de mama
durante la inmunización con 3 vacunas DC-TBH.
Basados en la muy buena evolución clínica de algunos pacientes con muy poca
reducción imagenológica de la masa tumoral, y conforme lo describiéramos en
material y métodos al discutir las formas de evaluar la respuesta tumoral a
posteriori del tratamiento inmunoterápico, comenzamos sistemáticamente a
evaluar con una segunda biopsia el grado de infiltración leucocitaria en esas
masas.
Los pacientes con una buena respuesta clínica e índice LPI (Superior a 15)
tenían un infiltrado de MNC que penetraba la masa tumoral. Por el contrario,
aquellos con LPI menor poseían muy poca respuesta inflamatoria.
Se decidió que, a 5 de los pacientes afectados de adenocarcinoma de mama
avanzado, tratados con tres inmunizaciones de DC-TBH, y que a pesar de ello
poseían bajo LPI, tratarlos con un implante de CD3+ CD25- [317]. Uno de los
pacientes poseía un índice superior a 3, sus imágenes hepáticas no habían
variado en forma ni aspecto y se rehusó a ser biopsiado pero quiso ser tratado.
123
Este paciente, descripto en la sección anterior, luego del citoimplante dentro de
una de las lesiones, presentó un SIRS que obligó a su internación en UTI.
Durante ese tiempo, según se comprobó por TAC y ecografía realizada
inmediatamente a posteriori de su salida de UTI, destruyó el 90% de sus
lesiones por necrosis central. A pesar de los buenos resultados obtenidos, para
evitar este tipo de eventos adversos, se decidió adoptar el algoritmo de
evaluación y decisión de conducta terapéutica que se describe en la figura 61.
TBH Preparation
DC-TBH Immunization x 2
LPI lower than 5
LPI between 5 to 15
LPI higher than 15
FNA
TIL CD3+ CD25-
CD3+ CD25-
DC-TBH x 6
DC-TBH x 6
TIL +
DC-TBH x 6
DC-TBH x 6
Figura 61: Algoritmo de evaluación y decisión de conducta terapéutica
La respuesta Inmune anti tumoral alcanzada por los pacientes que recibieron el
citoimplante de CD3+CD25- y respondieron con remisión parcial de su neoplasia,
incrementó a más de 20 su LPI. Estos valores fueron mantenidos en estos
pacientes por un lapso de 6 a 8 meses.
Como alternativa al citoimplante de CD3+CD25-, que se reservó solo para los
pacientes con bajo LPI y que en su biopsia se demostro que los linfocitos no
habían penetrado dentro de la masa tumoral, se los trató con Alfa 1 timosina
(Zadaxin®) [318]. Este producto elevó el LPI de los pacientes a un valor estable de
20. La respuesta inmune se mantuvo durante los seis meses de su tratamiento y
decayó en cuatro meses a posteriori de su suspención.
Finalmente dos pacientes con adenocarcinoma de mama, que luego de recibir tres
inmunizaciones con DC-TBH habían experimentado respuesta completa en un
caso, y en el otro caso parcial, y que al recaer mostraron incremento de sus Treg
periféricos, se las trato con la TregV [319]. Ambos pacientes incrementaron su LPI
y han experimentado reducción de su masa tumoral.
124
Respuesta Tumoral
La tabla 6 resume el total de los pacientes con adenocarcinoma de mama
metastático tratados, los tratamientos que han recibido y la respuesta tumoral y
tiempo de sobrevida en meses que tuvieron. Nótese que el signo + indica que
al momento de la última evaluación el paciente estaba vivo.
Código del Paciente
Tratamientos
57
58
1
27
28
29
26
35
36
37
38
39
40
41
51
52
53
54
55
56
42
43
44
45
46
47
48
49
50
31
30
33
34
32
7
8
9
10
17
18
TIL
TIL
ALT
MLC
MLC
MLC
MLC
TBH
TBH
TBH
TBH
TBH
TBH
TBH
TBH
TBH
TBH
TBH
TBH
TBH
TBH
TBH
TBH
TBH
TBH
TBH
TBH
TBH
TBH
MLC/TBH
MLC/TBH
MLC/TBH
MLC/TBH
MLC/TBH
DC
DC
DC
DC
DC
DC
Respuesta Sobrevida
CR
36
CR
108
PR
9
PR
9
PR
36
SD
7
PD
1
CR
24
CR
120+
CR
96+
CR
60+
CR
36+
CR
108+
CR
64+
PR
30
PR
8
PR
6
PR
48+
PR
12
PR
74
MR
12
MR
5
MR
7
MR
7
MR
6
MR
9
PD
2
PD
3
PD
3
CR
89+
PR
28
PR
36+
PR
74
MR
7
CR
24
CR
38+
CR
96+
CR
108+
PR
12
PR
12
125
19
20
21
22
23
25
11
12
13
24
14
15
16
3
4
5
6
2
59
60
DC
DC
DC
DC
DC
DC
DC
DC
DC
DC
DC
DC
DC
DC + CD3+ CD25DC + CD3+ CD25DC + CD3+ CD25DC + CD3+ CD25DC + CD3+ CD25DC-Treg V
DC-Treg V
PR
PR
PR
PR
PR
PR
MR
MR
MR
SD
PD
PD
PD
PR
PR
PR
PR
PD
PR
PR
36
10
16
9
22+
9
8
11
12
1
3
1
3
14
22
33
12
4
6+
6+
Tabla 6: Total de los pacientes con neoplasia avanzada de mama tratados
La tabla 7 resume las respuestas tumorales que se observaron respecto de la
aplicación de los diferentes tratamientos que se utilizaron.
Treatment
n
TIL
ALT
MLC
6 TBH
MLC+6TBH
DC
DC+CD3+CD25DC+TregV
2
1
4
22
5
19
5
2
Tumor Response
CR
2
7
2
4
PR
1
2
6
3
8
4
2
MR
SD
PD
1
1
3
1
3
1
6
3
Tabla 7: Resumen de las respuestas tumorales observadas por esquema terapéutico aplicado.
Las respuestas tumorales fueron evaluadas conforme a los criterios
establecidos en material y métodos. Sin desmedro de ello, varios pacientes que
fueron tratados con las distintas inmunoterapias mostraron remisiones
fácilmente evaluables por los criterios tradicionales (Figuras 62 a 70).
126
Figura 62: Paciente tratada con vacunas TBH. La imagen de la izquierda corresponde a la
evaluación pre tratamiento y la de la derecha ala evaluación post tratamiento.
Figura 63: Paciente tratada con vacunas TBH. La imagen de la izquierda corresponde a la
evaluación pre tratamiento y la de la derecha a la evaluación post tratamiento.
Se deben destacar tres puntos: 1.- La respuesta inmune efectora generada por
algunos tratamientos fue capaz de, sin mayor desarrollo de eventos adversos,
reducir grandes masas tumorales (ver en particular figuras 40 y 67). 2.- Los
linfocitos efectores generados por la inmunoterapia aplicada fueron capaces de
atravesar la barrera hematoencefálica y reducir las metástasis allí localizadas
(figuras 63 y 64). 3.- Salvo algunas excepciones, la respuesta tumoral
producida por la vacuna originada en la biopsia de un tejido en particular fue
capaz de originar una respuesta inmune efectora eficaz contra las metástasis
correspondientes, pero no contra las metástasis localizadas en otros tejidos. La
inmunización con un segundo esquema de vacunas generadas por las biopsias
del segundo tejido generalmente también fue efectiva contra las metástasis del
tejido correspondiente.
127
Figura 64: Paciente tratada con vacunas TBH. La imagen de la izquierda corresponde a la
evaluación pre tratamiento y la de la derecha a la evaluación post tratamiento.
Figura 65: Paciente tratada con el esquema MLC + TBH. La imagen de la izquierda
corresponde a la evaluación pre tratamiento y la de la derecha a la evaluación post tratamiento.
Figura 66: Paciente tratada con el esquema MLC + TBH. La imagen de la izquierda
corresponde a la evaluación pre tratamiento y la de la derecha a la evaluación post tratamiento.
128
Figura 67: Paciente tratada con vacunas DC-TBH. La imagen de la izquierda corresponde a la
evaluación pre tratamiento y la de la derecha a la evaluación post tratamiento.
Figura 68: Paciente tratada con el esquema DC-TBH + CD3+ CD25-. La imagen de la izquierda
corresponde a la evaluación pre tratamiento y la de la derecha a la evaluación post tratamiento.
Cabe destacar que se ha observado sinergia de acción entre el tratamiento con
quimioterapia a bajas dosis (pues disminuye los T reguladores) realizada en
paralelo con el tratamiento inmunoterápico y este último. (Ver figuras 69 y 70).
Asumimos que un efecto similar de sinergia debiera observarse por la
administración conjunta de hormonoterapia y los inhibidores de los receptores
al EGF y el VEGF. Lo observado en algunos pacientes actualmente en
tratamiento parece confirmar esta suposición.
Para evaluar estadísticamente estos resultados hemos recurrido al análisis
propuesto por Richard Simons, del “Biometric Research Branch of National
Cancer Institute” de USA [330]. Simons propone una metodología para
determinar si el tratamiento con vacunas tumorales posee una eficacia
129
suficiente como para que justifique el realizar una fase 2/3 de evaluación a
través de un ensayo clínico.
Figura 69: Comportamiento de los Marcadores tumorales de una paciente tratada con vacunas
DC-TBH precedida del uso de quimioterapia a bajas dosis, que experimentó una remisión
completa de su tumor.
