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TUNEL EN TEJIDOS Grupo de señalización por cannabinoides Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I Facultad de Ciencias Químicas Universidad Complutense de Madrid 28040 Madrid Tlfn: +34 913944668 Fax: +34 913944672 Pág. 1/1 PROCEDIMIENTO PASO 1. Si el corte está congelado y fijado, se pone 5’ en PBS limpio. Si el corte está en parafina, se desparafina primero y se hace el antigen retrieval. PASO 2. Permeabilizar el tejido con PBS + 0.25 % de Triton X-100 durante 30-40’. PASO 3. Lavar 1 vez con PBS. PASO 4. Incubar los cortes con la mezcla de reacción, calcular aproximadamente 350 µl por cada porta (2 horas mínimo en cámara húmeda a 37º C). Volúmenes (por ml de mezcla): Buffer 5x 200 µl (el que viene con la enzima) Enzima rTdT (recombinant terminal deoxynucleotidyl transferase) 5 µl dUTP 2.5 µl H2O 792.5 µl PASO 5. Lavar 2 veces con PBS 1x (entre 5-10’). PASO 6. Incubar con Streptavidina conjugada con Alexa 488 o Alexa 594 (3.5 µl de Strp/ml PBS) durante 2 horas en cámara húmeda en oscuridad. PASO 7. Lavar 2 veces con PBS 1x (entre 5-10’). PASO 8. Escurrir bien el exceso de líquido y montaje (aproximadamente 50 µl de Mowiol + YOYO-1 (1/1000) o TOTO-3 (1/1000), si se quieren teñir los núcleos). PASO 9. Guardar a 4º C en oscuridad.
