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ASIGNATURA BIOTECNOLOGIA
PROGRAMA DE TRABAJOS PRACTICOS
Práctico Nº 1: Laboratorio. Preparación de materiales. Limpieza, desinfección,
esterilización
Práctico Nº 2: Uso de la ultrasonografia. Equipos y accesorios
Práctico Nº 3: Lavado uterino ( Flushing ). Materiales y métodos.
Práctico Nº 4: Extracción, evaluación y congelación del semen bovino.
Práctico Nº 5: Extracción, evaluación y congelación del semen equino.
Práctico Nº 6: Ultrasonografia y Transferencia de Embriones en Bovinos.
Práctico Nº 7: Ultrasonografía y Transferencia de Embriones en Equinos.
Práctico Nº 8: FIV. Aspiración de ovocitos en ovarios provenientes de
mataderos.
PRACTICO Nº 1: Laboratorio. Preparación de materiales. Limpieza,
desinfección, esterilización

Que al alumno logre conocer los conceptos básicos de la limpieza del
material del laboratorio.

Asepsia de distintos materiales, gomas, plásticos, vidrios, etc.

Medios de asepsia, químicos, físicos .
Materiales auxiliares.
Tiza, pizarron, proyector de multimedias, diapositivas.
Materiales.
Autoclave, estufa, UltraVioleta, Gas,
Actividad del alumno.
El docente explicará al alumno los distinto conceptos de asepsia, desinfección,
esterilización que se usan corrientemente para mantener los laboratorios limpios
la forma en que los distintos materiales que de acuerdo a su composición reciben
el tratamiento adecuado. Plásticos, vidrios, latex, gomas, toallas etc..
Contenido.
1. Introducción
2. Indicaciones.
3. Contraindicaciones.
4. Principios básicos.
5. Equipos.
6.
Práctico Nº 2: Uso de la ultrasonografia. Equipos y accesorios
Objetivos:
Que el alumno logre:

Conocer las distintas partes que de los equipos y sus distintos accesorios.

Familiarizarse con la técnica de la ultrasonografía, sobre fantomas y organos
post morten.

Reconocer los órganos genitales y todos aquellos en los que se pueda aplicar
dicha técnica en animales en vivo.
Materiales auxiliares.
Tizas, pizarron, proyector de multimedia, diapositvas.
Materiales.
Ecógrafo, impresora, gel, guantes, uteros, ovarios.
Actividad del alumno
El docente mostrará los equipos y su modo de uso de tal manera que el alumno
trabajando en las mesadas adquiera las habilidades que necesitará cuando trabaje en
animales en vivo. El alumno deberá adquirir la práctica de poder manejar el
transductor en las distintas posiciones que le den una mejor vista del órgano en
cuestión, la práctica con los órganos sobre las mesadas o en baldes con agua
semejan al animal en vivo.
Contenido
1. Introducción.
2. Materiales.
3. Métodos.
4. Reconocimientos de órganos genitales.
1.- Introducción.
Adquirir destreza con el uso del ecógrafo es suma importancia para poder
determinar el momento del ciclo sexual, ovulación, gestación, sexado y patologías
ováricas y uterinas
2.-Materiales.
Ecógrafos Aloka 210 Maquina Impresora Sony. Gel y guantes. Uteros y ovarios.
Mesadas, baldes con agua.
3.- Métodos.
Luego de explicar el funcionamiento del ecógrafo y su preparación se abordará a su
uso sobre los órganos en cuestión.
Práctico Nº 3: Lavado uterino ( Flushing ). Materiales y métodos.
1) EXTRACCIÓN DE LOS EMBRIONES DEL ÚTERO. FLUSHING.
El lavaje de arrastre que se realiza en el útero para extraer los embriones se
denomina Flushing. Consiste en colocar distintas cantidades de líquido y
retirarlo, logrando de esta forma arrastrar los embriones que se encuentran en
él.
Para realizarlo nos valemos de una sonda Foley de dos vías, similar a la sonda
vesical humana pero un poco más larga. Este tipo de sondas tienen dos vías,
una de ellas para introducir aire que infla el balón que tiene en un extremo, y
la otra para introducir y evacuar el líquido que arrastrará los embriones.
En el mercado hay varias sondas disponibles siendo las mejores las Rusch®,
de origen alemán, que se caracterizan por poseer una punta metálica que
facilita la penetración, y por otro lado tiene mayor vida útil que las demás.
