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INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA
Sistema de Detección y Prevención IQ2000TM IMNV
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Sistema de Detección y Prevención
IQ2000TM IMNV
Infectious Myonecrosis Virus (IMNV)
Detección del Virus de la Mionecrosis
Infecciosa.
Para uso exclusivo In-Vitro
Material incluido, no contagioso.
Manual Instructivo
Manufacturer:
Farming IntelliGene Tech. Corp.
NO.2-1, 7th Rd., Taichung Industry Park, Taichung 407, Taiwan
TEL: 886-4-23580768 FAX: 886-4-23580769
E-mail: [email protected] http://www.iq2000kit.com
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Contenido
I.
Introducción
II.
Componentes del sistema
Extracción de los reactivos de ADN
kit de amplificación de IHHNV
III.
Equipo y reactivos requeridos
IV.
Detección y sensibilidad
V.
Preparación de Muestra y extracción de ADN
Procedimiento de extracción de ADN, DTAB-CTAB
ADN extraído por Buffer de Lisis
Disolución de ADN
VI.
Protocolo de reacción del kit de amplificación
Preparación de reacción
Condición de reactivo
Procedimiento de reacción
VII.
Electroforesis
Preparación del Gel de Agarosa
Electroforesis
Gel colorante y contenido de datos
VIII.
Diagnostico
IX.
Solución de problemas
X.
Referencias
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I. Introducción
El Virus de la Mionecrosis Infecciosa (IMNV), tuvo su primera aparición
en el Estado de Piauí, Brasil, en septiembre de 2002. Y no fue sino hasta
febrero de 2004, que el Dr. Donald V. Lightner, de la Universidad de Arizona,
US, confirmó oficialmente el descubrimiento del nuevo virus. El descubrimiento
tardío y la falta de información sobre su patología causaron severos daños a la
industria camaronícola brasileña. En 2003, la pérdida en producción fue
estimada alrededor de $20 millones USD en cultivos de L. vannamei, un
inesperado impacto para el sector.
El “Virus Zombi”, un apodo dado por los granjeros, es de aún origen
desconocido. El virus presenta ARN en su genoma y pertenece a la familia
Totiviridae. Los síntomas típicos son necrosis del abdomen y céfalo-tórax,
pérdida en el volumen del hepatopáncreas, pérdida de transparencia y
coloración alrededor de la cola, una apariencia de camarón cocido, etc. La
mortalidad puede ocurrir en cualquier ciclo de la vida del camarón, y la tasa se
puede incrementar cuando el camarón pasa de los 6 grs., la cual coincide con
el alto consumo en su ración de comida, causando grandes pérdidas en
recursos y alimento.
La ruta de transmisión del IMNV está aún bajo investigación, y la causa
real de la muerte es también un misterio. En cooperación con el equipo de
investigación guiado por el Dr. Donald V. Lightner, Farming IntelliGene Tech
Corp., han credo un sistema de detección altamente preciso para IMNV, un
nuevo producto en la detección viral IQ2000TM. Ha heredado todas las
características de las series IQ2000TM, tales como un control interno y diseño
semi-cuantitativo. El primer diseño elimina la posibilidad de falsos negativos, y
el segundo mide el grado de infección.
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II. Componentes del Sistema
‫ ٭‬Premezcla RT-PCR
1.
4 viales
420 μL/vial
Incluye: Buffer de reacción, dNTPs y primers específicos de IMNV
‫ ٭‬Premezcla de PCR Anidado
2.
4 viales
840 μL/vial
Incluye: Buffer de reacción, dNTPs y primers específicos de IMNV
‫ ٭‬Plásmido Control P(+)
3.
1 vial
100 μL/vial
Incluye: 104 copias/μL de plásmidos con una secuencia parcial de
IMNV
4.
‫ ٭‬tRNA de levadura (40 ng/μL)
1 vial
500 μL/vial
5.
