Download PROYECTO 2013 Mongini.

SUBSIDIOS A LA INVESTIGACIÓN EN
BIOQUÍMICA MOLECULAR Y GENÉTICA
AÑO 2013
LUGAR DE TRABAJO: LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR.
CENTRO DE ESTUDIOS FARMACOLÓGICOS Y BOTÁNICOS (CEFYBO. CONICET-UBA).
NOMBRE DEL INVESTIGADOR: CLAUDIA MONGINI
DNI: 14.433.903
CUIT: 27-14.433.903-5
DOMICILIO PARTICULAR: ROSARIO 356 20A
DOMICILIO LABORAL: PARAGUAY 2155 PISO 16
TEL. 4508-3680 INT.108
MAIL:
[email protected]/ [email protected]
Lugar y fecha de nacimiento: Buenos Aires, 16 de mayo de 1961
Cargo de CONICET: Investigador Adjunto.
Director del Laboratorio de Inmunología Molecular.
Centro de estudios Farmacológicos y Botánicos
(CEFYBO. CONICET-UBA).
TEMA: ESTUDIO
COMPARATIVO DE LAS PROPIEDADES INMUNOLÓGICAS DE LOS EXOSOMAS
DERIVADOS DE LAS CÉLULAS TUMORALES OBTENIDAS DEL LÍQUIDO ASCÍTICO O DE CULTIVOS PARA
SER USADOS COMO ANTÍGENOS ACELULARES EN EL DESARROLLO DE UNA VACUNA ANTITUMORAL
ANTECEDENTES DEL CONOCIMIENTO SOBRE EL TEMA DE LA INVESTIGACIÓN
El tratamiento del cáncer en las últimas décadas se ha basado principalmente en la cirugía,
radio y quimioterapia. Aunque los avances en estos campos han sido importantes aún son
insuficientes para erradicar determinados tipos de tumores. Esto es debido a que, después de un
tratamiento de quimioterapia o radioterapia, entre uno y 100 millones de células tumorales
permanecerían viables, siendo éstas las responsables de una recurrencia del cáncer. Dosis
mayores de quimioterapia o radioterapia que eliminen todas estas células causan también, efectos
de toxicidad muy importantes sobre las células normales. Estos tratamientos, si bien son efectivos
cuando la enfermedad es diagnosticada tempranamente, tienen la desventaja de poseer efectos
secundarios que hacen que la calidad de vida de los pacientes disminuya considerablemente. Es
por ello que el diseño de vacunas eficientes contra el cáncer sigue siendo uno de los mayores
desafíos de la ciencia médica ya que ofrecen una alternativa terapéutica efectiva y menos agresiva
para el paciente respecto de las utilizadas actualmente. Las vacunas antitumorales tienen por
objeto, desencadenar, restaurar o aumentar la respuesta inmune dirigida principalmente contra las
células tumorales residuales o las células metastásicas [Pardoll, 1998].
Durante los últimos años, el estudio de las nano vesículas llamadas exosomas ha adquirido
un creciente interés dentro de las ciencias biomédicas. Esto es debido a que participan
activamente ya sea en procesos fisiológicos normales como en condiciones patológicas. Por ser
vesículas normalmente secretadas por todas las células de un organismo poseen la propiedad de
biomimetismo y por su tamaño pequeño (40-100 nm) cobran gran interés en el desarrollo de
biofármacos dentro de la nanomedicina [Hood JL y col 2012]. Asimismo, por la posibilidad de ser
usados como vectores de drogas o como moduladores del sistema inmune poseen un gran
potencial para el desarrollo de biofármacos para el cáncer. Los exosomas son producidas por
diversos tipos celulares, como los reticulocitos, células dendríticas, linfocitos B y T y células
tumorales, entre otras. Se originan a partir de los endosomas tardíos o cuerpos multivesiculares y
son liberados al espacio extracelular por fusión con la membrana plasmática [Thery C y col. 2002 y
2009; Schorey J y col. 2008]. Expresan diversas proteínas, incluyendo antígenos tumorales, las
moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I y proteínas marcadoras de
exosomas como las tetraspaninas y las proteínas de shock térmico, entre otras [Thery C y col.