En un extremo tiene el balón inflable y dos o tres orificios de salida y entrada
para el medio. En el otro extremo presenta una válvula para inflar el balón que
tiene un trayecto separado del principal. También se encuentra el orificio de
entrada con una rosca para fijar el estilete.
El material necesario es el siguiente:
Medio de lavaje, PBS con Suero fetal al 20% , 1 litro.
Sonda Foley o Rusch® punta metálica.
Estilete metálico.
Mangueras plásticas con sus clips.
Probeta graduada de un litro.
Filtro Emncon®, con manguera y clips.
Guantes.
Lubricante.
Jeringas: 2 de 60 cc, 1 de 20 cc, 2 de 10 cc.
Xilocaína al 2 %.
Cuerda para atar la cola.
Agujas.Alcohol.Papel.Tijera.PGF2α
OPERACIONES CON LA DONANTE EN
LA MANGA
Operador 1
Operador
2
Palpación rectal.
Levanta la
cola.
Comprobación de Cuerpos lúteos.
Colocación
de la epidural
baja.
Evacuación de materia fecal.
Atado de la
cola.
Apertura de la
vulva.
Colacación de sonda en el útero.
Desenrosca y
retira el
estilete.
Infla el balón.
Coloca las
mangueras
(gravedad) o
carga las
jeringas con
medio.
Toma y eleva la punta del cuerno.
Comienzo del
flushing.
Da las indicaciones en caso de lavar con
Trae la
jeringas; en caso de lavar por gravedad el
jeringa con
mismo puede manejar los clips abriéndolos y medio y la
cerrándolos.
coloca en la
sonda,
introduciendo
el medio y
retirándolo,
siguiendo las
indicaciones
del Operador
1.
Atiende el
filtro en todo
momento.
Como se describe en el cuadro anterior, una vez ubicada la donante en la
manga se procede a realizar un tacto rectal, en el que se verifican los cuerpos
lúteos presentes. Este dato se anota en la planilla correspondiente, y su
presencia justifica el lavaje del cuerno indicado.
En segundo término se realiza una anestesia epidural baja, entre la 2da y 3ra
vértebra coccígea con Xilocaína al 2%. En forma práctica, la jeringa se carga
con 10 cc pero sólo se administran 3 a 5 cc inicialmente, y a medida que sea
necesario se va agregando un poco más.
GRAFICO DE EPIDURAL BAJA
Seguidamente se procede a evacuar la materia fecal del recto, se higieniza
toda la zona perivulvar, se seca y rocía con alcohol. La cola se ata con una
soga fina y se la fija al cuello del animal. Esta medida se toma como
precaución por la posibilidad de que el animal se asuste y escape, para evitar
que se lastime parte de la cola.
Una vez terminadas estas maniobras ya tenemos lista a la donante para
realizar el flushing.
Para colocar la sonda en el útero necesitamos darle rigidez y se utiliza para ese
fin un estilete metálico. Antes de colocarlo dentro de la sonda se hace circular
medio por el interior de la sonda y a lo largo del estilete, para que en el
momento que tengamos que retirarlo salga sin arrastrar la sonda hacia atrás,
inconveniente este que desubica la sonda. Si esto llegase a ocurrir, hay que
volver a repetir la operación de colocación.
Los estiletes tienen dos extremos. En uno de ellos presentan una rosca para
fijar la sonda, y el otro, el cual va dirigiendo la penetración de la misma , es
romo para evitar su ruptura.
Los estiletes son más largos que la sonda, y al colocarlos dentro de la misma
deben estirarla para que tome firmeza y adelgace su diámetro. De esta forma
puede penetrar con mayor facilidad a través del cervix y del cuerno
correspondiente.
Para la introducción de la sonda, se realiza la apertura de la vulva por un
ayudante procediendo de la misma manera que en una inseminación artificial.
Una vez que la punta de la sonda hace contacto con el cervix debemos
penetrar en él, siendo esta maniobra algo dificultosa, ya que el cervix presenta,
además de los inconvenientes anatómicos normales del mismo, un cierre y
tapón mucoso propio del diestro (día 7). Hay casos en que por ningún motivo
se puede atravesar el cervix completamente; debe entonces recurrirse a un
dilatador, el cual es similar al estilete metálico pero presenta un
engrosamiento de forma cónica muy suave.