‫ ٭‬IQ enzima ADN polimerasa (2U/μL)
1 vial
360 μL/vial
6.
‫ ٭‬Mezcla de enzima RT
1 vial
120 μL/vial
7. ☼ Tinte de carga 6X
1 vial
1500 μL/vial
8. ☼ Marcador de peso molecular
1 vial
100 μL/vial
9.
‫٭‬
10.
♦ Solución de extracción de ARN
DEPC ddH2O
100 mL/frasco
100 mL/frasco
Instrucciones de Almacenamiento:
☼ Almacenar a temperatura ambiente
♦ Almacenar a 4ºC
‫ ٭‬Almacenar a -20ºC
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III. Equipo y reactivos requeridos (no incluidos)
1. Termociclador
2. Micro centrífuga de alta velocidad (12000 rpm, d=5 a 8 cm)
3. Aparato de electroforesis
4. Transluminador UV
5. Mezclador Vortex
6. Termo block
7. Micro pipeta
8. Cámara Polaroid o sistema de foto digital.
9. Cloroformo
10. Etanol al 95%
11. Bromuro de Etidio
12. Buffer de electroforesis TAE o TBE
13. Agarosa
14. Isopropanol (2-propanol)
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IV. Limite de detección y sensibilidad
Este sistema de detección genera diferentes límites de detección y
niveles de sensibilidad de acuerdo a las diferentes fuentes de la muestra
sometida a prueba. En el cuadro siguiente se muestra la lista analizada. La
siguiente tabla lista algunas muestras comunes. Basado en el conocimiento de
la distribución viral en el camarón, se recomiendan muestras de músculo y
hepatopáncreas de juveniles y adultos para su escaneo.
ESPECIMEN
Plasmido de
CANTIDAD
LIMITE DE
EQUIVALENTE
DE LA
DETECCIÓN
DE
PRUEBA (COPIAS/REACCION) SENSIBILIDAD
2 copias/ ul de
2 copias
2
ADN IMNV
muestra de
plásmido
20 copias/µL
RNA transcrito
20 copias
20
in vitro
RNA transcrito
in vitro
<PL 12
10 PL´s
20
500 copias/ PL
PL 12 a PL 20
5 PL´s
20
1000 copias/PL
de >PL 20 a 5
10 a 20
20
2000
gr.
piezas
Hepatopáncreas
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copias/muestra
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Hepatopáncreas
2a3
de 5 gr. a crias
piezas
Hepatopáncreas
Media
de crias
pieza
20
2000
copias/muestra
20
2000
copias/muestra
En base al cuadro anterior, los usuarios tienen que saber que un resultado
"negativo" de la prueba indica que la muestra estaba o no infectadas o que el
nivel de infectados era Inferior al límite de detección.
V.
Preparación de muestra y extracción de ARN
1. Procedimiento de extracción de RNA
1.1 Para el pesado de la muestra seguir el PROTOCOLO PARA
EXTRACCION DE DNA Y RNA (LASA-EDR-IT-01-00)
Coloque la muestra en un tubo de 1.5 mL con 500 μL de solución de
extracción de RNA.
1.2. Triture la muestra en el tubo con un moledor desechable, deje a
temperatura ambiente por 5 min.
1.3. Agregue 100 μL de CHCl3 y aplique vortex 20 seg. . Déjelo a temperatura
ambiente por 3 min. , luego centrifugue a 12000g (12000 rpm r = 6cm) por
15 min.
1.4. Transfiera 200 μL de la fase acuosa clara de arriba a un nuevo tubo de 0.5
mL conteniendo 200 μL de 2-propanol (Isopropanol).
1.5. Aplique un vortex breve, centrifuge a 12000g por 10 min., luego decante el
isopropanol.
1.6. Lave el pellet con 0.5 mL de etanol al 75%, luego centrifugue por 5 min. a
7500g (9000 rpm r = 6 cm) para recobrar el RNA del pellet, luego decante
el etanol y seque el pellet.
