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MINISTERIO DE SALUD
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
CENTRO DE INFORMACIÓN Y DOCUMENTACIÓN CIENTÍFICA
VARIANTES GENÉTICAS DE Aedes
aegypti Y SU ASOCIACIÓN CON EL
SEROTIPO DEL VIRUS DENGUE EN
UNA ÁREA ENDÉMICA DEL PERÚ
SERIE INFORMES TÉCNICOS Nº96
BLGO. OMAR ALBERTO CÁCERES REY
BLGO. WALTER LEÓN CUETO
2007
VARIANTES GENÉTICAS DE Aedes aegypti Y SU ASOCIACIÓN CON EL SEROTIPO DEL VIRUS DENGUE EN UNA
ÁREA ENDÉMICA DEL PERÚ
INFORME FINAL
VARIANTES GENÉTICAS DE Aedes aegypti Y SU ASOCIACIÓN
CON EL SEROTIPO DEL VIRUS DENGUE EN UNA ÁREA
ENDÉMICA DEL PERÚ
I.
Autores
Blgo. Omar Alberto Cáceres Rey
Investigador Principal
Laboratorio de Biotecnología y Biología Molecular
Av. Defensores Del Morro Nº 2268 Chorrillos
Teléfono: 4674499 anexo 546
[email protected]
Blgo. Walter León Cueto
Co-Investigador
Laboratorio de Entomología
Av. Defensores del Morro 2268 Chorrillos
Teléfono: 4674499 anexo 548
[email protected]
II.
Resumen
Aedes aegypti es el principal vector de la enfermedad del Dengue. Las
epidemias pueden surgir en cualquier sitio en donde exista el vector y se introduzca el
virus. A esto se suma la falta de una vacuna eficaz disponible, al abandono de los
programas de control y vigilancia del mosquito, al transporte moderno y al rápido
crecimiento de la población. Todo esto ha conllevado a la expansión del virus y su
mosquito vector. Por lo tanto el conocimiento de su variabilidad genética y dispersión
génica llevará a un mejor control de la enfermedad. Objetivo: Identificar mediante la
técnica de AFLP, las variantes genéticas de A. aegypti procedentes de algunas
localidades endémicas del Perú. Materiales y Métodos: Se muestrearon en 9
localidades (Zarumilla, Sullana, Chiclayo, el distrito de El Rimac, Jaén, Tingo María,
Iquitos, Tarapoto, Pucallpa) del Perú y se analizó 5 mosquitos por localidad (n = 45).
El análisis se determinó por AFLP, utilizando tres combinaciones de primers.
Resultados: Mediante AFLP se determinó 111 marcadores, dando como resultado
dos variantes genéticas; la variante Costera y la variante Sierra-Selva. Conclusión:
La primera variante reveló un importante flujo génico (Fst = 0.106) y la segunda, una
limitada dispersión génica del mosquito (Fst = 0.160). AFLP resultó ser una
herramienta muy útil para identificar variantes genéticas; y apropiada cuando no se
cuenta con un número alto de muestras, debido a su alto poder de discriminación.
III.
Introducción
El Dengue es una enfermedad viral transmitida por la picadura del mosquito
Aedes aegypti, hay cuatro serotipos del virus llamados Dengue 1 (DEN-1),
Dengue 2 (DEN-2), Dengue 3 (DEN-3) y Dengue 4 (DEN-4). Actualmente, está
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preocupando al mundo por estar categorizada como reemergente. Las
epidemias pueden surgir en cualquier sitio en donde existan los vectores y se
introduzca el virus, tanto en zonas urbanas como rurales, esto es
principalmente en países ubicados en regiones tropicales y subtropicales
(Gubler y Trent, 1993). Además de la enfermedad febril benigna auto limitante
conocida como Dengue Clásico (DC), existen formas severas de la
enfermedad como el Dengue Hemorrágico (DH) y el Síndrome de Shock por
Dengue (SSD); los cuales comprometen la vida del paciente (Henchal y
Putnak, 1990). A todo esto, se suma la evidencia de que pueden darse
coinfecciones con hasta tres serotipos del virus en un mismo paciente
(Loroño–Pino y Col., 1999); probablemente esto se puede deber a que las
hembras de A. aegypti son capaces de llevar en su interior más de un serotipo
(Cáceres, 2003).