El método se designa Simon’s “optimal two-stage”. Su diseño es el más
utilizado para la evaluación de resultados obtenidos en el análisis de datos
recogidos conjuntamente para establecer toxicidad y eficacia de un tratamiento
inmunoterápico. La evaluación estadística asume que no más del 5% de los
pacientes podría tener una remisión espontánea no debida al tratamiento con
una probabilidad p0 =0.05 se puede realizar una terminación temprana del
protocolo si respecto de los controles históricos no se da determinado número
de casos satisfactorios. Los datos se resumen en la Tabla 8 y se explican en la
bibliografía mencionada [330]. El método asume que, por azar, se puede
descartar un tratamiento con un error de falso positivo del 5% y falso negativo
del 10%.
Si por el número de casos que cumplen con la respuesta esperada en ambas
fases supera las expectativas calculadas se concluye que el tratamiento es
activo.
130
Tanto el número de pacientes inmunizados con TBH como el de los pacientes
inmunizados con DC TBH es el suficiente para poder ser evaluado por este
método estadístico.
Number of
Probability of
Responses
Early
Required For
Termination
Activity (A)
20%
12
37
4
.54
25%
9
24
3
.63
30%
7
21
3
.70
35%
6
12
2
.74
Tabla 8: Optimal Two-Stage Designs Simon, R. Optimal two-stage designs
for phase II clinical trials. Controlled Clinical Trials 1989; 10:1-10.
Target
Response
Rate (p1)
First Stage
Sample Size
(N1)
Maximum
Sample Size
(N)
Figura 70: Estudio PET que corresponde a la paciente tratada con vacunas DC-TBH precedida
del uso de quimioterapia a bajas dosis ilustrada en la figura 69. La imagen de la derecha
corresponde a la evaluación pre tratamiento y la de la izquierda la evaluación post tratamiento.
En nuestro caso, sobre 22 pacientes tratados con TBH, 13 fueron respondedores
(7 CR y 6 PR) y sobre 19 pacientes tratados con DC-TBH 12 fueron
respondedores (4 CR y 8 PR) razón por la cual se asume que ambos
tratamientos son terapéuticamente activos.
131
Resultados: Eficiencia de las terapias Inmunes Utilizadas
Sobrevida
Los datos de la Tabla 6 permiten realizar un par de estudios sobre la sobrevida
de los pacientes relacionados con el tipo de tratamiento administrado (Figura
71) y respecto de la Respuesta tumoral que tuvieron a posteriori del tratamiento
(figura 72).
Sobrevida según diferentes tratamientos
100
80
Survival probability (%)
•
Tratamiento
DC
DC + CD3+ CD25MLC
MLC/TBH
TBH
TIL
60
40
20
0
0
20
40
60
80
100
120
Time in months
Factor
DC
MLC
MLC/TBH
TBH
TIL
19
DC + CD3+
CD255
Sample
size:
Median
surv.:
4
5
22
2
12
14
8
74
12
72
4.0
2.1
3.0
5.4
15.0
17.1
2.0
2.9
Comparison of survival curves
Logrank test
Endpoint
Observed n
15.0
5.0
Expected n
13.0
3.5
Chi-square
= 4.3487
DF
= 5
Significance
P = 0.5004
Figura 71: Análisis de Kaplan Meier de la Sobrevida Global según los diferentes tratamientos
aplicados
El análisis de Kaplan Meier determina que el número de pacientes tratados con
cada tratamiento es insuficiente para establecer algún tipo de diferencia entre
132
los distintos grupos. Mucho menos lo es para establecer la eficiencia de alguno
de estos tratamientos.
Por el contrario el mismo estudio estadístico demuestra que la respuesta
tumoral posee una correlación directa con la sobrevida del paciente. Este
elemento difiere del observado en los ensayos clínicos con quimio y
radioterapia para tumores avanzados.
Sobrevida respecto de la respuesta tumoral experimentada post tratamiento
100
Survival probability (%)
80
Respuesta
CR
MR
PD
PR
SD
60
40
20
0
0
20
40
60
80
100
120
Time in months
Factor
Sample
size:
Median
surv.:
CR
14
MR
10
PD
8
PR
23
SD
2
-
7.5
3
16
4
8.0
0.9
20.0
19.4
2.0
0.4
Comparison of survival curves
Logrank test
Endpoint
Observed n
4.0
10.0
Expected n
19.1
4.2
Chi-square
= 81.0500
DF
= 4
Significance
P < 0.0001
Figura 72: Análisis Kaplan Meier de la Sobrevida Global según las diferentes Respuestas
tumorales experimentadas post tratamiento. Referencias: CR, Respuesta Completa; PR,
Respuesta Parcial; MR, Respuesta Menor; SD,Enfermedad Estable; PD, Enfermedad
progresiva.
Por último, se ha observado en una pequeña muestra de pacientes no
respondedores que tal vez sería factible cambiar el estatus de respuesta
tumoral y la sobrevida de un paciente, si este es tratado con un estimulante de
la inmunidad Th1 utilizada en el tratamiento de las hepatitis B y C Crónicas.
133
Figura 73: Análisis de Kaplan Meier de la Sobrevida Global según la respuesta tumoral y el
tratamiento o no con Timosina a 1 de los pacientes no respondedores. [318]
134
Postulación de principios para el uso racional e integrado
de la Inmunoterapia a las otras formas terapéuticas
Según nos refiriéramos en la Introducción, los estudios de biología celular y
molecular nos permiten comprender mejor qué es el Cáncer. Éste no se reduce
a ser un tejido genéticamente alterado a consecuencia de lo cual crece en
forma anárquica y desordenada, sino el resultado de un desequilibrio de la
expresión genética de un genoma alterado. La alteración genética sólo puede
manifestarse fenotipicamente si las células de su microambiente, en particular
las del sistema inmune, sufren un desequilibrio tal que le permiten hacerlo.
Durante el desarrollo embrionario, las relaciones celulares que se establecen
son las que permiten la sana y ordenada diferenciación fenotípica de la célula;
y del desarrollo morfológico y funcional de los tejidos y órganos. La relación
mesodermo-ectodermo cumple un rol fundamental durante el período
embrionario. Más tarde, durante el período fetal, el estroma conectivo primero,
y en forma creciente el sistema inmune después, van ocupando el papel del
mesodermo.
En el adulto, para completar el desarrollo puberal de la glándula, las células
mioepiteliales, el estroma y en particular el sistema inmune son los mediadores
del sistema endocrino para que el órgano permanezca sano y funcionalmente
potente durante cada ciclo sexual.
En el capítulo de la relación del sistema inmune con el cáncer de mama hemos
comprobado que cuando se establece la desarmonía entre epitelio glandular y
células inmunitarias, se favorece la producción de tumores malignos.
Pretender atacar un tumor sólo procurando intoxicar su capacidad de crecer
parece ser tan efectivo como el controlar una infección solo con antitérmicos.
Esta acción, la de controlar la masa tumoral, por ablación o intoxicación, debe
ser acompañada del restablecimiento de la armonía del sistema inmune con el
epitelio transformado.
Intentando probar este planteo hemos mencionado cómo en experiencias in
vitro el estroma era capaz de cambiar la expresión genética de una célula
madre normal con otro destino y de células tumorales en tejido mamario normal
135
[73-75, 87]. Así mismo hemos señalado experiencias nuestras donde
mostrábamos que bastaba el contacto de las células madre mesenquimales
con los linfocitos efectores específicos anti-tejidos para que estas se
diferenciaran según la ruta que les marcan los linfocitos [93-95].
Figura 74: Representación esquemática del proceso de desarrollo normal, oncogénico y
metastático.
Éstos datos pueden ayudarnos a comprender en parte cómo el actuar sobre el
sistema inmune puede influir positivamente sobre el control de la enfermedad
neoplásica. La importancia de reducir la masa tumoral disminuye la influencia
pro-tumoral que la propia neoplasia genera. La inmunoterapia ayuda a
reestablecer la adecuada respuesta inmune que controla al terreno tumoral.
Ahora bien, para lograr éste propósito hemos desarrollado y optimizado una
forma de inmunización que contempla al problema en su totalidad. El principal
problema estriba en que, a pesar de que el oncocito posee antígenos propios
(TAA), éste evita ser reconocido como elemento extraño.
Las vacunas basadas en proteínas purificadas han demostrado su inutilidad
pues son más proclives a generar respuestas humorales en desmedro de las
celulares. Eso favorece aún más el desarrollo tumoral [171-178]. Por otro lado
el tumor responde a este tipo de tratamientos editando el fenotipo de la célula
tumoral [309].
136
Por el contrario, al utilizar como inmunógeno a la propia célula tumoral pero
enriquecida fenotipicamente con las moléculas MHC y co-estimuladoras
propias del linfocito B, se obtiene una célula con la totalidad de los antígenos
del tejido tumoral y sus moléculas de adhesión. Ésta es probablemente la
causa de la aparente actividad de las vacunas TBH y DC-TBH.
Una de las diferencias celulares más importantes entre las células que
metastatizan en los diversos tejidos y el tumor principal estriba en las diferentes
moléculas de adhesión celular que expresa cada oncocito. Esto es lo que les
permite anidar en los distintos órganos donde ellas metastatizan. Esta
diferencia es probablemente la causa por la cuál metástasis de un mismo tumor
presenten distinta respuesta inmune a una misma vacuna celular producida con
los oncocitos provenientes de una única locación.
