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Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales
TRABAJO PRÁCTICO Nº 1
UTILIZACIÓN DE PROGRAMAS DE
BIOMODELIZACIÓN I
I- INTRODUCCIÓN
Los programas de biomodelización son un buen recurso dentro de la
Biología Celular, ya que permiten la visualización de los componentes
moleculares de las células. Se trata de programas de representaciones
moleculares que permiten mostrar macromoléculas en tres dimensiones, de
manera que cada átomo de la macromolécula está en su posición 3D
específica y unida a otros átomos mediante los enlaces covalentes apropiados.
También interpreta los datos relacionados con la identidad de cada átomo, las
estructuras secundarias, puentes de hidrógeno, puentes disulfuro, cadenas
polipeptídicas, etc.
En este trabajo práctico se utilizará el programa RasMol para reconocer y
comparar motivos y dominios proteicos de diferentes proteínas.
II- OBJETIVOS
 Dar a conocer la importancia que tienen los programas de
biomodelización como una herramienta útil para realizar trabajos de análisis
estructurales, comparaciones e interacciones entre moléculas.
 Aprender a utilizar el programa RasMol para observar biomoléculas, y
reconocer sus componentes básicos.
 Analizar y comparar diferentes motivos y dominios en las proteínas de
membranas, para comprender la relación existente entre estructura y
función.
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III- METODOLOGÍA DE TRABAJO
Las Ca2+-ATPasas son responsables del transporte activo de iones Ca 2+ a
expensas de la hidrólisis de ATP en distintos tipos de membranas celulares.
Son miembros de la clase de ATPasas de tipo P, denominadas así por formar
un intermediario fosforilado durante su ciclo de reacción (Fig. 1). En la primera
etapa de este ciclo, el Ca2+ se une al sitio citosólico de la enzima en su
conformación de alta afinidad (E1) e inmediatamente se fosforila un residuo de
ácido aspártico por ATP. Como consecuencia, la enzima fosforilada (E1P)
cambia su conformación a un estado E2P que expone el Ca 2+ al exterior
lumenal, en el caso de la bomba del retículo sarcoplasmático, o al interior
celular, en el caso de la bomba de membrana. Entonces, se produce la
liberación del Ca2+ y la hidrólisis del intermediario fosforilado, causada por la
baja afinidad al Ca2+ de la forma E2P de la bomba. Tras la disociación del
intermediario fosforilado, la bomba vuelve a su conformación E1.
En la bomba del retículo sarcoplasmático (SERCA), se ha descrito una etapa
alternativa en el ciclo de reacción es la denominada “slippage” o deslizamiento,
que implica la liberación del calcio unido al intermediario fosforilado en el sitio
citoplasmático de la membrana en lugar de ser transportado al lumen o al
espacio extracelular. Como resultado de este proceso, la hidrólisis de ATP no
está acoplada al transporte de Ca2+ y la mayoría de la energía derivada de esa
hidrólisis se utiliza en la producción de calor, contribuyendo al control térmico
en mecanismos de hibernación y anoxia.
Los distintos tipos de bombas de Ca2+ comparten diversas propiedades
básicas como son su alta afinidad por el Ca2+, similar organización de sus
dominios catalíticos y diferentes conformaciones en su ciclo de reacción. Sin
embargo, presentan diferencias estructurales y funcionales que las
caracterizan.
Fig. 1 Esquema general del ciclo de reacción de las Ca2+-ATPasas. La enzima E existe
en dos estados conformacionales: el primero (E1) une Ca2+ con alta afinidad en la cara
citoplasmática de la membrana, el segundo (E2) tiene menor afinidad por Ca2+ y lo libera al
otro lado de la membrana. El ATP fosforila un ácido aspártico antes de la translocación del
Ca2+.
La bomba de Ca2+ del retículo sarcoplasmático (SERCA) es una proteína
anfifílica, integrada en la membrana del retículo sarcoplasmático. Transporta
dos iones Ca2+ desde el citoplasma hacia el lumen de esos compartimientos
utilizando la energía de hidrólisis del ATP en presencia de Mg2+. Estudios
exhaustivos con proteasas, con anticuerpos monoclonales y antipéptidos
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producidos frente a determinados segmentos, mutagénesis dirigida y
transferencia de energía de fluorescencia, entre otros, han contribuido a la
elaboración de su modelo estructural. Sin embargo la formación de cristales
tridimensionales y de imágenes de alta resolución (2,6Å) obtenidas por
microscopía crioelectrónica de cristales tubulares, han permitido obtener una
información más amplia sobre la estructura de la SERCA, así como de los
mecanismos cinéticos de la proteína y de los cambios conformacionales
asociados con la unión de Ca2+ (Toyoshima et al., 2003). La proteína SERCA
está constituida por aproximadamente 1000 aminoácidos, y tiene una masa
molecular aproximadamente de 110 kDa. Presenta los extremos N-terminal y
C-terminal hacia el citoplasma, y 10 dominios transmembrana. Tiene una
cabeza globular constituida por 2 dominios citoplasmáticos, uno de los cuales
es el dominio catalítico, donde se encuentra el ácido aspártico que se fosforila
y el sitio de unión al ATP (Fig. 2).
Fig. 2 La Ca2+ del retículo sarcoplasmático. Representación esquemática de la estructura
de la SERCA, mostrando los segmentos transmembranas numerados, el dominio catalítico, el
sitio de fosforilación (P) y el extremo C-terminal, que puede estar ubicado en dos posiciones.