Hay cerca de 500,000 casos de fiebre hemorrágica por dengue/síndrome del
shock por dengue (DHF/DSS) de gravedad cada año que requiere
hospitalización, con las proporciones de caso/fatalidad tan altas (5%), que
dependen de la disponibilidad del tratamiento (WHO, 2002). El reporte global
de DH ha aumentado cinco veces en promedio en los últimos 20 años. A
principios del siglo 21 se ha estimado entre 50 y 100 millones de casos de DC
y varios cientos de miles de casos de DH (Gubler, 2002).
Hasta el año 1999, en el Perú sólo circulaban DEN-1 y DEN-2 americano (no
virulento). Casos de DH no se reportaron sino hasta los años 2001 y 2002,
fecha de la introducción de DEN-2 asiático (virulento), DEN-3 y DEN-4 en
donde se registraron 28815 casos de dengue con 251 casos dengue
hemorrágico (Montoya Y y col., 2003). Recientemente, en el año 2005, surgió
un brote epidémico de DC autóctono en el Distrito de Comas (Lima). La
tipificación molecular determinó que se trataba del genotipo III del serotipo
DEN-3 (Mamani y Col., 2005).
El abandono de los programas de control y vigilancia del mosquito, el
transporte moderno y el rápido crecimiento de la población; ha conllevado a la
expansión del virus y su mosquito vector; haciendo que éste se adapte a
nuevos ambientes. Por lo tanto, el factor humano, ambiental y evolutivo; han
originado poblaciones polimórficas de A. aegypti a nivel genético, que podrían
influenciar su capacidad vectorial para los virus que trasmite. A principios de
los años 70s, las isoenzimas eran usadas extensamente como marcador para
analizar la estructura genética de poblaciones naturales, como el caso de A.
aegypti, donde se encontró una baja diferenciación genética entre poblaciones
del mosquito de todo el mundo (Tabachnick y Powell, 1979).
El Polimorfismo de Longitud de Fragmentos Amplificados (AFLP, del inglés
Amplified Fragment Length Polymorphism), desarrollada por Vos y Col., 1995;
es otra técnica de fingerprinting basado en las técnicas RFLP y PCR que
utiliza el genoma completo del organismo. Utilizada inicialmente para el
análisis de diversidad genética en plantas y bacterias, luego fue utilizada
satisfactoriamente en insectos. Su robustez, alta reproducibilidad, elevado
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poder discriminativo y facilidad de aplicación lo hace una técnica ideal para el
estudio de variabilidad genética de organismos como Aedes aegypti.
El análisis de AFLP ha dado información acerca de la variabilidad y
estructuración poblacional de A. aegypti. Yan y Col. (1999), utilizaron y
compararon los marcadores AFLP y RFLP en poblaciones de A. aegypti en
Trinidad y Tobago. Similarmente, en Phnom Penh, Cambodia, se compararon
tres marcadores moleculares, AFLP, isoenzimas y microsatélites, para
determinar la variabilidad genética del mosquito vector (Paupy y Col., 2004). A
nivel local, en el Noroeste de México, se determinó la diversidad genética de
A. aegypti mediante AFLP y microsatélites, observándose un proceso de
reinvasión (Ravel y Col., 2001); resaltando el gran poder de discriminación y
reproducibilidad de ésta técnica.
En el Perú, estarían circulando dos variantes genéticas de A. aegypti, la
primera pertenece a la zona de la Costa-Norte y la segunda a la del NorOriente (Leiva y Cáceres, 2004). En dicho estudio se analizaron y compararon
el Segundo Espaciador Transcrito Interno (ITS 2) de mosquitos provenientes
de 7 localidades del Perú (Jaén, Tingo María, Iquitos, Lambayeque, el distrito
de El Rimac, Sullana y Zarumilla) y una de Ecuador (Huaquillas). En este
estudio, no se encontraron relación entre las distancias genéticas del mosquito
y las distancias geográficas de las localidades analizadas, existiendo la
posibilidad de que la Cordillera de los Andes esté actuando como una barrera
geográfica.