Para explicar este fenómeno es necesario profundizar en la forma de cómo el
sistema inmune efector reconoce un blanco celular para destruirlo. Este
reconocimiento implica que el linfocito T debe, a través de su receptor T (CD4 o
CD8, según corresponda) vincularse a los antígenos ya libres en la membrana
celular del oncocito o los presentados por sus moléculas MHC (reacción
idiotipo-antidiotipo). Pero esta unión entre las dos células, para ser efectiva
debe estar acompañada de la unión de otros pares de moléculas que
acompañan tanto al oncocito como al linfocito T: las moléculas de adhesión y
las co-estimuladoras. Esto es lo que Cohen y col. han dado en llamar la
reacción ergotipo-antiergotipo [319]. Esta sea probablemente la razón por las
que se deben utilizar muestras de cada una de las metástasis para ser efectivo
en la enfermedad avanzada con localizaciones múltiples.
La vacuna DC-TBH posee una doble ventaja sobre el uso de la TBH sola: 1) al
fagocitar a la totalidad de la célula maligna, la DC adquiere y trasmite la misma
información que obtendría y elaboraría in-vivo al destruir una célula neoplásica
susceptible; 2) ahorra un paso importante del reconocimiento inmune del tumor
al presentar exvivo las células extrañas a DC recién movilizadas y por ende no
inhibidas por las secreciones tumorales.
Finalmente hemos comprobado, así como lo han observado otros grupos, que
las DC naive obtenidas por movilización son más eficaces respecto de la
137
respuesta tumoral lograda que las obtenidas por diferenciación de monocitos
periféricos [331].
Sin embargo no deben menospreciarse los cambios inmunológicos que
continuamente genera el tumor para subsistir. Estos son mediados por su
influencia sobre el estroma tumoral que induce la anergia de los linfocitos T
efectores y la generación de Treg para que el sistema inmune tolere al tumor.
El citoimplante del MLC y el citoimplante CD3+ CD25- autólogo parecen ser
formas efectivas de inmunoterapia adoptiva para superar la adversidad del
microambiente inducido por el tumor y permitir que las células T efectoras
penetren y destruyan tumores avanzados.
La imposibilidad de repetir el citoimplante de MLC nos llevó a desarrollar el
citoimplante CD3+CD25-. Esta técnica esta basada en el uso de material
autólogo. Sin embargo, debiera ser usado con precaución si las lesiones del
paciente poseen gran presencia TIL. El algoritmo de la Figura 61 explica las
pruebas y decisiones terapéuticas a aplicar ante la falta de respuesta tumoral
primaria para superar los problemas antes descriptos.
Otra estrategia diferente que aún no hemos explorado suficientemente se
refiere al uso de Timosina α 1 para, generando el mínimo de toxicidad, cambiar
la respuesta tumoral del paciente.
Las diferencias observadas entre los pacientes que experimentaron CR o PR
respecto del resto nos permiten indicar que la asociación de ésta terapia con el
tratamiento de citoreducción (Cirugía, ablación de radiofrecuencia, radioterapia
3D o quimioterapia supresora no inmune) mejora la respuesta tumoral de los
pacientes PR y los pacientes no respondedores. Esto también puede justificar
el uso de inmunoterapia como adyuvancia luego de la citoreducción completa
en estadios tumorales más tempranos.
Si bien todos los conceptos aquí vertidos requieren de mayor cantidad de datos
recogidos a través del tratamiento de un mayor número de pacientes, este
estudio parece simplificarse pues, a diferencia de lo que ocurre con la
quimioterapia, la respuesta tumoral sí parece estar relacionada con la eficiencia
de la inmunoterapia, lo que simplificaría y acortaría futuras evaluaciones
clínicas.
138
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173
ANEXO 1
Estadificación del Cáncer de Mama
Los estadios de la enfermedad tumoral se basan en el Tamaño del Tumor
primario, el número y localización de los ganglios regionales implicados y la
presencia o no de metástasis. Esto configura un primer tipo de estadificación
denominado TNM (del ingles, T por Tumor, N por Lymph Node y M por
metástasis).
Los datos de tamaño y distribución tumoral son recogidos por examen clínico
y medios diagnósticos auxiliares de márgenes. El diagnóstico positivo se refiere
al estudio anatomo patológico de una biopsia de las lesiones. Por esta razón ,
cuando
las
áreas
que
se
presumen
positivas
son
analizadas
anatomopatológicamente a posteriori de una intervención quirúrgica
se
denomina a esta nueva estadificación pTNM. Finalmente cunado la
estadificación se realiza a posteriori de un tratamiento se denomina a esta
ypTNM
Definiciones del sistema TNM of TNM
Tabla 1. Tumor Primario (T)
TX
Primary tumor cannot be assessed.
T0
No evidence of primary tumor.
Tis
Carcinoma in situ.
Tis
(DCIS)
DCIS. (ductal carcinoma in situ)
Tis
(LCIS)
LCIS. (lobular carcinoma in situ)
Tis
(Paget)
Paget disease of the nipple NOT associated with invasive carcinoma
and/or carcinoma in situ (DCIS and/or LCIS) in the underlying breast
parenchyma. Carcinomas in the breast parenchyma associated with
Paget disease are categorized based on the size and characteristics
of the parenchymal disease, although the presence of Paget disease
should still be noted.
T1
Tumor ≤20 mm in greatest dimension.
T1mi
Tumor ≤1 mm in greatest dimension.
T1a
Tumor >1 mm but ≤5 mm in greatest dimension.
174
T1b
Tumor >5 mm but ≤10 mm in greatest dimension.
T1c
Tumor >10 mm but ≤20 mm in greatest dimension.
T2
Tumor >20 mm but ≤50 mm in greatest dimension.
T3
Tumor >50 mm in greatest dimension.
T4
Tumor of any size with direct extension to the chest wall and/or to the
skin (ulceration or skin nodules).c
T4a
Extension to the chest wall, not including only pectoralis muscle
adherence/invasion.
T4b
Ulceration and/or ipsilateral satellite nodules and/or edema (including
peau d'orange) of the skin, which do not meet the criteria for
inflammatory carcinoma.
T4c
Both T4a and T4b.
T4d
Inflammatory carcinoma.
DCIS = ductal carcinoma in situ; LCIS = lobular carcinoma in situ.
a
Reprinted with permission from AJCC: Breast. In: Edge SB, Byrd DR, Compton
CC, et al., eds.: AJCC Cancer Staging Manual. 7th ed. New York, NY: Springer,
2010, pp 347–76
b
The T classification of the primary tumor is the same regardless of whether it is
based on clinical or pathologic criteria, or both. Size should be measured to the
nearest millimeter. If the tumor size is slightly less than or greater than a cutoff
for a given T classification, it is recommended that the size be rounded to the
millimeter reading that is closest to the cutoff. For example, a reported size of
1.1 mm is reported as 1 mm, or a size of 2.01 cm is reported as 2.0 cm.
Designation should be made with the subscript "c" or "p" modifier to indicate
whether the T classification was determined by clinical (physical examination or
radiologic) or pathologic measurements, respectively. In general, pathologic
determination should take precedence over clinical determination of T size.
c
Invasion of the dermis alone does not qualify as T4.
Table 2. Regional Lymph Nodes (N)a
Clasificación por examen clínico
NX
Regional lymph nodes cannot be assessed (e.g., previously removed).
N0
No regional lymph node metastases.
N1
Metastases to movable ipsilateral level I, II axillary lymph node(s).
Metastases in ipsilateral level I, II axillary lymph nodes that are clinically
fixed or matted.
N2
OR
Metastases in clinically detectedbipsilateral internal mammary nodes in
the absence of clinically evident axillary lymph node metastases.
N2a Metastases in ipsilateral level I, II axillary lymph nodes fixed to one
175
another (matted) or to other structures.
Metastases only in clinically detectedb ipsilateral internal mammary nodes
N2b and in the absence of clinically evident level I, II axillary lymph node
metastases.
Metastases in ipsilateral infraclavicular (level III axillary) lymph node(s)
with or without level I, II axillary lymph node involvement.
OR
N3
Metastases in clinically detectedb ipsilateral internal mammary lymph
node(s) with clinically evident level I, II axillary lymph node metastases.
OR
Metastases in ipsilateral supraclavicular lymph node(s) with or without
axillary or internal mammary lymph node involvement.
N3a Metastases in ipsilateral infraclavicular lymph node(s).
N3b
Metastases in ipsilateral internal mammary lymph node(s) and axillary
lymph node(s).
N3c Metastases in ipsilateral supraclavicular lymph node(s).
a
Reprinted with permission from AJCC: Breast. In: Edge SB, Byrd DR, Compton
CC, et al., eds.: AJCC Cancer Staging Manual. 7th ed. New York, NY: Springer,
2010, pp 347–76.
b
Clinically detected is defined as detected by imaging studies (excluding
lymphoscintigraphy) or by clinical examination and having characteristics highly
suspicious for malignancy or a presumed pathologic macrometastasis based on
fine needle aspiration biopsy with cytologic examination. Confirmation of
clinically detected metastatic disease by fine needle aspiration without excision
biopsy is designated with an (f) suffix, for example, cN3a(f). Excisional biopsy of
a lymph node or biopsy of a sentinel node, in the absence of assignment of a
pT, is classified as a clinical N, for example, cN1. Information regarding the
confirmation of the nodal status will be designated in site-specific factors as
clinical, fine needle aspiration, core biopsy, or sentinel lymph node biopsy.
Pathologic classification (pN) is used for excision or sentinel lymph node biopsy
only in conjunction with a pathologic T assignment.
Table 3. Pathologic (pN)a,b
Clasificación por examen anatomo patológico
pNX
Regional lymph nodes cannot be assessed (e.g., previously
removed or not removed for pathologic study).
pN0
No regional lymph node metastasis identified histologically.
Note: ITCs are defined as small clusters of cells ≤0.2 mm, or single tumor cells,
or a cluster of <200 cells in a single histologic cross-section. ITCs may be
detected by routine histology or by IHC methods. Nodes containing only ITCs
are excluded from the total positive node count for purposes of N classification
but should be included in the total number of nodes evaluated.
