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MORFOLOGIA Y ESTRUCTURA BACTERIANA
ASPECTOS PRACTICOS
El estudio morfológico de una bacteria incluye su estudio micro y macroscópico. En este
capítulo nos extenderemos sobre el primer punto, siendo la morfología macroscópica
desarrollada en el capítulo siguiente.
MORFOLOGIA MICROSCOPICA
Debido al pequeño tamaño que, como vimos, tienen las bacterias, para observarlas es
necesario recurrir a la ayuda de un microscopio.
Existen dos clases de microscopios: el microscopio óptico y el electrónico.
El primer grupo utiliza un sistema de lentes ópticos (microscopios de luz) y comprende
diferentes tipos, a saber:
- M de campo claro, de uso corriente en el laboratorio como luego veremos, siendo los otros
tipos de uso
más restringido, con fines especiales.
- M de campo oscuro, en este caso los microorganismos aparecen claros en un fondo oscuro.
Se utiliza para
observación de gérmenes difíciles de colorear, como ser en Bacteriología Treponema
pallidum , agente de
la Sífilis.
- M de contraste de fases, aquí, como en el caso anterior, se visualizan bacterias sin técnicas
de coloración.
- M de luz ultravioleta, utiliza como fuente de luz la ultravioleta, presentando mayor poder de
resolución por
tener menor longitud de onda.
- M de fluorescencia, de gran sensibilidad y especificidad.
El microscopio electrónico emplea en vez de ondas luminosas un haz de electrones que
cuando pasan a través de la preparación algunos son difractados creando una imagen que se
lee en una pantalla sensible a los electrones. La longitud de onda de la radiación de los
electrones es mucho más pequeña que la de luz visible y, siendo el poder resolutivo de un
microscopio inversamente proporcional a la longitud de onda utilizada, es por ello que la
resolución obtenida por este microscopio es mayor que por el microscopio óptico (puede
apreciar partículas de
10nm en vez de 0,2m del MO).
En clase veremos fotos obtenidas por este medio, siendo útil en el estudio de la estructura
bacteriana, como ser
flagelos, pili, pared bacteriana, ADN, etc.
MICROSCOPIO DE CAMPO CLARO
El microscopio de campo claro será el que el estudiante utilizará en sus trabajos prácticos, por
lo que deberá
familiarizarse con su estructura y manejo.
ESTRUCTURA
El MO de campo claro consta de:
- Dos sistemas de lentes convergentes.
- Uno próximo al objeto llamado objetivo. Generalmente los microscopios vienen con varios
objetivos que
se pueden usar indistintamente, constituyendo la "pieza revólver". Estos objetivos pueden ser
de poco
aumento (10X), mediano aumento (40X) o de inmersión (100X), siendo este el más usado en
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Bacteriología. Se sumerge este lente en la lámina a visualizar recubierta de aceite, y al tener
este mayor
índice de refracción que el aire, se aumenta el poder de resolución.
- Uno próximo al ojo llamado ocular que aumenta en diez veces la imagen obtenida por el
objetivo.
- Una fuente de luz uniforme que puede ser externa al microscopio o venir incluida en el.
- Un condensador móvil.
- Un espejo plano que refleje la luz.
- Un diafragma.
- La platina con pinzas para colocar la lámina y movilizarla.
- Un mecanismo de ajuste para enfocar el sistema de lentes sobre el objeto que consta de:
- Un macrométrico de ajuste grosero. Se desplaza cm. y coloca el objeto próximo al foco.
- Un micrométrico de ajuste fino, que opera en distancia de mm. y otorga el enfoque final.
MANEJO DEL MICROSCOPIO
- Abrir completamente el diafragma.
- Colocar la lámina en la platina con una gota de aceite de inmersión.
- Utilizar el objetivo de inmersión (100X, con una línea negra).
- Enfocar bajando con el macrométrico el tubo, mirando desde afuera hasta que el objetivo se
sumerja en el
aceite.
- Ahora mirar por el ocular y levantar el tubo lentamente hasta que sea visible la imagen del
objeto.
- Ajustar con el micrométrico.
Si el preparado a visualizar ya está enfocado utilizar únicamente el micrométrico para ajuste
fino.
Se recomienda mantener los dos ojos abiertos para disminuir el esfuerzo visual.