A pesar que se ha realizado muchos estudios con respecto a la enfermedad
del Dengue, todavía no existe ninguna vacuna disponible y se estima que
demorará de 5 a 10 años diseñar una vacuna eficaz. Pues bien, la única
alternativa es el control del vector. Para mantener efectivo dicho control, es
necesario conocer la genética y el flujo génico que hay entre las poblaciones
del mosquito, y entender como está formada su población, es decir, si es una
población monotípica o si presenta polimorfismo genético. Dicha información
podría permitir la discriminación entre subpoblaciones resistentes a
insecticidas y permitirá analizar la dispersión de estas subpoblaciones.
Además permitirá establecer marcadores moleculares propios de A. aegypti
resistentes o sensibles a insecticidas. También nos daría información acerca
de la diversidad genética del vector y nos permitirá determinar sí la capacidad
vectorial para la transmisión del virus está correlacionada con el polimorfismo
genético
Por lo tanto, en el presente trabajo se identificó mediante AFLP las variantes
genéticas de A. aegypti procedentes de alguna áreas del Perú y se confirmo la
existencia de las variantes genéticas de este vector previamente reportadas.
IV.
Antecedentes
El virus dengue pertenece a la familia Flaviviridae y esta constituido por una
cadena simple de ARN positivo, esta rodeado por una envoltura lipídica, su
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genoma tiene aproximadamente 11 kb de longitud, la cual se traduce a una
poliproteína que da origen a 3 proteínas estructurales y 7 proteínas no
estructurales (Henchal and Putnak, 1990).
Aedes aegypti es un mosquito que pertenece a la familia Culicidae y su ciclo
de vida comprende el huevo, cuatro estadios larvales, un estadio de pupa y el
de adulto. Es principalmente una especie doméstica, cuyas hembras
hematófagas infestan recipientes naturales o artificiales que se encuentran en
casas o cerca de poblados humanos (Nelson, 1986). El abandono de los
programas de control y vigilancia del mosquito, el transporte moderno y el
rápido crecimiento de la población humana ha conllevado a la expansión del
virus y su mosquito vector haciendo que éste se adapte a nuevos ambientes.
La fiebre por dengue es una enfermedad antigua que se ha distribuido
mundialmente en los trópicos durante los siglos XVIII y XIX. La epidemiología
global y la dinámica de transmisión del virus dengue cambiaron drásticamente
en el sureste de Asia durante la segunda guerra mundial. La ruptura y el
cambio en la ecología causada por la guerra tuvo como efecto la expansión
geográfica y el incremento en la densidad de A. aegypti, haciendo que muchos
países en ésta región sean altamente permisibles a la transmisión del virus
(Gubler, 1997).
Después del abandono del exitoso programa de erradicación de Ae. aegypti
en las Americas en 1970, A. aegypti reinvade muchos países de la región. En
los años 80s y 90s, el virus y su mosquito vector continuaron su expansión
geográfica causando procesos de reinvasión y aumentando la emergencia de
DH (Gubler, 2002).
En el Perú, A. aegypti se detectó por primera vez en el año de 1852. Se cree
que el mosquito se introdujo por el lado norte del Perú, a través de la región
vecina de Guayaquil (Ecuador). Luego se fue estableciendo progresivamente a
lo largo de la costa norte y central del Perú (Griffitts, 1934). En 1905, Barton
reportó la presencia de A. aegypti en el puerto del Callao, departamento de
Lima. Estos resultados pusieron en movimiento la primera campaña de control
de A. aegypti en el Perú (Roe, 1924).
