Download El hierro es un elemento esencial para los organismos vivientes

Materia: LABORATORIO DE QUÍMICA BIOLÓGICA
Tema: ACTIVIDAD PRO-OXIDANTE DE HIERRO Y ALUMINIO
Lugar de trabajo: Laboratorio de Análisis Biológicos, Depto. Qca. Biol.ógica
Tutores: Dras. Alcira Nesse y Gladis Pérez
INTRODUCCIÓN
El hierro (Fe) es un elemento esencial para los organismos vivientes. En soluciones acuosas, el Fe
puede encontrarse en dos estados de oxidación estables: Fe2+ (ferroso) y Fe3+ (férrico). Esta
propiedad lo hace capaz de participar en reacciones que abarcan gran parte de la bioquímica,
incluyendo aquéllas que controlan el flujo de electrones a través de rutas bioenergéticas, la síntesis de
ADN y el aporte de oxígeno a los tejidos (1). Entre las hemoproteínas que utilizan Fe como cofactor
se encuentran las que participan en el metabolismo del oxígeno (oxidasas, peroxidasas, catalasas e
hidroxilasas), en la transferencia de electrones (citocromos) y en el transporte de oxígeno
(hemoglobina) (2).
El Fe en el organismo se encuentra formando parte de dos compartimientos: uno funcional, que
incluye los diversos compuestos celulares que contienen o requieren Fe, y otro de depósito, el cual
constituye la reserva corporal del metal. El transporte de Fe unido a la transferrína plasmática facilita
el intercambio del metal entre ambos compartimientos. El exceso de Fe se deposita en el interior de
la célula asociado a ferritina y hemosiderina.
En condiciones fisiológicas, el Fe está unido a una proteína ya que su presencia aislada, como en los
casos de intoxicación por el metal, produce daños graves en los tejidos. Esta toxicidad se debe a la
habilidad del Fe libre de generar, en conjunción con el oxígeno, radicales hidroxilos que pueden
causar peroxidación de las membranas lipídicas y otros constituyentes celulares (3). Por esta razón, la
absorción, concentración y estado rédox de este metal, deben ser regulados cuidadosamente: si la
cantidad de Fe en el organismo es escasa, se produce anemia y si se encuentra en exceso, causa daño
en los órganos por siderosis (4).
A diferencia del Fe, el aluminio (Al) no es un elemento esencial para el organismo. Sin embargo, su
biodisponibilidad creciente ha sido relacionada con alteraciones agudas y enfermedades crónicas en
humanos (5). La acumulación de Al en el organismo ha sido considerada un factor etiopatogénico
que afecta, entre otros, los sistemas eritropoyético (6) y nervioso (7). De hecho, es el metal más
abundante en la Naturaleza y a la exposición ambiental hay que agregar la inevitable ingestión, ya
que se encuentra presente en gran cantidad de alimentos procesados y medicamentos de uso
frecuente (8). En la profusa bibliografía sobre este tema, la acción del Al ha sido adjudicada a
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reacciones competitivas con Fe (9,10), elemento con el que comparte la proteína de transporte, o bien
a su capacidad para formar complejos estables con grupos funcionales fosfatos y carboxilatos. Un
aspecto menos conocido de la bioquímica del Al es su actividad pro-oxidante a pesar de no poseer
actividad rédox. Diversos estudios documentan un efecto facilitador del Al sobre la acción prooxidante del Fe (11).
Una de las vías de ingreso de Fe a la célula, independiente de transferrina, es mediada por la proteína
transportadora de metales divalentes DMT1. Resultados previos de nuestro laboratorio demostraron
que tanto el exceso de Fe como la presencia de Al parecen regular la funcionalidad de esta vía (10),
sugiriendo la modulación de la expresión de la proteína transportadora.
OBJETIVO
El objetivo del presente proyecto es evaluar el comportamiento de células cultivadas en un ambiente
con exceso de Fe y/o presencia de Al, investigando: a) la acumulación de Fe en depósitos
intracelulares, b) la regulación de la vía de captación de Fe independiente de transferrina, c) el efecto
pro-oxidante de los metales, evaluando un posible efecto sinérgico entre ambos.
Se eligió el modelo de células de la línea K562 porque pueden desarrollar diferenciación eritroide,
por lo que necesitan el aporte de Fe para la formación de hemoglobina, proteína marcadora del
proceso. Por lo tanto, se espera que se produzcan alteraciones en el desarrollo y/o metabolismo
celular a causa de un desequilibrio en el balance de Fe y a la inducción de su actividad pro-oxidante.
ACTIVIDADES
1) Ensayos in vitro:
1.A. Adición al medio de cultivo (sin células) de distintas concentraciones de compuestos de Fe,
tanto en estado ferroso como férrico (cloruro, sulfato, nitrato, citrato, nitriloacetato) y de hemina
(inductor de la diferenciación eritroide que aporta Fe en su molécula).
1.B. Adición al medio de cultivo (sin células) de distintas concentraciones de compuestos de Al
(cloruro, sulfato, citrato).