Una vez que la sonda pasó a través del cervix debemos dirigirnos hacia uno de
los cuernos, siendo aconsejable elegir el correspondiente al ovario que
presente mayor cantidad de cuerpos lúteos, y en el caso de que posean similar
cantidad, debemos elegir el cuerno más chico. Con esto último nos
aseguramos de lavar en primer lugar el cuerno más importante (en número de
cuerpos lúteos) o el más difícil, ya que nunca se sabe si el lavaje se puede
complicar por algún motivo. Algunos ejemplos de estos imprevistos son la
indocilidad del animal, falla en la anestesia, cansancio del operador o ruptura
del útero.
El punto de colocación del balón es el momento más crítico, ya que el cuerpo
del útero es muy frágil al igual que las paredes de los cuernos, y al avanzar
debemos desenrollarlos muy suavemente. Una vez que logramos ubicar el
extremo del cuerno, soltamos el amarre de la sonda al estilete e insuflamos
para inflar el balón y así fijar la sonda.
El balón se infla por una válvula que presenta la sonda en el extremo que
quedará en el exterior; el volumen de aire a utilizar varía entre 5 a 7 cc,
dependiendo de la posición en que se coloca el balón y del tamaño del cuerno
uterino. Una vez completada esta maniobra se retira el estilete.
El flushing se puede realizar por gravedad o con jeringa. En el primer caso se
le adosan a la sonda foley una manguera de entrada y una de salida unidas por
un tubo en Y o en T, teniendo cada manguera un clip que permite su cierre o
apertura.
El medio para lavado del útero se coloca a una determinada altura, unido a la
manguera de entrada. La manguera de salida presenta un filtro con una malla
que detiene los embriones, y éste filtro se une mediante un tubo a un clip para
abrir y cerrar oportunamente. Este tubo desemboca en una probeta graduada
de un litro, que nos permite estimar la cantidad de medio recuperado. El filtro
nunca debe quedar sin medio.
El lavaje propiamente dicho se realiza por dos operadores. Uno de ellos es el
encargado de colocar la sonda dentro del útero y dirige el flushing. El segundo
operador infla el balón, retira el estilete, atiende la entrada y salida del medio
en el útero y, fundamentalmente, debe prestar la máxima atención al filtro.
Con la apertura del clip de entrada con el clip de salida cerrado iniciamos el
lavaje. En la primera colocación del medio al útero es conveniente emplear
poco líquido, aproximadamente 30 cc según el tamaño del cuerno, y
posicionar del balón en la punta del mismo, para luego ir de a poco
incrementado el volumen de medio. Una vez que el líquido entró
inmediatamente cerramos el clip de entrada y abrimos el de salida. Esta
operación es clave, ya que esta primera entrada de medio al útero puede
desgarrarlo, en casos de exceso de volumen, y esto provocará una lesión del
endometrio que determinará que los embriones difícilmente puedan
recuperarse.
El objetivo final del flushing es remover los embriones adheridos a la mucosa
endometrial y arrastrarlos con el líquido del lavaje.
Terminada esta operación, el filtro se traslada al laboratorio, donde se vuelca
su contenido en una Placa de Petri. Seguidamente, con jeringa de 10 cc y
aguja se lava el fondo y paredes del filtro, haciendo que el líquido caiga sobre
otra Placa de Petri. Si es necesario se repite la operación varias veces.
De esta manera se observarán en el microscopio el flushing Placa 1, Placa 2 y
Placa 3 de la vaca 556 (por ejemplo), en caso de usar un filtro para cada
cuerno tendremos la misma leyenda anterior, pero aclarando el cuerno al que
corresponde cada placa.
En caso de no contar con un filtro se utiliza una probeta graduada de un litro,
y el medio que se va recuperando se vuelca en ella. Los embriones decantarán,
y transcurridos 20 minutos se retitra el sobrenadante y el líquido del fondo de
la probeta se coloca en una Placa de Petri. Se toma la precaución de lavar el
fondo de la probeta dos veces y volcar el contenido en otra placa; así,
tendremos para revisar en el microscopio Placas 1, 2 y 3.