Como resultado del programa de control de A. aegypti, en 1958, el Ministerio
Peruano de Salud, bajo la consideración de la Organización Panamericana de
la Salud (PAHO), anunciaron que A. aegypti había sido erradicado del país
(Severo, 1958). Pero en 1984 personal del Ministerio de Salud reportaron la
captura de A. aegypti en el departamento de Loreto, y en 1986, se expandió
hacia los departamentos de San Martín y Huánuco. Más adelante, se reportó
la presencia de A. aegypti en algunas provincias de los departamentos de
Junín, Pasco, Tumbes, Piura, Lambayeque, La Libertad, Amazonas,
Cajamarca y Madre de Dios. En Marzo del 2000, larvas y pupas fueron
colectadas de contenedores de agua en una casa, en el distrito del Rímac
(Lima). Hasta el 2001, A. aegypti ha sido colectado al menos en 15 de los 24
departamentos peruanos (Sevilla y Col., 2001).
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En la actualidad es casi inexistente estudios acerca de variabilidad genética de
este vector en el país, por lo que este trabajo constituye el segundo estudio de
este vector realizado por este mismo grupo de investigación
V.
Objetivos generales y específicos
Objetivo general.
Identificar mediante la técnica molecular AFLP las variantes genéticas de
Aedes aegypti procedentes de algunas localidades del Perú.
Objetivos específicos.
1. Estandarización de la técnica de extracción y purificación de ADN
genómico de A. aegypti.
2. Estandarización de la técnica de AFLP.
3. Identificación y análisis de las variantes genéticas de A. aegypti generados
por el AFLP fingerprinting
4. Establecer la relación entre las poblaciones de A. aegypti analizados en el
presente estudio, mediante la construcción y análisis de un dendograma de
similitud
5. Determinación y análisis de la variabilidad genética y la estructura genética
poblacional (Fst) de la población de A. aegypti mediante el programa
RAPDFST y probar su significancia a través del test estadístico AMOVA
(análisis de varianza molecular)
VI.
Metodología
Material biológico.
Se trabajó con individuos adultos hembras de A. aegypti; los cuales fueron
recolectados de diferentes localidades (con presencia del vector) del Perú:
Zarumilla (Tumbes), Sullana (Piura), Chiclayo (Lambayeque), El Rímac (Lima),
Jaén (Cajamarca), Tingo María (Huánuco), Iquitos (Loreto), Tarapoto (San
Martín) y Pucallpa (Ucayali). De los mosquitos recolectados se escogieron 5
mosquitos por localidad. Por lo tanto, en el presente estudio se analizó una
muestra total de 45 individuos de A. aegypti (n = 45).
Extracción de ADN genómico de A. aegypti
La extracción de ADN genómico se hizo mediante el Kit GenomicPrep TM Cells
and Tissue DNA Isolation (Amersham Pharmacia Biotech Inc). Brevemente,
cada mosquito se colocó en un tubo de 1.5 ml, el cual contenía 100 µl de PBS
1X (pH = 7), luego se adicionó 200 µl de buffer TE (pH = 8), 30 µl SDS 10% y
15 µl proteinasa K (20 mg/ml) y se dejo incubando a 55°C toda la noche.
Después de la incubación, se añadió 3 µl de RNAsa A (10 mg/ml) y se incubó
a 37ºC por 30 minutos, rápidamente se adicionó 200 µl de acetato de amonio
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helado (7.5M) y se centrifugó a 14,000 rpm por 10 minutos. Se extrajo el
sobrenadante y se llevó a un tubo limpio, al cual se le añadió 600 µl de
isopropanol absoluto, para luego centrifugar a 14,000 rpm por 5 minutos. Se
descartó el sobrenadante, sin llevarse el pellet y se lavó con 600 µl etanol
helado (70%). Se centrifugó a 14,000 rpm por 5 minutos y finalmente se
descartó el sobrenadante, se dejó secar a 37º C por 5 minutos y se hidrató con
70 µl de buffer TE (pH = 8). El ADN fue cuantificado para obtener su
concentración, mediante un espectrofotómetro de UV (Spectronic 21D) a la
longitud de onda de 260 nm.
AFLP.