2002; Schorey J y col. 2008, Wolfers J y col. 2001; Dai S y col.2005]. Los exosomas representan
un sistema de transporte para un gran número de moléculas, incluyendo proteínas, lípidos y ácidos
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nucleicos. Además, son capaces de interactuar con las células blanco induciendo diversas
modificaciones funcionales. Hasta la fecha, se conocen al menos dos mecanismos de interacción:
interacción ligando (expresado en exosomas) / receptor (en la célula), y fusión entre el
exosoma y la célula diana. En el primer caso, se ha demostrado que la exosomas son capaces
de inducir una serie de funciones relacionadas con la interacción ligando / receptor (por ejemplo,
apoptosis mediata por Fas o TRAIL). En el segundo caso, después de la fusión, el exosomas vierte
su contenido (proteínas, ácidos nucleicos) en la célula diana. La enorme cantidad de publicaciones
que se están acumulando referida a los exosomas sugiere que estas nano-vesículas pueden
representar una de las más importantes fuentes de información tanto en la función normal del
organismo como en la patogénesis y el mantenimiento de la enfermedad.
Los exosomas derivados de las células tumorales han sido considerados capaces de
desencadenar una respuesta citotóxica específica con una inmunogenicidad superior a la lograda
con lisados tumorales o antígenos solubles [Wolfers J y col. 2001] debido a la posible
concentración antigénica y la expresión de las proteínas del shock térmico (hsp) cuyos efectos
como adyuvantes las convertiría en vacunas ideales contra el cáncer. Esto ha sido probado en
numerosos estudios preclínicos [Andre F y col. 2002 ; Zitvogel L y col. 1998; Zeelenberg IS y col.
2008] y en protocolos de Fase I en pacientes [Andre F y col. 2004; Escudier B y col. 2005; Morse
M y col. 2005; Dai S y col. 2008].
Se demostró que los exosomas pueden comportarse de diferente forma según su
interacción con el sistema inmune: inhibiendo, activando o induciendo tolerancia sobre el sistema
inmune [Vallhov H y col. 2011]. Sin embargo, los mecanismos fundamentales de la comunicación
intercelular en donde participan los exosomas continúan siendo preguntas por responder para
entender el rol de estas microvesículas in vivo y el potencial de éstas en ensayos clínicos.
En este proyecto se utilizará la línea celular LBC, desarrollada y caracterizada en nuestro
laboratorio, que deriva de un linfoma T murino espontáneo [Mongini C y col 2001; 1995; 1996].
Representa un modelo altamente agresivo en ratones singeneicos inmunocompetentes, la
inoculación de 1x106 células por vía intraperitoneal invade por vía hemática numerosos órganos
entre los que se encuentran órganos linfoides secundarios, estómago, intestinos, hígado y ovarios.
El objetivo general del proyecto en ejecución en nuestro laboratorio es el de desarrollar vacunas
antitumorales utilizando células tumorales irradiadas genéticamente modificadas para expresar
moléculas inmunomoduladoras [Ruybal P., 2008] y exosomas [Herschlik L, 2013] derivados de las
células tumorales que activen la respuesta inmune del huésped para el rechazo de la neoplasia.
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La utilización de exosomas como fuente definida de antígenos tumorales fácilmente obtenibles y
estables para modular el sistema inmunológico es una técnica muy novedosa para el tratamiento
del cáncer. Es por ello
que en este plan nos proponemos llevar a cabo la caracterización
inmunológica de los exosomas derivados de las células tumorales obtenidos de la línea celular
creciendo in vitro y comparar con los obtenidos a partir del tumor creciendo in vivo.
Habiendo determinado, en el marco de los proyectos desarrollados con las alumnas del Instituto
ORT de los años precedentes (2011 y 2012), que los exosomas derivados de las células de la
línea tumoral LBC comparten antígenos propios del tumor con dichas células y que son capaces
inducir una respuesta inmune in vitro e in vivo y sabiendo que el medio en donde crecen las células
tumorales influye en la expresión de culi-cuantitativa de las moléculas en los exosomas; nos
proponemos comparar la expresión de proteínas características de los exosomas (como las HSP y
tetraspaninas) y de antígenos tumorales por los exosomas derivados de las células creciendo en
cultivo respecto de aquellos obtenidos a partir del líquido ascítico producido en un ratón por
inoculación de las células tumorales. Asimismo, estudiaremos la respuesta inmune generada por
la inoculación de los exosomas en ratones normales estudiando los anticuerpos específicos para
los antígenos tumorales inducidos.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Obtener exosomas provenientes de células tumorales LBC
 Cultivo in vitro de las células tumorales LBC
 Obtención de tumores ascíticos por inoculación intraperitoneal de las células del linfoma
LBC
 Obtención de exosomas por centrifugación diferencial y ultracentrifugación
 Cuantificación de las proteínas obtenidas por medio de la técnica de Bradford
 Caracterización de las proteínas marcadoras de los exosomas por citometría de flujo y
Western blot
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2. Realización de planes de inmunización en lotes de ratones inmunocompetentes
utilizando a los exosomas como vacuna anti-tumoral
 Inmunización de ratones BALB/c con los exosomas tumorales obtenidos de ambas
fuentes
 Determinación de anticuerpos específicos en los sueros de los ratones inmunizados por
medio de la técnica de Dot blot
 Estudio de la especificidad de los anticuerpos mediante la técnica de Western blot
(separación de las proteínas tumorales presentes en los extractos de células tumorales y
en los exosomas por medio de geles de polyacrilamida. Transferencia semi-líquida de las
proteínas separadas a una membrana de nitrocelulosa modificada. Incubación de las
proteínas separadas e inmovilizadas en la membrana con los sueros específicos.