1.7. Disuelva el pellet con ddH2O DEPC.
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2. Disolución de RNA
La concentración de RNA es diferente, dependiendo de las distintas fuentes
de la muestra, por lo tanto la concentración de debe ser ajustada disolviendo el
pellet con el RNA en un volumen diferente de ddH2O DEPC.
FUENTE DE LA MUESTRA
VI.
VOLUMEN
PL
500 μL
Branquias
200 μL
Protocolo de reacción del kit de amplificación
Las siguientes condiciones de amplificación aplican para tubos de 0.2
mL de anchura ó placa de 96 pozos.
1. Condiciones de reacción (Uni-IQ Descripción de RT-PCR):
a. Descripción de la reacción RT-PCR:
42ºC – 30 min.; 94 ºC – 2 min.; Enseguida
94ºC – 20 seg.; 62ºC – 20 seg.; 72ºC – 30 seg., repita 15 ciclos, luego
72ºC – 30 seg.; 20ºC – 30 seg.; al final del ciclo.
b. Descripción de reacción de PCR anidado:
94ºC – 20 seg.; 62ºC – 20 seg.; 72ºC – 30 seg., repita 30 ciclos, luego
72ºC – 30 seg.; 20ºC – 30 seg.; al final del ciclo.
2. Preparación de los reactivos:
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a. Mezcla de reacción RT-PCR: 8 µL/reacción
Mezcle lo siguiente:
Premezcla RT-PCR
7.0 µL
IQ Enzima ADN polimerasa (2U/µL)
0.5 µL
Mezcla de Enzima RT
0.5 µL
b. Mezcla de reacción de PCR anidado : 15 µL/reacción
Mezcle lo siguiente:
Premezcla de PCR anidado
14 µL
IQ Enzima ADN polimerasa (2U/ µL)
1 µL
3. Procedimiento de reacción:
Pipetee 8 µL de mezcla de reacción RT-PCR en cada tubo de
reacción de 0.2 mL con su respectiva etiqueta.
Agregue 2 µL de RNA muestra extraída ó estándar* en cada
mezcla de reacción.
Realice la reacción RT-PCR
Agregue 15 µL de mezcla de reacción PCR anidado a cada tubo,
después de haber completado la reacción RT-PCR.
Realice la reacción de PCR anidado.
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Después de completar la reacción de PCR anidado, agregue 5 µL
de tinte de carga 6X a cada tubo de reacción y mezcle bien.
Después de mezclar, la muestra está lista para electroforesis.
* Un estándar de 10 copias/µL es muy recomendable para cada experimento,
para monitorear la sensibilidad de las reacciones. También recomendamos
tRNA de levadura para ser usado como diluyente para estándares positivos.
Bajo ésta condición, el estándar puede ser mantenido a -20ºC por una
semana.
VII.
Electroforesis
1. Preparación del gel de agarosa
Primero, decida el buffer de electroforesis entre TAE y TBE.
Luego, diluya el buffer a una concentración 1X para
procesar la
electroforesis y producir el gel de agarosa. Note que el buffer para
procesar la electroforesis y producir el gel debe ser del mismo.
Se recomienda un gel de agarosa al 2% para la electroforesis.
Para preparar el gel al 2%, agregue 2 gr. de agarosa a una botella ó
frasco de boca ancha con 100 mL de buffer.
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Caliente la mezcla hasta volverse hialina sin ninguna partícula de
gel. El calentamiento se puede hacer usando un mechero de gas ó placa
de calentamiento, incluso puede usarse un horno de microondas. Para
evitar el derramamiento, se recomienda un contenedor más grande (el
doble del volumen de la solución).
Dejar enfriar el gel a temperatura ambiente, hasta que llegue
alrededor de los 50ºC y lentamente vacíe el gel en la caja para geles. El
volumen del gel varía dependiendo del tamaño de la caja. La altura del
gel de agarosa solamente tiene que estar por encima del fondo del peine
del gel de 0.3 a 0.5 cm., y se sugiere que el ancho sea menor de 0.8 cm.