Para el análisis de AFLP se utilizó el kit AFLP® Analysis System I (Invitrogen
Life Technologies), siguiendo las instrucciones del fabricante con algunas
modificaciones. Brevemente, se digirió el ADN genómico con las enzimas de
restricción EcoRI y MseI, luego se añadieron los adaptadores, que se ligaron a
los extremos cohesivos generados por dichas enzimas. Se diluyó la mezcla de
reacción 1:10 con buffer TE. Luego se preamplificó la mezcla diluida
realizando 20 ciclos de PCR usando dos primers (primers E y M) que
contienen un nucleótido selectivo. Nuevamente se diluyó 1:10 los productos
con buffer TE.
Posteriormente, los productos de PCR diluidos fueron sometidos a una
amplificación selectiva, usando 3 combinaciones de primers (EcoRI/ACG y
MseI/CAA, EcoRI/ACG y MseI/CAG, EcoRI/ACG y MseI/CTT); los cuales
contienen 3 nucleótidos selectivos (un PCR para cada combinación de primer).
Los productos se cargaron en un gel de poliacrilamida denaturante al 8% y se
sometió a electroforesis. El gel se tiñó mediante una solución de nitrato de
plata con algunas modificaciones (Bassam, Caetano-Anolles y Gresshoff,
1991). Finalmente, el gel fue escaneado y luego colocado sobre papel filtro 3
MM, para llevarlo al secador de geles 583 Gel Dryer (BioRad) durante 30
minutos a 80ºC.
El PCR preselectivo se llevo a cabo en un termociclador (Amplitron II,
Thermolyne) con 20 ciclos de 94°C por 30 seg, 56°C por 60 seg y 72°C por 60
seg. Mientras que el proceso de PCR selectivo fue de un ciclo a 94° C por 30
seg; 65° C por 30 seg y 72° C por 60 seg. Luego se bajo la temperatura de
alineamiento (0.7ºC) por cada ciclo durante los 12 ciclos siguientes.
Finalmente se realizo 23 ciclos de 94°C por 30 seg; 56°C por 30 seg y 72°C
por 60 seg.
Determinación de las variantes genéticas de A. aegypti
Las bandas presentes en el gel fueron analizadas y procesadas utilizando el
software GeneProfiler versión 4.05 (Scanalytics, Inc., Fairfax, Va.). Solo se
analizaron las bandas polimórficas y que no sean ambiguas, para obtener una
matriz binaria de 0 (ausencia de banda) y 1 (presencia de banda). Luego se
procedió a la construcción de un dendograma utilizando el método de
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agrupamiento UPGMA (unweighted pair-group method with arithmetic
average), mediante el software Treecon versión 1.3b (Van de Peer and De
Wachter, 1994). Esto permitió definir los clusters e identificar las variantes de
la población de A. aegypti. Finalmente se determinó el estadístico Fst (Wright,
1951) mediante el programa RAPDFST (Apostol y Col., 1996), para determinar
el grado de variabilidad de dicha población. Dicho estadístico fue corroborado
por AMOVA (Análisis Molecular de Varianza)
VII.
Resultados
Los ADNs genómicos extraídos (Fig. 1) tuvieron un rango de concentración
entre 45 a 191 ng/ul. Para el proceso de AFLP se utilizó cerca de 300 ng por
muestra.
FIGURA 1. Gel de agarosa (1%) mostrando los ADNs genómicos extraídos
(señalados por la flecha).
En el análisis de AFLP (Fig. 2) se obtuvo un total de 42, 39 y 30 loci por cada
combinación de primer. Es decir; se obtuvo 111 marcadores. Los criterios para
determinar un locus o marcador fueron: 1) Que las bandas del gel estuvieran
en un rango de peso molecular de 0.1 a 1 Kb; 2) Si una misma banda está
presente en todas las muestras analizadas, entonces no se considera
polimórfica. 3) Los geles que mostraron bandas ambiguas no fueron tomadas
en cuenta.
A partir de los 111 marcadores se procedió a realizar una matriz de 1 y 0,
indicando presencia o ausencia de la banda respectivamente. Se obtuvieron
varios “score” por cada peso molecular obtenido.
Con la matriz obtenida se obtuvo un dendrograma (Fig. 3) utilizando el método
de agrupamiento UPGMA
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Score
0
0
1
1
0
1
1
0
1
0
1
0
FIGURA 2. Diagrama arrojado por el software GENEPROFILER de un gel teñido con
plata y escaneado. La flecha marca un marcador polimórfico, encima de las bandas el
score generado.