Este examen microscópico puede realizarse, ya sea en fresco o después de fijación y
coloración, siendo ello lo más usado en el laboratorio clínico. En el constituye un paso
fundamental en la orientación bacteriológica, pero por sí solo, salvo raras excepciones, no
identifica el germen observado.
EXAMEN EN FRESCO
Se realiza colocando el material a estudiar entre porta (lámina) y cubre objetos (laminilla),
observándose
posteriormente en objetivo de mediano aumento (40X) o sea, sin aceite de inmersión. Un
hecho a tener en cuenta es que se trabaja con bacterias vivas, que no sufren artificio de
fijación ni coloración, por lo que se deben extremar los cuidados para evitar la contaminación.
Esta técnica nos permite apreciar la existencia de bacterias, su morfología; y si presentan la
propiedad de movilidad.
Ello, a pesar de ser de gran importancia, puede resultar dificultoso de diferenciar del
movimiento browniano típico de las bacterias o de las corrientes líquidas presentes en la
preparación, por lo que generalmente se utilizan otras técnicas para detectar esta propiedad.
El examen en fresco también puede ser utilizado con técnicas especiales, por ejemplo la
tinción con tinta china nos permite identificar la presencia de una bacteria capsulada.
También puede utilizarse el examen en fresco en otro microscopio que no sea el de campo
claro, como por ejemplo el de campo oscuro es el utilizado para la detección de Treponema
pallidum como ya vimos.
Esta técnica no es de uso rutinario en los laboratorios porque las bacterias son difíciles de
visualizar debido a que su citoplasma es incoloro y presenta poca diferencia con el índice de
refracción del vidrio y del agua, aportando
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además las técnicas de fijación y coloración mayor cantidad de datos como ya veremos.
EXAMEN LUEGO DE FIJACION Y COLORACION
Existen diferentes grupos de coloraciones:
*SIMPLES, en la que se recubre la superficie bacteriana con una solución de un colorante en
alcohol y agua,
generalmente de carácter básico, por ejemplo Azul de Metileno. Esta técnica nos permite
apreciar la existencia de bacterias, su morfología, agrupación adoptada, la presencia de
esporos y células, como ser epiteliales, glóbulos rojos y blancos.
*DIFERENCIALES: utiliza diferentes colorantes por lo que además de aportar la
información dada por la técnica anterior nos permite diferenciar a las bacterias. Las técnicas
de Gram y Ziehl-Nielseen permiten agrupar a las bacterias en tres grandes grupos: Gram
positivas (+), Gram negativas (-), y ácido alcohol resistentes; lo que vimos guarda relación
con la estructura de sus respectivas paredes bacterianas.
El estudiante debe familiarizarse con estas técnicas que usará en las prácticas de laboratorio.
*ESPECIALES: permiten visualizar diferentes estructuras, como por ejemplo flagelos,
esporos, cápsula, núcleo, etc.
Previa coloración la muestra debe atravesar pasos fundamentales como es la preparación y
fijación del frotis.
Debemos estar atentos antes de iniciar estos pasos de contar con todo el material necesario
para ello, léase bandeja con todos los colorantes y en cantidades suficientes, láminas, soporte
para láminas, asas, pinzas, etc. Además debemos colocarnos cerca de un mechero y de una
pileta con pescadera y bocal para descartar el material así como jabón y alcohol iodado.
PREPARACION
La preparación del frotis es algo distinta según que el material a estudiar provenga de un
medio sólido o líquido.
a. Si es a partir de un medio sólido:
- depositar con el asa una gota de agua en el centro de la lámina,
- tocar con el asa estéril una porción de la colonia a estudiar,
- suspender el material recogido en la gota de agua,
- extender homogéneamente la suspensión con la misma asa mediante varios giros para que el
frotis
quede delgado.
b. A partir de un medio líquido o material patológico.
En estos casos no se necesita diluir el material a estudiar en agua, sino que se toma con el asa
estéril una gota del
caldo de cultivo y se coloca directamente sobre la lámina.
SECADO
Puede dejarse secar a temperatura ambiente (desecación espontánea) o para apresurar este
paso conviene pasar la
lámina varias veces y en forma rápida sobre el mechero, en la zona de aire caliente (alto).
FIJACION
Con este paso se pretende obtener la muerte de los gérmenes, su adhesión a la lámina y la
conservación de su
morfología. También en este caso existen diferentes posibilidades:
a. fijación por el calor; la más usada en Bacteriología. Consiste en pasar en forma rápida la
lámina con la cara
conteniendo el frotis mirando hacia arriba, tres veces por la parte más caliente de la llama del
mechero
(bajo);
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b. fijación por sustancias químicas, como por ejemplo el alcohol metílico (metanol).