Los medios que se usan para el flushing del útero son bufferados con el
agregado de suero fetal al 1 o 2%, siendo el más usado el PBS. En años
anterios se comercializaba en dos sobres separados y requería de una
reconsitución con sumo cuidado, ya que muchas veces precipitaban y también
se necesitaba agua de buena calidad.
En la actualidad existen en sachets de 4 litros y son productos importados.
Una buena alternativa es la Solución de Ringer empleada en hidratación, con
el agregado de suero fetal al 1 o 2 % . Es un excelente medio para los
embriones y de muy bajo costo.
También existen laboratorios que preparan medios de lavaje y cultivo como
son el OCM y el 50x.
Incluir gráficos de lavajes/sondas en útero!
Práctico Nº 4: Extracción, evaluación y congelación del semen bovino.
Práctico Nº 5: Extracción, evaluación y congelación del semen equino.
Práctico Nº 6: Ultrasonografia y Transferencia de Embriones en Bovinos.
Práctico Nº 7: Ultrasonografía y Transferencia de Embriones en Equinos.
Recuperación embrionaria
Los embriones equinos son selectivamente transportados a través del oviducto
hacia el útero entre los día 5-½ a 6 post-ovulación [14], estando en estadios de
desarrollo de mórula compacta (Fig. 1) a blastocito temprano (Fig. 2). después
de entrar al lumen uterino, el tamaño del embrión crece exageradamente
(Tabla 1) hasta blastocito expandido (Fig. 3). Aunque los embriones pueden
ser recuperados entre los días 6 y 9 después de la ovulación (Tabla 2), los días
óptimos son el séptimo o el octavo. La principal indicación para recuperar
embriones en el día 6 es para realizar el congelamiento de dichos embriones
[1]. Los embriones no son recuperados en el día 9 porque el porcentaje de
transferencia exitosa es generalmente más bajo que para los embriones
recuperados en los días 7 u 8 [1].
Figura 1. Mórula compacta equina. El embrión consiste en una
masa compacta de blastómeras, con una zona pelúcida
prominente. Los contornos de blastómeras individuales pueden observarse en
la periferia del embrión (flecha). El tamaño del embrión es aproximadamente
220 mm (barra = 100mm). - Para ver una magnificación oprima la figura -
Figura 2. blastocito temprano equino. Comenzó la formación
de fluido que llena la cavidad del blastocele y la zona pelúcida
se está adelgazando. El tamaño del embrión es aproximadamente 290 mm
(barra= 100 mm). - Para ver una magnificación oprima la figura -
Tabla 1. Diámetro de los embriones equinos recuperados del lumen
uterino.*
Diámetro Embrionario (mm)
Días Posovulación
Número de
Embriones
Promedio
Rango
6
121
0.208
0.132 0.756
7
144
0.406
0.136 1.460
8
142
1.132
0.120 3.980
9
41
2.220
0.730 4.520
*Adaptado de [20]
Figura 3. blastocito equino expandido. La cavidad del
blastocele está totalmente formada y el macizo celular interno,
el futuro embrión-feto, puede ser diferenciado de la capa trofoblástica externa
(futura placenta). La zona pelúcida está siendo reemplazada por una delgada
cápsula. El tamaño del embrión es aproximadamente 560 mm (barra = 100
mm). - Para ver una magnificación oprima la figura -
Tabla 2. Efecto del día del lavado en la tasa de recuperación
embrionaria.*
Referencia
Día pos-ovulación
6 (%)
7 (%)
8 (%)
9 (%)
21/32 (66)
68/90 (76)
50/61 (82)
----
3/13 (23)
15/22 (68)
4/8 (50)
----
Squires et al., [23]
86/137 (63)
73/96 (76)
218/293 (74)
43/53
(81)
Meira et al., [24]
70/127 (55)
23/41 (56)
----
----
----
26/45 (58)
31/47 (66)
----
Bowen et al., [26]
12/23 (52)
----
25/31 (81)
----
Fleury y Alvarenga
[18]
----
106/215
(49)
388/669 (58)
18/33
(55)
192/332
(58)
311/509
(61)
716/1109
(65)
61/86
(71)
Luliano et al., [21]
Castleberry et al., [22]
Wade y Gallagher [25]
Total
*Adaptada de [2]
La recolección embrionaria es realizada por lavado uterino transcervical (Fig.