A partir del dendograma generado se definieron los clusters de la población de
A. aegypti, dando como resultado dos grandes clusters bien definidos: el
cluster Costero, el cual involucra principalmente especimenes de A. aegypti
del departamento de Tumbes, Piura, Lambayeque y Lima; y el cluster SierraSelva, que involucra especimenes de Huancayo, Loreto, San Martín, Ucayali,
Cajamarca, Lambayeque y Lima.
Un individuo denominado Ucay05 (de Ucayali) estuvo fuera de todos los
patrones y se le consideró como un outgroup. El dendrograma fue sometido a
100 bootstrap, es decir cada cluster del dendrograma fue evaluado 100 veces,
esto con la finalidad de analizar la consistencia a las ramas.
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VARIANTE
SIERRASELVA
Fst: 0.160
VARIANTE
COSTERA
Fst: 0.106
FIGURA 3. Dendrograma mostrando valores Boostrap (>70) y las variantes genéticas
con sus respectivos Fst.
Por otra parte, el estadístico Fst total (diferencia genética) fue de 0.113, para
el cluster Costero fue de 0.106 y para el cluster Sierra-Selva fue de 0.160. El
AMOVA dio como resultado un valor de 14.99% (p<0.001) respaldando el Fst.
VIII.
Discusión
La capacidad del mosquito a infectarse esta asociada a la picadura y su
capacidad genética tiene una gran importancia epidemiológica para explicar
algunas diferencias en los patrones de la distribución geográfica de las
poblaciones. Afortunadamente la aparición de los marcadores moleculares
está ayudando a eliminar tanto los inconvenientes de una selección basada en
el análisis exclusivo del fenotipo, como la identificación de especies y
variedades de una forma más rigurosa y repetitiva.
Leiva y Cáceres (2004) encontraron las mismas variantes, pero no pudieron
determinar la variabilidad genética dentro de ellas puesto que la técnica
utilizada no permitió (por su naturaleza) un análisis más exhaustivo de los
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individuos. En el presente trabajo se utilizó la técnica de AFLP como
herramienta para identificar las posibles variables genéticas de A. aegypti por
ser una herramienta mucho mas fina y sensible comparada con el SSCP
utilizada en un trabajo anterior (Leiva y Cáceres, 2004)
Se determino la variabilidad genética de A. aegypti dando como resultado dos
variantes: la variante Costera y la variante Sierra-Selva. Dichas variantes
muestran a su vez diferencias a nivel genético-estructural; ya que la variante
Costera (Fst=0.106) muestra que dichas zonas están sujetas a un importante
flujo génico y que por lo tanto no habría diferencia entre los especimenes de
dichas localidades (no hay subclusters), esto se puede deber al gran tráfico
comercial que hay entre esas zonas.
Por otra parte, la variante Sierra-Selva (Fst=0.160) muestra subvariantes
diferenciadas por ejemplo Ucayali y Huanuco, probablemente por alguna
barrera geográfica, la cual limita la dispersión génica del mosquito. La
variabilidad genética depende en gran parte a la cantidad de comercio y
transporte humano. Usando marcadores microsatélites Huber y Col., en el año
2004, estimaron la diferencia génica de A. aegypti en Cambodia, Tailandia y
en el Sur de Vietnam. Dichos análisis (Fst = 0.117) han sugerido una
migración pasiva del mosquito vector a través de la ayuda humana la cual
explica los patrones de diferenciación. El transporte humano de huevos, larvas
y adultos en contenedores a través de rutas de comerciales podría originar
poblaciones geográficamente distantes pero genéticamente similares.
El análisis de AFLP ha dado información acerca de la variabilidad y
estructuración poblacional de A. aegypti. En Phnom Penh, Cambodia, se
compararon tres marcadores moleculares, AFLP, microsatélites y isoenzimas,
para determinar la variabilidad genética del mosquito vector (Paupy y Col.,
2004), dando como resultado Fst = 0.122, 0.04 y 0.02, respectivamente.