176
pN0(i–)
No regional lymph node metastases histologically, negative IHC.
pN0(i+)
Malignant cells in regional lymph node(s) ≤0.2 mm (detected by
H&E or IHC including ITC).
pN0(mol–)
No regional lymph node metastases histologically, negative
molecular findings (RT-PCR).
pN0(mol+)
Positive molecular findings (RT-PCR), but no regional lymph node
metastases detected by histology or IHC.
pN1
Micrometastases.
OR
Metastases in 1–3 axillary lymph nodes.
AND/OR
Metastases in internal mammary nodes with metastases detected
by sentinel lymph node biopsy but not clinically detected.c
pN1mi
Micrometastases (>0.2 mm and/or >200 cells but none >2.0 mm).
pN1a
Metastases in 1–3 axillary lymph nodes, at least one metastasis
>2.0 mm.
pN1b
Metastases in internal mammary nodes with micrometastases or
macrometastases detected by sentinel lymph node biopsy but not
clinically detected.c
pN1c
Metastases in 1–3 axillary lymph nodes and in internal mammary
lymph nodes with micrometastases or macrometastases detected
by sentinel lymph node biopsy but not clinically detected.
pN2
Metastases in 4–9 axillary lymph nodes.
OR
Metastases in clinically detectedd internal mammary lymph nodes
in the absence of axillary lymph node metastases.
pN2a
Metastases in 4–9 axillary lymph nodes (at least 1 tumor deposit
>2 mm).
pN2b
Metastases in clinically detectedd internal mammary lymph nodes
in the absence of axillary lymph node metastases.
pN3
Metastases in ≥10 axillary lymph nodes.
OR
Metastases in infraclavicular (level III axillary) lymph nodes.
OR
Metastases in clinically detectedc ipsilateral internal mammary
177
lymph nodes in the presence of one or more positive level I, II
axillary lymph nodes.
OR
Metastases in >3 axillary lymph nodes and in internal mammary
lymph nodes with micrometastases or macrometastases detected
by sentinel lymph node biopsy but not clinically detected.c
OR
Metastases in ipsilateral supraclavicular lymph nodes.
pN3a
Metastases in ≥10 axillary lymph nodes (at least 1 tumor deposit
>2.0 mm).
OR
Metastases to the infraclavicular (level III axillary lymph) nodes.
pN3b
Metastases in clinically detectedd ipsilateral internal mammary
lymph nodes in the presence of one or more positive axillary
lymph nodes;
OR
Metastases in >3 axillary lymph nodes and in internal mammary
lymph nodes with micrometastases or macrometastases detected
by sentinel lymph node biopsy but not clinically detected.c
pN3c
Metastases in ipsilateral suprclavicular lymph nodes.
Posttreatment ypN
–Posttreatment yp "N" should be evaluated as for clinical (pretreatment) "N"
methods above. The modifier "sn" is used only if a sentinel node evaluation was
performed after treatment. If no subscript is attached, it is assumed that the
axillary nodal evaluation was by AND.
–The X classification will be used (ypNX) if no yp posttreatment SN or AND was
performed.
–N categories are the same as those used for pN.
AND = axillary node dissection; H&E = hematoxylin and eosin stain; IHC =
immunohistochemical; ITC = isolated tumor cells; RT-PCR = reverse
transcriptase/polymerase chain reaction.
aReprinted with permission from AJCC: Breast. In: Edge SB, Byrd DR,
Compton CC, et al., eds.: AJCC Cancer Staging Manual. 7th ed. New York, NY:
Springer, 2010, pp 347–76.
bClassification is based on axillary lymph node dissection with or without
sentinel lymph node biopsy. Classification based solely on sentinel lymph node
biopsy without subsequent axillary lymph node dissection is designated (sn) for
"sentinel node," for example, pN0(sn).
c"Not clinically detected" is defined as not detected by imaging studies
(excluding lymphoscintigraphy) or not detected by clinical examination.
178
d"Clinically detected" is defined as detected by imaging studies (excluding
lymphoscintigraphy) or by clinical examination and having characteristics highly
suspicious for malignancy or a presumed pathologic macrometastasis based on
fine-needle aspiration biopsy with cytologic examination.
Table 4. Distant Metastases (M)a
a
Reprinted with permission from AJCC: Breast. In: Edge SB, Byrd DR, Compton
CC, et al., eds.: AJCC Cancer Staging Manual. 7th ed. New York, NY: Springer,
2010, pp 347–76.
M0
No clinical or radiographic evidence of distant metastases.
No clinical or radiographic evidence of distant metastases, but
deposits of molecularly or microscopically detected tumor cells in
cM0(i+)
circulating blood, bone marrow, or other nonregional nodal tissue that
are ≤0.2 mm in a patient without symptoms or signs of metastases.
M1
Distant detectable metastases as determined by classic clinical and
radiographic means and/or histologically proven >0.2 mm.
Posttreatment yp M classification. The M category for patients treated with
neoadjuvant therapy is the category assigned in the clinical stage, prior to
initiation of neoadjuvant therapy. Identification of distant metastases after the
start of therapy in cases where pretherapy evaluation showed no metastases is
considered progression of disease. If a patient was designated to have
detectable distant metastases (M1) before chemotherapy, the patient will be
designated as M1 throughout.[1]
Table 5. Anatomic Stage/Prognostic Groupsa,b
Stage
T
N
M
0
Tis
N0
M0
IA
T1b
N0
M0
T0
N1mi
M0
T1b
N1mi
M0
T0
N1c
M0
T1b
N1c
M0
T2
N0
M0
T2
N1
M0
T3
N0
M0
T0
N2
M0
T1b
N2
M0
IB
IIA
IIB
IIIA
179
Stage
T
N
M
T2
N2
M0
T3
N1
M0
T3
N2
M0
T4
N0
M0
T4
N1
M0
T4
N2
M0
IIIC
Any T
N3
M0
IV
Any T
Any N
M1
IIIB
a
Reprinted with permission from AJCC: Breast. In: Edge SB, Byrd DR,
Compton CC, et al., eds.: AJCC Cancer Staging Manual. 7th ed. New York,
NY: Springer, 2010, pp 347–76.
b
T1 includes T1mi.
c
T0 and T1 tumors with nodal micrometastases only are excluded from Stage
IIA and are classified Stage IB.
–M0 includes M0(i+).
–The designation pM0 is not valid; any M0 should be clinical.
–If a patient presents with M1 prior to neoadjuvant systemic therapy, the stage
is considered Stage IV and remains Stage IV regardless of response to
neoadjuvant therapy.
–Stage designation may be changed if postsurgical imaging studies reveal the
presence of distant metastases, provided that the studies are carried out within
4 months of diagnosis in the absence of disease progression and provided that
the patient has not received neoadjuvant therapy.
–Postneoadjuvant therapy is designated with "yc" or "yp" prefix. Of note, no
stage group is assigned if there is a complete pathologic response (CR) to
neoadjuvant therapy, for example, ypT0ypN0cM0.
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180
Breast Cancer Treatment (PDQ®) Health Professional
Version
Stage IIIB, Inoperable IIIC, IV, Recurrent, and Metastatic Breast Cancer
Inoperable Stage IIIB or IIIC or Inflammatory Breast Cancer
Multimodality therapy delivered with curative intent is the standard of care for
patients with clinical stage IIIB disease. In a retrospective series, approximately
32% of patients with ipsilateral supraclavicular node involvement and no
evidence of distant metastases (pN3c) had prolonged disease-free survival
(DFS) at 10 years with combined modality therapy.[1] Although these results
have not been replicated in another series, this result suggests such patients
should be treated with the same intent.
Initial surgery is generally limited to biopsy to permit the determination of
histology, estrogen-receptor (ER) and progesterone-receptor (PR) levels, and
human epidermal growth factor receptor 2 (HER2/neu) overexpression. Initial
treatment with anthracycline-based chemotherapy and/or taxane-based therapy
is standard.[2,3] In one series of 178 patients with inflammatory breast cancer,
DFS was 28% at 15 years with a combined-modality approach.[2] [Level of
evidence: 3iiiDii] For patients who respond to neoadjuvant chemotherapy, local
therapy may consist of total mastectomy with axillary lymph node dissection
followed by postoperative radiation therapy to the chest wall and regional
lymphatics. Breast-conserving therapy can be considered in patients with a
good
partial
or
complete
response
to
neoadjuvant
chemotherapy.[3]
Subsequent systemic therapy may consist of further chemotherapy. Hormone
therapy should be administered to patients whose tumors are ER-positive or
unknown. All patients should be considered candidates for clinical trials to
evaluate the most appropriate fashion in which to administer the various
components of multimodality regimens.
Stage IV, Recurrent, and Metastatic Breast Cancer
Recurrent breast cancer is often responsive to therapy, though treatment is
rarely curative at this stage of disease. Patients with localized breast or chest
wall recurrences, however, may be long-term survivors with appropriate
181
therapy. Prior to treatment for recurrent or metastatic cancer, restaging to
evaluate extent of disease is indicated. Cytologic or histologic documentation of
recurrent or metastatic disease should be obtained whenever possible. The ER
and PR levels, HER2/neu positivity at the time of recurrence, and previous
treatment should be considered, if known, when selecting therapy. ER status
may change at the time of recurrence. In a single small study by the Cancer and
Leukemia Group B (MDA-MBDT-8081 6), 36% of hormone receptor–positive
tumors were found to be receptor negative in biopsy specimens isolated at the
time of recurrence.[4] Patients in this study had no interval treatment. If ER and
PR status is unknown, then the site(s) of recurrence, disease-free interval,
response to previous treatment, and menopausal status are useful in selecting
chemotherapy or hormone therapy.[5]
Recurrent local-regional breast cancer
Patients with local-regional breast cancer recurrence may become long-term
survivors with appropriate therapy. A clinical trial indicated that between 10%
and 20% of patients will have locally recurrent disease in the breast between 1
and 9 years after breast-conservation surgery plus radiation therapy.[6] Nine
percent to 25% of these patients will have distant metastases or locally
extensive disease at the time of recurrence.[7-9] Patients with local-regional
recurrence should be considered for further local treatment (e.g., mastectomy).