En cada ensayo de 1.A y 1.B, determinación de la oxidación de NADH para evaluar la capacidad
oxidativa de los distintos compuestos. Medición espectrofotométrica de la desaparición de NADH
por oxidación a NAD+, mediante lectura de absorbancia a 340 nm.
2) Ensayos en cultivos celulares, empleando las condiciones de cultivo estandarizadas en nuestro
laboratorio para las células K562 (9):
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2.A. Incubación de las células en presencia de los compuestos de Fe que hayan mostrado más
actividad pro-oxidante en el ensayo previo.
2.B. Adición de compuestos de Al a los ensayos mencionados en 2.A.
2.C. Cultivos celulares en presencia del quelante de Fe, deferroxamina.
Determinación del efecto de los tratamientos descriptos en 2.A, 2.B y 2.C sobre:
a) Crecimiento y viabilidad celular. Estudio mediante la determinación del ensayo colorimétrico de
MTT basado en la habilidad de las células vivas (acción de enzimas mitocondriales) para clivar
una sal de tetrazolio, o bien, recuento celular en cámara de Neubauer de células teñidas con azul
Tripán.
b) Determinación de depósitos de Fe. Reacción de extendidos celulares con ferricianuro de potasio
para formar el complefo ferrocianuro férrico o azul de Prusia y observación al microscopio.
c) Producción de peroxidación lipídica. Se realizará la prueba de sustancias reactivas con el ácido
tiobarbitúrico (TBARS) en lisados celulares. Por descomposición de hidroperóxidos lipídicos se
forman productos de bajo peso molecular, como malonildialdehido, el cual es medido en esta
prueba. Procedimiento: lisis celular bajo condiciones hipotónicas y en presencia de inhibidores
de proteasas, cuantificación de proteínas totales por el método de Lowry y prueba de TBARS. El
malonildialdehido reacciona con el ácido tiobarbitúrico y el producto de reacción, extraído en
solución butanólica, se mide espectrofotométricamente a 535 nm (12).
d) Expresión de la proteína DMT1 que participa en la vía alternativa de captación de Fe, bajo
condiciones de depleción y de exceso del metal, evaluando los niveles de ARNm por RT-PCR.
Se cuenta con los primers adecuados y las condiciones de trabajo han sido establecidas en el
laboratorio.
FACTIBILIDAD
En nuestro laboratorio se realizan, de rutina, cultivos y diferentes ensayos con células K562.
Se cuenta con el material, equipamiento y espacio adecuados para realizar los cultivos celulares
(campana de seguridad biológica, estufa de temperatura y concentración de dióxido de carbono
regulables, centrífuga refrigerada y microscopio invertido, así como disponibilidad para esterilizar
material).
Se cuenta con un espectrofotómetro UV-visible y subsidios para la adquisición del material
descartable y los reactivos necesarios.
En el departamento de Química Biológica se dispone de cicladores térmicos y transiluminador UV.
BIBLIOGRAFÍA
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1.- Aisen P, Listowsky I. Ann Rev Biochem 49:357-393, 1980.
2.- Ponka P. Blood 89:1-25, 1997.
3.- Crichton R, Wilmet S, Legssyer R, Ward R. J Inorg Biochem 91:9-18, 2002.
4.- Pérez G, Vittori D, Pregi N, Garbossa G, Nesse A. Acta Bioquím Clín Latinoamer 39:301-314,
2005.
5.- Exley C (ed.). Aluminium and Alzheimer’s Disease. The science that describes the link.
Amsterdam, Elsevier, 2001.
6.- Nesse A, Garbossa G. En (Exley C, ed.) Aluminium and Alzheimer’s Disease. The science that
describes the link. Amsterdam, Elsevier, 2001, pp. 261-277.
7.- Zatta P, et al. Brain Res Bull 62:15-28, 2003.
8.- Warner G. En (Kirk R et al., eds.) Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical tehnology, vol. 2,
Wiley, New York 1979, pp. 202-209.
9.- Pérez G, Garbossa G, Sassetti B, Di Risio C, Nesse A. J Inorg Biochem 76:105-112, 1999.
10.- Pérez G, Pregi N, Vittori D, Di Risio C, Garbossa G, Nesse A. Bichim Biophys Acta 1745:124130, 2005.
11.- Exley C. Free Radical Biol Med 36:380-387, 2004.
12.- Lushchak V, et al. Int J Biochem Cell Biol 37:1670-1680, 2005.
ORGANIZACIÓN DEL TRABAJO
1) Lectura y discusión de trabajos para conocimiento del tema. Búsqueda bibliográfica para
seleccionar las condiciones de trabajo para la realización del ensayo de TBARS.
2) Adquisición de habilidades para el trabajo general de laboratorio, para microscopía y
desarrollo de PCR.
3) Adaptación de las condiciones metodológicas y puesta a punto del ensayo TBARS.
4) Aprendizaje del trabajo en condiciones de esterilidad y cultivos celulares.
5) Realización de los ensayos descriptos en las Actividades 1 y 2.
6) Análisis de los resultados y redacción del trabajo final.
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