4). Después de colocar a la yegua en el brete, la zona del periné es lavada
usando detergente suave, bien enjuagada con agua limpia y secada. El
operador se coloca un guante de plástico estéril en el brazo y gel lubricante
estéril, luego introduce el catéter (o la sonda) estéril, que cuenta con un balón
en la vagina. El autor utiliza un catéter de silicona de 80 cm con un diámetro
interno de 8 mm (Escala Francesa 33; Fig. 5); también están disponibles otros
catéteres de lavado. Después de meter el catéter en la vagina éste es colocado
a través del cérvix en el cuerpo uterino, el balón es insuflado con 80 cc de aire
o solución salina estéril y luego se tracciona hacia atrás contra el orificio
cervical interno para prevenir la pérdida de líquido. Una vez colocado el
catéter, el útero es lavado tres a cuatro veces con solución salina amortiguada
con fosfatos puro o modificado (DPBS) previamente entibiado (30 - 35º C)
conteniendo 1% (v/v) de suero fetal bovino, penicilina (100 unidades/ml) y
estreptomicina (100 mg/ml; Fig. 6a ). El útero es llenado con 1 a 2 litros de
DPBS en cada lavado (4 a 8 litros son usados durante todo el proceso de
recolección). Después de llenado el útero se le permite al líquido salir y pasar
a través de un filtro para embriones de 0.75m (Fig. 7). Es importante que el
filtro de embriones no rebase o quede sin líquido; los filtros son ahora
diseñados para prevenir ambos problemas. El líquido que pasa por el filtro es
recolectado para evaluar cuanto se recuperó. Después del primer lavado el
útero es masajeado a través del recto durante los subsiguientes lavados, y esto
puede ayudar a que el embrión quede suspendido en el medio y además
aumentar la recuperación total del líquido. La mayoría (> 90%) del líquido de
lavado debería ser recuperado y estar libre de restos celulares o de sangre. La
recuperación de líquido de lavado opaco indica que la yegua tiene un proceso
de endometritis activa en el momento del lavado, y necesitará una evaluación
diagnóstica futura. La presencia de sangre es asociada con un masajeo
vigoroso del útero y o la manipulación del catéter.
Figura 4. Esquema del procedimiento de recuperación
embrionaria. De Aguilar y Woods con autorización [2]. - Para
ver una magnificación oprima la figura -
Figura 5. Catéter con balón para el lavado. - Para ver una
magnificación oprima la figura -
Figura 6a. Medio de lavado: solución salina amortiguada con
fostatos Dulbecco. El medio puede ser adquirido
comercialmente en forma líquida (a) o en un kit conteniendo los componentes
sólidos que requieren la reconstitución previa a su uso (b). - Para ver una
magnificación oprima la figura -
Figura 6b. Medio de lavado en baño de agua, previo a ser
utilizado. - Para ver una magnificación oprima la figura -
Figura 7. Filtro de recolección embrionaria. Otro tipo de filtro
puede también ser adquirido. - Para ver una magnificación
oprima la figura -
Una vez finalizado el lavado el contenido del filtro es vaciado en una caja de
Petri con cuadrícula para la búsqueda (Fig. 8) y enjuagado con DPBS (Fig. 9).
El líquido recuperado es revisado utilizando un microscópio estereoscópico a
un aumento de 15x (Fig. 10). Los embriones de 8 días usualmente se ven a
simple vista. Cuando un embrión es identificado, es lavado como mínimo por
3 pasajes sucesivos en gotas de un mililitro de medio DPBS con 10% de suero
fetal bovino (esterilizado por pasaje por filtro de 0.22 m); después del lavado
el embrión se coloca en el mismo medio en una placa de Petri de 35 x 10 mm.
El embrión es evaluado a mayor aumento (40 - 80x) y calificado usando la
escala de 1 (excelente) a 4 (pobre) [15]. Los embriones pueden ser tomados
utilizando pajuelas de 0,25 o 0,5 cc (Fig. 11), pipetas capilares de vidrio de 25
ml, o cualquier otro instrumento adosado a una jeringa. Cada vez que se tome
un embrión con un tipo de estos capilares o pajuelas, la columna de líquido
que contiene el embrión debe ir rodeada de una burbuja de aire en cada
extremo y luego una columna de medio líquido sólo (Fig. 12). Esto previene
accidentes como el de absorber la columna de medio al tocar con el extremo
de la pajuela algún material absorbente. El proceso de levantar y depositar un
embrión debería ser realizado bajo lupa estereoscópica
Flushing
El lavado del útero de la donante para retirar el ó los embriones contenidos en
el, recibe el nombre de “flushing” y consiste en introducir medio de lavaje por
gravedad y se retira por sifonaje.