In one series, the 5-year actuarial rate of relapse for patients treated for
invasive recurrence after initial breast conservation and radiation therapy was
52%.[8] A phase III randomized study showed that local control of cutaneous
metastases could be achieved with the application of topical miltefosine;
however, the drug is not currently available in the United States.[10][Level of
evidence: 1iiDiii]
Local chest wall recurrence following mastectomy is usually the harbinger of
widespread disease, but, in a subset of patients, it may be the only site of
recurrence. For patients in this subset, surgery and/or radiation therapy may be
curative.[11,12] Patients with chest wall recurrences of less than 3 cm, axillary
and internal mammary node recurrence (not supraclavicular, which has a
poorer survival), and a greater than 2-year disease-free interval prior to
recurrence have the best chance for prolonged survival.[12] The 5-year DFS
182
rate in one series of such patients was 25%, with a 10-year rate of 15%.[13]
The local-regional control rate was 57% at 10 years. Systemic therapy should
be considered in patients with local regional recurrence caused by the high risk
of subsequent metastases.[14] No randomized controlled studies are available
to guide patient care in this situation.
Stage IV and metastatic disease - Systemic disease
Treatment for systemic disease is palliative in intent. Goals of treatment include
improving quality of life and prolongation of life. Although median survival has
been reported to be 18 to 24 months,[15] some patients experience long-term
survival. Among patients treated with systemic chemotherapy at a single
institution between 1973 and 1982, 263 patients (16.6%) achieved complete
responses. Of those, 49 patients (3.1% of the total group) remained in complete
remission for more than 5 years, and 26 patients (1.5%) were still in complete
remission at 16 years.[16][Level of evidence: 3iiDiii]
Treatment of metastatic breast cancer will usually involve hormone therapy
and/or chemotherapy with or without trastuzumab. Radiation therapy and/or
surgery may be indicated for patients with limited symptomatic metastases. All
patients with metastatic or recurrent breast cancer should be considered
candidates for ongoing clinical trials.
Surgery
Surgery may be indicated for selected patients. Examples include patients who
need mastectomies for fungating/painful breast lesions, parenchymal brain or
vertebral metastases with spinal cord compression, isolated lung metastases,
pathologic (or impending) fractures, or pleural or pericardial effusions. (Refer to
the PDQ summary on Pain 7 for more information; for information on pleural and
pericardial effusions, refer to the PDQ summary on Cardiopulmonary
Syndromes 8.)
Radiation therapy
Radiation therapy has a major role in the palliation of localized symptomatic
metastases. Indications include painful bony metastases, unresectable central
nervous system metastases (i.e., brain, meningeal, and spinal cord), bronchial
obstruction, and fungating/painful breast or chest wall lesions. Radiation therapy
183
should also be given following surgery for decompression of intracranial or
spinal cord metastases and following fixation of pathologic fractures. Clinical
trials (including the completed Radiation Therapy Oncology Group's trial
[RTOG-9714 9]) are exploring the optimal radiation fractionation schedule.
Strontium 89, a systemically administered radionuclide, can be administered for
palliation of diffuse bony metastases.[17,18]
Systemic Therapy
Bisphosphonates
The use of bisphosphonates to reduce skeletal morbidity in patients with bone
metastases should be considered.[19] Results of randomized trials of
pamidronate and clodronate in patients with bony metastatic disease show
decreased skeletal morbidity.[20-22][Level of evidence: 1iC] Zoledronate has
been at least as effective as pamidronate.[23] (Refer to the PDQ summary
on Pain 12 for more information on bisphosphonates.)
Hormone therapy
Hormone therapy should generally be considered as initial treatment for a
postmenopausal patient with newly diagnosed metastatic disease if the patient’s
tumor is ER-positive, PR-positive, or ER/PR-unknown. Hormone therapy is
especially indicated if the patient’s disease involves only bone and soft tissue
and the patient has either not received adjuvant antiestrogen therapy or has
been off such therapy for more than 1 year. While tamoxifen has been used in
this setting for many years, several randomized trials suggest equivalent or
superior response rates and progression-free survival for the aromatase
inhibitors compared to tamoxifen.[24-26][Level of evidence: 1iiDiii] In a metaanalysis that included randomized trials in patients who were receiving an
aromatase inhibitor as either their first or second hormonal therapy for
metastatic disease, those who were randomized to a third-generation drug
(anastrozole, letrozole, exemestane, or vorozole) lived longer (HR for death =
0.87; 95% CI, 0.82–0.93) than those who received standard therapy (tamoxifen
or a progestational agent).[27][Level of evidence: 1iA]
Several randomized but underpowered trials have tried to determine if
combined hormone therapy (luteinizing hormone-releasing hormone [LHRH]
184
agonists + tamoxifen) is superior to either approach alone in premenopausal
women. Results have been inconsistent.[28-30] The best study design
compared buserelin (an LHRH agonist) versus tamoxifen versus the
combination in 161 premenopausal women with hormone receptor–positive
tumors.[31] Patients receiving buserelin and tamoxifen had a significantly
improved median survival of 3.7 years compared with those receiving tamoxifen
or buserelin who survived 2.9 and 2.5 years, respectively (P = .01).[31][Level of
evidence: 1iiA] Very few women in this trial received adjuvant tamoxifen, which
makes it difficult to assess whether these results are applicable to women who
relapse after adjuvant tamoxifen.
Women whose tumors are ER-positive or unknown, with bone or soft tissue
metastases only, who have received an antiestrogen within the past year,
should be given second-line hormone therapy. Examples of second-line
hormone therapy in postmenopausal women include selective aromatase
inhibitors, such as anastrozole, letrozole, or exemestane; megestrol acetate;
estrogens; androgens;[32-40] and the ER down-regulator, fulvestrant.[41,42] In
comparison to megestrol acetate, all three currently available aromatase
inhibitors have demonstrated, in prospective randomized trials, at least equal
efficacy and better tolerability.[32-38,43] In a meta-analysis that included
randomized trials of patients who were receiving an aromatase inhibitor as
either their first or second hormonal therapy for metastatic disease, those who
were randomly assigned to a third-generation drug (e.g., anastrozole, letrozole,
exemestane, or vorozole) lived longer (HR for death 0.87; 95% CI, 0.82–0.93)
than those who received standard therapy (tamoxifen or a progestational
agent).[27][Level of evidence: 1iA] Two randomized trials that enrolled 400 and
451 patients who had progressed after receiving tamoxifen demonstrated that
fulvestrant yielded similar results to anastrozole in terms of its impact on
PFS.[44,45] The proper sequence of these therapies is currently not
known.[43,46]
Premenopausal women should undergo oophorectomy (surgically, with
external-beam radiation therapy or with an LHRH agonist).[47] Patients with
lymphangitic pulmonary metastases, major liver involvement, and/or central
nervous system involvement should not receive hormone therapy as a single
185
modality. Patients with structural compromise of weight-bearing bones should
be considered for surgical intervention and/or radiation in addition to systemic
therapy. Patients with vertebral body involvement should be evaluated for
impending cord compression even in the absence of neurologic symptoms.
Increasing bone pain and increasing alkaline phosphatase within the first
several weeks of hormone therapy does not necessarily imply disease
progression.[48] Patients with extensive bony disease are at risk for the
development of symptomatic hypercalcemia early in the course of hormone
therapy.[48] Early failure (e.g., <6 months) on hormone therapy suggests that
cytotoxic chemotherapy should be the next modality employed.
Trastuzumab
Approximately 25% of patients with breast cancer have tumors that
overexpress HER2/neu.[49] Trastuzumab is a humanized monoclonal antibody
that binds to the HER2/neu receptor.[49] In patients previously treated with
cytotoxic chemotherapy whose tumors overexpress HER2/neu, administration
of trastuzumab as a single agent resulted in a response rate of 21%.[50][Level
of evidence: 3iiiDiv] In a prospective trial, patients with metastatic disease were
randomized
to
receive
either
chemotherapy
alone
(doxorubicin
and
cyclophosphamide or paclitaxel) or the same chemotherapy and trastuzumab.
Patients treated with chemotherapy plus trastuzumab had an overall survival
(OS) advantage as compared with those receiving chemotherapy alone (25.1
months vs. 20.3 months, P = .05).[51][Level of evidence: 1iiA] When combined
with doxorubicin, trastuzumab is associated with significant cardiac toxicity.[52]
Consequently, patients with metastatic breast cancer with substantial
overexpression of HER2/neu are candidates for treatment with the combination
of trastuzumab and paclitaxel or for clinical studies of trastuzumab combined
with taxanes and other chemotherapeutic agents.[53] In a randomized study of
patients with metastatic breast cancer treated with trastuzumab, paclitaxel, and
carboplatin, patients tolerated the combination well and had a longer time-toprogression
with
the
addition
of
carboplatin
to
trastuzumab
and
paclitaxel.[54][Level of evidence: 1iDiii]
186
Lapatinib
Lapatinib
is
an
orally
administered
tyrosine
kinase
inhibitor
of
both HER2/neu and the epidermal growth factor receptor. Lapatinib has shown
activity in combination with capecitabine in patients who have HER2-positive
metastatic breast cancer that progressed after treatment with trastuzumab. A
nonblinded randomized trial (GSK-EGF100151 13) compared the combination of
capecitabine and lapatinib in 324 patients with locally advanced or metastatic
disease that progressed after therapies that included anthracyclines, taxanes,
and trastuzumab.[55] At the first planned interim analysis of the trial, a highly
significant difference was found that favored the combination arm with respect
to the primary study endpoint and time to progression (median time to
progression 8.4 months vs. 4.4 months; HR = 0.49; 95% CI, 0.34–0.71; P <
.001). There was no difference in overall survival (HR = 0.92; 95% CI, 0.58–
1.46; P = .72).[55][Level of evidence: 1iiA] Patients on combination therapy
were more likely to develop diarrhea, rash, and dyspepsia. No data on quality of
life or treatment after progression are available. (For information on diarrhea,
refer to the PDQ summary onGastrointestinal Complications 14.)