Demostrando
que
AFLP
es
altamente
discriminativo
entre
e
intrapoblacionalmente. También se puede usar a nivel local, como en el
Noroeste de México, donde se determinó la diversidad genética de Ae.
aegypti mediante AFLP y microsatélites, observándose un proceso de
reinvasión (Ravel y Col., 2001).
Algunos autores por el contrario han determinado que AFLP no es adecuado
para estudios de estructura poblacional, Yan y Col. (1999), determinaron que
AFLP no es una buena herramienta para variabilidad genética
(heterocigosidad = 0.34) al compararlos con RFLP (heterocigosidad = 0.45).
Sin embargo en la actualidad la técnica ha probado ser poderosa sin utilizar
muchas muestras
La capacidad vectorial puede expresarse de manera diferente entre cepas de
mosquitos o entre especies cercanamente relacionadas, ya que se sabe que
dicha capacidad se determina genéticamente en poblaciones diferentes. Esta
característica hace que A. aegypti sea una especie compleja en el sentido de
que presenta variaciones morfológicas, fisiológicas y de conducta mucho
mayores que la mayoría de otros insectos (Tabachnick y Powell, 1979). Esto
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sugiere que en ausencia de selección local, los genes involucrados en la
susceptibilidad del Dengue o en la resistencia a insecticidas podrían
permanecer uniformes en frecuencia génica.
Por tanto, no se ha encontrado asociación entre las variantes genéticas de
Aedes aegypti analizados y el serotipo de virus Dengue esto significa que la
capacidad vectorial es la misma entre las dos variantes o esta característica
no se ve afectada al momento de la segregación de las poblaciones.
Finalmente, AFLP resultó ser una herramienta muy útil para identificar
variantes genéticas, y apropiada cuando no se cuenta con un número alto de
muestras; ya que su alto poder discriminatorio (multimarcador) lo hace muy
efectivo en estas situaciones. Según nuestros resultados en Lima están
circulando A. aegypti de las dos variantes y esto es congruente con elevado
comercio que sufre la capital donde recibe productos provenientes de la costa,
sierra y selva por tanto es lógico suponer que es posible encontrar las dos
variantes en Lima.
IX.
Conclusiones






X.
Se determinaron dos variantes genéticas de Aedes aegypti en el Perú:
Variante costera y Variante Sierra-Selva
Las poblaciones de la variante costera presenta un elevado flujo
genético por tanto no existirían diferencias entre las poblaciones de los
diferentes departamentos costeros
Las poblaciones de la variante sierra-selva presentarían diferencias
entre las poblaciones de los departamentos analizados debido al poco
flujo génico generado por barreras geográficas o escaso comercio
entre ellas. Dichas diferencias se observan a nivel genotípico que
podrían hacerse evidentes en el fenotipo con el paso del tiempo
no se ha encontrado asociación entre las variantes genéticas de
Aedes aegypti analizados y el serotipo de virus Dengue
La técnica de AFLP ha demostrado ser muy sensible, poderosa y
reproducible para estudios de variabilidad genética donde la
disponibilidad de muestras es una limitante
En Lima circulan las dos variantes genéticas producto del elevado
comercio que existe entre la ciudad y las regiones del Peru.
Recomendaciones
Se recomienda analizar individuos de Aedes aegypti de los departamentos
faltantes donde se encuentra el vector para tener un panorama completo de la
variabilidad genética de este vector
Variantes genéticas de Aedes aegypti y su asociación con el serotipo del virus dengue en una
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ÁREA ENDÉMICA DEL PERÚ
XI.
Referencias Bibliograficas
1. Apostol, BL, Black, WC, Reiter, P and Miller, BR. 1996. Population genetics
with RAPD-PCR markers: the breeding structure of Aedes aegypti in Puerto
Rico. Heredity 76:325-34.
2. Bassam BJ, Caetano-Anolles G, Gresshoff PM. Fast and sensitive silver
staining of DNA in polyacrylamide gels. Anal Biochem 1991; 196(1): 80-83.