Revelado de la reacción con un suero anti-ratón conjugado con la enzima peroxidasa y
utilización de un sustrato quimioluminiscente para detección de las bandas por captura en
un analizador de imágenes).
3. Análisis de los resultados obtenidos en cada caso
4. Búsqueda bibliográfica de los temas a desarrollar
Con el desarrollo de esta investigación esperamos poder caracterizar inmunológicamente los
exosomas derivados de las células tumorales creciendo en cultivo y comparar sus propiedades con
aquellos que provenientes del tumor transplantado en el ratón. De esta forma esperamos aportar
nuevos conocimientos para obtener antígenos acelulares definidos molecularmente para la
producción de vacunas antitumorales.
REFERENCIAS
 Andre F y col. The Lancet 360:295. 2002
 Andre F, Chaput N, Schartz NE, Flament C, y col. J Immunol. 172: 2126, 2004.
 Dai S, Wan T, Wang B, Zhou X, Xiu F, Chen T, Wu Y, Cao X. Clin Cancer Res 11:7554. 2005
 Dai S, Wei D, Wu Z, Zhou X, Wei X, Huang H, Li G. Mol Ther. 16: 782-90. 2008
 Herschlik L, De Toro J; Di Sciullo P, Gravisaco MJ, Vendrell A, Waldner C and Mongini C.
Exosomes derived from a T-cell lymphoma expressing CD24 and HSP90 on the surface induce
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antigen specific T-cell response". Clinical and Experimental Immunology;
aceptado con
modificaciones (marzo 2013).
 Escudier B, Dorval T, Chaput N, André F, col Transl Med 3:10, 2005.
 Hood JL, Wickline SA. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol.4:458-67. 2012
 Mongini C, Ruybal , Gravisaco MJ , Croci M , Sánchez Lockhart M , Waldner C. In vitro Cell. Dev.
Biol, 37. 499. 2001.
 Mongini C, Sanchez Lockhart M, Waldner Cl y col. Br J Cancer 74:258. 1996
 Mongini C, Waldner CL, Alvarez E y col. Scand J Immunol 41:298. 1995
 Morse MA, Garst J, Osada T, Khan S y col. J Transl Med 3: 9. 2005.
 Paglia P, Medina E, Arioli I, Guzman C and Colombo M. Blood, 92: 3172, 1998.
 Pardoll D. Nat Med, 4:525, 1998.
 Ruybal P, Gravisaco MJ, Barcala V, Escalada A y col. Vaccine 26:697-705. 2008
 Schorey JS y Bhatnagar S. Traffic. 9:871. 2008
 Thery C, Zitvogel L, Amigorena S. Nat Rev Immunol 2:569-579. 2002
 Wolfers J, Dossier A, Raposo G, Regnault A, Thery C y col. Nat Med 7:297-303. 2001
 Zitvogel L, Regnault A, Lozier A, Wolfers J, Flament C y col. Nat Med. 4(5):594-600. 1998
 Zeelenberg IS, Ostrowski M, Krumeich S, Bobrie A, y col Cancer Res. 68(4):1228-35. 2008
INFRAESTRUCTURA Y EQUIPAMIENTO DISPONIBLES
El proyecto se llevará a cabo en el Laboratorio de Inmunología Celular y Molecular del Centro de
Estudios Farmacológicos y Botánicos (CEFYBO, CONICET) que funciona en la Facultad de
Medicina (UBA). El grupo dispone de un laboratorio propio de experimentación que cuenta con las
instalaciones y todo el equipamiento básico y específico necesario para el desarrollo del proyecto:
microscopio óptico, microcentrífugas, equipos de corridas electroforéticas y western blot.
El CEFYBO cuenta con un área estéril donde se encuentran los flujos laminares y estufas de
cultivo gaseadas CO2 a 37º C y el siguiente equipamiento: ultracentrífuga, freezer -70ºC,
espectrofotómetro UV, lector de placas de ELISA, contador de centelleo, analizador de imágenes.
El citómetro de flujo BD FACSCalibur y el microscopio electrónico serán facilitados por el Instituto
de Virología y Biotecnología del INTA de Castelar con el que existe un compromiso de
colaboración.
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