Cuidadosamente remueva el peine plástico y tapaderas de ambos
lados de la caja, cuando el gel esté completamente coagulado. El gel
está ya listo para electroforesis. El gel terminado no debe ser expuesto a
temperatura ambiente por más de 4 horas.
2. Electroforesis
Coloque el gel de agarosa coagulado dentro de la caja. El ADN de
peso molecular caminará hacia delante (+), ya que el ADN está cargado
negativamente.
Agregue buffer de electroforesis a 1X dentro de la caja, hasta que
cubra ligeramente el gel.
Cargue 5 µL del producto de PCR a cada pozo. La mezcla se irá
al fondo del pozo, por que su densidad es más alta que el buffer. Este
paso debe manejarse cuidadosamente para evitar contaminación.
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Se requiere un marcador de ADN para cada electroforesis. Se
recomienda alrededor de 5 µL de marcador de ADN. El marcador de
peso molecular sirve como referencia para saber el tamaño del producto
de PCR.
Cuando todas las muestras sean cargadas, conecte la corriente
de la caja del gel antes de encenderla. Se recomienda un voltaje
constante entre 100V- 150V en la electroforesis (NO CORRA LA
MUESTRA A MAS DE 150 VOLTS).
El tinte de carga del kit contiene 2 colorantes: EL azul de bromo
fenol da un color azul subido; el cyanol de xileno da un color azul suave.
Cuando el
azul oscuro se aproxima de ½ a 2/3 del gel, detenga la
electroforesis. Luego remueva el gel de la caja para proceder con la
tinción con bromuro de etidio.
Para evitar contaminación, no use de nuevo el buffer de
electroforesis, a menos que se usen varios geles ese mismo día.
Cuando termine la electroforesis, lave la caja del gel con bastante agua.
3. Tinción del gel e Interpretación de datos
El Bromuro de Etidio (EtBr), generalmente se prepara para un
stock de 10 mg/mL. ésta solución debe ser almacenada en un frasco
ámbar, ya que el EtBr es un químico que se degrada si es expuesto a la
luz. Note que el EtBr es un carcinógeno conocido, se recomienda el uso
de traje protector, guantes y lentes.
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Diluya la solución stock 10 mg/mL 20,000 veces (Ej. Agregue 5 µL
de la solución stock a 100 mL de agua destilada para preparar la
solución de tinción).
Vacíe la solución de tinción en una bandeja de plástico ó bolsa de
cierre con el gel de electroforesis terminado. La solución debe cubrir
todo el gel.
Deje a temperatura ambiente por 10 min. Luego, destiña el gel en
otra bandeja de plástico con agua destilada por otros 10 min. para
eliminar residuos.
Coloque el gel en un transiluminador UV para leer el resultado
final.
VIII. Diagnóstico
1.
Los estándares y muestras positivas mostrarán los siguientes patrones en
el gel:
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Carril 1: Plásmido de ADN estándar IMNV, 2000 copias/reacción
Carril 2: Plásmido de ADN estándar IMNV, 200 copias/reacción
Carril 3: Plásmido de ADN estándar IMNV, 20 copias/reacción
Carril 4: Control Negativo (tARN de Levadura ó ddH2O)
Carril 5: Muestra con infección severa por IMNV
Carril 6: Muestra con infección ligera por IMNV
Carril 7: Muestra negativa de IMNV
Carril M: Marcador de peso molecular, 848 pb, 630 pb, 333 pb
2. Las muestras negativas mostrarán solamente una banda a las 680 pb, el
cual es un producto de un control interno, mARN para ß-actina de
camarón peneido.