A double-blind, randomized phase III study compared paclitaxel and lapatinib
for first-line therapy in patients with metastatic breast cancer.[56] There was no
benefit for patients with HER2/neu metastatic breast cancer. Specimens were
evaluated
retrospectively
to
determine HER2/neu status.
When
used
with HER2/neu-positive patients, treatment with paclitaxel and lapatinib showed
improvement in time to progression, event-free survival, response rate, and
clinical benefit rate; OS did not increase. Toxicities, specifically alopecia,
diarrhea, and rash were higher in the HER2/neu-positive lapatinib group. A
series of adverse events were low and existed in both arms.[56][Level of
evidence: 1iDiii]
Cytotoxic chemotherapy
Patients whose tumors have progressed on hormone therapy are candidates for
cytotoxic chemotherapy. Patients with hormone receptor–negative tumors and
those with visceral metastases are also candidates for cytotoxic agents.[57]
Single agents that have shown activity in metastatic breast cancer:
187
1) Anthracyclines.
a) Doxorubicin.
b) Epirubicin.
c) Liposomal doxorubicin.[58-61]
d) Mitoxantrone.
2) Taxanes.
a) Paclitaxel.[62,63]
b) Docetaxel.
c) Albumin-bound nanoparticle paclitaxel (ABI-007 or Abraxane).[64,65]
3) Alkylating agents.
a) Cyclophosphamide.
4) Fluoropyrimidines.
a) Capecitabine.[66-68]
b) 5-FU.
5) Antimetabolites.
a) Methotrexate.
6) Vinca alkaloids.
a) Vinorelbine.[69]
b) Vinblastine.
c) Vincristine.
7) Platinum.
a) Carboplatin.
b) Cisplatin.
8) Other.
a) Gemcitabine.[70]
b) Mitomycin C.
Combination regimens that have shown activity in metastatic breast cancer:
•
CA: cyclophosphamide and doxorubicin.[71]
•
Docetaxel and doxorubicin.[72]
•
CAF: cyclophosphamide, doxorubicin, 5-fluorouracil.[73]
•
CMF: cyclophosphamide, methotrexate, 5-fluorouracil.[74]
•
Doxorubicin and paclitaxel.[75,76]
•
Docetaxel and capecitabine.[77]
•
Vinorelbine and epirubicin.[78]
•
Capecitabine and ixabepilone.[79]
188
Whether single-agent chemotherapy or combination chemotherapy is preferable
for first-line treatment is unclear. An Eastern Cooperative Oncology Intergroup
study (E-1193 15) randomly assigned patients to receive paclitaxel and
doxorubicin given both as a combination and sequentially.[80] Although
response rate and time-to-progression were both better for the combination,
survival was the same in both groups.[80][Level of evidence: 1iiA][81,82] The
rate of disease progression, the presence or absence of comorbid medical
conditions, and physician/patient preference will influence the choice of therapy
in individual patients. At this time, no data support the superiority of any
particular regimen. Sequential use of single agents or combinations can be
used for patients who relapse. Combinations of chemotherapy and hormone
therapy have not shown an OS advantage over the sequential use of these
agents.[15,83] A systematic review of 17 randomized trials found that the
addition of one or more chemotherapy drugs to a chemotherapy regimen in the
attempt to intensify the treatment improved tumor response but had no effect on
OS.[84][Level of evidence: 1iiA]
The optimal treatment duration for patients with responsive or stable disease
has been studied by several groups. For patients who attain a complete
response to initial therapy, two randomized trials have shown a prolonged DFS
from immediate treatment with a different chemotherapy regimen compared to
observation with treatment upon relapse.[85,86][Level of evidence: 1iiA] Neither
of these studies, however, showed an improvement in OS for patients who
received immediate treatment, and in one of these studies,[86] survival was
actually worse in the immediately treated group. Similarly, no difference in
survival was noted when patients with partial response or stable disease after
initial therapy were randomized to receive either a different chemotherapy
versus observation [87] or a different chemotherapy regimen given at higher
versus lower doses.[88][Level of evidence: 1iiA] These four studies indicate that
different combination regimens of additional chemotherapy immediately
following a patient’s best response to an induction chemotherapy regimen does
not improve OS. In view of the lack of a standard approach, patients requiring
second-line regimens are good candidates for clinical trials.
189
The potential for doxorubicin-induced cardiotoxicity should be considered in the
selection of chemotherapeutic regimens for an individual patient. Recognized
risk factors for cardiac toxicity include advanced age, prior chest-wall radiation
therapy, prior anthracycline exposure, hypertension, diabetes, and known
underlying heart disease. The cardioprotective drug dexrazoxane has been
shown to decrease the risk of doxorubicin-induced cardiac toxicity in patients in
controlled studies. The use of this agent has permitted patients to receive
greater cumulative doses of doxorubicin and allowed patients with cardiac risk
factors to receive doxorubicin.[89-92] Dexrazoxane has a similar protective
effect in patients receiving epirubicin.[93] The risks of cardiac toxicity may also
be reduced by administering doxorubicin as a continuous intravenous
infusion.[94]
Studies comparing high-dose chemotherapy with stem cell support to
conventional chemotherapy in patients with metastatic disease indicate no OS
or relapse-free survival benefit for patients receiving high-dose chemotherapy
with stem cell support.[95,96][Level of evidence: 1iiA] In the absence of data
suggesting a benefit from high-dose chemotherapy with stem cell support, this
remains an area of clinical evaluation.[97,98]
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60. Keller AM, Mennel RG, Georgoulias VA, et al.: Randomized phase III trial
of pegylated liposomal doxorubicin versus vinorelbine or mitomycin C
plus vinblastine in women with taxane-refractory advanced breast
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61. Sparano JA, Makhson AN, Semiglazov VF, et al.: Pegylated liposomal
doxorubicin plus docetaxel significantly improves time to progression
without additive cardiotoxicity compared with docetaxel monotherapy in
patients with advanced breast cancer previously treated with
neoadjuvant-adjuvant anthracycline therapy: results from a randomized
phase III study. J Clin Oncol 27 (27): 4522-9, 2009.
62. Seidman AD, Berry D, Cirrincione C, et al.: Randomized phase III trial of
weekly compared with every-3-weeks paclitaxel for metastatic breast
cancer, with trastuzumab for all HER-2 overexpressors and random
assignment to trastuzumab or not in HER-2 nonoverexpressors: final
results of Cancer and Leukemia Group B protocol 9840. J Clin Oncol 26
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dexrazoxane for doxorubicin-containing therapy in advanced breast
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Oncology clinical practice guidelines for the use of chemotherapy and
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92. Marty M, Espié M, Llombart A, et al.: Multicenter randomized phase III
study of the cardioprotective effect of dexrazoxane (Cardioxane) in
advanced/metastatic breast cancer patients treated with anthracyclinebased chemotherapy. Ann Oncol 17 (4): 614-22, 2006.
93. Venturini M, Michelotti A, Del Mastro L, et al.: Multicenter randomized
controlled clinical trial to evaluate cardioprotection of dexrazoxane versus
198
no cardioprotection in women receiving epirubicin chemotherapy for
advanced breast cancer. J Clin Oncol 14 (12): 3112-20, 1996.
94. Hortobagyi GN, Frye D, Buzdar AU, et al.: Decreased cardiac toxicity of
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combination chemotherapy for metastatic breast carcinoma. Cancer 63
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95. Stadtmauer EA, O'Neill A, Goldstein LJ, et al.: Conventional-dose
chemotherapy compared with high-dose chemotherapy plus autologous
hematopoietic stem-cell transplantation for metastatic breast cancer.
Philadelphia Bone Marrow Transplant Group. N Engl J Med 342 (15):
1069-76, 2000.
96. Schmid P, Schippinger W, Nitsch T, et al.: Up-front tandem high-dose
chemotherapy compared with standard chemotherapy with doxorubicin
and paclitaxel in metastatic breast cancer: results of a randomized trial. J
Clin Oncol 23 (3): 432-40, 2005.
97. Berry DA, Broadwater G, Klein JP, et al.: High-dose versus standard
chemotherapy in metastatic breast cancer: comparison of Cancer and
Leukemia Group B trials with data from the Autologous Blood and
Marrow Transplant Registry. J Clin Oncol 20 (3): 743-50, 2002.
98. Farquhar C, Marjoribanks J, Basser R, et al.: High dose chemotherapy
and autologous bone marrow or stem cell transplantation versus
conventional chemotherapy for women with metastatic breast cancer.
Cochrane Database Syst Rev (3): CD003142, 2005.