3. Cáceres, O. 2003. Detección rápida de los serotipos del virus dengue en el
mosquito Aedes aegypti. Rev Peru Med Exp Salud Pública 20(3):156-8.
4. Gubler, DJ and Trent, DW. 1993. Emergence of epidemic dengue/dengue
hemorrhagic fever as a public health problem in the Americas. Infect Agents
Dis 2(6):383-93.
5. Gubler, DJ. 2002. Epidemic dengue/dengue hemorrhagic fever as a public
health, social and economic problem in the 21st century. Trends Microbiol
10(2):100-03.
6. Henchal, EA and Putnak, JR. 1990. The dengue viruses. Clin Microbiol Rev
3(4):376-96.
7. Leiva, NR y Cáceres, O. 2004. Variabilidad genética de Aedes aegypti en
algunas áreas del Perú usando Single Stranded Conformational Polymorphism
(SSCP). Rev Peru Med Exp Salud Pública 21(3):157-66.
8. Loroño-Pino, MA, Cropp, CB, Farfan, JA, Vorndam, AV, Rodriguez-Angulo,
EM, Rosado-Paredes, EP, Flores-Flores, LF, Beaty, BJ and Gubler, DJ. 1999.
Common occurrence of concurrent infections by multiple dengue virus
serotypes. Am J Trop Med Hyg 61:725-30.
9. Mamani, E, Cáceres, O, García, MP, Gutiérrez, V, Cabezas, C y Harris, E.
2005. Tipificación molecular del virus dengue 3 durante el brote epidémico
de dengue clásico en Lima, Perú, 2005. Rev Peru Med Exp Salud
Pública 22(3):161-64.
10. Pan American Health Organization (PAHO). 2002. Number of Reported Cases
of Dengue & Dengue Hemorrhagic Fever (DHF), Region of the Americas (by
country and subregion). Source: Country reports to PAHO of data originating
from the respective Ministries of Health; regional data compiled by PAHO from
said reports.
11. Paupy, C, Orsoni, A, Mousson, L and Huber, K. 2004. Comparisons of
Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP), Microsatellite, and
Isoenzyme Markers: Population Genetics of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae)
from Phnom Penh (Cambodia). J Med Entomol 41(4):664-71.
12. Ravel, S, Monteny, N, Velasco-Olmos, D, Escalante-Verdugo, J and Cuny, G.
2001. A preliminary study of the population genetics of Aedes aegypti
(Diptera: Culicidae) from Mexico using microsatellite and AFLP markers.
Acta Trop 78:241-50.
Variantes genéticas de Aedes aegypti y su asociación con el serotipo del virus dengue en una
área endémica del Perú
Blgo. Omar Cáceres Rey
11/06/2007
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VARIANTES GENÉTICAS DE Aedes aegypti Y SU ASOCIACIÓN CON EL SEROTIPO DEL VIRUS DENGUE EN UNA
ÁREA ENDÉMICA DEL PERÚ
13. Tabachnick, WJ and Powell JR. 1979. A world-wide survey of genetic variation
in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Genet Res 34:215-29.
14. Van de Peer, Y and De Wachter, Y. 1994. TREECON for Windows: a software
package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft
Windows environment. Compu. Applic Biosci 10:569-70.
15. Vos, P, Hogers, R, Bleeker, M, Reijans, M, Van De Lee, T, Hornes, M, Frijters,
A, Pot, J, Peleman, J, Kuiper, M and Zabeau, M. 1995. AFLP: a new technique
for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res 23:4407-14.
16. World Health Organization (WHO). 2002. Fact sheet: dengue and dengue
haemorrhagic fever. World Health Organization, Geneva.
17. Yan, G, Romero-Severson, J, Walton, M, Chadee, DD and Severson, DW.
1999. Population genetics of the yellow fever mosquito in Trinidad:
comparisons of amplified fragment length polymorphism (AFLP) and restriction
fragment length polymorphism (RFLP) markers. Mol Ecol 8:951-63.
Variantes genéticas de Aedes aegypti y su asociación con el serotipo del virus dengue en una
área endémica del Perú
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11/06/2007
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