3. Procedimiento de diagnóstico:
a. Banda formada a las 255 pb y 510 pb: Severa IMNV P (+)
b. Banda formada solamente a las 255 pb: Ligera IMNVN P (+)
4. Cada experimento requiere controles positivos y negativos. Si el control
de ADN plásmido de 101 no produjo una banda en las 255 pb, significa
que la reacción de PCR ha fallado ó la sensibilidad del sistema no está
por arriba del estándar. Por otro lado, si el resultado del control negativo
muestra una banda a las 255 pb, significa que se ha contaminado la
muestra.
IX. Solución de problemas
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Problema o síntoma
Posibles causas
Recomendaciones
1. EtBr Degradadas
Banda tenue o Ninguna
banda después de la
coloración
2. No prende la luz UV
3. Fondo demasiado
fuerte
4. El gel de agarosa es
demasiado grueso
El estándar positivo
muestra bandas
normales, pero no
mostrar el marcador
El marcador fue
degradado o tiene baja
carga.
1. RT y/o PCR fallado
El marcador muestra
bandas normales, pero
p(+) no tiene banda.
Muestra banda alta P(+)
(103), pero la baja
positiva no tiene banda.
El Control negativo (-)
muestra banda positiva
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2. La enzima no fue
agregada.
3. P(+) fue degradada.
1. P (+) fue degradado.
2. El estándar 104 fue
degradado.
3. Baja actividad de la
enzima.
1. Contaminación micro
pipeta.
2. Contaminación del
reactivo.
3. Contaminación Lab.
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1. Preparar nuevo EtBr
o extender el tiempo
de coloración
2. Checar la tabla de
UV
3. Remojar el gel en
agua limpia a 4°C
por otros 30 minutos
4. Checar si el espesor
del gel es más de
0,8cm. Preparar un
gel más delgado y
ejecutar la
electroforesis.
Cambiar el marcador, o
incrementar el volumen
de carga.
1. Comprobar el registro
de preparación de la
mezcla de reactivos y el
perfil del ciclo de PCR.
2. Agregar enzima.
3. Preparar nueva P(+).
1. Preparar nuevas P (+)
2. Sustituir 104 estándar
3. Compruebe la fecha
de caducidad y
condiciones de
almacenamiento
de la enzima, o sustituir
enzima.
1. Desmontar la pipeta y
hacerle limpieza, se
recomienda el uso de
aerosoles libres de
punta. Se recomienda
utilizar una pipeta
diferente para el
procedimiento de PCR.
Producto de pipeteado
2. Usar reactivos
abiertos, una vez más
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Muestra control de
banda normal P(+) y
N (-), pero la muestra
conocida no tiene
banda.
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1. Extracción de ARN
fallida.
2. Mala calidad de ARN
o concentración muy
alta de ADN.
3. Inhibidor de PCR.
16
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3. Consulte con Farming
Intelligene para la
limpieza del equipo.
1. Checar el
procedimiento de
extracción de
ARN.
2. Checar el rango
de OD 260/280,
normalmente esta
ración debe ser
de 1.6 a 1.8.
3. Reacción de PCR
Spike 10³
P(+)estándar
para un paralelo.
Si la primera es
con10³
mostrando una
banda normal.
Entonces la
inhibición esta
fuera de lugar.
Si con P (+)10³
no tiene banda,
entonces hay
inhibición.
4. Los usuarios
necesitan
preparar otra
extracción de
ARN.
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X. Referencias:
1. Lightner, D. V., Pantoja, C. R., Poulos, B. T., Tang, K.F.J., Redman,
R.M., Andreas, T., Bonami, J. R. “Infectious Myonecrosis (IMN): A new
virus disease of L. vannamei”. World Aquaculture Society 2004. Honolulu,
Hawaii, USA (March 2004): 353, Abstract. Aquaculture 2004 Abstract on
CD-ROM.
2. Nunes, Alberto J. P., Cunha Martins, Pedro Carlos, y Vasconcelos
Gesteira Tereza Cristina. “Carcinicultura Ameacada: Productores sofreí
com as mortalidades decurrentes do virus da Mionecrose Infecciosa
(IMNV)”. Panorama de Acuicultura May/June: 2004.
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