199
ANEXO 2
Preparación de Vacuna TBH
MNC producidas por Aféresis
Biopsia Tumoral
μ1−β1
Control Citológico
MNCs purificadas por Gradiente
de Densidad
μ4−β4
Disociación Mecánica del
Tumor
μ2−β2
Expansión y Activación de
Linfocitos B
μ2−β5
Cultivo de Células Tumorales
μ2−β2
Selección Negativa de
Linfocitos B
Cosecha de Células Tumorales
μ3−β6
μ3−β3
Fusión Linfocito B Célula Tumoral (TBH)
μ2−β7
Cultivo de TBH
Cosecha de TBH
μ4−β8
μ: control microbiológico
Vacuna TBH
Cultivo del TBH
β: control biológico
Preparación de Vacuna TBH-AAL
Biopsia Tumoral
MNC producidas por
Aféresis
μ1−β1
Control Citológico
MNCs purificadas por
Gradiente de Densidad
μ4−β4
Disociación Mecánica del Tumor
μ2−β2
Expansión y Activación
de Linfocitos B
μ2−β5
Cultivo de Células Tumorales
μ2−β2
Selección Negativa de
Linfocitos B
Cosecha de Células Tumorales
μ3−β6
μ3−β3
Fusión Linfocito B Célula Tumoral (TBH)
MNC producidas por
Aféresis
μ1−β1
μ2−β7
MNCs purificadas por
Gradiente de Densidad
Cultivo de TBH
μ2−β2
Cosecha de TBH
μ3−β8
Cultivo de TBH
Co-Cultivo TBH-AAL
Cosecha de TBH-AAL
μ4−β10
Vacuna TBH-AAL
μ: control microbiológico
β: control biológico
200
Preparación de Vacuna TBH-DC
Biopsia Tumoral
MNC producidas por
Aféresis
μ1−β1
Control Citológico
MNCs purificadas por
Gradiente de Densidad
μ4−β4
Disociación Mecánica del Tumor
μ2−β2
Expansión y Activación
de Linfocitos B
μ2−β5
Cultivo de Células Tumorales
μ2−β2
Selección Negativa de
Linfocitos B
Cosecha de Células Tumorales
μ3−β6
μ3−β3
Fusión Linfocito B Célula Tumoral (TBH)
Pre Tratamiento del
Paciente con GMCSF
MNC producidas por
Aféresis
μ1−β1
μ2−β7
MNCs purificadas por
Gradiente de Densidad
Cultivo de TBH
μ2−β2
Selección Negativa de
DC
Cosecha de TBH
μ1−β9
μ3−β8
Co-Cultivo TBH-DC
Cultivo de TBH
Cosecha de DC-TBH
μ4−β10
Vacuna DC-TBH
μ: control microbiológico
β: control biológico
Preparación de Suspensión Celular MLC
MNC del Paciente
Producidas por Aféresis
MNC del Donante
Producidas por Aféresis
μ1−β1
μ1−β1
MNCs purificadas por
Gradiente de Densidad
MNCs purificadas por
Gradiente de Densidad
μ2−β2
μ2−β2
Irradiación de las MNC
μ2−β14
Cultivo del MLC
Cosecha del MLC
μ4−β11
Suspensión Celular
de MLC
μ: control microbiológico
β: control biológico
201
Preparación de Suspensión Celular CD3+CD25MNC Producidas por
Aféresis
μ1−β1
MNC Purificadas por
Gradiente de densidad
TBH en Cultivo
μ2−β2
Selección Negativa de
linfocitos CD·3+
μ1−β12
Cosecha del TBH
μ3−β8
TBH en Cultivo
CD3-TBH co-cultivo
Selección Negativa
de CD3+CD25μ3−β13
Cultivo de
CD3+CD25Cosecha de
CD3+CD25μ4−β14
Suspensión Celular
de CD3+CD25-
μ: control microbiológico
β: control biológico
Preparación de Suspensión Celular TIL
Biopsia Tumoral
Control Citológico
μ4−β4
Disociación Mecánica del
Tumor
μ2−β5
TIL Purificadas por Gradiente
de Densidad
μ2−β15
Cultivo de TIL
Cosecha de TIL
μ4−β16
Suspensión Celular de TIL
μ: control microbiológico
β: control biológico
202
Controles Biológicos
Producto
Celular
Conteo Diferencial Viabilidad
Identidad
MNC obtenidas
por Aféresis
MNC Purificadas
por Gradiente de
Densidad
> 5 x 109 Células
>70 %
MNC a la Observación
Microscópica
> 3 x 109 Células
>70 %
MNC a la Observación
Microscópica
β3
Linfocitos B
> 1 x 107 Células
>70 %
CD19+ y CD80+ por
Citometría de Flujo
β4
---
---
Control Citológico Positivo
> 1 x 106 Células
>70 %
Control Citológico Positivo
> 1 x 106 Células
>70 %
Pan Citoqueratina +
β7
Células de la
Biopsia
Células Tumorales
Post-Disociación
Células Tumorales
Post Cultivo
Células
Fusionadas
> 1 x 106 Células
>70 %
β8
TBH
> 5 x 106 Células
>70 %
β9
DCs t=0
> 1 x 107 Células
>70 %
β10
DCs t=3
> 1 x 107 Células
>70 %
β11
MLC
Post-Cultivo
> 1 x 109 Células
>70 %
β12
Linfocitos T
> 1 x 109 Células
>70 %
> 1 x 108 Células
>70 %
CD 3+ y CD25- por
Citometría de Flujo
> 1 x 109 Células
>70 %
CD 3+ CD25- y CD69+
por Citometría de Flujo
> 1 x 105 Células
>70 %
> 1 x 107 Células
>70 %
β1
β2
β5
β6
β13
β14
β15
β16
Linfocitos T
Efectores
Post Selección
Linfocitos T
Efectores
Post Cultivo
TIL
Post Selección
TIL
Post Cultivo
Células Bi o Polinucleadas
por Microscopía
Pan Citoqueratina + y
CD19+ por Citometría de
Flujo
CD 83+por Citometría de
Flujo
CD 80+ y CD 86+ por
Citometría de Flujo
CD 69+ por Citometría de
Flujo
CD 3+por Citometría de
Flujo
CD 3+ y CD25- por
Citometría de Flujo
CD 3+ CD25- y CD69+
por Citometría de Flujo
Controles Microbiológicos
Gram+
Gram-
Hongos
Micobacterias
Endotoxina
Micoplasma
Anaerobias
μ1
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
-
-
-
μ2
Negativo
Negativo
Negativo
-
-
-
-
μ3
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
μ4
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Para poder realizar estas pruebas microbiológicas cada muestra fue procesada
como se describe a continuación:
203
1. Muestras de célula y sbrenadante se examinaron en fresco, se les
practicaron tinciones específicas y se las cultivó en medio de recuperación.
2. De crecer alguna colonia bacteriana en alguno de los medios de
recuperación, muestras de los microorganismos fueron examinadas en
fresco, teñidas y resembradas en medio de aislamiento. Este nuevo cultivo
fue utilizado para identificar al microorganismo y realizar pruebas de
sensibilidad (antibióticos y antimicóticos según correspondió).
3. De no poder identificarse apropiadamente la colonia microbiana esta fue
enviada a un laboratorio de referencia..
Los métodos de coloración fueron:
1. Coloración de Gram.
2. Coloración de Ziehl Neelsen.
3. Coloración de Giemsa.
4. Coloración con Mycotec TM Kit (Gibco, Invitrogen Corp.) para Micoplasma.
5. Para detectar la presencia de Endotoxina se utilizó el Linulus Test.
Los medios de recuperación utilizados fueron:
1. Cultivo por 1 semana en medio Cerebro Corazón (Aerobios y Anaerobios).
2. Cultivo por 1 semana en medio líquido de Tioglicolato (Aerobios).
3. Cultivo por 1 semana en caldo de Sabouraud Broth (hongos).
4. Cultivo por 4 semana en medio Lowenstein Jensen (Mycobacterias).
Los medios de aislación utilizados fueron:
1. Agar sangre (Aerobios).
2. Agar sangre + Antibióticos (Anaerobios).
3. Agar Chocolate (Aerobios).
4. Sabouraud Agar (hongos).
204
Anexo 3
Criterios de Terminología Común para Las Reacciones Adversas
“Common
terminology
criteria
for
adverse
events,
v3.0”
(CTCAE)
(http://ctep.cancer.gov/forms/CTCAEv3.pdf)
Menor toxicidad es 0 y mayor toxicidad es 4. 54 ítems analizados. Rango de 0
a 216
Grados de Toxicidad
Órgano
blanco
Grado 0
Grado 1
Grado 2
Grado 3
Grado 4
Rango
Rango
Rango
Rango
Rango
Glóbulos
Blancos
> 4,000/mm3
> 150000/mm3
2,0002,900/mm3
50,00074,900/mm3
1,0001,900/mm3
25,00049,900/mm3
< 1000/mm3
Plaquetas
Hemoglob
ina
Granulocit
os en
banda
> 12,5
mg/mm3
3,0003,900/mm3
75,00014,900/mm3
10,0-12,4
mg/mm3
Sangre/Médula Ósea
8,0-9,9 mg/mm3 6,5-7,9 mg/mm3
< 25,000/mm3
< 6,5 mg/mm3
> 2,000/mm3
1,5001,900/mm3
1,0001,400/mm3
500-900/mm3
< 500/mm3
> 2,000/mm3
1,5001,900/mm3
1,0001,400/mm3
500-900/mm3
< 500/mm3
Hemorragi
a (clínica)
No
Leve, no
transfusión
Grave,
transfusión de
1-2 unidades
por episodio.
Grave,
transfusión de
3-4 unidades
por episodio.
Masiva,
transfusión de
>4 unidades por
episodio.
Infección
No
Media
Moderada
Severa
Riesgo de vida.