Luego de preparar el frotis de esta forma puede ser sometido -previo enfriamiento- a cualquier
tipo de coloración, ya sea simple o diferencial.
COLORACION
TECNICA DE GRAM
En esta técnica se utilizan, como dijimos, varios colorantes en pasos sucesivos a los que se les
debe respetar su
orden y tiempo de aplicación para lograr resultados fiables. Cada una de estas sustancias se
coloca sobre la lámina ubicada en un soporte en la bandeja y se deja actuar el tiempo indicado
para cada una de ellas, luego de lo cual se vuelca la sustancia y se arrastra el remanente con
agua para continuar con la sustancia siguiente. Mostramos ahora las diferentes sustancias, los
tiempos de aplicación recomendados y los resultados obtenidos en los diferentes pasos.
TECNICA DE ZIEHL-NIELSEEN
En esta técnica más que ninguna las láminas a usar deben estar en perfecto estado, sin
rayaduras que permitan
retener el colorante de Ziehl y conducir de esa forma a errores de lectura.
*Se cubre la lámina con la fuscina y se calienta con el mechero hasta la emisión de vapores
sin que la solución
colorante llegue a la ebullición. Esto debe mantenerse durante 5' por lo que para evitar la
ebullición debe calentarse en forma intermitente. Si es necesario puede agregarse más
colorante para mantener el frotis totalmente cubierto.
Luego se lava con agua y se coloca el decolorante hasta que no ceda más colorante, lo que
sucede en
aproximadamente 1', pudiendo ser necesario el agregado de más cantidad.
Luego de realizada la coloración se deja secar a temperatura ambiente, o con el aire caliente
del mechero; se deja
enfriar y está pronto para ser visto en el microscopio como ya vimos.
RESULTADOS
La técnica de Gram nos aporta múltiples datos como ya vimos, por ejemplo, según el
comportamiento frente a estos colorantes las bacterias se clasifican en:
a. Gram positivas, si se colorean de color violeta.
b. Gram negativas, si se colorean de color rosado o rojo.
c. Gram variable, si existen células teñidas de color violeta y rosado simultáneamente. Ello
puede ser debido
a una mala técnica de tinción, a que las células son viejas, a que se produjo un daño en su
pared celular, o a
que son por naturaleza Gram variables.
d. Gram neutrales, si no toman ningún colorante (ni el cristal violeta ni el de contraste).
Aparecen sin color en
un fondo rosado (Gram negativo). Es el ejemplo de las micobacterias y hongos.
Nos permite, además, definir las formas predominantes:
a. de la célula bacteriana; cocos, bacilos o filamentos;
b. de las terminaciones; cóncavas, redondas, cónicas; aplanadas,
c. de los lados; paralelos, ovoides, cóncavos o irregulares;
d. del eje celular; recto, curvo o en espiral;
e. pleomórfico.
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Como ya vimos también podemos conocer la agrupación adoptada por las bacterias, sobre
todo cocos (aislados, en cadenas, en racimos, en tétradas, etc.).
Asimismo podemos hacernos una idea del tamaño relativo de la bacteria en cuestión,
sabiendo que un glóbulo rojo mide aproximadamente 7 µm y un neutrófilo 2-3 µm.
De esta forma:
a. El tamaño global puede ser:
- Diminuto; menor a 0,3 µm.
- Pequeño; entre 0,3 y 0,5 µm.
- Mediano o largo.
b. La longitud
- Corto; 0,5 a 1 µum.
- Mediana longitud.
- Filamentoso; 10 a 30 µm.
c. El ancho
- Delgado.
- Mediano.
- Grueso.
d. Pleomórfico.
La coloración puede ser captada en forma regular por la bacteria, o si no ser bipolar, en
cuentas o rosario, en punteado, irregular, etc.
Además esta técnica nos permite observar la presencia de células no bacterianas como ser
células de la sangre o células epiteliales.
Tiempo
GRAM +
GRAM -
Colorante
cristal violeta
30 seg
violeta
violeta
Mordiente
lugol
30 seg
violeta
violeta
Decolorante alcohol-acetona
10 seg
violeta
Colorante
zafranina
De contrtaste
30 seg
violeta
rosado
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