Dependiendo del embrión que uno quiere retirar variara el día del flushing, los
embriones del día 7 son los mas recomendados para la transferencia de
embriones frescos, en cambio si uno quiere congelar o hacer un división es
preferible el día 6.
Se toma el día de la ovulación como el día “0” y si queremos obtener
blastocistos se recurre al día 7, es por eso que es fundamental saber con
exactitud cuando ovula la yegua.
El medio mas comúnmente usado para lavar el útero es el PBS o Sol Dulbecco
modificada, también se puede usar Sol de Ringer con el 2% de Suero Fetal
mas Penecilina 100.000 UI por litro y Estreptomicina 100mg por litro.
Para el lavado del ùtero se usa una sonda Foley 30 de origen francés de doble
vía especiales para equinos, esta se coloca en el cuerpo del útero, para
ubicarla el cervix debe ser dilatado manualmente luego se procede a llevar la
sonda al cervix introduciéndola en él, se la hace pasar unos 5 cm en el cuerpo
del útero luego se la fija inflando el manguito de goma con 40 cc a 60 cc de
aire se retira un poco para atrás para ver si esta bien colocada en caso de el
aire no sea suficiente se la infla un poco mas.
En la entrada a la sonda se le coloca un tubo en “Y” a donde se le acoplan las
mangueras de entrada y salida, ambas con el clip de cierre y abre, la primera
trae el medio por gravedad y a la segunda se le coloca al final un filtro EmCon
que retiene los embriones, debajo del filtro una probeta graduada a recibe el
medio recuperado.
El medio de lavado se introduce en volúmenes de 500cc e inmediatamente se
retira y la cantidad total son entre 3 a 6 lts de medio.
Es conveniente que a medida que vamos lavando se busque en la lupa los
embriones, esto se hace cuando recuperamos el primer litro se cambia el filtro
y se vuelca el contenido en una Placa de Petri mediana(5 cm de diámetro) esta
permite una rápida recorrida de todo el campo, si no se encuentra el embrión
se sigue lavando caso contrario se termina el lavaje de esta forma nos
ahorramos medio y tiempo.
Una vez encontrado el embrión se lo coloca en una placa de cultivo PBS con
Suero Fetal al 15% durante diez minutos, se lo lava diez veces se lo coloca en
una pajuela con ese mismo medio y se lo transfiere a la receptora
correspondiente.
Antes de ser colocada en la pajuela esta debe ser lavada con medio diez veces,
esto se hace aspirando medio y largándonlo nuevamente en la placa, evitando
que el medio aspirado toque el émbolo de la pajuela por que la inutiliza.
En la pajuela la disposición de su contenido va con una columna de medio,
aire, medio con el embrión, aire, medio.
Práctico Nº 8: FIV. Aspiración de ovocitos en ovarios provenientes de
mataderos.
BIBLIOGRAFIA
Allen W.R. Reproducción Equina
Aller Atucha J.F. Recolección y evaluación de semen bovino.
Aller Atucha J.F. Procesamiento de semen bovino para su procesamiento.
Aisen E.G. Reproducción ovina y caprina. Editorial. Inter.-Médica
Buide R. Manejo de Haras. Hemisferio Sur.
Barth
……………… Reproducción Equina. Clínica Norteamericana.
Ginther O.J. Reproductive Biology of the Mare.
Hafez E.S.E. Reproducción e Inseminación Artificial en Animales. Interamericana.
Mc Graw-Hill 6 ª Edición
IRAC Instituto de Reproducción Animal de Córdoba. 1999 Curso de Post Grado de
Reproducción Bovina.
Kobluk-Ames-Geor. The Horse. Diseases & Clinical Management.
Neely D.P. Reproducción equine.
Taboada A.F. Apuntes de clase: Extracción evaluación y congelación de s. bovino.
Taboada A.F. Apuntes de clase: Transferencia de embriones en bovinos.
Taboada A. F. Apuntes de clase: Transferencia de embriones en equinos.
Zemjanis. Reproducción animal. Diagnósticos y técnicas terapéuticas