DVN
0,99-0,75 x N
0,74-0,50 x N
0,49-0,25 x N
< 0,24 x N
DVN
1,01-1,25 x N
1,26-1,50 x N
1,51-2,00 x N
> 2,00 x N
DVN
1,01-1,66 x N
1,67-2,33 x N
2,34-3,00 X N
> 3,00 x N
Linfocitos
Coagulación
Fibrinóge
no
Tiempo de
Protrombi
na
KPTT
205
Grados de Toxicidad
Órgano
blanco
Grado 0
Grado 1
Grado 2
Grado 3
Grado 4
Ingesta
significativamente
disminuida pero puede
comer
Ingesta no
significativa.
----
2-5 episodios en 24
hs.
6-10 episodios en
24 hs.
> 10 episodios en 24
hs.
Gastrointestinal
Nauseas
No
Ingesta
adecuada
Vómitos
No
Un episodio
en 24 hs.
No
Incremento
en 2-3
deposiciones
diarias.
No
Úlceras
indoloras,
eritema, o
dolor medio.
Bilirubina
DVN
----
< 1,5 x N
1,5-3,0 x N
> 3,0 x N
(BRMP)
DVN
< 2,5 x N
2,6-5,0 x N
5,1-10,0 x N
> 10 x N
DVN
< 2,5 x N
2,6-5,0 x N
5,1-20,0 x N
> 20,0 x N
DVN
< 2,5 x N
2,6-5,0 x N
5,1-20,0 x N
> 20,0 x N
Sin variar el
estado
basal.
----
----
Pre-coma
Coma hepático
< 1,5 x N
1+o<
0,3g% o <
3g/l
Microhematuria
1,5-3,0 x N
3,1-6,0 x N
> 6,0 x N
2-3 + o < 0,3g% o <
3-10g/l
4 + o > 1,0 g% o
>10g/l
Síndrome Nefrótico
Importante, sin
coágulos
Importante, con
coágulos
Requiere transfusión
Diarrea
Estomatitis
Incremento en > 10
Incremento en 4-6
Incremento en 7-9
deposiciones diarias, o
deposiciones diarias o
deposiciones
diarrea francamente
deposiciones
diarias, o
sanguinolenta, o
nocturnas o cólicos
incontinencia, o
necesita hidratación
moderados.
cólicos severos.
parenteral.
Eritema doloroso,
Eritema doloroso,
Requiere hidratación y
edema, o úlceras
edema, o úlceras, pero
alimentación enteral o
y pero no puede
puede comer.
parenteral
comer.
Hígado
SGOT,
SGPT
FAL o 5’
nucleotida
sa.
Hígado,
clínica.
Riñón, vejiga
Creatinina
DVN
Proteinuria Sin Cambio
Hematuria
Negativo
Edema
(BRMP)
Cambio de
peso
No o sin
cambios
Mediano
Moderado
Severo
----
< 5,0 %
5,0-9,9%
10,0-19,9%
> 20,0%
----
No o no
cambio
Asintomático
, con
anormalidad
en PFT’s
Disnea de esfuerzo.
Disnea con
actividad
cotidiana.
Disnea de reposo.
Pulmones
Frecuencia
Respiratori
a
206
Órgano
blanco
Grados de Toxicidad
Grado 0
Grado 1
Grado 2
Grado 3
Grado 4
Requiere O2
continuo o
ventilación asistida.
----
Pulmones
Síntomas
(BRMP)
No o sin
cambios.
medianos
Disnea de esfuerzo
Disnea de
descanso,
requiere O2
ocasionalmente
Función
(BRMP)
No o sin
cambios
25-50%↓ en
DLCO o
VC
50%↓ en DLCO o
VC
----
Corazón
Disritmia
s
cardíacas
No <
Función
cardiaca
No
Isquemia
Cardiaca
No
Síntomas
Pericárdi
cos
No
Requiere monitoreo;
Asintomátic
Recurrente o
o hipotensión, o
o,
Requiere
persistente, no
taquicardia
ocasionalme
tratamiento
requiere terapia.
ventricular, o
nte requiere
fibrilación.
terapia.
Asintomátic
o,
Asintomático,
disminuye
Fallo cardíaco
disminuye la
Fallo cardíaco
la fracción
mediano que
severo o que no
de eyección fracción de eyección
responde a
de reposo
de reposo más del
responde a terapia.
terapia.
menos del 20% del valor basal.
20% del
valor basal.
Inespecífica
Asintomática,
Angina sin
Infarto Cardíaco
aplanamient
cambios en las
evidencias de
Agudo.
o de la onda ondas ST y T que
infarto.
T.
sugieren isquemia.
Derrame
Percarditis (frote,
Derrame
Taponamiento
asintomátic
o, no
dolor, cambios del pericárdico que Cardíaco: requiere
ECG)
requiere drenaje.
drenaje urgente.
requiere
intervención
Tensión Arterial
Hipertensión
Asintomático,
No o sin cambios.
incremento
Asintomático,
recurrente o
incremento transitorio persistente mayor de
mayor de 20 mm Hg (D) 20 mm Hg (D) o >
o > 150/100 si
150/100 si
previamente se
previamente se
encontraba DVN. No
encontraba DVN.
requiere tratamiento.
No requiere
tratamiento.
Requiere
tratamiento.
Crisis hipertensiva.
207
Órgano
blanco
Grados de Toxicidad
Grado 0
Grado 1
Grado 2
Grado 3
Grado 4
Cambios que
no requieren
terapia
(incluido
hipotensión
ortostática).
Requiere reemplazo
de fluidos u otra
terapia pero no
hospitalización.
Requiere terapia y
hospitalización,
resuelve dentro de
las 48 hs. luego
de suspender el
agente.
Requiere terapia y
hospitalización > de
48 hs. luego de
suspender el agente.
Tensión Arterial
Hipotensión
No o sin
cambios.
Sistema Nervioso
Neurose
nsorial
No o sin
cambios
Parestesias
Parestesias que
leves:
Parestesias
interfieren con la
moderadas: Perdida
pérdida de
función: Perdida
los reflejos sensorial objetiva leve
sensorial objetiva
osteotendinos
o moderada
grave
os.
Neuro
motor
No o sin
cambios
Debilidad
Subjetiva: no
hay cambios
objetivables
No
Somnolencia
leve o
agitación.
Neuro
cortical
----
Debilidad objetiva
leve sin alteración
significativa de la
función.
Debilidad
objetiva con
alteración de la
función.
Parálisis.
Somnolencia leve o
agitación
Somnolencia
severa o agitación
confusión,
desorienta-ción, o
alucinacio- nes.
Coma, convulsiones
Psicosis tóxica.
Ataxia
locomotora.
Necrosis Cerebelosa.
Ansiedad o
depresión severa.
Ideación suicida
Incoordinació
Tremor intencional,
n leve,
dismetría, disartria,
diadoqusinesi
Nistagmo
a.
Ansiedad o
Ansiedad o depresión
depresión
moderada
leve.
Función
cerebelo
sa.
No
Cambios
de
humor.
Sin cambios
Cefalea
No
Leve
Moderada o severa
pero transitoria.
Irreducible y
severa.
----
Constipa
ción
origen
SCN
No o sin
cambios
Leve
Moderada
Severa
> 96 hs
No o sin
cambios
Asintomático
, pérdida de
la audición
detectada
solo con
audiometría
Acúfenos
Pérdida de la
audición que
interfiere con la
función pero
puede ser
corregida con
audífono.
Sordera irreducible.
Trastornos de
Audición
de
origen
SNC.
208
Órgano
blanco
Grados de Toxicidad
Grado 0
Grado 1
Grado 2
Grado 3
Grado 4
----
----
Sintomático,
perdida subtotal
de visión
Ceguera
> 40,0 °C
> 40,0 °C por más de
24 hs o fiebre
accompañada de
hipotensión
Sistema Nervioso
Trastorn
os de
visión de
origen
SNC
Fiebre
en
ausencia
de
infección
No o sin
cambios
No
37,1-38,0 °C
38,1-40,0 °C
Piel
No o sin
cambios
Erupción
macular o
papular
difusa o
eritema
asintomático.
Edema
(BRMP)
No o sin
cambios
Leve
Moderado
Severo
----
No
Rash
Transitorio,
Fiebre
medicamento
sa < 38 °C
Urticaria, Fiebre
medicamentosa = 38
°C. Broncoespasmo
leve.
Enfermedad del
suero,
broncoespasmo
que requiere
medicación
parenteral.
Anafilaxia
Alopecia
Sin Pérdida
Caída de
cabello
moderada.
Caída de cabello
pronunciada o total.
----
----
Alteració
n Local
No
Dolor.
Dolor y tumefacción,
con inflamación o
flebitis.
Ulceración
Indicación de cirugía
plástica
116-160
161-250
251-500
> 500 o cetoacidosis
55-64
40-54
30-39
< 30
< 1,5 x N
1,5-2,0 x N
2,1-5,0 x N
> 5,1 x N
< 10,6
10,6-11,5
11,6-12,5
12,6-13,5
> 13,5
> 8,4
8,4-7,8
7,7-7,0
6,9-6,1
< 6,0
> 1,4
1,4-1,2
1,1-0,9
0,8-0,6
< 0,5
Piel y faneras
Alergia
Metabolismo
Hiperglu
< 116
cemia
Hipogluc
> 64
emia
Amilasa
DVN
Hipercal
cemia
Hipocalc
emia
Hipomag
nesemia
Erupción macular o Erupción macular,
papular difusa o
papular o
Dermatitis exfoliativa
eritema con prurito u
vesicular
o ulcerativa.
generalizada
otros síntomas
asociados.
sintomática.
209