Actividad
La actividad consiste ubicar en la bomba de Ca2+, las siguientes estructuras:
Dominios estructurales.
1. Los tres dominios citoplasmáticos característicos de las bombas de tipo
P, y las hélices transmembranas.
2. Las hélices que forman parte de los dos sitios de alta afinidad por el
calcio.
3. Los dos residuos de aminoácidos a los cuales se une el análogo de
sustrato (Phe 487 y Asp 351).
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4. Las dos hélices transmembranas a las cuales se encuentra anclado el
dominio A, y que sufren rearreglos conformacionales tras la unión del análogo
de sustrato.
5. Los residuos de Glu 309, que actúa como residuo puente, y la Leu 65,
que se une a este por uniones de tipo van der Waals, tras la adición del
análogo.
6. La Asn 796 que forma puentes de hidrógeno con el Glu 309.
Dominio funcional
7. Los residuos que estabilizan un hidroxilo (O3) de la ribosa (Arg 687).
8. Los residuos que estabilizan al fosfato-α y al fosfato-β, y que también
forman puentes de hidrógenos con residuos de los dominios N y P (Arg 489 y
Arg 560).
9. Todos los residuos de aminoácidos que se encuentran dentro de 3,4 Å
de distancia del fosfato-γ; estos son la Asp 531, la Thr 353 y Thr 625, así como
la Gly 626.
10. La Arg 560, que es un residuo que aparentemente orienta la cadena
fosfato en la dirección correcta y forma un puente salino con la Asp 627,
estableciendo una interacción entre el dominio N y el dominio P.
Con los datos que se obtendrán luego del trabajo con el programa RasMol,
confeccionar un informe con el formato que se encuentra en el Anexo I; dentro
de este informe deberán estar incluidas las preguntas de la instancia de
autoevaluación, así como también las imágenes capturadas desde las
ventanas de RasMol.
IV- CUESTIONES DE AUTOEVALUACIÓN
Las cuestiones de autoevaluación podrán ser respondidas utilizando la
bibliografía de apoyo.
Pregunta Nº 1. La ATP-asa de Ca2+ pertenece a una familia de ATP-asas, las
llamadas ATP-asas de tipo P; ¿qué estructuras de esta gran familia de
proteínas se conservan en la mayoría de las integrantes? Analizar las
estructuras desde una perspectiva filogenético.
Pregunta Nº 2. ¿Cuáles don los dominios estructurales encargados de
funciones específicas en la ATP-asa de Ca2+?
Pregunta Nº 3. ¿Cuáles son los dominios funcionales principales?
Pregunta Nº 4. ¿Hay alguna relación entre los dominios estructurales y los
dominios funcionales en esta ATP-asa?
Pregunta Nº 5. ¿Hay motivos estructurales que sean necesarios para cumplir
alguna función específica?
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Bibliografía:
1. Frithof von Germar, Andreas Barth, and Werner Mäntele (2000) Structural Changes of
the Sarcoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase upon Nucleotide binding Studied by
Fourier Transform Infrared Spectroscopy Biophys. J. 78:1531-1540.
2. Chikashi Toyoshima, Tatsuaki Mizutani (2004) Crystal structure of the calcium pump
with a bound ATP analogue Nature 430:529-535.
3. David H. MacLennan, William J. Rice, N. Michael Green (1997) The Mechanism of Ca2+
Transport by Sarco(Endo)plasmic Reticulum Ca2+-ATPases J. Biol. Chem.
272:28815-28818.
4. Werner Kühlbrant (2004) Biology, Structure and Mechanism of P-type ATP-ases
Nature 5:282-295.
5. Koji Yonekura, David L. Stokes, Hiroyuke Sasabe, Chikashi Toyoshima (1997) The ATPBinding Site of Ca2+-ATPase Revealed by Electron Image Analysis Biophys. J.
72:997-1005.
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ANEXO I: Formato para la presentación del Informe.
Título del Trabajo
Nombre
Trabajo Práctico Nº
Fecha
Grupo Nº
Carrera
Introducción: Escribir aquí una breve introducción que describa con claridad
el tema que vas a desarrollar.
Desarrollo: Escribir aquí el texto. Utilizar todas las páginas necesarias, sin
olvidar incluir cada uno de los apartados principales que se quiera desarrollar
en el trabajo.
Conclusión: Escribir una conclusión que resuma con claridad los resultados
de la investigación.
Fuentes de información
Bibliografía:
Enumerar aquí los libros que has consultado. Si tiene varios tomos especifica el
que has usado.
Libros:
Apellidos del autor, nombre del autor. Título de la obra. Lugar de publicación:
editorial, año de publicación.
Artículo de Enciclopedia:
"Título del artículo", nombre de la enciclopedia. Año de la edición.
Artículo de un periódico, revista o diario:
Apellidos del autor, nombre del autor. "Título del artículo". Título de la
publicación. Fecha de la publicación: número, (páginas).
Reseña:
Apellidos del autor de la reseña, nombre del autor de la reseña. Reseña de
Título del libro, de Nombre y apellidos del autor. Lugar de publicación: editorial,
año de publicación.
Páginas Web:
Enumera las direcciones de las páginas Web que has consultado.
Apellidos del autor, nombre del autor. "Título del artículo o de la página",
nombre del sitio. Institución u organización mantenedora del sitio. Dirección
URL.